DE60128914T2

DE60128914T2 - Antikörper menschlichen Ursprungs zur Hemmung der Thrombozytenaggregation

Info

Publication number: DE60128914T2
Application number: DE60128914T
Authority: DE
Inventors: Claudia Büttner; Meike Schwarz; Stefan Knackmuss; Karlheinz Peter; Peter Röttgen; Melvyn Little
Original assignee: Affimed Therapeutics AG
Current assignee: Affimed GmbH
Priority date: 2001-10-05
Filing date: 2001-10-05
Publication date: 2008-05-08
Anticipated expiration: 2021-10-06
Also published as: EP1300419A1; ATE364632T1; WO2003031476A1; DE60128914D1; JP2010029203A; US20070218067A1; EP1300419B1; JP2005514009A; US7812136B2; JP4504017B2; ES2288900T3

Description

Die vorliegende Erfindung ist auf einen Antikörper zum Hemmen einer Blutplättchenaggregation und auf ein Verfahren zum Identifizieren und/oder Isolieren eines derartigen Antikörpers gerichtet. Ferner betrifft die vorliegende Erfindung das DNA-Kodieren für diesen Antikörper und eine den Antikörper oder seine kodierende DNA enthaltende pharmazeutische oder diagnostische Zubereitung.
Blutplättchen bzw. Thrombozyten spielen auf dem Gebiet der Thrombose, des Herzinfarktes und der instabilen Angina eine entscheidende Rolle: Der Blutplättchenintegrinrezeptor GPIIb/IIIa ist von besonderer Bedeutung, da er die Blutplättchenaggregation durch Binden des bivalenten Plasmamoleküls Fibrinogen vermittelt. Dieser Rezeptor weist mindestens zwei Konformationszustände auf: 1) Einen nicht-aktivierten Zustand, bei dem es sich um den Grundzustand auf unstimulierten Blutplättchen handelt. In diesem nicht-aktivierten Zustand zeigt der Rezeptor eine sehr niedrige Affinität für seine Liganden und ist nicht imstande, eine Blutplättchenaggregation herbeizuführen. 2) Einen aktivierten Zustand, der nach der Blutplättchenaktivierung vorliegt, z.B. durch Thrombin. In diesem aktivierten Zustand hat GPIIb/IIIa eine Konformationsveränderung erfahren, was zu einer hochaffinen Bindung von Fibrinogen führt (Shatill et al., J. Biol. Chem. 1985; 260(20): 11107-11114).
Folglich ist die therapeutische Blockade von GPIIb/IIIa eine sehr effektive antithrombozytäre Strategie, da sie den letzten gemeinsamen Endpunkt der Blutkörperchenaktivierungskaskade beeinflusst. In den letzten Jahren wurden eine große Vielzahl von GPIIb/IIIa-Blockern entwickelt. Diese sind entweder chimäre murine/menschliche Fab-Fragmente eines GPIIb/IIIa-blockierenden monoklonalen Antikörpers (Abciximab) (Coller B. et al., J. Clin. Invest. 1983, 72: 325-338), zyklische Peptide (Eptifibatid) oder polyzyklische synthetische Peptidomimetika (z.B. Tirofiban) (Bhatt DL und Topol EJ. JAMA. 2000; 284(12):1549-58; Topol EJ et al., Lancet. 1999; 353(9148): 227-31). Diese Therapie hat sich zwar als effektiv erwiesen, doch bestehen in diesem Zusammenhang noch immer einige Probleme:

– Insbesondere bei der Therapie mit Abciximab liegt eine erhöhte Prävalenz von schwerer Thrombozytopenie vor (~ 1%) (Dasgupta H. et al., Am. Heart J. 2000; 140(2): 206-11).
– Aufgrund der teueren Herstellung sind die Therapiekosten beträchtlich, insbesondere für Abciximab. (Hillegass WB et al., Pharmacoeconomics. 2001; 19(1): 41-55).
– Blutungskomplikationen nehmen zu, und diese sind besonders gravierend, wenn GPIIb/IIIa-Blocker mit einer Thrombolyse kombiniert werden.
– Oral verabreichte synthetische GPIIb/IIIa-Blocker lieferten aufgrund ihrer pharmakokinetischen Eigenschaften, insbesondere einer eher niedrigen Affinität für den Rezeptor, enttäuschende Ergebnisse (Chew DP. et al., Circulation. 2001, 103(2): 201-206).
– Es gibt Anhaltspunkte dafür, dass GPIIb/IIIa-Blocker, insbesondere niedermolekulare Agenzien, nach der Bindung mit dem Rezeptor interagieren. Dies könnte zu einem paradoxen intrinsischen Aktivierungseffekt führen (Peter K. et al., Blood. 1998; 92(9): 3240-).
– Die Umkehrbarkeit der Wirkung von Abciximab ist sehr langsam (> 12 Stunden).
– Etwa 6% der mit Abciximab behandelten Patienten bilden chimäre Anti-Human-Antikörper (AHAC); 11% im Fall von wiederholt behandelten Patienten (Gawaz M., Therapie bei koronarer Herzerkrankung. Stuttgart, New York: Thieme, 1999).

