DE60133581T2

DE60133581T2 - Von lactobacillus casei ke01 stamm abgeleitete probiotische verbindungen

Info

Publication number: DE60133581T2
Application number: DE60133581T
Authority: DE
Inventors: A. Satyanarayan Diamond Bar NAIDU
Original assignee: PROBIO HEALTH; Probio Health Los Angeles
Current assignee: PROBIO HEALTH; Probio Health Los Angeles
Priority date: 2000-12-18
Filing date: 2001-12-17
Publication date: 2009-06-04
Anticipated expiration: 2021-12-18
Also published as: AU2002246679B2; JP2010195778A; DE60133581D1; BR0116349A; MXPA03005465A; WO2002058712A2; ATE391509T1; NZ526443A; JP2004525106A; WO2002058712A3; CA2442602A1; EP1345613B1; KR20040018319A; EP1345613A2; US20020192202A1; JP5186077B2; IL156490A0; US6797266B2

Description

BEREICH DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung beschreibt probiotische Zubereitungen mit Lactobacillus casei. Insbesondere werden gegen Entzündungen und Durchfall wirkende Zubereitungen beschrieben, die von einem jüngst charakterisierten Stamm von Lactobacillus casei abgeleitet sind, der mit KE01 bezeichnet wird. Es werden auch entsprechende Verfahren zur Zubereitung von probiotischen Verbindungen unter Verwendung des Stamms KE01 von Lactobacillus casei- und hier mit in Verbindung stehende Verfahren zur Verwendung der probiotischen Zusammensetzungen basierend auf KE01 beschrieben.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Der kürzlich beschriebene probiotische Stamm von Lactobacillus casei, der hier beschrieben wird, wurde als KE01 bezeichnet. Früher wurde der gleiche Organismus als Lactobacillus casei KE99 bezeichnet (siehe z. B. die US-Patentanmeldung Nr. 60/256528 und A. S. Naidu, X Xie, D. A. Leumer, S. Harrison, M. J. Burrill und E. A. Fonda, 2001: Reduction of Sulfide, Ammonia Compounds and Adhesion Properties of Lactobacillus casei strain KE99 In Vitro, Curr. Microbiol. 43: In press.).
Milchsäurebakterien (LAB) gehören zur indigenen Mikroflora des Magen-Darm-Trakts von Säugetieren und spielen eine wichtige Rolle bei der Mikroökologie des Wirtes und es wurde ihnen eine beeindruckende Liste von therapeutischen und prophylaktischen Eigenschaften zugeordnet. Diese therapeutischen und prophylaktischen Eigenschaften umfassen, ohne hierauf beschränkt zu sein, die Aufrechterhaltung der mikrobiellen Ökologie des Darms sowie physiologische, das Immunsystem beeinflussende und antimikrobielle Effekte. Andere Attribute, die mit LAB in Verbindung gebracht werden, umfassen die Freisetzung von Enzymen in das Darminnere, die mit der Anhaftung von LAB synergetisch wirken, um Symptome der Darm-Fehlabsorption zu lindern. Darüber hinaus helfen die LAB-Enzyme, den pH-Wert im Darm zu regulieren, was zu einem erhöhten Abbau von aromatischen Aminosäuren führt [R. Fuller, Probiotic foods – current use and future developments. IFI Nr. 3: 23–26 (1993); T. Mitsuoka, Taxonomy and ecology of Bifidobacteria. Bifidobacteria Microflora 3: 11 (1984); G. R. Gibson et al, Probiotics and intestinal infections, S. 10–39. In R. Fuller (Herausgeber), Probiotics 2: Applications and practical aspects. Chapman and Hall, London, U.K. (1997). AS Naidu et al, Probiotic spectra of lactic acid bacteria (LAB). Crit Rev Food Sci Nutr 39: 3–126 (1999); A. S. Naidu, R. A. Clemens, Probiotics, S. 431–462. In A. S. Naidu (Herausgeber), Natural Food Antimicrobial Systems. CRC Press, Boca Raton, FL (2000)].
Milchsäurebakterien haben auch gezeigt, dass sie die Fähigkeit besitzen, in signifikanter Weise Sulfid und Ammoniak enthaltende Verbindungen in tierischem Kot zu vermindern und auf diese Weise den Geruch und die Giftigkeit zu verringern, die mit Tierexkrementen verbunden sind. Diese ex vivo erfolgende Anwendung von LAB wird im zunehmenden Maße wichtiger, da sich die Agrarindustrie ausdehnt und Gemeinden fortfahren, ihre anscheinend niemals endende Ausweitung in zuvor unbebaute ländliche Bereiche auszuweiten. Beispielsweise wurde gezeigt, dass LAB unangenehme Gerüche beseitigen und die Schwefelwasserstoff-Produktion vermindern, die mit beim Abfall von Zuchtbetrieben auftreten, wenn Abfall von Hähnchen und Muscheln mit einer Mischung versetzt wird, die 15% Carbohydrat und LAB enthält. Darüber hinaus wurde gezeigt, dass LAB-Zusammensetzungen die Eigenschaft besitzen, den Escherichia coli- und Salmonellen-Gehalt von Abfall aus Aufzuchtbetrieben auf vernachlässigbare Pegel zu vermindern. Darüber hinaus werden der Geruch und die Viskosität von Geflügelabfall, wie z. B. dem Abfall aus der Masthähnchen-Verarbeitung durch eine durch L. acidophilus vermittelte Milchsäure-Fermentation beträchtlich vermindert. Darüber hinaus wurde berichtet, dass Zubereitungen, die LAB enthalten, das Aufbrechen von schwer abzubauenden Kohlehydraten beschleunigen und die Ammoniak-Erzeugung durch zökale Schweine-Bakterien vermindern. Schließlich vermindert eine ex vivo erfolgende Silage-Fermentation durch L. casei FG1 und L. plantarum FG10 in signifikanter Weise die Ammoniak-Pegel durch eine Hemmung der den Harnstoff aufspaltenden Organismen. [A. C. Deshmukh, P. H. Patterson, Preservation of hatchery wastes by lactic acid fermentation. 1. Laborstory scale fermentation. Poult Sci 76: 1212–1219 (1997); S. M. Russell et al., Lactic acid fermentation of broiler processing waste; physical properties and chemical analysis. Poult Sci 71: 765–770 (1992); G. W. Tibbetts et al., Poultry offal ensiled with lactobacillus acidophilus for growing and finsihing swine diets. J Anim Sci 64: 182–190 (1987); T. Sakata et al., Probiotic preparations dose-dependently increase net production rates of organic acids and decrease that of ammonia by pig cecal bacteria in batch culture. Dig Dis Sci 44: 1485–1493 (1999); Y. Cai et al., Effect of applying lactic acid bacteria isolated from forage crops an fermentation characteristics, aerobic deterioration of silage. J Dairy Sci 82: 520–526 (1999); H. W. Modler et al., Bifidobacteria and bifidogenic factors. Can Inst Food Sci Tech 23: 29–41 (1990)].
Das größte Potential von LAB zur Verbesserung der Lebensqualität von Menschen und Haustieren liegt in den in vivo erfolgenden probiotischen Anwendungen von LAB. Damit die LAB vorteilhafte probiotische Wirkungen in vivo erzielen können, müssen die Organismen über längere Zeiträume hinweg im Magen-Darm-Trakt überleben. Daher ist es wichtig, dass probiotische LAB-Stämme ausgewählt werden, die Eigenschaften besitzen, welche ihre rasche Ausscheidung durch Darm-Kontraktion verhindern. Wirksame probiotische Bakterien müssen in der Lage sein, die Bedingungen im Magen zu überleben und dem Darm zumindest zeitweise dadurch zu besiedeln, dass sie sich an das Darmepithel anheften. Daher haben LAB, welche eine erhöhte Fähigkeit besitzen, an Schleimhaut-Oberflächen anzuhaften, und die daher eine verbesserte bakterielle Versorgung und verlängerte Verweilzeiten im Magen-Darm-Trakt aufweisen, einen Wettbewerbsvorteil gegenüber LAB, die diese Eigenschaften nicht besitzen. [S. Salminen et al., Clinical uses of probiotics for stabilizing the gut mucosal barrier: successful strains and future challenges. Antonie Van Leeuwenhoek 70: 347–358 (1996); P. Conway, Selection criteria for probiotic microorganisms. Asia Pacific J Clin Nutr 5: 10–14 (1996); R. Havenaar et al., Selection of strains for probiotic use, S. 209–224. In R. Fuller (Herausgeber), Probiotics, the scientific basis. Chapman and Hall, London U.K. (1992)].
Lactobacillus kann aufgrund einer Reihe verschiedener Mechanismen den Magen-Darm-Trakt von Säugetieren erfolgreich besiedeln. Beispielsweise binden sich manche bakterielle Arten an verschiedene sub-epitheliale Matrix-Proteine und spezifische Rezeptoren an der Darmschleimhaut. Andere Arten können mit Hilfe von Mechanismen an Säugetier-Darmzellen anhaften, die verschiedene Kombinationen von Carbohydrat- und Protein-Faktoren an den Bakterien und den eukaryotischen Zell-Oberflächen des Wirtes umfassen. Unabhängig von dem oder den Mechanismen des Anhaftens ist es jedoch die Fähigkeit von LAB, den menschlichen Magen-Darm-Trakt erfolgreich zu besiedeln, welche dem LAB die probiotischen Qualitäten verleiht. [J. D. Greene, T. R. Klaenhammer, Factors involved in adherence of lactobacilli to human Caco-2 cells. Appl Environ Microbiol 60: 4487–4494 (1994); F. Sarem et al., Comparison of the adherence of three Lactobacillus strains to Caco-2 and Int-407 human intestinal cell lines. Lett. Appl Microbiol 22: 439–442 (1996); A. S. Naidu et al., Particle agglutination assays for rapid detection of fibronectin, fibriogen, and collagen receptors an Staphylococcus aureus. J Clin Microbiol 26: 1549–1554 (1988); T Wadström et al., Surface properties of lactobacilli isolated from the small intestines of pigs. J Appl Bacteriol 62: 513–520 (1987); M. F. Bernet et al., Lactobacillus acidophilus LA1 binds to cultured human intestinal cell lines and inhibits cell attachment, invasion by entern-virulent bacteria. Gut 35: 483–489 (1994); L. Z. Jin et al., Effect of adherent Lactobacillus spp. an in vitro adherence of salmonellae to the intestinal epithelial cells of chicken. J Appl Bacteriol 81: 201–206 (1996); G. Reid et al., Influence of lactobacilli an the adhesion of Staphylococcus aureus and Candida albicans to fibers and epithelial cells, J Ind Microbiol 15: 248–253 (1995)].
Allgemein gesprochen üben probiotische Bakterien ihre nützlichen Wirkungen dadurch aus, dass sie invasive oder Gift erzeugende pathogene enterische Bakterien (enterische Pathogene) von der Darmschleimhaut durch einen Konkurrenz-Bindeprozess verdrängen. Enterische Pathogene wie z. B. (ohne hierauf beschränkt zu sein) enteropathogene Escherichia coli (EPEC), enterotoxigene E. coli (ETEC), Salmonella enteriditis, Yersina pseudotuberculosis und Listeria monocytogenes müssen in der Lage sein, nach und nach den Darmtrakt eines Menschen oder Tiers zu besiedeln, um eine Erkrankung zu verursachen.
Die Mechanismen, die diese Organismen verwenden, um in wirksamer Weise den Darm zu besiedeln, sind unterschiedlich. Beispielsweise hängen sich ETEC, die CFA/I- oder CFA/II-Haftfaktoren tragen, in der Kultur spezifisch an den Bürstensaum der polarisierten epithelialen menschlichen Darm-Caco-2-Zellen an. S. typhimurium und EPEC hängen sich in der Kultur an den Bürstensaum von differenzierten menschlichen epithelialen Darm-Caco-2-Zellen an, während Y. pseudotuberculosis und L. monocytogenes sich an die Peripherie von nicht differenzierten Caco-2-Zellen binden.
Vor kurzem hat sich gezeigt, dass Zubereitungen mit durch Hitze abgetöteten L. acidophilus wirksame probiotische Zusammensetzungen sind. Es wurde gezeigt, dass Zubereitungen mit durch Wärme abgetöteten L. acidophilus bekannte enterische Pathogene von der Auskleidung der Darmwand eines Versuchstiers in einer von der Dosis abhängigen Weise verdrängen. Folglich waren die enterischen Pathogene nicht in der Lage, den Magen-Darm-Trakt des Tiers zu besiedeln und auf diese Weise wurde eine Erkrankung verhindert. Beispielsweise zeigte sich, dass L. acidophilus (Lacetol^®-Stamm) dieses Anhaften in einer von der Dosis abhängigen Weise des Stamms 841 von E. coli (ECB41) verhinderten. Bei anderen Experimenten verhinderten sowohl lebende als auch durch Hitze abgetötete Stämme von L. acidophilus LB in wirksamer Weise sowohl eine Assoziierung mit Caco-2-Zellen als auch eine Invasion von enterischen Pathogenen. In einer weiteren Studie wurde gezeigt, dass durch Wärme abgetötete Stämme von L. acidophilus LB vollständig eine ETEC-Anhaftung an Caco-2-Zellen verhindern. [J. Fourniat et al., Heat-killed Lactobacillus acidophilus inhibits adhesion of Escherichia coli 641 to HeLa cells. Ann Rech Vet 23: 361–370 (1992); G. Chauviere et al., Competitive exclusion of diarrheagenic Escherichia coli (ETEC) from human enterocyte-like Caco-2 cells by heat-killed Lactobacillus. FEMS Microbiol Lett 70: 213–217 (1992)]. M. H. Coconnier et al., Inhibition of adhesion of enteroinvasive pathogens to human intestinal Caco-2 cells by Lactobacillus acidophilus strain LB decreases bacterial invasion. FEMS Microbiol Lett 110: 299–305 (1993)].
Wie zuvor erläutert, werden probiotische Zusammensetzungen im Allgemeinen als mikrobielle Nahrungsmittel-Ergänzungen definiert, die in vorteilhafter Weise den Wirt dadurch beeinflussen, dass sie das mikrobielle Gleichgewicht im Darm verbessern. Die beiden Hauptarten von Mikroorganismen, die üblicherweise gedanklich mit probiotischen Substanzen in Verbindung gebracht werden, sind Lactobacillus sp und Bifidobacteria sp. Die nützlichen Wirkungen, die probiotischen Substanzen zugeordnet werden, umfassen eine erhöhte Widerstandsfähigkeit gegen Infektionserkrankungen, ein gesundes Immunsystem, eine Verminderung des Reizdarm-Syndroms, Verminderung des Blutdrucks, vermindertes Serum-Cholesterin, geringere Allergieneigung und Tumor-Rückbildung. Trotz jüngster wissenschaftlicher Fortschritte und der Publikation von begrenzten in vivo und in vitro gefundenen experimentellen Beweisen, welche die Wirksamkeit von probiotischen Zusammensetzungen stützen, haben sich die meisten Studien, welche diese und andere Vorteile berichten, auf Gegenmittel-Beweise gestützt.
Beispiele von Veröffentlichungen, die von Gegenmittel- und begrenzten in vitro gewonnenen Daten abhängen, umfassen die US-Patente 3 957 974 , 4 210 672 , 4 314 995 , 4 345 032 , 4 579 734 , 4 871 539 , 4 879 238 und 5 292 362 (die „Hata"-Patente). Die Hata-Patente beschreiben verschiedene Unterarten von Lactobacillus spp und berichten vorteilhafte, probiotische Wirkungen. Die Hata-Patente offenbaren oder beschreiben jedoch nicht eine Lactobacillus-Art, welche eine heftige Bindungsneigung zu sub-epithelialen Matrizen und einem konkurrierenden Ausschluss und eine mikrobielle Bekämpfung von bakteriellen, enterischen Pathogenen zeigt.