Alle derzeit verwendeten GPIIb/IIIa-Blocker binden mit gleicher Affinität an den aktivierten und nicht-aktivierten Rezeptor. Ein aktivationsspezifischer Inhibitor könnte mehrere Vorteile bieten. Beispielsweise wäre die Blutplättchenadhäsion noch intakt, was zu einer Verringerung der Blutungsereignisse führen sollte. Zudem würden Wechselwirkungen mit dem nicht-aktivierten Rezeptor verhindert. Es wäre wünschenswert, einen kleineren GPIIb/IIIa-Blocker mit einer Antikörper-ähnlichen Affinität zu entwickeln, der bessere pharmakokinetische Eigenschaften zeigen sollte.
Eine andere Anwendung für einen aktivationsspezifischen Antikörper wäre die Detektion von aktivierten Blutplättchen, die in einer Vielzahl von Forschungs- und Diagnoseszenarien sehr nützlich ist.
Es ist daher die Aufgabe der vorliegenden Erfindung, einen Antikörper mit derart verbesserten Eigenschaften zu finden sowie Verfahren zur Identifizierung eines derartigen Antikörpers bereitzustellen.
Diese Aufgabe wird durch die Bereitstellung des Antikörpers gemäß dem unabhängigen Anspruch 1 gelöst. Weitere vorteilhafte Merkmale, Ausführungsformen und Aspekte der vorliegenden Erfindung werden bei Betrachtung der weiteren unabhängigen und abhängigen Ansprüche, der Beschreibung und der Zeichnungen besser verständlich.
Dementsprechend ist die Erfindung auf einen Antikörper menschlichen Ursprungs zum Hemmen einer Blutplättchenaggregation gerichtet, dadurch gekennzeichnet, dass er dadurch wirksam ist, dass er im Wesentlichen ausschließlich an den aktivierten Zustand eines Blutplättchenintegrinrezeptors GPIIb/IIIa bindet.
Die Begriffe Thrombozyt und Blutplättchen werden in dieser Schrift synonym verwendet. Der allgemeine Begriff „Blutplättchenintegrinrezeptor" bedeutet „Blutplättchenintegrinrezeptor GPIIa/IIIa".
Gemäß der vorliegenden Erfindung bindet der Antikörper an den Blutplättchenintegrinrezeptor GPIIb/IIIa (Alpha IIb/Beta 3) und hemmt die Bindung des natürlichen Liganden Fibrogen. Wie oben näher ausgeführt, ist dieser Rezeptor dadurch gekennzeichnet, dass er den Aggregationsprozess herbeiführt, wenn Fibrogen an ihn bindet. Durch Blockieren dieses Rezeptors ist eine Vernetzung unmöglich.
Aufgrund der selektiveren Wirkungen, die sich erhalten lassen, bindet der Antikörper „im Wesentlichen ausschließlich" an die aktivierte Konformation des Blutplättchenintegrinrezeptors. Dies bedeutet, dass seine Bindungsaffinität zur aktivierten Konformation des Blutplättchenintegrinrezeptors viel größer ist als seine jeweilige Affinität, an die inaktive Konformation des Blutplättchenintegrinrezeptors zu binden. Im besten Fall ist das Agens im Wesentlichen außer Stande, an die nicht-aktivierte Konformation des Integrinerzeptors zu binden.
In der vorliegenden Schrift sind mit dem Begriff „Antikörper" Immunoglobuline menschlichen Ursprungs gemeint. Bei dem Immunoglobulin kann es sich auch um ein Fragment menschlicher Immunglobuline handeln, das die variablen Domänen der schweren und leichten Kette umfasst. Bei dem Fragment kann es sich auch um ein einzelkettiges Antikörperfragment (scFv von engl. „single-chain antibody fagment"), Fab oder rekombinante Konstrukte und deren Derivate handeln. Es kann monovalent, bivalent oder multivalent sein.
Es kann im Vergleich zu echten Antikörpern Modifikationen seiner Aminosäuresequenz enthalten und eine modifizierte Domänenstruktur aufweisen. Es muss aber dennoch imstande sein, die typische, in nativen Antikörpern zu findende Domänenkonfiguration sowie eine Aminosäuresequenz anzunehmen, die hochspezifisch an Targets (Antigene) binden kann. Typische Beispiele für Antikörperderivate sind an andere Polypeptide gekoppelte Antikörper, umstrukturierte Antikörperdomänen oder Antikörperfragmente. Der Antikörper kann auch mindestens ein weiteres Kompositum wie beispielsweise eine Proteindomäne aufweisen, wobei die Proteindomäne durch kovalente oder nicht-kovalente Bindungen verknüpft ist. Die Verknüpfung kann auf einer Genfusion gemäß den in der Technik bekannten Verfahren basieren. Die im Fusionsprotein mit dem erfindungsgemäß eingesetzten Antikörper vorliegende zusätzliche Domäne kann durch einen flexiblen Linker, vorzugsweise einen Peptidlinker, verknüpft sein, wobei der Peptidlinker mehrere hydrophile, peptidgebundene Aminosäuren aufweist, die lang genug sind, um den Abstand zwischen dem C-Terminus der weiteren Proteindomäne und dem N-Terminus des Antikörpers oder umgekehrt zu überspannen. Das vorgenannte Fusionsprotein kann ferner einen spaltbaren Linker oder eine Spaltstelle für Proteinasen aufweisen. Somit könnte beispielsweise der Antikörper mit einem Effektormolekül verknüpft sein, das eine geeignete Konformation für eine biologische Aktivität oder für eine selektive Anbindung an einen festen Träger, eine biologisch aktive Substanz (z.B. ein Zytokin oder ein Wachstumshormon), einen chemischen Wirkstoff, ein Peptid, ein Protein oder einen Arzneistoff aufweist.
Der Antikörper der vorliegenden Erfindung ist menschlichen Ursprungs. Dies stellt ein besonders wichtiges Merkmal der Erfindung dar, da es die Verwendung derartiger Antikörper für eine Therapie menschlicher Patienten eröffnet, ohne dass die Gefahr von unerwünschten Immunreaktionen gegen andere „fremde" Antikörperarten besteht. Insbesondere sind die Gesamtstruktur/-sequenz und die konstanten Regionen des verwendeten Antikörpers menschlichen Ursprungs. Bei der Quelle des menschlichen Antikörpers kann es sich um eine Phagendisplaybibliothek natürlicher oder modifizierter menschlicher Antikörperfragmente handeln, die nach Antikörpern mit einer Thrombozytenaffinität durchsucht wird.
Vorzugsweise ist der Antikörper ein einzelkettiger Antikörper, in dem eine VH-Domäne mit einer VL-Domäne verknüpft ist. Der Begriff „verknüpft" bedeutet vorzugsweise eine Peptidbindung. Ein derartiger einzelkettiger Antikörper ist vorzugsweise ein rekombinanter scFv-Antikörper. Verfahren zum Erzeugen eines derartigen einzelkettigen Antikörpers mit den vorgenannten Eigenschaften oder von DNA-Sequenzen, die für einen derartigen Antikörper kodieren, dessen Expression in geeigneten Wirten und dessen Gewinnung und Aufreinigung sind beispielsweise in WO-A-89/0622 , WO-A-89/01783 , EP-A-0 239 400 , WO90/07861 und Colcher et al., Cancer Research 49 (1989), S. 1732-1745 beschrieben. Das eingesetzte scFv kann ein rekombinantes Konstrukt von einzelkettigen Antikörperfragmenten) sein, falls derartige Umstrukturierungen oder Veränderungen der Sequenz nötig sind, um das gewünschte Produkt zu erhalten. Der Fachmann kennt Verfahren, wie er die jeweiligen Immunoglobulindomänen modifizieren kann, beispielsweise über Aminosäure-Deletion, Insertionen, Substitutionen und/oder Rekombinationen. Verfahren zum Einbringen derartiger Modifikationen in die Kodiersequenz für die Immunoglobulinkette sind dem Fachmann bekannt (z. B. Sambroock et al., Molecular Cloning – A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor (1989), N.Y.). Andererseits kann das einzelkettige Antikörperfragment beispielsweise aus einem menschlichen IgM- oder IgG-Antikörper gewonnen werden. Alternativ können rekombinante BsAb oder Diabodies (die zwei vorzugsweise über einen Peptidlinker verknüpfte scFv-Fragmente enthalten) gebildet werden. Es ist auch vorteilhaft, Tandem-Diabodies durch Homodimerisation einzelkettiger Fragmente mit vier variablen Antikörperdomänen (VH und VL) zweier verschiedener Spezifitäten zu konstruieren.
Aufgrund der immensen Variabilität des Antikörperherstellungsprozesses im Lauf einer Immunantwort kann im allgemeinen eine große Anzahl verschiedener Sequenzen hergestellt werden, die sich zum Angreifen eines fremden Antigens eignen. Dem Fachmann ist klar, dass sich deshalb mehrere Ausführungsformen von Antikörpersequenzen auffinden lassen würden, um die Anforderungen der vorliegenden Erfindung zu erfüllen. Um ein geprüftes und wohlbewährtes Beispiel zu nennen, kann der erfindungsgemäße Antikörper dadurch gekennzeichnet sein, dass das Fragment eine Aminosäureregion umfasst, die das Translationsprodukt der Nukleinsäuresequenz aus 2 aufweist (SEQ. Nr. 1). In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform umfasst es die in 2 gezeigte Aminosäuresequenz oder es besteht aus der Aminosäuresequenz der 2. In einer weiteren Ausführungsform stellt die vorliegende Erfindung Nukleinsäuremoleküle bereit, die für ein Fragment, Derivat oder eine allelische Variation des obigen Polypeptids kodieren, die im Wesentlichen die gleichen Eigenschaften wie das der 2 aufweisen. Der Begriff „Derivat" bedeutet in diesem Zusammenhang, dass sich die Sequenzen dieser Moleküle in einer oder mehreren Positionen von den Sequenzen der Nukleinsäuremoleküle und/oder der Aminosäuresequenz der 2 unterscheiden, aber zu diesen Sequenzen einen hohen Homologiegrad aufweisen. Homologie bedeutet dabei eine Sequenzidentität von mindestens 60%, insbesondere eine Identität von mindestens 70 oder 80%, vorzugsweise von mehr als 90% und insbesondere bevorzugt von mehr als 95%. Die Abweichungen von den vorgenannten Nukleinsäuremolekülen oder Peptidmolkülen können durch Deletion, Substitutionen, Insertionen oder Rekombination hervorgerufen worden sein.
Ein anderes geeignetes Beispiel ist eine synthetische Bibliothek von Antikörpersequenzen. Das identifizierte Fragment umfasst eine CDR3-Domäne einer schweren Kette, die die Sequenz ELEAYCRGDCYPPYYG oder ein Derivat derselben mit einer vergleichbaren Struktur und vergleichbaren Eigenschaften enthält. Diese Sequenz hat sich als imstande herausgestellt, an den Integrinrezeptor zu binden, vielleicht weil es die Fibrinogenstruktur imitieren kann.
Eine weitere bevorzugte Ausführungsform betrifft die DNA-Sequenz, die für den einzelkettigen Antikörper kodiert. Diese DNA-Sequenzen können in einen Vektor oder Expressionsvektor eingefügt werden. Somit bezieht sich die vorliegende Erfindung auch auf Vektoren und Expressionsvektoren, die diese DNA-Sequenzen enthalten. Mit dem Begriff „Vektor" ist ein Plasmid (pUC18, pBR322, pBlueScript, etc.), ein Virus oder irgendein anderes geeignetes Vehikel gemeint. In einer bevorzugten Ausführungsform sind die DNA-Sequenzen funktionell mit regulatorischen Elementen verknüpft, die ihre Expression in prokaryotischen oder eukaryotischen Wirtszellen erlauben. Neben den regulatorischen Elementen (z.B. Promotor) enthalten derartige Vektoren einen Replikationsursprung und spezifische Gene, die die phänotypische Selektion einer transformierten Wirtszelle erlauben. Die regulatorischen Elemente für die Expression in Prokaryoten (z.B. E. coli) sind ein lac-, trp-Promotor oder T7-Promotor, und für die Expression in Eukaryoten ein AOX1- oder Ga1-Promotor (für die Expression in Hefen) und ein CMV-, SV40-, RVS-40-Promotor, CMV- oder SV40-Enhancer (für die Expression in Tierzellen). Weitere Beispiele für Promotoren sind Metallothein I und Polyhydrin-Promotor. Geeignete Expressionvektoren für E. coli sind pGEMEX, pUC-Derivate, pEXHAM und pGEX-2T. Geeignete Promotoren für die Expression in Hefe sind pY100 und Ycpad1 und für die Expression in Säugetierzellen pMSXND, pKCR, pEFBOS, cDM8 und pCEV4.
In der Technik bekannte allgemeine Verfahren können für die Konstruktion der Expressionsvektoren verwendet werden, die die DNA-Sequenzen der vorliegenden Erfindung und geeignete regulatorische Elemente enthalten. Beispiele für diese Techniken sind in-vitro-Rekombinationstechniken, synthetische Verfahren und in-vivo-Rekombinationstechniken (vgl. Sambrook et al., Molecular Cloning – A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor (1989), N.Y.). Die DNA-Sequenzen gemäß der vorliegenden Erfindung können auch in Kombination mit DNA-Sequenzen, die für andere, als Fusionsproteine zu exprimierende Proteine oder Peptide kodieren, in einen Vektor eingefügt werden.
Die vorliegende Erfindung betrifft ferner Wirtszellen, die diese Vektoren enthalten. Diese Wirtszellen sind beispielsweise Bakterien (z.B. die E. coli-Stämme XL1blue, HB101, DH1, x1776, JM101, JM109, BL21 und SG13009), Hefen (vorzugsweise S. cervisiae), Insektenzellen (vorzugsweise sf9-Zellen) und Tierzellen (vorzugsweise Säugetierzellen). Bevorzugte Säugetierzellen sind Myelomzellen, vorzugsweise murine Myelomzellen. Verfahren zum Transformieren dieser Wirtszellen, Verfahren zur phänotypischen Selektion von Transformanten und für die Expression der DNA-Sequenzen gemäß der vorliegenden Erfindung unter Verwendung der vorgenannten Vektoren sind auf dem vorliegenden technischen Gebiet bekannt.
Die vorliegende Erfindung bezieht sich ferner auf Verfahren für die rekombinante Herstellung des (einzelkettigen) Antikörpers unter Verwendung der oben genannten Expressionsvektoren. Dieses Verfahren umfasst die Kultivierung der vorgenannten Wirtszellen unter Bedingungen, die die Expression (vorzugsweise stabile Expression) des Proteins (oder Fusionsproteins) und die Gewinnung des Proteins aus der Kultur oder aus den Wirtszellen erlauben. Der Fachmann kennt Bedingungen, wie sich transformierte oder transfizierte Wirtszellen kultivieren lassen. Geeignete Verfahren für die rekombinante Herstellung von Proteinen sind bekannt (z.B. Holmgren, Annual Rev. Biochem. 54 (1985), 237; La Valle et al., Bio/Technology 11 (1993), 187, Wong, Curr. Opin. Biotech. 6 (1995), 517; Davies, Curr. Opin. Biotech 6 (1995), 543). Ferner sind geeignete Aufreinigungsverfahren bekannt (z.B. präparative Chromatographie, Affinitätschromatographie, HPLC, etc.).
Die Erfindung ist ferner auf ein Verfahren zum Identifizieren und/oder Isolieren von Antikörpern zum Hemmen einer Blutplättchenaggregation durch Bindung an die aktivierte Form des Integrinrezeptors GPIIb/IIIa von Blutthrombozyten gerichtet.
Ein derartiges erfindungsgemäßes Verfahren umfasst die folgenden Schritte:

– Erstellen einer Bibliothek von Nukleinsäuren, die für Sequenzen von Kandidaten kodieren;
– Erzeugen einer Phagenbibliothek aus der Nukleinsäurebibliothek;
– aufeinander folgende Reaktion der Phagenbibliothek mit nicht-aktiven Thrombozyten, aktiven Thrombozyten, anderen Zellen, die nicht-aktive Integrinrezeptormoleküle exprimieren, und anderen Zellen, die aktive Integrinrezeptormoleküle exprimieren; und
– Elution von Phagen, die an die Thrombozyten oder andere Zellen, die aktive Integrinrezeptormoleküle exprimieren, binden.

Ein wichtiger Schritt des erfinderischen Verfahrens besteht darin, dass die Phagenbibliothek von weniger geeigneten Polypeptiden, die entweder an nicht-aktivierte Blutplättchen oder an andere Komponenten an der Oberfläche von aktivierten Blutplättchen binden, depletiert wird. Nach jedem der Bindungsschritte sollte eine Gewinnung der ausgewählten Phagen durchgeführt werden, was anhand von bekannten Verfahren erfolgen kann. Schließlich werden jene Phagen, die Polypeptide tragen, die spezifisch an den Integrinrezeptor binden, auf ihre Blockierungsaktivität untersucht.
Die Schritte des Selektierens mit anderen Zellen können auch entfallen. Durch diese Modifikation können Phagen, die eine Blutplättchenaggregation durch andere Mechanismen hemmen, detektiert werden.
Dadurch lässt sich eine „natürliche Bibliothek", die auf der Antikörperpopulation der Spender basiert, erhalten.
Alternativ kann eine synthetische Bibliothek verwendet werden, wobei der Schritt des Erstellens einer Bibliothek die folgenden Schritte umfasst:

– Erstellen einer Nukleinsäure, die eine Sequenz für ein einzelkettiges Antikörperfragment enthält, das eine schwere und eine leichte variable Domäne umfasst; und
– Einführen von mindestens einer randomisierten Nukleotidsequenz in eine Region des einzelkettigen Antikörperfragments.