Das US-Patent 6 060 050 (das „050-Patent") beschreibt eine Zubereitung, die aus probiotischen Mikroorganismen besteht, die in einer Stärke verteilt sind, welche ein Medium enthält, das verwendet wird, um die Organismen während der Lagerung zu schützen, und das dazu dient, die Organismen zum Dickdarm zu transportieren, und das ein Wachstum förderndes Substrat liefert. Das 050-Patent liefert jedoch keine Daten, die unmittelbar eine probiotische Aktivität gegen enterische Pathogene zeigen.
Das US-Patent 5 965 128 (das „128-Patent") beschreibt die Behandlung von enterischen Erkrankungen, die durch E. coli O157:H7 (enterohämorrhagisches E. coli) verursacht werden. Die probiotischen Zusammensetzungen des 128-Patentes umfassen jedoch nur nicht pathogene Stämme von E. coli, und es wird kein Lactobacillus sp beschrieben. Folglich fehlen, obwohl die nicht pathogenen enterischen Organismen des 128-Patentes für den Empfänger eine Art probiotischen Schutz gegen enterohämorrhagische E. Coli verschaffen können, andere vorteilhafte Qualitäten, die bei Lactobacillus sp und Bifidobacteria sp vorhanden sind.
Die US-Patente 4 839 281 , 5 032 399 und 5 709 857 (das „857-Patent") beschreiben mehrere Stämme von Lactobacillus acidophilus, die an Darmschleimhaut-Zellen anhaften. Darüber hinaus beschreibt das 857-Patent einen Stamm von Lactobacillus acidophilus, der das Wachstum von bestimmten enterischen Pathogenen hemmt. Das 857-Patent beschreibt jedoch keine Stämme von L. casei, welche die nachgewiesenen vorteilhaften Qualitäten besitzen, die zu den Kulturen von L. acidophilus des 857-Patentes gehören.
WO-A-98/55131 beschreibt probiotische Zusammensetzungen, welche den Stamm LB21 von Lactobacillus casei rhamnosus enthalten, zur Behandlung von Magen-Darm-Erkrankungen.
US-A-5 705 160 beschreibt für eine Behandlung von Infektionen der Harnwege Zusammensetzungen, die einen Stamm enthalten, der aus L. casei var rhamnosus GR-1, L. rhamnosus RC-6, L. jensenii RC-28 und L. fermentum B-54 ausgewählt ist.
E. M. Tuomola et al beschreiben in FEMS Immunology and Medical Microbiology, Bd. 26, 1999, S. 139–142 die Wirkung von probiotischen Bakterien auf die Anhaftung von Pathogenen an die menschliche Darmschleimhaut. Lactobacillus GG und L. rhamnosus LC-705 verminderten leicht das Anhaften von S-fimbrierten E. coli, L. johnsonii LJ1 und L. casei Shirota hemmten die Anhaftung von S. typhimurium, während Lactobacillus GG und L. rhamnosus diese erhöhten.
Daher besteht weiterhin ein Bedarf für neue Stämme von Lactobacillus sp, die probiotische Aktivitäten aufweisen. Insbesondere besteht ein Bedarf für mehr Stämme von Lactobacillus sp, welche die nachgewiesene Fähigkeit besitzen, enterisch-pathogene Erkrankungen zu vermindern und die Vitalität und Gesundheit von Menschen und Tieren zu erhöhen.
Gemäß der Erfindung wird eine probiotische Zusammensetzung geschaffen, wie sie in den beigefügten Ansprüchen 1 und 21 definiert ist, sowie ihre Verwendung gemäß dem beigefügten Anspruch 29.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Es ist ein Ziel der vorliegenden Erfindung, einen neuen Stamm von Lactobacillus sp anzugeben, der probiotische Eigenschaften gezeigt hat. Es ist ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung, einen neuen Stamm von Lactobacillus spp anzugeben, der eine gegen enterische Pathogene gerichtete, probiotische Aktivität besitzt.
Es ist ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung, einen neuen Stamm von Lactobacillus sp. anzugeben, der die Gesundheit und Vitalität von Menschen und Tieren aufrechterhält.
Es ist ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung, Nahrungsmittel-Ergänzungsstoffe und pharmazeutische Zubereitungen anzugeben, die aus Lactobacillus sp. hergestellt sind und die probiotische Eigenschaften gezeigt haben.
Die vorliegende Erfindung erreicht diese und andere Ziele dadurch, dass ein neuer Stamm von Lactobacillus casei angegeben wird, der mit KE01 bezeichnet ist und wissenschaftlich bewiesene probiotische Eigenschaften aufweist, zu denen eine in vivo nachgewiesene Aktivität gegen enterische Pathogene gehört. Darüber hinaus schafft die vorliegende Erfindung Nahrungsmittel-Ergänzungsstoffe und pharmazeutische Zubereitungen, die den Stamm KE01 von L. casei umfassen und in einem Zuckerkomplex zubereitet werden, der aus Trehalose und Fructooligosacchariden besteht, die für einen Langzeitschutz des Organismus sorgen und dabei helfen, seine nachgewiesenen probiotischen Eigenschaften aufrecht zu erhalten.
Es besteht ein Bedarf für neue probiotische Zubereitungen, die verwendet werden können, um enterisch pathogene Infektionen zu behandeln und zu verhindern, und die dabei helfen, die Gesundheit und die Vitalität von Menschen und Vieh aufrecht zu erhalten. Kürzlich hat die Federal Food and Drug Administration (FDA) ihre Kampagne gegen die übermäßige Verschreibung und den klinischen Missbrauch von Antibiotika intensiviert. Die übermäßige Verwendung von Antibiotika hat die Anzahl von menschlichen und tierischen Pathogenen erhöht, welche gegen die hauptsächlichen Antibiotika resistent sind, was zu einer Erhöhung von Infektionen führt, die auf herkömmliche antimikrobielle Therapien nicht reagieren. Darüber hinaus hat die prophylaktische Verwendung von Antibiotika bei der Tiernahrung zu einer alarmierenden Erhöhung von Darminfektionen bei Vieh geführt, was zu einer verringerten Größe der Herden und einem verringerten Gewicht der Tiere führte, das auf einer schlechteren Nährstoffabsorption beruht. Folglich ist die Anzahl von gesunden Tieren, die für einen menschlichen Verzehr geeignet sind, abgefallen, und die Tiere, die genügend lange leben, um den Markt zu erreichen, haben signifikant niedrigeres Gewicht und somit eine verminderte Fleischqualität.
Ein Mittel, die schnelle Ausbreitung von gegen Medikamente resistenten, enterischen Pathogenen beim Menschen und Vieh zu verhindern, besteht darin, die Verwendung von Antibiotika beträchtlich zu vermindern. Die Ausbreitung von übertragbaren Erkrankungen, einschließlich enterischer Infektionen beruht unvermeidlich auf der Überbelegung von Bauernhöfen und der Überbevölkerung von Städten. Daher muss, bevor die prophylakti sche Verwendung von Antibiotika vollständig unterbrochen werden kann, eine geeignete antimikrobielle Alternative zur Verfügung stehen. Jüngst durchgeführte Studien haben gezeigt, dass die Verwendung von Nahrungsmitteln und Lebensmittel-Ergänzungen, die spezielle Stämme von probiotischen Mikroorganismen enthalten, dabei helfen können, enterisch pathogene Erkrankungen zu verhindern und in vielen Fällen sogar zu heilen. Viele der probiotischen Zubereitungen, die zurzeit auf dem Markt sind, beruhen jedoch auf Organismen einschließlich Lactobacillus spp und Bifidobacteria sp (und anderen Arten), die keiner wissenschaftlichen Überprüfung unter Verwendung von erprobten Verfahren zur Bewertung der probiotischen Wirksamkeit unterzogen worden sind. Folglich fehlt zu vielen der zurzeit verfügbaren, „probiotischen" Zubereitungen eine bewiesene, in vivo erfolgende Aktivität gegen enterische Pathogene. Darüber hinaus sind viele der klinisch wirksamen, probiotischen Zubereitungen, die im Handel zur Verfügung stehen, bei der Lagerung nicht stabil und liefern daher keine wirksamen Mengen von lebensfähigen probiotischen Bakterien an den Verwender. Der Erfinder der vorliegenden Erfindung hat viele im Handel zur Verfügung stehende Zubereitungen getestet und fand eine mikrobielle Lebensfähigkeit weit unter den behaupteten Konzentrationen, und in vielen Fällen hat der Erfinder gefunden, dass diese im Handel erhältlichen Zubereitungen überhaupt keine lebensfähigen Bakterien enthielten.
Der Erfinder hat Verfahren zur Zubereitung und Verpackung eines neuen Stammes von L. casei entwickelt, der als KE01 bezeichnet wird. Der neue Stamm von L. casei stammte ursprünglich aus einem herkömmlichen fermentierten, joghurtartigen, aus Asien kommenden Molkereiprodukt, das vom vorliegenden Erfinder entwickelt wurde. Danach charakterisierte der Erfinder das Isolat und den Stamm, der bei der American Type Culture Collection (ATCC, MD, USA) hinterlegt wurde. Dem Stamm KE01 von Lactobacillus casei wurde die ATCC-Hinterlegungsnummer PTA-3945 zugeordnet. Darüber hinaus hat der vorliegende Erfinder Zubereitungen entwickelt, die die Lebensfähigkeit des L. casei KE01 aufrechterhalten, so dass eine klinisch wirksame Dosis von lebensfähigen probiotischen Mikroorganismen den Empfänger erreicht.
Die vorliegende Erfindung schafft einen Stamm von L. casei (KE01), der die bakterielle Anhaftung von enterischen Pathogenen an einer Vielzahl von Säugetier-Zellarten stört (mikrobielle Störung), wie z. B. die von enteropathogenen und enterotoxigenen E. coli, Helicobacter pylori, Campylobacter jejuni, S. typhimurium und S. enteritidis. Darüber hinaus kann der Lactobacillus der vorliegenden Erfindung auch in Konkurrenz diese und andere bakterielle Pathogene daran hindern, sich an viele Säugetier-Zellen zu binden (kompetitive Exklusion). Die nützlichen Eigenschaften, die in Verbindung mit dem neuen Lactobacillus-Stamm der vorliegenden Erfindung auftreten, haben zu verbesserten probiotischen Nahrungsmittel-Ergänzungsstoffen geführt, welche die allgemeine menschliche und tierische Gesundheit fördern. Darüber hinaus kann die vorliegende Erfindung verwendet werden, um prophylaktische, therapeutische und palliative Substanzen zu schaffen (die hier kollektiv als „Probiotika" bezeichnet werden) für Zustände wie z. B. Reisedurchfall, Magen-Darm-Infektionen, hämolytisch uremisches Syndrom und Magengeschwüren, ohne dass diese Aufzählung vollständig wäre.
Darüber hinaus umfassen neue Merkmale und Qualitäten dieses neuen Stammes KE01 von L. casei, ohne hierauf beschränkt zu sein, die Fähigkeit von L. casei KE01, Sulfid-Konzentrationen innerhalb von 48 Stunden um einen Faktor zu vermindern, der 300 ppm übersteigt, wenn der Stamm einem Wachstumsmedium ausgesetzt wird, das ungefähr 2000 ppm von Sulfiden enthält, sowie die Demonstration einer raschen Bindung an subepitheliale Matrizen einschließlich Bio-coat^TM (Kollagen Typ I, Kollagen-Typ IV, Laminin und Fibronectin), Matrigel^TM und an die Caco-2-Zellen-Monoschicht. Besonders wichtig ist, dass gezeigt wurde, dass eine wieder hergestellte, gefriergetrocknete Zubereitung des L. casei gemäß der vorliegenden Erfindung in wirksamer Weise an Kollagen haftende E. coli ablösen kann.
Die Verfahren, die verwendet werden, um die Lebensfähigkeit des L. casei gemäß der vorliegenden Erfindung aufrecht zu erhalten und seine Fähigkeiten beizubehalten, E. coli zu verdrängen, umfassen, ohne hierauf beschränkt zu sein, die Verwendung von Zucker-Trehalose und Feuchtigkeit und die Verpackung der fertigen Zusammensetzung in sauerstoffdichten, mit Polymer (beispielsweise Mylar^®) ausgekleideten Folienbeuteln.
Diese und andere nützliche probiotische Eigenschaften des neuen Stammes von Lactobacillus werden noch genauer klar durch die folgende, detaillierte Beschreibung der vorliegenden Erfindung.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNG
In dieser zeigen:
1 den genomischen Fingerabdruck des Stammes KE01 von Lactobacillus casei auf 1% Agarosegel im Vergleich zu 12 verschiedenen Lactobacillus artigen Stämmen, basierend auf der Randomly Amplified Polymorphic DNA-Untersuchung (RAPD).
2 das phylogene Dendogram, das von dem genomischen Fingerabdruck abgeleitet wurde, und die Verwandtschaft des Stamms KE01 von Lactobacillus mit anderen Arten von lactobacillus-artigen Stämmen.
3 das Anhaften des Stammes KE01 von Lactobacillus casei an Rinderdarm-Epithelialzellen,
4 den durch Besiedelung gebildeten Biofilm auf der epithelialen Rinder-Darmschleimhaut,
5 in graphischer Weise die verstärkte Darm-Besiedelung und fäkale Ausscheidung von Lactobacilli infolge einer Ergänzung der Tiernahrung mit dem Stamm KE01 von Lactobacillus casei gemäß der Erfindung,
6 in einer graphischen Darstellung die Verminderung der fäkalen Coliform-Zählwerte infolge einer Ergänzung des Tierfutters mit dem Stamm KE01 von Lactobacillus casei gemäß der vorliegenden Erfindung,
7 in graphischer Weise die Verminderung von Ammoniakprodukten im Tierkot infolge einer Ergänzung der Tiernahrung mit dem Stamm KE01 von Lactobacillus casei gemäß der vorliegenden Erfindung,
8 in graphischer Weise die Verminderung der Sulfidprodukte im tierischen Kot als Folge der Ergänzung der Tiernahrung mit dem Stamm KE01 von Lactobacillus casei gemäß der vorliegenden Erfindung, und
9 in graphischer Weise die Erhöhung der Gewichtszunahme bei Tieren infolge der Ergänzung der Tiernahrung mit dem Stamm KE01 von Lactobacillus casei gemäß der vorliegenden Erfindung.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Eine Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist eine Nahrungsmittel-Ergänzung, die ungefähr 10⁵ bis 10¹¹ Kolonie bildende Einheiten von lebensfähigen Lactobacilli pro Gramm enthält. Bei einer anderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung umfasst die Nahrungsmittel-Ergänzung ungefähr 10⁵ bis 10¹¹ nicht-lebensfähige Lactobacilli pro Gramm. Der Lactobacillus gemäß der vorliegenden Erfindung ist der Stamm KE01 von Lactobacillus casei, der die Zugangsnummer PTA-3945 der American Typ Culture Collection (ATCC) besitzt. Eine Kolonie bildende Einheit (CFU) von Lactobacillus casei KE01 ist gleich einer bakteriellen Zelle. Obwohl der Ausdruck Kolonie bildende Einheit, oder CFU, im Allgemeinen nur unter Bezugnahme auf lebensfähige Bakterien verwendet wird, wird er hier auch als einzelne, nicht lebensfähige bakterielle Zelle definiert, wenn auf Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung mit Zusammensetzungen mit nicht lebensfähigen Lactobacillus- Bezug genommen wird.