Die Region, in die die mindestens eine randomisierte Nukleotidsequenz eingeführt wird, ist vorzugsweise die CDR3-Region von VH oder VL, wie ein scFv.
Die anderen Zellen können vorzugsweise CHO-Zellen sein, die wohlbekannt sind und den Integrinrezeptor nach ihrer Transformation auf ihrer Oberfläche exprimieren können.
Die Erfindung ist ferner auf die Verwendung einer pharmazeutischen Zusammensetzung, die den Antikörper, die DNA oder die Expressionsvektoren gemäß der vorliegenden Erfindung enthält, zum Blockieren des Blutplättchenintegrinrezeptors auf Thrombozyten gerichtet.
Die Erfindung ist darüber hinaus auf die Verwendung des Antikörpers, der DNA oder des Expressionsvektors gemäß der Erfindung zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung gerichtet.
Der Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist auch von diagnostischem Interesse. Er kann zum Bestimmen der Anzahl aktivierter Thrombozyten im Verhältnis zu nicht-aktivierten Trombozyten eines Patienten verwendet werden. Er ist besonders zur Überwachung des (De-)Aktivierungszustands nützlich, falls der Patient mit Thrombozytenaggregationshemmern behandelt wird.
Die pharmazeutische oder diagnostische Zusammensetzung kann zusätzlich einen pharmazeutisch verträglichen Träger enthalten. Geeignete Träger sind phosphatgepufferte Salzlösungen, Wasser, Emulsionen (z.B. Wasser-in-Öl-Emulsionen), Tenside, sterile Lösungen, etc. Die Verabreichung der pharmazeutischen Zusammensetzung kann oral oder parenteral erfolgen (z.B. topisch, intraarteriell, intramuskulär, subkutan, intramedullär, intrathekal, intraventrikulär, intravenös, intraperitoneal oder intranasal). Die geeignete Dosierung wird durch den Arzt bestimmt und hängt von verschiedenen Bedingungen ab (z.B. Alter, Geschlecht, Gewicht des Patienten, Art der Krankheit und Art der Verabreichung, etc.).
Die DNA-Sequenzen der vorliegenden Erfindung können auch in einen Vektor eingefügt werden, der sich für die Gentherapie eignet, beispielsweise unter der Kontrolle eines gewebespezifischen Promotors. In einer bevorzugten Ausführungsform ist der DNA-Sequenzen enthaltende Vektor ein Virus (z.B. ein Adenovirus, Vaccinia-Virus oder adenoassoziierter Virus). Retroviren sind bevorzugt. Beispiele für geeignete Retroviren sind MoMuLV, HaMuSV, MuMTV, RSV oder GaLV. Für gentherapeutische Zwecke können die DNA-Sequenzen gemäß der vorliegenden Erfindung auch in Form von kolloidalen Dispersionen zu den Target-Zellen transportiert werden. In diesem Zusammenhang werden auch Liposome und Lipoplexe erwähnt (Mannino et al., Biotechniques 6 (1988), 682).
Schließlich ist die Erfindung auf ein Verfahren zum Behandeln eines Patienten umfassend die folgenden Schritte gerichtet:
Verabreichen einer erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzung in einer pharmazeutisch wirksamen Dosis an den Patienten.
Im Folgenden wird die Erfindung anhand von beispielhaften, nicht beschränkenden Ausführungsformen, in denen auf die begleitenden Zeichnungen Bezug genommen wird, näher ausgeführt:
1 zeigt eine FACS-Analyse eines Klons, der ein Antikörperfragment gemäß einer ersten Ausführungsform der Erfindung exprimiert;
2a zeigt die Nukleinsäuresequenz des für einen scFv-Antikörper gemäß der vorliegenden Erfindung kodierenden Klons MB9; 2b zeigt die Aminosäuresequenz von MB9.
3 zeigt die Sequenz von C9-scFv und E4-scFv.
4 zeigt Oligonukleotide, die für die Konstruktion der auf menschlichen scFcv basierten synthetischen Bibliothek verwendet werden. Bbs1-Restriktionsenzym-Erkennungsstellen sind durch Fettdruck angegeben, geschnittene Stellen sind unterstrichen.
5 zeigt eine schematische Darstellung von Anlagerungspositionen von Oligonukleotiden, die für die Konstruktion von pEXHAM4/C9 und pEXHAM4/E4 verwendet werden. Gene der in pEXHAM1 geklonten scFv C9 und E4 sind als Rechtecke gezeigt. Schwarz gefärbte Felder stellen CDR-Regionen dar; Oligonukleotide sind durch Pfeile dargestellt und durch Zahlen gekennzeichnet (vgl. 4). Bpil-Restriktionsendonuklease-Erkennungsstellen sind angegeben.
6 zeigt Vektorkarten von pEXHAM4/C9 und pEXHAM4/E4.
7 zeigt Vektorkarten von pEXHAM7/C9 und pEXHAM7/E4.
8 führt Oligonukleotide auf, die als Primer in einer 1. PCR zur Amplifikation von variablen Regionen schwerer und leichter menschlicher Ketten verwendet werden.
9 führt Oligonukleotide auf, die als Primer in einer 2. PCR zum Einführen von Restriktionsendonuklease-Erkennungssequenzen verwendet werden (durch Fettdruck markiert).
10 zeigt die FACS-Analyse der Klone SA8, SA10 und SA11. Bindung von angegebenen scFv an aktivierte (schwarze Kurve) und nicht-aktivierte (graue Kurve) Thrombozyten.
11 zeigt die gesamte, die Vektorkarte pEXHAM4/E4 betreffende Nukleotidsequenz.
12 zeigt die gesamte, die Vektorkarte pEXHAM4/C9 betreffende Nukleotidsequenz.
13 zeigt die gesamte, die Vektorkarte pEXHAM7/E4 betreffende Nukleotidsequenz.
14 zeigt die gesamte, die Vektorkarte pEXHAM7/C9 betreffende Nukleotidsequenz.
Im Folgenden werden Beispiele für die Erzeugung menschlicher scFv-Antikörper gegeben, die für einen aktivierten Blutplättchenintegrinrezeptor GPIIb/IIIa spezifisch sind.
Generelle Strategie
Phagenbibliotheken für die Präsentation einzelkettiger Antikörperfragmente (scFv) werden aus menschlichen IgM-Antikörpergenen erzeugt. Alternativ wird eine synthetische Bibliothek durch Randomisierung der CDR3-Region der schweren Kette in zwei scFv-Masterstrukturen menschlichen Ursprungs erzeugt. Beide Bibliotheken werden für nicht-aktivationsspezifische Binder durch Inkubation auf ruhenden Thrombozyten vor ihrer Verwendung zur Selektion auf aktivierten Blutplättchen subtrahiert. Um die Selektion auf den GPIIb/IIIa-Rezeptor zu fokussieren, werden auf in-vitro-kultivierten Zellen, die rekombinanten GPIIb/IIIa-Rezeptor exprimieren, zusätzliche Selektionsrunden durchgeführt. Nach der Selektion werden die scFv-Klone im Hinblick auf eine Bindung an aktivierte Trombozyten und Kompetition der Fibrinogenbindung mittels FACS-Analyse untersucht.
Beispiel 1: Erzeugung des menschlichen scFv-Antikörperfragments MB9 RNA- und cDNA-Präparation
Die Gesamt-RNA wird aus Milzproben von sechs menschlichen Spender und peripheren Blutlymphozyten (PBL) von fünf gesunden menschlichen Spendern (jeweils ca. 1–5 × 10⁸ PBL, RNeasy (TM) Midiprep.Kit, Quiagen) isoliert. Aus der Gesamt-RNA wird Poly-A⁺-RNA hergestellt (Oligotex mRNA Kit, Quiagen) und für die cDNA-Synthese verwendet (SuperScript^TM Preamplification System, Gibco BRL/LIFE Technologies).
Amplifikation von menschlichen variablen Ig-Regionen