Bei einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung umfasst die Nahrungsmittel-Ergänzung eine Gelatinekapsel, die mit einer getrockneten Lactobacillus-Zusammensetzung gefüllt ist. Bei einer anderen Ausführungsform liegt die Nahrungsmittel-Ergänzung in Form einer flüssigen Zubereitung vor. Bei einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung hat die Nahrungsmittel-Ergänzung die Form eines analen oder vaginalen Zäpfchens. Bei einer Verwendung als Zäpfchen kann ein geeigneter Brei gebildet werden, und es können nichttoxische Gleitmittel, Stabilisatoren, Wachse und dergleichen enthalten sein, um die Verabreichung zu erleichtern. Bei einer anderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung kann die Lactobacillus umfassende Nahrungsmittel-Ergänzung mit Lebensmitteln verbunden sein, wie z. B. mit Molkereiprodukten, Getreide, Brot, Fleisch, Früchten, Gemüse, Reis und dergleichen, ohne dass diese Aufzählung vollständig wäre. Die Form, welche der Lactobacillus-Nahrungsmittel-Ergänzungsstoff der vorliegenden Erfindung annimmt, ist nicht wichtig und nicht einschränkend.
In dieser Beschreibung wird durchgehend die vorliegende Erfindung als eine probiotische Zusammensetzung, eine Lactobacillus enthaltende Zusammensetzung, eine Nahrungsmittel-Ergänzung, ein gefriergetrocknetes Pulver oder eine Lactobacillus-Zusammensetzung bezeichnet. All diese eben erwähnten Ausdrücke bedeuten eine Zusammensetzung unabhängig von der Form oder dem Vorhandensein oder Fehlen von anderen Bestandteilen, die einen lebensfähigen oder nicht lebensfähigen Stamm KE01 von Lactobacillus casei enthält, der die ATCC-Zugangs-Nummer. PTA-3945 besitzt, oder ein genetisches Äquivalent, wie dies unter Verwendung der hier im Einzelnen beschriebenen Verfahren festgelegt wird.
Bei einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird die Lactobacilli-Zusammensetzung unter Verwendung von Standardverfahren gefriergetrocknet, wie sie dem Durchschnittsfachmann auf dem Gebiet der Lebensmittel-Wissenschaften bekannt sind. Bei einer anderen Ausführungsform der Lactobacillus-Zusammensetzung gemäß der vorliegenden Erfindung ist die Lactobacilli-Zusammensetzung luftgetrocknet. Bei einer weiteren Ausführungsform handelt es sich bei der Lactobacilli-Zusammensetzung um eine Paste. Bei einer anderen Ausführungsform ist die Lactobacilli-Zusammensetzung gemäß der vorliegenden Erfindung eine Flüssigkeit.
Die Lactobacilli-Zusammensetzungen gemäß der vorliegenden Erfindung können in Verbindung mit zusätzlichen Bestandteilen oder ohne solche zusätzlichen Bestandteile vorliegen. Beispielsweise ist bei einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung die Lactobacilli-Zusammensetzung mit einem Kohlehydrat gemischt, das aus der Gruppe ausgewählt ist, die Trehalose, Glukose, Sucrose, Fructose, Maltose und Kombinationen hiervon umfasst. Das oder die Kohlehydrate können von ungefähr 50% bis 98% der gesamten Zusammensetzung ausmachen. Bei einer anderen Ausführungsform können Proteine, wie z. B. Albumin und/oder Molke zu den Lactobacilli-Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung hinzugefügt werden oder aber auch nicht.
Die Lactobacilli-Zusammensetzungen gemäß der vorliegenden Erfindung können oral als Brei, in der Form einer Gelatinekapsel, als gepresste Tablette oder als eine Gelkapsel eingenommen werden. Bei einer anderen Ausführungsform können die Lactobacilli-Zusammensetzungen gemäß der vorliegenden Erfindung oral in der Form eines flüssigen Getränkes eingenommen werden. Das flüssige Getränk kann andere Bestandteile enthalten, wie z. B., ohne hierauf beschränkt zu sein, Geschmacksverstärker, Süßstoffe, Viskositätsverstärker und andere Lebensmittel-Zusätze. Die vorliegende Erfindung kann auch zusammen mit anderen Nahrungsmitteln entweder getrennt oder mit diesen verbunden eingenommen werden.
Bei einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird einem Menschen oder Tier eine einzelne Dosis verabreicht, die von ungefähr 10⁵ bis 10¹¹ Lactobacilli pro Gramm einer probiotischen Zusammensetzung enthält. Die verabreichte Gesamtmenge hängt von den individuellen Bedürfnissen des Menschen oder Tieres und dem Gewicht und der Größe des Menschen oder Tieres ab. Die bevorzugte Dosierung für irgendeine Anwendung kann auf einfache Weise durch Titration ermittelt werden. Titration wird dadurch bewerkstelligt, dass eine Reihe von Standardgewichts-Dosen zubereitet wird, von denen jede von ungefähr 10⁵ bis 10¹¹ Lactobacilli pro Gramm enthält. Eine Reihe von Dosen wird beginnend mit 0,5 g verabreicht, und es wird bis zu einem logischen Endpunkt fortgefahren, der durch die Größe des Menschen oder Tiers und die Dosisform bestimmt ist. Die geeignete Dosis ist erreicht, wenn die Minimalmenge der Lactobacilli-Zusammensetzung, die erforderlich ist, um die gewünschten Ergebnisse zu erzielen, verabreicht wird. Die geeignete Dosis ist dem Fachmann auch als „wirksame Menge" der probiotischen Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung bekannt.
Beispielsweise wird dann, wenn gewünscht wird, die Symptome zu vermindern, die bei einem Menschen oder Tier mit dem Reizdarm-Syndrom verbunden sind, eine in der oben beschriebenen Weise gemessene Dosis täglich verabreicht, wobei in aufeinander folgenden Tagen die Dosis jeweils in 0,5 g-Inkrementen gesteigert wird, bis die Symptome abnehmen. Bei einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung liegt die bevorzugte Dosis zwischen ungefähr 10³ bis 10⁸ lebensfähigen Lactobacilli pro Kilogramm Körpergewicht (dem Gewicht des empfangenden Menschen oder Tieres) pro Tag. Dies ist ungefähr gleich 10 Milliarden lebensfähigen Bazillen des Stammes KE01 von Lactobacillus casei pro Tag für einen mittleren, gesunden erwachsenen Menschen. Es ist einfach, durch Extrapolation die ungefähre Dosis zu berechnen, die für irgend einen Menschen oder irgend ein Tier mit irgend einem Körpergewicht geeignet ist. Es sei darauf hingewiesen, dass dies ein nicht einschränkend zu verstehendes Beispiel ist, das in geeigneter Weise durch Fachleute im Bereich der Verschreibung von probiotischen Zusammensetzungen oder durch Verwendung des oben erläuterten Titrations-Verfahrens variiert werden kann.
Die probiotischen Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung können an jeden Menschen oder jedes Tier verabreicht werden, der bzw. das sie benötigt, einschließlich, ohne hierauf beschränkt zu sein, an Menschen, Säugetiere, Vögel, Reptilien und Fische. Typische Anwendungsfälle umfassen die Verabreichung der probiotischen Zusammensetzungen gemäß der Erfindung an Menschen, Pferde, Schweine, Kühe, Schafe, Hunde, Katzen, Kaninchen, Hühner, Truthähne, Fasane, Wachteln, Sittiche, Papageien und andere Wild- und Haustiere.
Insbesondere können die probiotischen Zusammensetzungen gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet werden, um Krankheiten zu hemmen oder zu behandeln, die mit enterischen Pathogenen einhergehen, wobei sie an ein Lebewesen verabreicht werden, das sie benötigt, unter Verwendung von Verfahren, die in der vorliegenden Beschreibung erläutert werden. Durch enterische Pathogene verursachte Erkrankungen umfassen solche, die durch Pathogene erzeugt werden, wie z. B. Durchfall, Reizdarm-Syndrom und Darm-Hämorrhagen. Beispiele von enterischen Pathogenen, die mit diesen Erkrankungen in Verbindung stehen, sind, ohne hierauf beschränkt zu sein, enteropathogene Escherichia coli (EPEC), enterotoxigene E. coli (ETEC), Salmonella enteriditis, Yersina pseudotuberculosis und Listeria monocytogenes. Der vorliegende Erfinder nimmt theoretisch an, ohne dass dies einschränkend zu verstehen ist, dass die Hemmung und Behandlung der enterisch pathogenen Erkrankungen durch die probiotischen Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung durch einen Konkurrenz-Bindevorgang bewerkstelligt wird. Das heißt, die probiotischen Lactobacilli der vorliegenden Erfindung stehen in Konkurrenz mit enterischen Pathogenen für Bindungsstellen an der Darmschleimhaut. Da die probiotischen Lactobacilli gemäß der vorliegenden Erfindung eine höhere Affinität und Avidität zu diesen Bindungsstellen als die enterischen Pathogene besitzen, verdrängen die probiotischen Lactobacilli gemäß der vorliegenden Erfindung die enterischen Pathogene in das Darmmilieu, von wo sie in harmloser Weise durch normale metabolische Vorgänge aus den Därmen ausgespült werden. In vivo durchgeführte Beispiele dieser oben beschriebenen Konkurrenz-Bindung und ihre Wirksamkeit bei der Hemmung und Behandlung von auf enterischen Pathogenen beruhenden Krankheiten werden in den folgenden detaillierten Beispielen und durch die beigefügten Figuren gegeben.
Die folgende technische Erläuterung liefert detaillierte Hinweise. Im Abschnitt I wird dem Fachmann gezeigt, wie die probiotischen Lactobacilli, insbesondere die probiotischen Stämme von Lactobacillus der vorliegenden Erfindung, nämlich der Stamm KE01 von Lactobacillus casei isoliert und identifiziert werden können. Im Abschnitt II werden spezielle Beispiele gegeben, die zeigen, wie die probiotischen Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung zubereitet werden, sowie die Tests, die durchgeführt wurden, um in wissenschaftlicher Weise die probiotischen Eigenschaften zu bewerten, welche von den probiotischen Zusammensetzungen gemäß der vorliegenden Erfindung gezeigt wurden.
I. Isolation und Charakterisierung des Stammes KE01 von Lactobacillus casei
A. Isolation von als Kandidaten infrage kommenden probiotischen Bakterien
Die probiotischen Organismen der vorliegenden Erfindung wurden aus einem herkömmlich fermentierten, joghurtartigen, asiatischen Molkereiprodukt isoliert. Die Durchsuchung war auf traditionell fermentierte joghurtartige asiatische Molkereiprodukte begrenzt, die wenigstens eine 10-jährige Geschichte eines sicheren menschlichen Verzehrs besaßen. Die Isolation der probiotischen Bakterien wurde unter Verwendung von drei selektiven mikrobiologischen Medien unter Verwendung von Verfahren durchgeführt, wie sie dem Durchschnittsfachmann im Bereich der Mikrobiologie bekannt sind. Das für Lactobacilli selektive Medium umfasste SL-Medium ergänzt mit 0,05% Cystein, Bifidobacterium spp. wurden unter Verwendung eines Trypticase Phytone Hefeextrakt-Mediums selektiert, das Antibiotika enthielt, und Streptococcus spp. wurden unter Verwendung von Trypticase Hefeextrakt-Cystein-Medium isoliert.
Mögliche probiotische Lactobacilli sollten katalase-negativ, glukose-homo-fermentativ, gram-positive, keine Sporen bildende Keime sein, die einen niedrigen pH-Wert und Widerstandsfähigkeit gegen Magensäure und Galle besaßen. Die Unfähigkeit von Lactobacilli-Isolaten, bei einem pH-Wert von 9,0 zu wachsen, gekoppelt mit ihrer Fähigkeit, auf Acetat enthaltenden Medien zu wachsen, dienten dazu, sie von Carnobacterium spp. zu unterscheiden. Basierend auf diesen Kriterien wurden insgesamt 81 isolierte Stämme als mögliche probiotische Lactobacilli klassifiziert und sie wurden weiter bezüglich der folgenden Kriterien eingeteilt: i) Widerstandsfähigkeit gegen geringen Bauchspeichelsaft, ii) Anhaftungsfähigkeit an sub-epitheliale Matrizen, wie z. B. Biocoat^TM Matrigel (Becton Dickinson, Redford, MA) und an in Kultur befindliche epitheliale Darmzellen (Caco-2-Zellli nie); iii) ihre Fähigkeit in Konkurrenz enterohämorrhagische E. coli Serotypen 0157:H7 Bakterien zu verdrängen, die an Kollagen-Matrizen hafteten; und iv) ihre Fähigkeit, Ammoniak und Sulfid enthaltende Verbindungen zu reduzieren.
Nach der Analyse von allen 81 möglichen probiotischen Lactobacilli wurden zwei Stämme identifiziert, die alle obigen Merkmale besaßen. Diese Stämme wurden als Stamm KE97 und Stamm KE99 bezeichnet (letzterer wird nunmehr als KE01 bezeichnet). Schließlich wurden die Wachstums-Multiplikationsrate (Generationszeit ermittelt durch Impedanz-Erkennung unter Verwendung von BioMerieux^TM Bactometer Systems), die Stabilität der Stämme in kontinuierlicher Kultur, die Gefriertrocknungs- und Wiederbelebungs-Merkmale und die Aroma/Geschmacks-Profile für jeden Stamm untersucht.
Die Organismen des isolierten Stammes KE01 von Lactobacillus casei werden in einer im Wesentlichen reinen Kultur zur Verwendung bei der Zubereitung von probiotischen Zusammensetzungen gemäß der vorliegenden Erfindung aufrechterhalten. So wie er hier verwendet wird, bezeichnet der Ausdruck „im Wesentlichen reine Kultur" eine bakteriologische Kultur, die zu nur einem identifizierbaren Organismus führt, wenn sie auf einem festen oder halbfesten mikrobiologischen Kulturmedium zur Kultur angesetzt wird. Es versteht sich, dass extrem niedrige Mengen von Zellen von anderen bakteriellen Arten vorhanden sein können; diese Zellen sind aber jedoch entweder nicht lebensfähig, nicht kultivierbar oder unterhalb der Nachweisgrenze bei der Verwendung von klassischen, nicht auf dem Genom basierenden mikrobiologischen Verfahren. Der Ausdruck „nicht auf dem Genom basierend" soll solche Verfahren, wie z. B. PCR-Erkennung oder ähnliche Verfahren ausschließen, die verwendet werden, um mikrobielle DNA oder RNA zu detektieren.
Darüber hinaus sei darauf hingewiesen, dass immer dann, wenn Pulver, Pasten, Gele, Breie oder andere probiotische Zusammensetzungen gemäß der Erfindung aus dem Stamm KE01 von Lactobacillus casei (der auch kurz nur als KE01 bezeichnet werden kann) hergestellt werden, wie sie hier beschrieben sind, der Stamm KE01 von Lactobacillus casei von einer im Wesentlichen reinen Kultur abgeleitet worden war.
B. DNA-Fingerabdruckmethode durch Random Amplified Polymorphic DNA-Untersuchung (RAPD)

Das RAPD-Protokoll verwendet PCR zur Erzeugung eines eindeutigen Fingerabdrucks für eine bakterielle Identifizierung. Die Analyse durch PCR kann auf schnelle und zuverlässige Weise durchgeführt werden. Somit wurde die RAPD-Untersuchung für eine molekulare Identifizierung des Stammes KE01 und ein entsprechendes Fingerabdruckverfahren verwendet. Es wurden insgesamt 12 dem Lactobacillus spp. ähnliche Stämme aus der ATCC-Sammlung dem Fingerabdruckverfahren unterzogen und mit KE01 verglichen. Für das DNA-Fingerabdruckverfahren wurden alle Lactobacillus-Stämme über Nacht in MRS-Nährlösung kultiviert (Difco). Die für die DNA-Fingerabdrücke analysierten Lactobacillus-Stämme sind in der folgenden Tabelle 1 aufgeführt. Tabelle 1

Lactobacillus spp.	Quelle
Lactobacillus Stamm KE01	en-N-tech, Inc., Kalifornien, USA
Lactobacillus acidophilus ATCC 4356	Human [L 917; IFO 13951; NCIB 8690]
Lactobacillus amylovorus ATCC 33620	Rinder-Futtergetreide-Abfall-Silage
Lactobacillus brevis ATCC 14869	menschliche Fäkalien
Lactobacillus casei subsp. casei ATCC 393	Käse [IAM 12473; Orland L-323]
Lactobacillus casei subsp. rhamnosus ATCC 7469	[BUCSAV 227; P. A. Hansen 300; NCDO 243; NCIB 6375; NCTC 6375; NRC 488]
Lactobacillus delbrueckli subsp. lactis ATCC 12315	Schweizer Käse [DSM 20072; IAM 12476; NCDO 1438]
Lactobacillus fermentum ATCC 14931	fermentierte Zuckerrüben [NCIB 11840]
Lactobacillus helvaticus ATCC 15009	Schweizer Käse
Lactobacillus paracasei subsp. paracasei ATCC 25302	[NCDO 151, R094]
Lactobacillus pentosus ATCC 8041	[DSM 20314; NCDO 363; NCIB 8026]
Lactobacillus plantarum ATCC 14917	Sauerkraut [IAM 124771]
Lactobacillus reuteri ATCC 23272	menschliche Fäkalien