Oligonukleotide, die bei der PCR für die Amplifikation variabler Regionen der schweren und leichten Ketten menschlicher Immunoglobuline verwendet werden, sind jene der 8. Schwere Ketten werden unter Verwendung eines einzelnen IgM-spezifischen konstanten Primers und eines aus einer Reihe von verschiedenen Primern (VH-1 bis VH-7), die spezifisch für die variable Region sind, in separaten PCR-Reaktionen amplifiziert. Dementsprechend werden leichte Lambda- und Kappa-Ketten unter Verwendung eines einzelnen Lambda- oder Kappa-spezifischen konstanten Primers und eines aus einer Reihe von verschiedenen variablen Primern (Vλ-1 bis Vλ10 und Vκ-1 bis 6) amplifiziert. Die PCR wird in einem 50 μl-Volumen unter Verwendung von 0,5 μl cDNA, 1 Einheit Ventexo^–-DNA-Polymerase (New England Biolabs) und 0,5 μM jedes Primers unter den folgenden Bedingungen durchgeführt: 3 Min. 95°C, 20× [30 Sek. 95°C, 1 Min. 55°C, 1 Min. 72°C] 5 Min. 72°C. Die Produkte der ersten PCR werden unter Verwendung des PCR-Aufreinigungskits (Qiagen) aufgereinigt und als Vorlagen für eine zweite PCR verwendet, bei der ein entsprechender Satz von Oligonukleotidprimern der 9 verwendet wird, um Restriktionsstellen für das Klonen einzuführen. Die zweite PCR wird entsprechend der ersten PCR für jeden Primersatz getrennt durchgeführt, jedoch unter Verwendung von 1 Min. 57°C für die Anlagerung. Die Produkte der zweiten PCR der schweren Kette, der leichten Lambda-Kette und der leichten Kappa-Kette werden gepoolt und über ein PCR-Aufreinigungskit (Quiagen) aufgereinigt.
Klonen der scFv-Phagendisplaybibliothek
Fragmente schwerer Ketten werden mit NcoI und HindIII verdaut, Fragmente leichter Ketten mit MluI und NotI (jeweils New England Biolabs) entsprechend den Anweisungen des Anbieters und werden schließlich durch Gelextraktion aus 1 %-igen Agarosegels unter Verwendung des Gelextraktionskits (Qiagen) aufgereinigt. Zum Erzeugen einer Unterbibliothek werden die schweren Ketten erst in den Phagendisplay-Vektor pEXHAM1 (1) geklont, der ein Füll-scFv („stuffer scFv") enthält. Vektor-DNA wird mit NcoI und HindIII geschnitten, über Gelextraktion aufgereinigt und separat mit Fragmenten schwerer Ketten ligiert, die von verschiedenen Spender stammen. Die Ligation erfolgt in einem 20 μl-Volumen unter Verwendung von 50 ng Vektor, 9 ng schwere-Kette-Fragment und 1 Einheit T4-DNA-Ligase (Roche) für drei Stunden bei Raumtemperatur. Die Ligationsmischung wird gefällt, in 10 μl Wasser resuspendiert und mit 35 μl elektrokompetenten E. coli-XL1-Blue-Zellen (Stratagene) für eine Elektroporation entsprechend den Anweisungen des Anbieters gemischt. Transformierte Zellen werden auf selektive LB-Agarose-Platten plattiert, die 50 mM Glukose, 100 μg/ml Ampillicin und 20 μg/ml Tetracyclin enthalten, und bei 30°C über Nacht inkubiert. Die Größe der Unterbibliotheken liegt im Bereich von 1,5 × 10⁶ bis 7,1 × 10⁷, wie durch das Plattieren geeigneter Verdünnungen bestimmt.
Bakterienklone werden von den Platten abgeschabt und für die DNA-Maxipräparation (Quiagen) verwendet, um die Vektor-DNA für das Klonen der kompletten Bibliotheken zu präparieren. Die Unterbibliothek-DNA wird mit MluI und NotI geschnitten, durch Gelextraktion aufgereinigt und separat mit den Fragmenten leichter Lambda- und Kappaketten aufgereinigt. Die Ligation erfolgt in einem 20 μl-Volumen unter Verwendung von 1 μg Vektor-DNA und eines zweifachen molaren Überschusses von DNA der leichten Ketten. Nach Inkubation mit 1 Einheit T4-Ligase (Roche) über Nacht bei 8°C wird die Ligitationsmischung gefällt und in 2,5 μl Tris 10 mM, pH 8,5 wieder in Lösung gebracht. Davon werden 2 μl für die Transformation von 50 μl-Aliquots elektrokompetenter XL1-Blue-Zellen verwendet. Die Zellen werden auf selektive Agarplatten plattiert und die Anzahl der Transformanten wird, wie oben beschrieben, durch Plattieren geeigneter Verdünnungen bestimmt. Die Gesamtgröße aller aus Milz- und PBL-RNA-Material erzeugten Bibliotheken beträgt 1,75 × 10⁹.
„Rescue" der Bibliothek
Zur Phagenpräsentation von scFv wird die Bibliothek in 250-ml-Aliquots eines mit 50 mM Glukose, 100 μg/ml Ampicillin und 20 μg/ml Tetracyclin versetzten LB-Mediums bei einer anfänglichen OD600 von 0,025 inokuliert, was sicherstellt, dass die Anzahl der Zellen die Komplexität um einen Faktor 10 übersteigt. Die Zellen werden bei 37°C und 200 UpM bis auf eine OD600 von 0,2 inkubiert und mit M13K07-Helferphagen bei einer Infektionsmultiplizität von 10 infiziert. Nach einer einstündigen Inkubation bei 37°C werden die Zellen durch Zentrifugation geerntet, in 250 ml eines glukosefreien Mediums resuspendiert und über Nacht bei 30°C und 200 UpM inkubiert. Die Phagen werden durch PEG-Fällung (PEG6000 20%, NaCl 2,5M) isoliert und in Phagenverdünnungspuffer (Tris 10 mM pH 7,5, NaCl 20 mM, EDTA 2 mM) wieder in Lösung gebracht.
Durchsuchen der Bibliothek nach scFv, die aktivierte Blutplättchen binden
Depletion der Bibliothek von scFs, die nicht-aktivierte Blutplättchen binden:
5 ml menschliches Venenblut wird in einer 25 μl Prostaglandin E10 (10 mM) enthaltenden S-Monowette (Sarstedt) aufgefangen und bei 110 g für 10 Min. zentrifugiert. 1 ml eines blutplättchenreichen Plasmas (obere Phase) wird in ein frisches Röhrchen überführt, mit 9 ml CGS-Puffer gemischt (Natriumzitrat 10 mM, Dextrose 30 mM, NaCl 120 mM) und bei 1000 g für 10 Min. zentrifugiert. Das Pellet wird in 4 ml Tyrode-Puffer (NaCl (150 mM), NaHCO₃ (12 mM), KCl, MgCl (jeweils 2 mM), Glukose, BSA (jeweils 1 mg/ml), pH 7,4), der 2% Magermilchpulver enthält, resuspendiert und mit 1,75 × 10¹² Bakteriophagen (1000× Komplexität) für 2 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert. Die Blutplättchen werden bei 1000 g für 10 Min. zentrifugiert, der Überstand entfernt und bei 4°C gelagert.
Bindung auf aktivierte Blutplättchen:
5 ml menschliches Venenblut wird in einer S-Monowette (Sarstedt) aufgefangen und bei 110 g für 10 Min. zentrifugiert. 1 ml eines blutplättchenreichen Plasmas (obere Phase) wird in ein frisches Röhrchen überführt, mit 9 ml CGS-Puffer vermischt und bei 1000 g für 10 Min. zentrifugiert. Das Pellet wird mit 4 ml einer CaCl₂, MgCl₂ (jeweils 2 mM), ADP (15 μM) enthaltenden, depletierten Phagenlösung resuspendiert und bei Raumtemperatur für 2 Stunden inkubiert. Die Blutplättchen werden zweimal durch Zentrifugation (1000 g, 10 Min.) gewaschen und in 14 ml Tyrode-Puffer resuspendiert.
Elution:
Für die Elution bindender Phagen werden die Blutplättchen zentrifugiert (1000 g, 10 Min.), in 1 ml Glyzinpuffer resuspendiert (0,1 M, pH 2,2) und für 10 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Nach der Zentrifugation (1000 g, 10 Min.) wird der Überstand durch die Zugabe von Tris (2 M, pH 8,0) neutralisiert.
Reinfektion:
Eluierte Phagen werden mit 10 ml logarithmisch wachsenden E. coli-XL1-Blue-Zellen gemischt und bei 37°C für 30 Min. inkubiert. Nach dem Zentrifugieren (10 Min., 6000 g) werden die Zellen in 400 μl LB_GAT-Medium (50 mM Glukose, 100 μg/ml Ampillicin und 20 μg/ml Tetracyclin enthaltendes LB-Medium) resuspendiert, auf LB_GAT-Agarplatten plattiert und über Nacht bei 37°C inkubiert.