DNA-Extraktionsverfahren
DNA wurde von den Lactobacilli unter Verwendung des Wizard Genomic DNA Purification Kits (Promega, WI, USA) extrahiert. Kurz gesagt, wurden 1 ml von über 24 Stunden hinweg gewachsener MRS-Nährlösungskultur eines jeden Lactobacillus spp. durch Zentrifugation gewonnen, die Zellen wurden in 50 mM EDTA resuspendiert und mit 10 mg/ml Lysozyme (Sigma, MO, USA) bei 37°C 60 Minuten lang behandelt. Die Lactobacilli-Zellen wurden durch Zentrifugation als Kügelchen gewonnen und der Überstand wurde entfernt. Die bakteriellen Kügelchen wurden in der Nuclei-Lysis-Lösung resuspendiert und bei 80°C 5 Minuten lang inkubiert. Man ließ die Zellsuspension auf Zimmertemperatur abkühlen und RNAse wurde in die Lösung eingemischt. Die Suspension wurde 60 Minuten lang bei 37°C inkubiert. Nach der Inkubation wurde eine Protein-Ausfäll-Lösung zur Mischung hinzu gegeben. Die Lösung wurde in einem Wirbel gemischt und auf Eis 5 Minuten lang inkubiert. Die Mischung wurde 3 Minuten lang bei 15K xg zentrifugiert und der Überstand wurde in ein frisches Röhrchen übergeführt und die DNA wurde mit Isopropylalkohol ausgefällt. Die DNA wurde zentrifugiert und der Isopropylalkohol wurde abgesaugt. Das DNA-Kügelchen wurde mit 70% Ethanol gewaschen und durch Zentrifugation zurück gewonnen. Das Ethanol wurde entfernt und man ließ das Kügelchen trocknen. Die DNA wurde in Tris-EDTA-Puffer resuspendiert.
PCR-Amplifikation der extrahierten DNA
Ein Mikroliter der extrahierten DNA wurde in den PCR-Reaktionen verwendet, die am iCycler (Bio-Rad, CA, USA) unter Verwendung einer einzigen beliebigen Nukleotid-Se quenz gemäß Cocconcelli et al. (1995) durchgeführt wurden. Ein 2 × PCR-Lösungs-Prämix-Taq (Takara, Shiga, Japan) wurde für jede Reaktion verwendet. Jede Reaktion enthielt ein Gesamtvolumen von 50 μl, 1,25 Einheiten von Takara Ex Taq DNA-Polymerase, 1 × Puffer, 200 μM dNTP-Mix (jeweils 2,5 mM). Die Endkonzentration des Primers war 4 μM und der Primer, der für die Amplifikation verwendet wurde, war 5'-AgCAgCgTgg-3' (Operon Technologies, Inc. CA, USA). Die Reaktionsmischungen mit der Schablonen-DNA wurden über das folgende Temperaturprofil hinweg zyklusmäßig behandelt: 1 Zyklus bei 94°C für 5 Minuten; 40 Zyklen bei 94°C für 1 Minute; 29°C für 1 Minute; Rampe auf 72°C 1,5 Minuten und auf 72°C für 1,5 Minuten gehalten; 1 Zyklus bei 72°C für 2 Minuten; und bei 4°C gehalten [Cocconcelli, PS et al., Development of RAPD protocol for typing of strains of lactic acid bacteria and entercocci. Lett. Appl. Microbiol. 21: 376–379 (1995)].
Gel-Elektrophorese
Gleiche Mengen eines jeden durch RAPD verstärkten Reaktionsproduktes (10 μl) wurden durch 1% (Gew./Vol.) Agarosegel-Elektrophorese in Tris-Borat-EDTA-Puffer gemäß Sambrook et al. (1989) analysiert. Die Gele wurden 2 Stunden lang bei 120 V ohne Kühlung behandelt. Der DNA-Molekulargewichts-Marker Hyperladder I (Bioline, Randolph, MA, USA) wurde als Standard verwendet. Nach der Elektrophorese wurde das Gel mit Ethidiumbromid (5 μg/ml) 10 Minuten lang gefärbt, 5 Minuten lang gewaschen und auf einem Fluor-S-Multilmager (BioRad, CA, USA) optisch inspiziert und analysiert [J. Sambrook, E. F. Fritsch, T. Maniatis, Molecular Cloning – A Laborstory Manual, 2. Auflage, Cold Spring Harbor Laborstory Press, New York, (1989)].
Die RAPD-Untersuchung unter Verwendung eines einzigen 10-Mer-Primers erzeugte ausgeprägte Bandmuster mit veränderlichen Intensitäten und einer Reihe von verstärkten Produkten auf 1% Agarosegel mit DNA-Proben von verschiedenen Lactobacillus-Referenz-Stämmen und dem Stamm KE01. Ein Vergleich der Fragmente der verschiedenen Arten auf dem Gel mit dem Referenz-Lactobacillus spp. wurde aufgezeichnet. Das Band-Muster mit der Dokumentation wie in 1 und Tabelle 2 wiedergegeben, dient dazu, den Stamm KE01 eindeutig zu identifizieren, und ergab eine genomische Fingerabdruck-Bibliothek. Basierend auf dem genomischen Fingerdruckverfahren wurde ein Dendogramm abgeleitet, wie in 2 dargestellt. Es wurde Ward's Cluster Method of Phylogenic Analysis verwendet. Das Verfahren minimiert die Quadratsumme von jeweils 2 Clustern, die bei jedem Schritt gebildet werden können, wobei Cluster mit kleiner Größe erzeugt werden. Basierend auf der phylogenen Analyse zeigte der Stamm KE01 eine 13%-ige Homologie mit Lactobacillus helvaticus ATCC15009 und eine 55%-ige Homologie mit Lactobacillus casei ssp. rhamnosus ATCC7469.
Eine reine Kultur von Stamm KE01 von Lactobacillus casei wurde bei der American Type Culture Collection, Bethesda, MD hinterlegt und erhielt die Nummer ATCC PTA-3945.
II. Beispiele der vorliegenden Erfindung
Größere Mengen des Stamms KE01 von Lactobacillus, die bei den folgenden Beispielen verwendet wurden, wurden unter Verwendung von herkömmlichen Fermentations-Verfahren in Massen hergestellt, wie sie dem Fachmann auf dem Gebiet der Fermentations-Mikrobiologie bekannt sind. Der gereinigte Stamm KE01 von Lactobacillus wurde dann bei der Zubereitung von verschiedenen Verabreichungssystemen einschließlich feiner Pulver, Breikapseln, Gel und trockenen Tierfutter-Mischungen in der folgenden Weise verwendet:
BEISPIEL 1
Zubereitung der den Stamm KE01 von Lactobacillus enthaltenden Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung
Zubereitung von gefriergetrocknetem KE01 zu einer feinen Pulverform
Eine reine Kultur von Lactobacillus KE01 (Starter), die bei –22°C gefroren gelagert worden war, wurde in einem Fermentationsnährlösungs-Medium wieder belebt, das Proteine, Vitamine, Mineralien und eine Kohlenwasserstoff-Quelle enthielt. Eine Saatkultur wurde in einem Fermenter zubereitet, der an ein NBS-1500 l-Fermentationsgefäß angeschlossen war. Die mikrobielle Reinheit wurde zu festgelegten Zeitpunkten (durch log-Phase und Endzyklus) während des Fermentationsvorganges überwacht. Die mikrobielle Masse wurde in einem hygienisch gereinigten Separator gesammelt und der Schlamm des Zellkonzentrats wurde nach einem Vermischen mit Trägern gefriergetrocknet, die eine Mischung von wasserfreier Dextrose und Trehalose enthielten. Es wurde eine sprühgetrocknete, mit geringer Hitze pasteurisierte, fettfreie Milch der Stufe A als Cryo-Schutz verwendet. Das gefriergetrocknete KE01-Konzentrat wurde zu feinem Pulver unter Verwendung einer hygienisch gereinigten Mahlausrüstung gemahlen. Die Qualität des KE01-Pulvers wurde hinsichtlich der Reinheit und der Lebensfähigkeit vor der Verwendung überprüft.
Einmischen von KE01-Pulver in Mischungen
Alle Vorgänge werden in einer Umgebung durchgeführt, die hinsichtlich der Temperatur (23,33°C bis 24,44°C) und der Feuchtigkeit (30% bis 40%) kontrolliert war. Das KE01-Pulver (ungefähr 10¹¹ CFU/g Lactobacilli) und andere in den unten angegebenen Zusammensetzungen aufgeführte Bestandteile wurden für eine Vermischung in ein geschlossenes System eingeführt. Eine serielle geometrische Verdünnung wurde durchgeführt, um eine homogene Verteilung aller Bestandteile sicherzustellen. Die Mischung erfolgt in einem Masseströmungs-Behälter-Trommelsystem mit einer auf den Kunden abgestimmten Geometrie, um eine Bett-Trennung und einen Querstrom sicherzustellen. Sobald sie gemischt sind, werden die Pulver in dem geschlossenen System gehalten, bis sie in 2,27 kg fassende Kübel verpackt wurden. Das gemischte Pulver wird in geeignete Behälter (Kübel, Einheitsdosis-Verpackungen usw.) mit Feuchtigkeitsabsorbierenden Verpackungsmaterialien oder inhärenten Dampfbarrieren-Eigenschaften verpackt und mit einem luftdichten Deckel verschlossen.
Für den Fachmann ist klar, dass der Ausdruck „ungefähr" verwendet wird, um eine vernünftige Fehlergröße zuzulassen, die beim Abwiegen und der Herstellung von Massenmaterialien unweigerlich auftritt. So wie er hier verwendet wird, beschreibt der Ausdruck „ungefähr" einen Fehlerfaktor von 0,1 bis 0,5%. Darüber hinaus wird vom Durchschnittsfachmann ohne weiteres verstanden, dass die Menge von Materialien, die zur Zubereitung einer endgültigen Zusammensetzung verwendet werden, insgesamt 100% ergeben müssen und den Wert 100% nicht übersteigen können. Alle Prozentsätze sind Gew.-%. Beispielsweise umfasst, ohne das dies als Einschränkung zu verstehen ist, bei einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung die gemäß den Lehren der vorliegenden Erfindung hergestellte probiotische Zusammensetzung ungefähr 1 bis 5% KE01-Pulver mit ungefähr 10⁵ bis 10¹¹ CFU von KE01 pro Gramm und von 95% bis 99% reaktionsträge oder aktive Bestandteile, die aus der folgenden, nicht einschränkend zu verstehenden Gruppe ausgewählt sind: Kohlehydrate, Lipide, Polypeptide, Fettsäuren, Pflanzenchemikalien und Kombinationen hiervon.
Kohlehydrate, die gemäß der Lehre der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, umfassen Monosaccharide, Disaccharide, Oligosaccharide und Polysaccharide wie z. B. (ohne hierauf beschränkt zu sein) Trehalose, Maltose, Sucrose, Dextrose, Lactose, Inulin, Ribose, Malzdextrin und dergleichen. Bei einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist das Disaccharid Trehalosedihydrat, das Oligosaccharid Fructooligosaccharid und das Polysaccharid Malzdextrin.
Geeignete Lipide umfassen, ohne hierauf beschränkt zu sein, Sojabohnenöl, Olivenöl, Palmkernöl, Erdnussöl, Walnussöl, Rapsöl und dergleichen. Geeignete Polypeptide umfassen Molkeprotein, Eieralbumin, Gelatine, Milchproteine und andere tierische und pflanzliche Proteine. Schließlich umfassen Pflanzenchemikalien, wie sie hier verwendet werden, Verbindungen wie Polyphenole, Saponine, Flavanoide, Monoterpene, Allylsulfide, Lycopene, Carotenoide, Polyacetylene, Silymarin, Glycyrrhizin-Catechine und andere.
Bei einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung hat die den Stamm KE01 von Lactobacillus casei enthaltende probiotische Mischung die folgenden Gew.-% von Bestandteilen: Tabelle 3: beispielhafte Mischung

feines KE01-Pulver ungefähr 1 bis 5%

Disaccharide ungefähr 25 bis 95%

Oligosaccharide ungefähr 0 bis 10%

Polysaccharide ungefähr 0 bis 50%
Zubereitung von KE01 in Breikapseln
Gefriergetrocknete, feines KE01-Pulver (ungefähr von 10⁵ bis 10¹¹ CFU/g Lactobacilli), Trehalosedihydrat (Lebensmittelqualität) und Dextrose (Lebensmittelqualität) oder Malzdextrin (Grain Processing Corp., Muscatine, IA)) wurden sorgfältig bei 3%:67%:30% gemischt. Die durchmischte Mischung wurde in Gelatinekapseln abgefüllt. Die Qualität der KE01-Breikapseln wurde vor der Verwendung hinsichtlich Reinheit und Lebensfähigkeit getestet. Tabelle 4 – Beispielhafte Brei-Mischung

feines KE01-Pulver 3%

Trehalosedihydrat (Cargil Foods, Blair, NE) 67%

Malzdextrin (Grain Processing Corp., Muscatine, IA) 30%

insgesamt 100%
Zubereitung von KE01 in Gel-Form

Gefriergetrocknetes feines KE01-Pulver (ungefähr 10⁵ bis 10¹¹ CFU/g Lactobacilli) wurde sorgfältig mit Fructooligosaccharid (pharmazeutische Qualität) bei einer Konzentration von 2,5% gemischt. Ein von nicht-genetisch veränderten Organismen extrudiertes bzw. gepresstes Sojabohnenöl wurde als primärer Träger verwendet. Das Gel wird sorgfältig durchmischt und die Proben wurden von der Oberseite, aus der Mitte und vom Boden der Chargen unter Verwendung einer sterilisierten Spatel gesammelt und hinsichtlich Reinheit und Lebensfähigkeit der KE01 analysiert. Das KE01-Gel wurde in Röhrchen mit 50 cm³ abgefüllt. Tabelle 5 – Beispielhafte Gel-Mischung

feines KE01-Pulver	3%
Trehalosedihydrat (Cargil Foods, Blair, NE)	62%
Fructo-oligosaccharid (Biomatrix, Minneapolis, MN)	5%
Malzdextrin (Grain Processing Corp., Muscatine, IA)	30%
insgesamt	100%

BEISPIEL 2
Zell-Anhaftungs-Studien
Es wurde eine in vitro durchgeführte Radio-Adhäsions-Untersuchung (RAA) durchgeführt, um die Anhaftung des Stammes KE01 von Lactobacillus zu messen, unter Verwendung der 24 Mulden (wells) umfassenden Cell Environments^TM Platte (Becton Dickinson, Bedford, Mass.), die Kollagen (Cn) vom Typ I, Cn vom Typ IV, Laminin oder Fibronectin enthielten und unter Verwendung der Caco-2-Zell-Monoschichten.
Zubereitung von KE01-Lactobacilli-Zellen
Eine 50 μl umfassende Beimpfung einer über Nacht angesetzten Kultur von KE01, die unter anaeroben Bedingungen in Bacto^® Lactobacilli MRS-Nährlösung (Difco) gewachsen war, wurde in 10 ml MRS-Nährlösung erneut beimpft, die ³H-Thymidin enthielt (20 μci). Man ließ die KE01-Zellen unter anaeroben Bedingungen bei 37°C bis zur exponentialen Phase (ungefähr 7 Stunden) wachsen, um eine optimale Aufnahme und Inkorporation des ³H-Thymidin in die bakterielle DNA zu ermöglichen. Mit ³H-Thymidin gekennzeichnete KE01 wurden durch Zentrifugation bei 7500 xg gesammelt, gewaschen und in Phosphat gepufferter Salzlösung gewaschen (PBS, pH-Wert 7,2). Die bakterielle Zellendichte wurde optisch auf 10 Lactobacilli/ml bei 600 nm eingestellt.
Radio-Adhäsions-Untersuchung (RAA)
Für sub-epitheliale Matrix-Wechselwirkungs-Untersuchungen wurde eine 24-Muldenplatte von Cell Environments^TM, die Kollagen (Cn) Typ I, Cn Typ IV, Laminin oder Fibronectin enthielten, verwendet, um die Anhaftung von KE01 zu testen. Die Matrix-Komponenten wurden als gleichmäßiger, optisch klarer Überzug aufgebracht, der eine Gesamtoberfläche von 1,75 cm² bedeckte. Es wurde auch Biocoat^® Matrigel-Matrix, eine lösliche Basismembran, die aus dem Engelbreth-Holm-Swarm-Mäusetumor extrahiert ist und dann, wenn sie bei Zimmertemperatur rekonstituiert wird, ein Gel bildet, bei den Wechselwirkungsstudien verwendet. 2 ml einer KE01-Suspension (2 × 10⁷ Lactobacilli) wurden zu jeder Mulde, die eine Matrixschicht enthielt, hinzu gegeben und bei Zimmertemperatur inkubiert. Nach einer Stunde wurde die KE01-Suspension aus den Mulden abgesaugt und weg gegossen. Ein Milliliter Trypsin Typ I (110 Enzymeinheiten; Sigma Chemicals, St. Louis, MO) wurden jeder Mulde hinzugefügt und man ließ sie 30 Minuten bei Zimmertemperatur hydrolysieren, um die Matrix-Proteinschicht frei zugeben. Das Trypsin-Hydrolysat wurde in Szintillationsfläschchen abgesaugt und ein weiterer Milliliter aus jeder Mulde wurde 10 Minuten lang bei Zimmertemperatur homogenisiert (Scintigest^TM; Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ),. Das Homogenisat wurde in das entsprechende Szintillationsfläschchen angesaugt. Ein Volumen eines 10 ml Szintillationscocktails (ScintiSafe^TM Gel, Fisher Scientific) wurde in das Fläschchen abgegeben und sorgfältig gemischt. Nach dem Absetzen und Klären der Mischung wurde die Radioaktivität unter Verwendung eines Flüssigkeits-Szintillations-Analysators (Tri-Carb 2100 TR^®, Packard Inc.) gemessen.
Für Untersuchungen der Wechselwirkung mit eukaryotischen Zellen, Cacao-2, wurde eine Darmkrebs-Zelllinie in Gewebekulturplatten mit 24 Mulden über 72 Stunden in einem CO₂-Inkubator unter Verwendung von Eagle's Minimal essential Medium (ergänzt mit 1% nicht essentiellen Aminosäuren und 10% fötalem Kälberserum) wachsen gelassen, bis sie zu einer Monoschicht zusammen wuchs. Nachdem vollständige Monoschichten erreicht worden waren, wurde jede Platte zweimal mit durch Phosphat gepufferter Salzlösung (PBS, pH-Wert 7,2) gewaschen. Ein 2 ml umfassendes Volumen (ungefähr 2 × 107 Bakterien) von mit ³H-Thymidin gekennzeichneter Lactobacilli-Suspension wurde zu jeder Mulde hinzu gegeben, die ungefähr 10⁵ Caco-2-Zellen enthielt. Das Verhältnis zwischen Caco-2-Zellen und Lactobacilli wurde bei 1:200 gehalten. Nach einer einstündigen Inkubation bei 37°C wurde die bakterielle Suspension abgesaugt und die Mulden wurden mit PBS gewaschen. Jede Mulde wurde mit Trypsin vom Typ I, Gewebe, Homogenisator behandelt und hinsichtlich der Radioaktivität gemessen, wie oben beschrieben. Die Bindung wurde in gebundenen Lactobacilli pro cm² biologischer Oberfläche ausgedrückt (für subepitheliale Matrix-Protein-Wechselwirkungen) oder pro Zelle (für Caco-2-Zell-Wechselwirkungen).

Die Wechselwirkung von KE01 mit verschiedenen Biomatrix-Schichten wurde ebenfalls mit den Wechselwirkungen von drei ATCC-Referenz-Stämmen, L. casei ATCC393, L. reuteri ATCC23272 und L. rhamnosus ATCC7469 in Tabelle 6 verglichen. Um die Signifikanz zu ermitteln, wurden die Bindungsdaten mit einer 4 × 6 faktoriellen Varianzanalyse analysiert (SAS Inc. Raleigh, NC). Tabelle 6

Biomatrix-Schicht	KE01	L. casei ATCC 393	L. reuteri ATCC23272	L. rhamnosus ATCC7469
Kollagen Typ I	7,4 × 10⁶/cm²	3,5 × 10⁵/cm²	3,0 × 10⁵/cm²	4,7 × 10⁵/cm²
Kollagen Typ II	5,0 × 10⁶/cm²	8,7 × 10⁴/cm²	6,3 × 10⁴/cm²	9.9 × 10⁴/cm²
Laminin	4,1 × 10⁶/cm²	6,4 × 10⁴/cm²	5,3 × 10⁴/cm²	7,2 × 10⁴/cm²
Fibronectin	5,3 × 10⁶/cm²	6,4 × 10⁴/cm²	9,5 × 10⁴/cm²	1,6 × 10⁴/cm²
Matrigel^TM	6,6 × 10⁶/cm²	2,1 × 10⁵/cm²	1,7 × 10⁵/cm²	2,8 × 10⁵/cm²
Caco-2-Monoschicht	108/Zelle	40/Zelle	26/Zelle	64/Zelle

KE01 zeigte eine heftige Bindung an Kollagen Typ I, Kollagen Typ IV, Laminin und Fibronectin und Matrigel^TM-Schichten in vitro. Die KE01-Bindung an Caco-2-Zell-Monoschichten betrug ungefähr 54% (108 Lactobacilli/Zelle). Alle der in vitro erfolgenden Wechselwirkungen von KE01 mit sub-epithelialen Matrix-Schichten und Caco-2-Zell-Monoschichten waren signifikant höher als die der ATCC-Referenz-Stämme L. casei ATCC393 (p < 0,0001), L. reuteri ATCC23272 (p < 0,0001) und L. rhamnosus ATCC7469 (p < 0,0001).
BEISPIEL 3

Studien bezüglich der Störung des Anhaftens von enterischen pathogenen Zellen Die Wirksamkeit von KE01 zum Hemmen der Anhaftung von enterischen Pathogenen (aufgeführt in Tabelle 7) an Biomatrizen und zum Ablösen von Komplexen von pathogenen Biomatrizen. Tabelle 7

Enteropathogene	Quelle
Escherichia coli ATCC43888	Enterotoxigenes Isolat, das weder shiga-artiges Toxin (SLT)-I noch SLT-II erzeugt
Escherichia coli ATCC43889	Fäkalien-Isolat von einem Patienten mit einem hämolytisch-uremischen Syndrom, das SLT-II erzeugt
Escherichia coli ATCC43890	Enterotoxigenes Isolat, das SLT-I erzeugt
Escherichia coli ATCC43894	Fäkalien-Isolat von einem Ausbruch von hämorrhager Kolitis, das sowohl SLT-I als auch SLT-II erzeugt
Escherichia coli ATCC43895	Isolat von rohem Hamburger Fleisch, das bei einem Ausbruch von hämolytischer Kolitis beteiligt war und von dem bekannt ist, dass es SLT-I und SLT-II erzeugt
Enterococcus faecalis ATCC7080	Isolat von Fleisch, das bei einer Lebensmittelvergiftung eine Rolle spielte
Campylobacter coli ATCC33559	Isolat aus Schweinemist
Campylobacter jejuni ATCC29428	Isolat aus Durchfalls-Stuhlgang eines Kindes
Salmonella enteritidis ATCC4931	Isolat aus einer menschlichen Gastroenteritis
Salmonella pullorum ATCC13036	Isolat aus Eiern

Anhaftungs-Ablösungs-Untersuchung
Eine 10 μl umfassende Beimpfung von einer Übernacht stehen gelassenen Kultur von E. coli O 157:H7, gewachsen in einer tryptischen Sojanährlösung (TSB) oder der anderen aufgeführten Pathogene, die in einem geeigneten Nährlösungsmedium gewachsen waren, wurden in 3 ml TSB oder einem entsprechenden geeigneten Medium erneut beimpft, das ³H-Thymidin enthielt 820 μci). Die Bindung von bakteriellen Pathogenen an Biocoat^®-Platten, die Kollagen (Cn) Typ I, Cn Typ IV, Laminin, Fibronectin und Matrigel-Oberflächen aufwiesen, wurde wie im Beispiel 1 beschrieben durchgeführt. Zu diesen Biocoat^® bakteriellen Pathogenkomplexen wurde ein 2 ml betragendes Volumen einer nicht markierten KE01-Suspension (2,0 × 10⁷ Lactobacilli/ml) zu jeder Mulde hinzu gegeben und 1 Stunde lang bei Zimmertemperatur inkubiert. Die KE01-Lactobacilli-Suspension wurde von der Mulde abgesaugt. Die folgenden Schritte der Freisetzung des Inhaltes der Mulden und die Messung der Radioaktivität wurden gemäß dem im Beispiel 2 beschriebenen Protokoll durchgeführt. Der Unterschied der bakteriellen Zellen-Zahlen in Mulden mit anhaftenden Pathogenen mit und ohne KE01-Behandlung wurden als logarithmische Ablöse-Werte Log₁₀ ausgedrückt.
Anhaftungs-Hemmungs-Untersuchung
Die Bindung von nicht markiertem KE01 an Biocoat®-Platten, die Kollagen (Cn) Typ-I, Cn Typ IV, Laminin, Fibronectin und Matrigel-Oberflächen aufwiesen, wurde wie im Beispiel 2 beschrieben durchgeführt. Zu diesem Biocoat^®-KE01-Komplex wurde ein 2 ml betra gendes Volumen von mit ³H-Tymidin markierten E. coli oder einer anderen bakteriellen Pathogensuspension (2,0 × 10⁷ Bakterien/ml) zu jeder Mulde hinzu gegeben und 1 Stunde lang bei Zimmertemperatur inkubiert, und die Suspension wurde abgesaugt. Die folgenden Schritte zur Freisetzung des Inhalts in den Mulden unter Messung der Radioaktivität wurden gemäß dem im Beispiel 2 beschriebenen Protokoll durchgeführt. Biocoat^®-Mulden, die nicht mit KE01 behandelt worden waren, dienten als Adhäsions-Kontrolle für E. coli oder andere Pathogene. Die Verminderung in der Anhaftung von bakteriellen Pathogenen an Biomatrizen, die mit KE01 vorbehandelt worden waren, wurden als „Log₁₀-Hemmungs"-Werte ausgedrückt.

Die Ergebnisse der hemmenden und ablösenden Wirkungen von KE01 auf E. coli O157:H7 (Stamm ATCC43895)-Wechselwirkungen mit Biomatrizen und Matrigel^TM-Biocoat^®-Oberflächen sind in Tabelle 8 dargestellt. Tabelle 8

Biomatrix-Schicht	E. coli gebunden (Bakterien/cm²)	KE01 Einflüsse auf die Wechselwirkungen von E. coli
Biomatrix-Schicht	E. coli gebunden (Bakterien/cm²)	E. coli/cm² (log₁₀ Hemmung)	E. coli/cm² (log₁₀ Ablösung)
Kollagen Typ I	6,2 × 10⁶	3,3 × 10³ (3,3-log)	6,7 × 10² (3,9-log)
Kollagen Typ IV	2,9 × 10⁵	1,8 × 10³ (2,1-log)	1,1 × 10³ (2,2-log)
Fibronectin	7,6 × 10⁵	4,4 × 10³ (2,3-log)	5,8 × 10³ (2,1-log)
Laminin	1,4 × 10⁵	9,2 × 10² (2,2-log)	3,7 × 10² (2,7-log)
Matrigel^TM	9,1 × 10⁶	8,2 × 10³ (3,1-log)	6,4 × 10³ (3,3-log)

KE01 zeigte eine heftige Bindung an alle getesteten Bio-Oberflächen, doch war die Wechselwirkung mit Kollagen vom Typ I und Matrigel^TM signifikant höher. KE01 bewirkte eine > 3-log-Hemmung von E. Coli O157:H7 Anheftung an Kollagen vom Typ I und Matrigel^TM und eine > 2-log-Hemmung mit Kollagen vom Typ IV, Fibronectin und Laminin-Wechselwirkungen. Die Wirksamkeit der Ablösung von anhaftenden E. coli durch KE01 lag in der gleichen log-Größenordnung wie die Hemmungswerte.