Verpackung:
Kolonien werden unter Verwendung von zweimal 5 ml LB_GAT-Medium von Agarplatten abgeschabt und zur Inokulierung von 20 ml LB_GATMedium bei einer OD600 von 0,1 verwendet. Die Zellen werden bei 37°C und 200 UpM für eine Stunde inkubiert und mit ca. 1 × 10¹⁰ M13K07-Helferphagen superinfiziert. Nach einer Stunde bei 37°C werden die Zellen durch Zentrifugieren (5 Min., 6000 g) aufgefangen, in LB-Medium resuspendiert, das mit Ampicillin (100 μg/ml) und Kanamycin (50 μg/ml) versetzt wurde, und über Nacht bei 30°C und 200 UpM inkubiert. Die Phagen werden durch PEG-Fällung aufgefangen und in 1 ml Phagenverdünnungspuffer resuspendiert (wie für „Rescue" der Bibliothek beschrieben).
Durchsuchen der Bibliothek nach scFV, die rekombinante GPIIb/IIIa auf CHO-Zellen binden
Depletion von scFv, die nicht-aktivierte GPIIb/IIIa binden:
Ovarienzellen chinesischer Hamster (CHO), die nicht-aktivierten GPIIb/IIIa-Rezeptor exprimieren (A5-Zellen; Peter et al., Blood, Bd. 9, 1998, S. 3240-3249) werden trypsiniert, zentrifugiert (10 Min., 140 g) und bei 5 × 10⁶ Zellen/ml in Tyrodepuffer resuspendiert. Ca. 10⁹ verpackte Phagen aus der ersten Selektionsrunde werden mit 4 ml Zellsuspension gemischt und für eine Stunde bei Raumtemperatur inkubiert. Die Zellen werden für 20 Min. bei 140 g zentrifugiert und der Überstand erneut durch Zentrifugieren geklärt (20 Min., 3200 g).
Bindung auf aktivierten GPIIb/IIIa:
CHO-Zellen, die aktive GPIIb/IIIa-Zellen (C13-Zellen, Peter K und O'Toole TE, J Exp Med. 1995, 181(1): 315-326) aufweisen, werden durch Trypsination geerntet, zentrifugiert und einmal unter Verwendung von 1 ml Tyrodepuffer gewaschen. 4 × 10⁶ Zellen werden mit 4 ml depletierter Phagenlösung für 30 Min. bei Raumtemperatur inkubiert.
Elution durch Antikörperkompetition:
Die Zellen werden für 10 Min. bei 140 g zentrifugiert, in 50 ml Tryodepuffer resuspendiert, dreimal für 20 Min. bei 700 g zentrifugiert und in 1 ml Tyrodepuffer resuspendiert und schließlich in 200 μl ReoPro (2 mg/ml) resuspendiert. Nach 20 Min. bei Raumtemperatur werden die Zellen durch 10-minütiges Zentrifugieren bei 13000 UpM in einer Tischzentrifuge entfernt.
Saure Elution:
Die Zellen werden für 10 Min. bei 140 g zentrifugiert, in 50 ml modifiziertem Tyrodepuffer resuspendiert (Tyrodepuffer pH 6, eingestellt mit Hepes, enthaltend CaCl₂, MgCl₂ (jeweils 2 mM) und 1 mg/ml BSA), zweimal für 20 Min. bei 700 g zentrifugiert und in 1 ml modifiziertem Tyrodepuffer resuspendiert und schließlich in 1 ml Glycin (pH 2,2) resuspendiert. Nach 15 Min. bei Raumtemperatur wird die Mischung durch Zugabe von 100 μl Tris (2 M, pH 8) neutralisiert und durch Zentrifugieren bei 13000 UpM für 10 Min. in einer Tischzentrifuge geklärt.
Reinfektion und Verpackung: erfolgen wie oben beschrieben.
Analyse des Restriktionsendonukleaseverdaus selektierter Klone
Die DNA von Klonen aus Selektionsexperimenten wird unter Verwendung von DNA-Spin-Säulen unter Befolgung der Empfehlungen des Herstellers (Quiagen) präpariert. Die DNA wird mit BstNI (New England Biolabs) verdaut und auf einem 1 %-igen Agarosegel analysiert.
Herstellung von Periplasmaextrakten
5 ml LB_GAT-Medium werden mit 250 μl einer Übernachtkultur inokuliert und bei 37°C und 180 UpM für 4 Stunden inkubiert. Die Zellen werden durch Zentrifugieren (5 Min., 6000 g) geerntet, in 5 ml LB-Medium enthaltend Ampicillin (10 μg/ml) und IPTG (100 μM) resuspendiert und bei 28°C und 180 UpM über Nacht inkubiert. Die Zellen werden erneut durch Zentrifugieren geerntet und in 500 μl Schocklösung (50 mM Tris-HCl pH 8,0, 20% Saccharose, 1 mM EDTA) resuspendiert und bei 8°C für eine Stunde inkubiert. Die Zellen werden durch Zentrifugieren entfernt (10 Min., 13000 UpM Tischzentrifuge) und der Überstand wird zweimal für 3 Stunden bei 4°C gegen PBS dialysiert.
FACS-Analyse
Die FACS-Analyse wird unter Verwendung einer FACS-Calibur-Vorrichtung (Becton Dickinson) durchgeführt.
Analyse der Aktivationsspezifität:
Zitriertes Vollblut (S-Monowette, Sarstedt) wird 1:50 in 50 μl Tyrodepuffer mit oder ohne ADP (20 μM) verdünnt und für 20 Min. bei Raumtemperatur mit 10 μl Periplasma-scFv-Extrakten inkubiert. Als sekundärer Antikörper wird FITC-markierter anti-His-Antikörper (Dianova) zugegeben, für 20 Min. inkubiert und mit Cellfix fixiert (1×).
Analyse der Fibrinogen-Kompetition:
Zitriertes Vollblut (S-Monowette, Sarstedt) wird 1:50 in 50 μl Tyrodepuffer mit oder ohne ADP (20 μM) verdünnt und vor der Fixierung mit Cellfix (1×, Becton Dickinson) für 20 Min. mit FITC-markiertem Anti-Fibrinogen-Antikörper (WAK-Chemie Medical) in Gegenwart oder Abwesenheit von 20 μl Periplasma-scFv-Extrakten inkubiert.
Ergebnisse
Selektion von GPIIb/IIIa-bindenden scFv
Aus Milz und PBL stammende menschliche scFv-Phagendisplaybibliotheken werden durch Selektion auf aktivierten menschlichen Blutplättchen für eine Runde nach GPIIb/IIIa-spezifischen Klonen durchsucht. Die Bibliothek wird zuvor auf nicht-aktivierten Blutplättchen depletiert, um nicht-aktivationsspezifische Binder zu entfernen. Nach der Depletion auf Zellen, die eine nicht-aktivierte Variante aufweisen, wird die zweite und dritte Selektionsrunde auf CHO-Zellen durchgeführt, die rekombinante, aktivierte GPIIa/IIIb-Rezeptoren exprimieren. Eine Elution wird entweder durch Säure oder durch Kompetition mit ReoPro durchgeführt. Nach der dritten Selektionsrunde werden Klone zufällig ausgewählt und zuerst auf Anreicherung durch BstNI-Verdau und aktivationsspezifische Bindung an Thrombozyten untersucht (Tabelle 1). Es wird festgestellt, dass ein Klon, MB9, unter Verwendung einer sauren sowie kompetitiven Elution auf 10 von 80 bzw. 10 von 60 Klone angereichert wird. MB9 ist bei der Blutplättchenbindung auch stark aktivationsspezifisch und hemmt die Bindung von Fibrinogen an Bluttplättchen, wie durch die in 1 dargestellte FACS-Analyse gezeigt. Darin ist Folgendes dargestellt: Linkes Histogramm: zeigt die Bindung von MB9-scFv an aktivierte (schwarze), nicht aber an unaktivierte (graue) menschliche Thrombozyten. Rechtes Histogramm: Bindung von Fibrinogen an aktivierte (schwarze), nicht aber unaktivierte Thrombozyten. Die Bindung von Fibrinogen an aktivierte Thrombozyten wird in Gegenwart von MB9-scFv gehemmt (ausgefüllte hellgraue Kurve).
Darüber hinaus kompetitiert MB9 mit ReoPro um Bindung. Andere angereicherte Klone, wie MA1, zeigten auch eine aktivationsspezifische Bindung, versagten jedoch bei der Hemmung einer Fibrinogenbindung oder sind nicht stark spezifisch für aktivierte Thrombozyten wie MA3 oder MB1.
Die DNA-Sequenz des Klons MB9 ist in SEQ-ID Nr. 1 angegeben (2). Restriktionsendonuklease-Erkennungssequenzen, die schwere und leichte Ketten flankieren (NcoI, HindIII bzw. MluI, NotI), sind angegeben.