Das Spektrum der Wirksamkeit von KE01 zur Hemmung von Bindung und zum Ablösen von anhaftenden Bakterien wurde mit mehreren in Tabelle 9 aufgeführten enterischen Pathogenen getestet. Tabelle 9

Enteropathogene	Bindung (Bakterien/cm²)	Einfluss des Stammes KE01 auf die Bindung
Enteropathogene	Bindung (Bakterien/cm²)	Log₁₀-Hemmung	Log₁₀-Ablösung
Escherichia coli ATCC43888	1,9 × 10⁶	3,5-log	3,8-log
Escherichia coli ATCC43889	9,1 × 10⁶	2,9-log	3,1-log
Escherichia coli ATCC43890	1,0 × 10⁷	4,2-log	4,4-log
Escherichia coli ATCC43894	8,4 × 10⁶	3,2-log	3,2-log
Enterococcus faecalis ATCC7080	2,6 × 10⁶	2,8-log	3,7-log
Campylobacter coli ATCC33559	7,5 × 10⁶	3,6-log	3,5-log
Campylobacter jejuni ATCC29428	8,1 × 10⁶	3,3-log	3,5-log
Salmonella enteritidis ATCC4931	3,4 × 10⁷	4,1-log	3,9-log
Salmonella pullorum ATCC13036	9,6 × 10⁶	3,9-log	4,0-log

KE01 hemmte in wirksamer Weise die Wechselwirkungen von Enteropathogenen in einem Bereich von 2,8-log (mit Enterococcus faecalis) bis 4,2-log (mit Salmonella enteritidis). Im Vergleich war die Wirksamkeit von KE01 zum Ablösen von Enteropathogenen höher und lag in einem Bereich von 3,1-log (mit enterohämorrhagischen E. coli ATCC43889) bis 4,4-log (mit enterohämorrhagischen E. coli ATCC43890).
BEISPIEL 4
Wirksamkeit von feinem KE01-Pulver beim Ablösen von anhaftenden enterischen Pathogenen

Die Wirksamkeit von feinem KE01-Pulver zum Ablösen von anhaftenden enterischen Pathogenen wurde in einem Zellensystem unter Verwendung von Caco-2-Monoschichten getestet. Die Caco-2-Zell-Adhäsions-Untersuchung für Enteropathogene wurde in der Weise durchgeführt, wie dies für KE01 im Beispiel 2 beschrieben wurde. Die Adhäsions-Ablösungs-Untersuchung wurde durchgeführt, wie dies für die Biomatrix-Schichten im Beispiel 3 beschrieben wurde. Bei den beiden obigen Protokollen wurde jedoch das KE01-Pulver als 1%-ige Lösung verwendet (1 g feines Pulver suspendiert und sorgfältig durchmischt in 100 ml physiologischer Salzlösung, pH-Wert 7,2). Eine Behandlung mit physiologischer Salzlösung wurde als Kontrolle verwendet und der Wert wurde bei der Interpretation des Ergebnisses als Hintergrundswert abgezogen. Die Daten sind in Tabelle 10 wiedergegeben. Tabelle 10

Enteropathogene	Unbehandelte Bakterien/Mulde (/Zelle)	mit KE01-behandelte Bakterien/Mulde (/Zelle)	Ablösung Log₁₀ (%)
Escherichia coli ATCC43888	1,1 × 10⁶ (15)	7,3 × 10⁴ (0,97)	1,3-log (93,5%)
Escherichia coli ATCC43889	5,1 × 10⁶ (68)	2,2 × 10⁴ (0,29)	2,3-log (99,6%)
Escherichia coli ATCC43890	5,7 × 10⁶ (76)	8,3 × 10³ (0,11)	2,7-log (99,8%)
Escherichia coli ATCC43894	4,8 × 10⁶ (64)	1,9 × 10⁴ (0,25)	2,3-log (99,6%)
Escherichia coli ATCC43895	6,2 × 10⁶ (83)	3,8 × 10⁴ (0,51)	2,2-log (99,4%)
Enterococcus faecalis ATCC7080	1,9 × 10⁶ (22)	5,5 × 10⁴ (0,73)	1,6-log (96,7%)
Campylobacter coli ATCC33559	4,3 × 10⁶ (57)	7,1 × 10⁴ (0,95)	1,7-log (98,3%)
Campylobacter jejuni ATCC29428	4,1 × 10⁶ (55)	6,5 × 10⁴ (0,87)	1,8-log (98,4%)
Salmonella enteritidis ATCC4931	6,6 × 10⁶ (88)	8,3 × 10³ (0,11)	2,8-log (99,9%)
Salmonella pullorum ATCC13036	6,7 × 10⁶ (89)	7,9 × 10³ (0,10)	3,1-log (99,9%)

Die Caco-2-Zell-Adhäsions-Profile von Enteropathogenen lagen im Bereich von 1,1 × 10⁶ (15 Bakterien pro Caco-2-Zelle mit enterohämorrhagischen E. coli ATCC43888) bis 6,7 × 10⁶ (89 Bakterien pro Caco-2-Zellen mit Salmonella pullorum ATCC13036). KE01 hat in wirksamer Weise die an den Caco-2-Zellen anhaftenden enteropathogenen Komplexe mit einer Ablösewirksamkeit abgetrennt, die in einen Bereich von 1,3-log (93,5%) bis 3,1-log (99,9%) für E. coli ATCC43888 bzw. Salmonella pullorum lagen.
BEISPIEL 5
Demonstration der Fähigkeit von frischen und gefriergetrockneten KE01-Zubereitungen zum Anhaften und Besiedeln der epithelialen Schleimhaut des Rinder-Darmtraktes.
Rinder-Darm-Adhäsions-Untersuchung
Darm-Proben wurden von frisch geschlachteten Tieren genommen und in gekühltem Zustand in das Labor transportiert. Die Därme wurden aufgeschnitten und die epitheliale Schleimhaut des Lumens wurde sanft gewaschen, um Fäkalreste zu entfernen. Jeweils eine 6,452 cm² große Schleimhautoberfläche wurde mit zwei verschiedenen Zubereitungen von KE01 beimpft: A) Mit dem mit ³H-Thymidin markierte KE01, wie im Beispiel 2 beschrieben (0,1 ml Beimpfung, die ungefähr 10⁷ Lactobacilli enthielten), und B) mit einer KE01-Pulver-Mischung wie im Beispiel 1 beschrieben (homogen suspendiert in physiologischer Salzlösung und verdünnt, 0,1 ml Beimpfung enthielten ungefähr 10⁷ Lactobacilli). Bei einer 2-stündigen Inkubation wurde die Fläche der Beimpfung sanft dreimal mit physiologischer Salzlösung gewaschen.
Die Probenzubereitung A wurde bezüglich der KE01-Anhaftung untersucht. Die Fläche der Beimpfung wurde herausgeschnitten, mit Gewebe-Homogenisator aufgelöst, mit flüs sigem Szintillationsfluid verstärkt und die Radioaktivität wurde entsprechend dem Radio-Adhäsions-Test gemessen, wie er im Beispiel 2 beschrieben ist. KE01 zeigte eine starke Bindung an die epitheliale Rinderdarm-Schleimhaut, d. h. ungefähr 2,5 × 10⁶ Lactobacilli/6,452 cm².
Die Probenzubereitung B wurde bezüglich der KE01-Besiedelung mit Hilfe von Rasterelektronen-Mikroskopie bewertet (SEM). Die Proben wurden mit 2% OsO4 30 bis 60 Minuten lang behandelt und mit Wasser gespült. Die Proben wurden jeweils 5 Minuten lang mit 50%, 70% und 95% Ethanol behandelt, worauf 2 mal für 10 Minuten eine Spülung mit 100% Ethanol folgte. Nach einer bis zum kritischen Punkt erfolgenden Trocknung mit flüssigem Kohlenstoffdioxid wurden die Proben montiert und in einem Sputter-Vorgang mit Gold-Palladium beschichtet. Die Biopsie-Proben wurden unter Verwendung eines JEOL6300-Raster-Elektronenmikroskops untersucht. Die mikroskopischen Aufnahmen sind in den 3 und 4 dargestellt.
BEISPIEL 6
In vivo auftretende probiotische Effekte von KE01 enthaltenden Tierfutter-Ergänzungsmitteln, die an Ferkel verabreicht wurden. Demonstration der Besiedelung des Darms und der Ausscheidung von KE01 in den Fäkalien-; Fähigkeit von KE01, den Fäkaliengeruch von Schweinen zu vermindern (Verminderung des Sulfid- und Ammoniak-Gehalts der Fäkalien); und Beitrag von KE01 zur Gewichtszunahme der Tiere
Dosierung der Futter-Ergänzungsmittel
Die Dosierung der Futter-Ergänzungsmittel wurde in Form eines Gels zubereitet, wie dies im Beispiel 1 beschrieben ist. Kurz gesagt, wurde feines, gefriergetrocknetes KE01-Pulver (ungefähr von 10⁵ bis 10¹¹ CFU/g Lactobacilli) mit Fructooligosaccharid (FOS) bei einer Konzentration von 2,5% gemischt. Ein von genetisch nicht modifizierten Organismen extrudiertes bzw. gepresstes Sojabohnenöl wurde als primärer Träger verwendet. Das Gel wird sorgfältig gemischt und es wurden Proben von der Oberseite, aus der Mitte und vom Boden der Charge unter Verwendung einer sterilisierten Spatel gesammelt und hinsichtlich der Reinheit und der Lebensfähigkeit der KE01 analysiert. Das KE01-Gel wurde in 50 cm² fassende Röhrchen für die Verwendung aufgefüllt. Kontrollfutter-Dosierungen, die nur den Träger enthielten, sowie Träger mit KE01-Zellen gemischt und Träger gemischt mit KE01-Zellen und FOS wurden ebenfalls zugeleitet.
Tierfutter-Ergänzungsmittel-Versuch
Die Studie umschloss insgesamt 20 Schweine (zwischen 6 und 8 Wochen alt), die ein Gewicht im Bereich von 18 bis 27 kg besaßen. Diese Tiere wurden in vier Gruppen unterteilt, von denen jede 5 Tiere enthielt und die in der folgenden Weise kategorisiert wurden:

Gruppe 1 (Kontrolle): Tiere, die mit 10 cm³ Gel gefüttert wurden, das nur den primären Träger enthielt.
Gruppe 2: Tiere, die täglich mit 10 cm³ Gel gefüttert wurden, das nur 2,5% FOS vermischt mit dem primären Träger enthielt.
Gruppe 3: Tiere, die täglich mit 10 cm³ Gel gefüttert wurden, das ungefähr 10¹⁰ cfu/cm³ der Stamm-KE01-Zellen gemischt mit dem primären Träger enthielt,
Gruppe 4: Tiere, die täglich mit 10 cm³ Gel gefüttert wurden, das eine Kombination von 10¹⁰ cfu/cm³ Zellen des Stammes KE01 und 2,5% FOS gemischt mit dem primären Träger enthielt.

Die Tiere wurden nach Gruppen getrennt und in isolierten Pferchen gehalten und wurden regelmäßig mit einem Schweinefutter mit hohem Proteingehalt gefüttert. Die vier Gruppen von Tieren wurden täglich mit 10 cm³ ihrer jeweiligen Kategorie von Futter-Ergänzungs-Dosierungen gefüttert. Das Experiment wurde über sechs Wochen hinweg geführt. Eine Analyse der Fäkalien und Messungen des Körpergewichts wurden regelmäßig jede Woche während des Futter-Ergänzungsmittel-Versuches ausgeführt.
Sammeln der Fäkalien
Fäkalien-Proben (ungefähr 20 g pro Tier) wurden in sterile 50 cm³ fassenden Polystyren-Röhrchen gesammelt. Die Proben wurden in 1:1 Gew./Vol.-Verhältnis in normaler Salzlösung verdünnt, in einem Wirbelmischer sorgfältig homogenisiert und bei 2 K × g 5 Minuten lang zentrifugiert. Der Überstand wurde sorgfältig abgegossen und einer mikrobiologischen und chemischen Analyse unterzogen.
Die Fäkalien-Proben wurden einen Tag vor dem eigentlichen Futter-Ergänzungsmittel-Versuch gesammelt, um einen Ausgangspunkt für die mikrobiologischen Zählungen (fäkale Coliformen und fäkale Lactobacilli) und einen Ausgangspunkt für den fäkalen Ammoniak- und Sulfid-Gehalt zu erhalten.
Mikrobiologische Analyse der Fäkalien
Die Fäkalienlösung (1:1 Gew./Vol., abgegossener Überstand) wurde seriell jeweils 10-fach in normaler Salzlösung verdünnt. Die ausgewählten Verdünnungen wurden 2-fach auf MRS-Agar (Difco) für eine Gesamtzählung der Lactobacilli und auf MacConkey-Agar (Difco) für eine Coliform-Gesamtzählung unter Verwendung einer Autoplate^® 4000-Vorrichtung aufgebracht (Spiral Biotech, Norwood, MA). Das Aufbringen erfolgte in einer exponentiellen log-Verdünnungs-Einstellung am Spiral-Autoplater. Die Agar-Platten wurden für den MacConkey-Agar bei 37°C und für den MRS-Agar bei 32°C 24 bzw. 48 Stunden lang inkubiert. Die Kolonie-Gesamtzählwerte wurden unter Verwendung einer automatisierten Infrarot-Q-Zählvorrichtung/Spiral Biotech, Norwood, MA) abgeschätzt. Die Daten wurden als Bakterien pro Gramm Fäkalien ausgedrückt und die Ergebnisse sind die Lactobacilli-Zählwerte in 5 und für die fäkalen Coliform-Zählwerte in 6 dargestellt.
Tiere, denen Futter-Ergänzungsmittel verabreicht worden waren, die KE01 und eine Kombination von KE01 und FOS enthielten, zeigten eine ungefähr 2,5-log Erhöhung hinsichtlich der fäkalen Ausscheidung von Lactobacilli im Vergleich zu den Kontrollgruppen, was auf eine Vermehrung und Besiedelung des Stammes KE01 im Magen-Darmtrakt der Schweine hinwies, wie in 5 dargestellt. Auf der anderen Seite nahmen die fäkalen Coliform-Zählwerte um ungefähr 2,5-log bei Tieren, die mit KE01 und KE01 plus FOS gefüttert worden waren, ab im Vergleich zu Kontrolltieren, was auf einen wirksamen Konkurrenz-Ausschluss durch den Stamm KE01 im Schweinedarm hinwies, wie in 6 dargestellt.
Sulfid- und Ammoniak-Analyse von Fäkalien
Die Sulfid- und Ammoniak-Pegel in den Fäkalien wurden mit ionen-selektiven Elektroden unter Verwendung eines MP230 pH/Ionen-Meters (Mettler Toledo, Columbus, Ohio) gemessen.
Zur Standardisierung einer für Sulfid-Ionen selektiven Elektrode wurde eine 75 ml Verdünnungs-Sulfid-Standard-Lösung (10 ppm) unter sanftem Rühren einem 25 ml betragenden Sulfid-Antioxidantien-Puffer hinzu gegeben. Das Elektrodenpotential (E₁) der Lösung wurde unter Verwendung einer für Silber selektiven DX232-Elektrode kombiniert mit einer DX200-Referenz-Elektrode gemessen. Das E₂ wurde getrennt mit 75 ml Sulfidlösung (100 ppm) und 25 ml Sulfid-Antioxidantien-Puffer gemessen. Die Differenzen zwischen E₁ und E₂ bildeten die Steigung für die Sulfid-Elektrode. Für eine Probenmessung wurden 100 ml einer Standard-Silberlösung (100 ppm) mit 2 ml Bromid-ISA (Ionenstärken-Einstellung)-Puffer gemischt und der E₁-Wert wurde gemessen. Der E₂-Wert wurde durch Mischen einer 10 ml betragenden Fäkalien-Lösung zu der obigen Lösung gemessen. Die Differenz zwischen E₁ und E₂ wurde als ΔE betrachtet. Basierend auf der Standardsteigung und ΔE wurde die Konzentration von Sulfid in den Fäkalien entsprechend dem Konzentrationsverhältnis-Chart (Q) unter Verwendung der Gleichung C = C_S × Q abgeschätzt (C = Sulfidkonzentration in den Fäkalien; C_S = bekannte Sulfidkonzentration, d. h. 100 ppm Standard und Q = Konzentrationsverhältnis).
Für die Standardisierung der für Ammoniak-Ionen selektiven Elektrode wurde eine 1 ml betragende Ammoniak-Standardlösung (1000 ppm) unter sanftem Rühren zu 100 ml destilliertem Wasser vorgemischt mit 2 ml Ammoniak pH/ISA (Ionenstärken-Adjustment)-Puffer hinzu gegeben. Das Elektrodenpotential (E₁) der Lösung wurde unter Verwendung einer Ammoniak-DX217-Elektrode gemessen. Die Lösung wurde dann mit 10 ml Ammoniak-Standard gespiked (1000 ppm) und es wurde die Änderung des Elektrodenpotentials (E₂) gemessen. Die Differenz zwischen E₁ und E₂ bildete die Steigung für die Ammoniak-Elektrode. Für die Probenmessung wurden 10 ml einer Fäkalienlösung unter sanftem Rühren zu 90 ml destilliertem Wasser hinzu gegeben, das mit 2 ml Ammoniak-pH/ISA- Puffer vorgemischt war und der E₁-Wert wurde gemessen. Die Fäkalienlösung wurde mit Ammoniak-Standard gespiked und der E₂-Wert wurde gemessen. Die Konzentration des Ammoniaks in den Fäkalien wurde unter Verwendung der obigen Gleichung abgeschätzt.
Tiere, denen Futtermittel-Ergänzungsmittel verabreicht worden waren, die KE01 und KE01 plus FOS enthielten, zeigten eine markante Verminderung des Ammoniaks um ungefähr 35 ppm/g und von Sulfid um ungefähr 375 ppm/g im Vergleich zur Kontrollgruppe von Tieren, wie in den 7 und 8 dargestellt. Auch waren die Fäkalien von Tieren, die mit KE01 und KE01 plus FOS gefüttert worden waren, ranzig aufgrund der Milchsäureproduktion durch die sich vermehrenden probiotischen KE01-Lactobacilli.
Messungen der Körpergewichtszunahme der Tiere
Die Tiere wurden einen Tag vor dem eigentlichen Futtermittel-Ergänzungsmittel-Versuch gewogen, um Basis-Messwerte für die Körpergewichtszunahme zu erhalten. Die Körpergewichte der Tiere aus allen vier Gruppen wurden einmal pro Woche während des 6-wöchigen Futtermittel-Versuches gemessen. Beim Abschluss des Experimentes zeigten Tiere, die mit KE01 gefüttert worden waren, eine Körpergewichtszunahme von ungefähr 12,7 kg, und die Tiergruppe, die KE01 plus FOS erhalten hatte, zeigte eine Körpergewichtszunahme von 9 kg im Vergleich zur Kontrollgruppe von Tieren, wie in 9 dargestellt.

Claims

Probiotische Zusammensetzung, welche den Bakterienstamm Lactobacillus casei KE01 mit der ATCC-Zugangsnummer PTA-3945 umfasst, wobei dieser Bakterienstamm Lactobacillus casei KE01 von einer im Wesentlichen reinen Kultur abgeleitet ist.
Probiotische Zusammensetzung nach Anspruch 1, die weiterhin reaktionsträge oder aktive Bestandteile umfasst, die aus der Gruppe ausgewählt sind, die Carbohydrate, Polypeptide, Lipide, sekundäre Pflanzenstoffe und Kombinationen hiervon umfasst.
Probiotische Zusammensetzung nach Anspruch 2, bei der das Carbohydrat aus der Gruppe ausgewählt ist, die Monosaccharide, Disaccharide, Oligosaccharide, Polysaccharide und Kombinationen hiervon umfasst.
Probiotische Zusammensetzung nach Anspruch 3, bei der das Carbohydrat aus der Gruppe ausgewählt ist, die Trehalose, Maltose, Sucrose, Dextrose, Laktose, Inulin, Ribose und Kombinationen hiervon umfasst.
Probiotische Zusammensetzung nach Anspruch 3, bei welcher das Disaccharid Trehalosedihydratat ist.
Probiotische Zusammensetzung nach Anspruch 3, bei der das Oligosaccharid Fructo-Oligosaccharid ist.
Probiotische Zusammensetzung nach Anspruch 3, bei der das Polysaccharid Malzdextrin ist.
Probiotische Zusammensetzung nach Anspruch 2, bei der das Polypeptid aus der Gruppe ausgewählt ist, die Molkeprotein, Eialbumin, Gelatine, Milchproteine und Kombinationen hiervon umfasst.
Probiotische Zusammensetzung nach Anspruch 2, bei der das Lipid aus der Gruppe ausgewählt ist, die Sojabohnenöl, Olivenöl, Palmkernöl, Erdnussöl, Walnussöl, Rapsöl und Kombinationen hiervon umfasst.
Probiotische Zusammensetzung nach Anspruch 2, bei der der sekundäre Pflanzenstoff aus der Gruppe ausgewählt ist, die Polyphenole, Sapponine, Flavanoide, Monoterpene, Allylsulfide, Lykopene, Carotinoide, Polyacetylene, Silymarin, Glycyrrhizincatechine und Kombinationen hiervon umfasst.
Probiotische Zusammensetzung nach Anspruch 1, die weiterhin Trehalose umfasst.
Probiotische Zusammensetzung nach Anspruch 11, die weiterhin Malzdextrin umfasst.
Probiotische Zusammensetzung nach Anspruch 11, die weiterhin Fructo-Oligosaccharide umfasst.
Probiotische Zusammensetzung nach Anspruch 13, bei der der Bakterienstamm Lactobacillus casei KE01 in der Menge von ungefähr 10⁵ bis 10¹¹ koloniebildenden Einheiten (CFU) pro Gramm vorhanden ist.
Probiotische Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 14, bei welcher die probiotische Zusammensetzung ein Bolus, ein Gel oder eine Flüssigkeit für eine Verabreichung an ein Lebewesen ist.
Probiotische Zusammensetzung nach Anspruch 15, bei welcher das Lebewesen aus der Gruppe ausgewählt ist, die Menschen, Säugetiere, Fische, Vögel und Reptilien umfasst.
Probiotische Zusammensetzung nach Anspruch 16, bei denen das Säugetier aus der Gruppe ausgewählt ist, die Pferde, Hunde, Katzen, Kaninchen, Schafe, Schweine und Kühe umfasst.
Probiotische Zusammensetzung nach Anspruch 16, bei welcher der Vogel aus der Gruppe ausgewählt sind, die Hühnchen, Truthähne, Fasane, Wachteln, Sittiche und Papageien umfasst.
Probiotische Zusammensetzung nach Anspruch 15, bei welcher der Bolus aus der Gruppe ausgewählt ist, die Gelatinekapseln, gepresste Tabletten und Gelkapseln umfasst.
Probiotische Zusammensetzung nach Anspruch 19, bei der der Bolus in einem mit Polymer ausgekleideten Folienbeutel verpackt ist.
Probiotische Zusammensetzung, die Folgendes umfasst: den pulverförmigen Bakterienstamm Lactobacillus casei KE01 mit der ATCC-Zugangsnummer PTA-3945 in der Menge von ungefähr 1 bis 5 Gew.-%, ein Disaccharid mit ungefähr 25 bis 95 Gew.-%, ein Oligosaccharid mit ungefähr 0 bis 10 Gew.-% und ein Polysaccharid mit ungefähr 0 bis 50 Gew.-%.
Probiotische Zusammensetzung nach Anspruch 21, bei welcher der Bakterienstamm Lactobacillus casei KE01 mit der ATCC-Zugangsnummer PTA-3945 ungefähr 10⁵ bis 10¹¹ CFU pro Gramm aufweist und in der Menge von ungefähr 3 Gew.-% vorhanden ist.
Probiotische Zusammensetzung nach Anspruch 21, bei welcher das Disaccharid in der Menge von ungefähr 62 Gew.-% vorhanden ist.
Probiotische Zusammensetzung nach Anspruch 21, bei welcher das Oligosaccharid in der Menge von ungefähr 5 Gew.-% vorhanden ist.
Probiotische Zusammensetzung nach Anspruch 21, bei welcher das Polysaccharid in der Menge von ungefähr 30 Gew.-% vorhanden ist.
Probiotische Zusammensetzung nach Anspruch 21, bei welcher das Disaccharid Trehalose, das Oligosaccharid Fructo-Oligosaccharid und das Polysaccharid Malzdextrin ist.
Probiotische Zusammensetzung nach Anspruch 21, die Folgendes umfasst: ungefähr 3 Gew.-% des pulverförmigen Bakterienstamm es Lactobacillus casei KE01 mit der ATCC-Zugangsnummer PTA-3945, mit ungefähr 10⁵ bis 10¹¹ CFU pro Gramm, ungefähr 62 Gew.-% Trehalose, ungefähr 5 Gew.-% Fructo-Oligosaccharid, und ungefähr 30 Gew.-% Malzdextrin.
Verwendung der probiotischen Zusammensetzungen nach einem der Ansprüche 1 bis 27 bei der Herstellung eines Medikamentes zur Hemmung einer durch ein enterisches Pathogen verursachten Erkrankung bei einem Lebewesen.
Verwendung nach Anspruch 28, bei der das enterische Pathogen aus der Gruppe ausgewählt ist, die enteropathogene Escherichia Coli Bakterien (EPC), enterotoxigene E. Coli Bakterien (ETC), Salmonella enteriditis, Yersina pseudotuberculosis und Listeria monocytogenes umfasst.
Verwendung nach Anspruch 28, bei der das Lebewesen aus der Gruppe ausgewählt ist, die Menschen, Säugetiere, Fische, Vögel und Reptilien umfasst.
Verwendung nach Anspruch 30, bei der das Säugetier aus der Gruppe ausgewählt ist, die Pferde, Hunde, Katzen, Kaninchen, Schafe, Schweine und Kühe umfasst.
Verwendung nach Anspruch 30, bei der der Vogel aus der Gruppe ausgewählt sind, die Hühnchen, Truthähne, Fasane, Wachteln, Sittiche und Papageien umfasst.
Verwendung nach Anspruch 28, bei der die probiotische Zusammensetzung aus der Gruppe ausgewählt ist, die Gelatine-Kapseln, gepresste Tabletten, Gelkapseln, Tierfutter und flüssige Getränke umfasst.