Ein für MB9 kodierender Klon wurde am 6. September 2001 unter DSM 14491 (XL1blue(pEXHAM4/MP9)) bei der „Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, D-38124 Braunschweig" nach dem Budapester Vertrag hinterlegt. Tabelle 1: Charakterisierung von auf aktivierten GPIIb/IIIa angereicherten scFv-Klonen

Klon	Elution durch	Anreicherung identische Klone/analysierte Klone	Aktivierung der spezifischen Bindung an menschliche Blutplättchen	Hemmung der Fibrinogen-Bindung	Kompetition durch ReoPro
MA1	Säure	20:80	++	–	–
MA2	Säure	10:80	++	++	+
MA3	Säure	24:80	+	–	–
MB1	Kompetition	21:60	+	+	+
MB9 identisch zu MA2	Kompetition	10:60	++	++	+

++: sehr positiv; +: positiv; –: negativ

Beispiel 2: Herstellung des auf der synthetischen menschlichen Struktur basierten scFv-Antikörperfragments
Ursprung von Masterstrukturen menschlicher scFv
Für die Erzeugung einer synthetischen Bibliothek durch Randomisierung der CDR3-Region der schweren Kette werden aufgrund ihrer hervorragenden Herstelleigenschaften in E.coli-Zellen zwei menschliche Masterstrukturen (C9 und E4, 3) gewählt. Beide scFv stammen aus einer großen menschlichen Phagendisplay-Antikörperbibliothek (Little, M., et al., J. Immunol. Methods 1999, 231: 3-9) und sind für Hepatitis-B-Virusantigen (C9) bzw. Estradiol (E4) spezifisch.
Vektorkonstruktion für die synthetische scFv-Bibliothek
C9- und E4-scFv werden in pEXHAM1-Vektor-DNA geklont, wobei das Füll-scFv durch übliche rekombinante Klontechniken unter Verwendung von NcoI- und NotI-Klonstellen ersetzt wird.
Zur Herstellung eines Vektors, der die Randomisierung der CDR3 der schweren Kette ohne Veränderungen der ursprünglichen Sequenz erlaubt, wird diese Region durch ein DNA-Füllfragment ersetzt, welches Restriktionsenzym-Erkennungsstellen vom Typ IIS-Enzym-BbsI (BpiI) enthält. Übliche PCR-Reaktionen werden unter Verwendung der in 4 gezeigten Oligonukleotidprimer aufgebaut, um DNA-Fragmente der scFv-Regionen 3' und 5' der CDR3 der schweren Kette zu erzeugen, welche einzigartige BPiI-Klonstellen enthält, wie in 5 skizziert, bei der es sich um eine schematische Darstellung von Anlagerungspositionen der für die Konstruktion von pEXHAM4/C9 und pEXHAM4/E4 verwendeten Oligonukleotide handelt. Gene der scFv C9 und E4, die in pEXHAM1 geklont sind, sind als Rechtecke gezeigt. Schwarz eingefärbte Flächen stellen CDR-Regionen dar; Oligonukleotide sind durch Pfeile dargestellt und durch Nummern gekennzeichnet (vgl. Sequenzdefinitionen). BpiI-Restriktionsendonuklease-Erkennungsstellen sind angegeben.
Das DNA-Füllfragment wird unmittelbar durch Hybridisierung synthetischer Oligonukleotide erzeugt. DNA-Fragmente werden mit BpiI geschnitten und in BpiI-verdauter pEXHAM1-Vektor-DNA geklont, um pEXHAM4/C9 und pEXHAM4/E4 zu erzeugen (6, 11 und 12).
Die unmittelbare Verwendung von pEXHAM4-Vektor-DNA zum Klonen über Bbs1 erfordert die Aufreinigung zweier Vektorfragmente einer Größe von 3,8 und 0,5 kb. Um dies zu vermeiden, werden beide Bbs1-Restriktionsstellen außerhalb der scFv-Sequenz in mehreren Schritten entfernt, ohne die Proteinsequenz zu verändern, indem nicht komplementäre Oligonukleotide als Primer für die PCR oder unmittelbar hybridisierte synthetische Oligonukleotide verwendet werden, um Bbs1-enthaltende DNA-Fragmente durch Klonen über benachbarte Restriktionsstellen zu entfernen. Die Endkonstrukte werden pEXHAM7/C9 bzw. pEXHAM7/E4 genannt (7, 13 und 14).
Erzeugung der synthetischen, auf menschlichen Strukturen basierten scFv-Bibliothek
Zur Erzeugung einer Bibliothek werden synthetische Oligonukleotide, die durch NNK-Codone (VHCDR3_3.4/cut bis VHCDR3_3.7/cut; jeweils 1 μM) für vier bis sieben zufällige Aminosäuren kodieren, separat unter Verwendung der Oligonukleotide VHCDR3_for/cut und VHCDR3_back/cut (0,2 μM) (4) mit 1 Einheit Vent-exo^–-DNA-Polymerase (New England Biolabs) unter den folgenden PCR-Bedingungen eingefüllt: 2 Min. 94°C, 5× [1 Min. 94°C, 1 Min. 40°C, 1 Min. 72°C] 10 Min. 72°C in 100 μl Volumen. Die PCR-Produkte werden unter Verwendung eines PCR-Aufreinigungs-Kits (Quiagen) aufgereinigt. Zwei Drittel des Materials wird mit 100 Einheiten BbsI für 6 Stunden geschnitten und wieder anhand des erwähnten Kits aufgereinigt. Im Falle von VHCDR3_3.4/cut und VHCDR3_3.5/cut wird die Vektor-DNA pEXHAM4/C9 und pEXHAM4/E4 mit BbsI (1 Einheit/μg in 6 Std.) geschnitten und beide Vektorfragmente (3,8 und 0,5 kb) werden über Gelelution aus einem 1%-igen Agarosegel aufgereinigt (Gelextraktions-Kit, Quiagen). Für VHCDR3_3.6/cut und VHCDR3_3.7/cut werden pEXHAM6/C9 und pEXHAM6/E4 verwendet, so dass nur ein Vektorfragment aufzureinigen war. Die Ligation erfolgt in allen Fällen bei einem äquimolaren Verhältnis aller Fragmente. Danach wird die Ligationsmischung gefällt, in Tris 10 mM, pH 8,5 wieder in Lösung gebracht und für die Transformation von XL1-Blue-Zellen verwendet, im Wesentlichen genau wie für Beispiel 1 beschrieben.
Neben synthetischen randomisierten DNA-Fragmenten wird die CDR3 der schweren Kette auch durch natürliche CDR3-Sequenzen ersetzt, die aus den Produkten der ersten PCR der natürlichen Bibliothek amplifiziert wurden (s. Beispiel 1), um auf funktionale, in vivo verwendete Sequenzen für diese Region abzustellen. Verwendete und in 4 beschriebene Oligonukleotide werden entworfen, um die meisten der CDR3-Regionen menschlicher schwerer Ketten abzudecken, ohne C9- oder E4-Struktursequenzen zu modifizieren. Die PCR wird separat für jede menschliche VH-PCR-Vorlage unter Verwendung 1 Einheit Vent-exo^–-DNA-Polymerase (New England Biolabs) und 0,2 μM Primer in einem 100 μl-Volumen unter den folgenden Bedingungen durchgeführt: 2 Min. 94°C, 30× [1 Min. 95°C, 1 Min. 50°C, 1 Min. 72°C] 10 Min. 72°C. Die Oligonukleotide #42, #43 und #44 werden als äquimolares Gemisch verwendet. Die PCR-Produkte werden mittels des PCR-Aufreinigungs-Kits aufgereinigt, und aus Milz bzw. PBL stammendes Material wird gepoolt. Die Restriktion mit BbsI, die Ligation mit pEXHAM6/C9 bzw. pEXHAM6/E4 und die Transformation werden wie oben beschrieben durchgeführt.
Die Größe der gesamten synthetischen Bibliothek (synthetische und natürliche in C9- oder E4-Strukturen geklonte CDR3) beträgt in diesem Beispiel 7,5 × 10⁸ Klone.
„Rescue" der Bibliotheken
Die Verpackung der synthetischen Bibliotheken wird wie für die natürliche Bibliothek beschrieben durchgeführt (Beispiel 1).
Durchsuchen der synthetischen Bibliothek
Das Durchsuchen der synthetischen Bibliothek erfolgt genau wie für die natürliche Bibliothek beschrieben (Beispiel 1) ausgehend von 7,5 × 10¹¹ Bakteriophagen (1000× Komplexität).
Ergebnisse

Die aus menschlichen scFv-Strukturen (C9 und E4) gewonnene synthetische Bibliothek wird genau wie in Beispiel 1 beschrieben nach GPIIb/IIIa-spezifischen Klonen durchsucht. Nach der dritten Selektionsrunde werden Klone zufällig ausgewählt und die DNA-Sequenz der VH-CDR3-Regionen bestimmt (vgl. Tabelle 2). Tabelle 2: Analyse der DNA-Sequenz von VH-CDR3 von elf aus der synthetischen Bibliothek selektierten GPIIb/IIIa-Klonen

Klon	Translation von VH-CDR3-DNA	Anzahl identischer Klone	Für CDR3 verwendete Oligonukleotide
SA1	CAR RYRVG FDY	1	VHCDR3 3.5/cut
SA2	CAR GATYTSRSDVPDQTS FDY	2	VHCDR3 ev2/for/cut
SA3	CAR DDLAYCRGDCSGRFA FDI	2	VHCDR3 ev2/for/cut
SA4	CAR RFSISRA FDY	1	VHCDR3 3.7/cut
SA6	CAR RWGKARS FDY	1	VHCDR3 3.7/cut
SA8	CAK ELEAYCRGDCYPPYYG MDV	1	VHCDR3 ev3/for/cut
SA10	CAR DLFRGRGDYGDYG MDV	1	VHCDR3 ev2/for/cut
SA11	CAR TYYYDSRTDRRPPHA FDI	1	VHCDR3 ev3/for/cut

Alle Klone verwenden die E4-Struktursequenz. Drei der elf untersuchten Klone kodieren für die Aminosäuresequenz RGD (auch in Fibrogen vorhanden) innerhalb der CDR3 (SA3, SA8 und SA10). Bei den Klonen SA3 und SA8 wird das RGD-Motiv unmittelbar von zwei Cysteinresten flankiert, die die Schleife durch Disulfidbrücken stabilisieren könnten. Der Klon SA3 wurde zweimal unter elf untersuchten Klonen gefunden und hat sich daher wahrscheinlich durch den Durchsuchungsvorgang angereichert. Dasselbe gilt für den Klon SA11. Diese scFv-Klone ähneln Antikörpern wie PAC-1, die RGD-ähnliche Sequenzen enthalten und Fibrinogenbindung durch Blockieren des aktivierten Rezeptors hemmen (Shatill et al., 1985). Nur SA8, SA10 und SA11 zeigten eine aktivationsspezifische Bindung an Thrombozyten in Gegenwart von Fibrinogen (vgl. 10).
Die ausgewählten Klone interagieren wahrscheinlich genau mit der Fibrinogenbindungsstelle des GPIIb/IIIa-Rezeptors, aber mit einer ähnlichen oder niedrigeren Affinität als Fibrinogen. Die Affinität wurde durch Mutation innerhalb der VH- und/oder VL-Domäne des scFV-Antikörperfragments oder den Austausch der gesamten VL-Domäne („Chain Shuffling”) erhöht.
Sequenzprotokoll

Claims

Antikörper oder dessen Derivat menschlichen Ursprungs zum Hemmen einer Blutplättchenaggregation, dadurch gekennzeichnet, dass er dadurch wirksam ist, dass er im Wesentlichen ausschließlich an den aktivierten Zustand eines Blutplättchenintegrinrezeptors GPIIb/IIIa bindet.
Antikörper nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Antikörperderivat ein Fragment eines Immunglobulins ist, das variable Domänen seiner leichten und schweren Kette umfasst.
Antikörper nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass das Fragment ein einzelkettiges Antikörperfragment (scFv) oder Fab ist.
Antikörper nach Anspruch 2 oder 3, dadurch gekennzeichnet, dass das Fragment ein rekombinantes Konstrukt eines einzelkettigen Antikörperfragments (scFv) ist.
Antikörper nach Anspruch 2 oder 3, dadurch gekennzeichnet, dass das einzelkettige Antikörperfragment von einem IgM oder IgG Antikörper stammt.
Antikörper nach Anspruch 3 oder 4, dadurch gekennzeichnet, dass das Fragment die Aminosäuresequenz von 2 oder eine Aminosäuresequenz umfasst, die mindestens 60 % homolog dazu ist.
Antikörper nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass er ein bivalentes oder multivalentes Antikörperkonstrukt ist, das die variable Domäne eines Antikörpers umfasst, der dahingehend spezifisch ist, dass er an den aktivierten Zustand des Blutplättchenintegrinrezeptors GPIIb/IIIa bindet.
Verfahren zum Identifizieren und/oder Isolieren von Antikörpern zum Hemmen einer Blutplättchenaggregation durch Bindung an einen aktivierten Integrinrezeptor GPIIb/IIIa von Blutthrombozyten, umfassend die folgenden Schritte: – Erstellen einer Bibliothek von Nukleinsäuren, die eine Sequenz für ein einzelkettiges Antikörperfragment enthalten, das eine schwere und eine leichte variable Domäne umfasst; und – Einführen von mindestens einer randomisierten Nukleotidsequenz in die CDR Region des einzelkettigen Antikörperfragments; – Erzeugen einer Phagenbibliothek aus der Nukleotidsäurebibliothek; – aufeinander folgende Reaktion der Phagenbibliothek mit nicht aktiven Thrombozyten, aktiven Thrombozyten, anderen Zellen, die nicht aktive Integrinrezeptor-GPIIb/IIIa-Moleküle exprimieren, und anderen Zellen, die aktive Integrinrezeptor-GPIIb/IIIa-Moleküle exprimieren; und – Elution von Phagen, die an die Thrombozyten oder andere Zellen, die aktive Integrinrezeptormoleküle exprimieren, binden.
DNA Sequenz, die für den Antikörper nach einem der Ansprüche 1 bis 7 kodiert.
Expressionsvektor, enthaltend die DNA Sequenz nach Anspruch 9.
Zelllinie, enthaltend die DNA Sequenz nach Anspruch 9 oder den Expressionsvektor nach Anspruch 10.
Pharmazeutische Zusammensetzung, enthaltend den Antikörper nach einem der Ansprüche 1 bis 7, die DNA Sequenz nach Anspruch 9 oder den Expressionsvektor nach Anspruch 10.
Verwendung des Antikörpers nach einem der Ansprüche 1 bis 7, die DNA Sequenz nach Anspruch 9 oder den Expressionsvektor nach Anspruch 10 zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zum Blockieren des Blutplättchenintegrinrezeptors auf Thrombozyten.
Verwendung des Antikörpers nach einem der Ansprüche 1 bis 7, der DNA Sequenz nach Anspruch 9 oder des Expressionsvektors nach Anspruch 10 als diagnostisches Mittel zum Bestimmen der Zahl von aktivierten Thrombozyten.