DE60127100T2

DE60127100T2 - Gereinigtes recombinantes hlh mit spezifischer bioaktivität und verfahren zu dessen reinigung

Info

Publication number: DE60127100T2
Application number: DE60127100T
Authority: DE
Inventors: Gianfranco Paradisi; Mara Rossi; Laura Scaglia
Original assignee: Applied Research Systems ARS Holding NV
Current assignee: Merck Serono SA
Priority date: 2000-02-22
Filing date: 2001-01-22
Publication date: 2007-06-28
Anticipated expiration: 2021-01-23
Also published as: MXPA02007867A; CN1404486A; EE04932B1; HRP20020651A2; AU780377B2; BG107001A; UA78676C2; WO2001062774A3; NO20023963D0; NO20023963L; SK12052002A3; US7053054B2; US20060079460A1; ES2278722T3; HU227007B1; BR122012018280B1; DE60127100D1; CZ20022856A3; EA200200893A1; EP1777231A2

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Reinigung von luteinisierendem Hormon (LH), insbesondere auf die Reinigung von rekombinantem LH (r-LH) aus einer Probe von rohem rekombinantem LH, umfassend die kombinierte Verwendung von Ionenaustauschchromatografie mit einem Anionenaustauscherharz und Reversed Phase HPLC.
Luteinisierendes Hormon (LH) ist ein Gonadotropin, das durch den Hypophysenvorderlappen zusammen mit einem anderen Gonadotropin, dem follikelstimulierenden Hormon (FSH), abgesondert wird. Diese Hormone sind Heterodimere, die aus nicht-kovalent gebundenen α- und β-Untereinheiten bestehen.
Diese Gonadotropine stimulieren das normale Funktionieren der Keimdrüsen und die Absonderung von Geschlechtshormonen sowohl von Männern als auch Frauen. Bei Frauen stimuliert das follikelstimulierende Hormon die Entwicklung und Reifung der Follikel und der Eizellen. Wenn sich der Follikel entwickelt, produziert er Östrogen in steigenden Mengen, welches zur Zyklusmitte die Freisetzung von LH stimuliert. Dies verursacht ein Reißen des Follikels bei der Ovulation und wandelt den Follikel in den Gelbkörper um, der Progesteron absondert. Bei Männern stimuliert das luteinisierende Hormon die interstitiellen Zellen des Hodens, um Testosteron abzusondern, welches wiederum eine direkte Wirkung auf die Samenkanälchen hat. Gonadotrope Substanzen mit luteinisierender oder follikelstimulierender Wirkung oder beidem werden bei der Behandlung von Fruchtbarkeitsstörungen verwendet, hauptsächlich bei Frauen, aber auch bei Männern. Solche Substanzen umfassen Choriongonadotropin, welches LH-Aktivität besitzt, und humane menopausale Gonadotropine, welche sowohl LH- als auch FSH-Aktivität besitzen. Ein rekombinantes, von DNA abgeleitetes menschliches luteinisierendes Hormon (rechLH) wird als Alternative zu Choriongonadotropin oder zur Verabreichung in Verbindung mit FSH untersucht.
Es sind verschiedene Verfahren verwendet worden, um LH zu isolieren und zu reinigen, wie Ionenaustausch, Gelfiltration und Immunoaffinitätschromatografie (Jack, G. W., Blazek, R., James, K., Boyd, J. E. & Micklem, L. R., The automated production by immunoaf finity chromatography of the human pituitary glycoprotein hormones thyrotropin, follitropin and lutropin. Journal of Chemical Technology and Biotechnology 39, 45–58, 1987).
Die Ionenaustauschchromatografie ist zur Isolierung dieser Hormone verwendet worden; dieses Verfahren scheint jedoch einige miteinander verbundene Probleme zu haben, die durch die beträchtliche Ladungsheterogenität von LH im Hypophysengewebe hervorgerufen werden. Da diese Glycoproteine und FSH überlappende Ladungen haben, ist erstens ihre vollständige Trennung schwierig und arbeitsaufwändig. Zweitens kann die Reinigung dieser Hormone als Einzelfraktionen schwierig sein (Stockell Hartree, A., Thomas, M., Furnival, B. E., Burns, T. W. & Langley, P., Thyroid-stimulating and lipolytic activities of purified preparations of human thyroid-stimulating hormone. Journal of Endocrinology 53, 95–100, 1972). Als ein Ergebnis können bestimmte geladene Formen des Hormons während der Reinigung ausgewählt werden, wie in dem Fall von LH vorgeschlagen (Storring, P. L., Zaidi, A. A., Mistry, Y. G., Lindberg, M., Stenning, B. E. & Diczfalusy, E., A comparison of preparations of highly purified human pituitary luteinising hormone: differences in the luteinising hormone potencies as determined by in vivo bioassays, in vitro bioassay and immunoassay. Acta Endocrinologica 101, 339–347, 1982). Eine selektive Reinigung kompliziert die Charakterisierung dieser heterogenen Formen weiter, einschließlich der Strukturanalyse ihrer Kohlehydratkomponenten. Eine Schwankung in dem Gehalt anionischer Oligosaccharide, die Sialyl- und Sulfatgruppen enthalten, können die Hauptursache der Ladungsheterogenität in LH sein.
WO 90/02757 bezieht sich auf die Reinigung von rekombinantem Rinder-LH unter Verwendung der Schritte sowohl einer Ionenaustauschchromatografie mit einem stark kationischen Harz (Trisacryl M-SP) als auch einer Umkehr-HPLC; es wird kein Hinweis gegeben, einen Ionenaustausch mit einem Anionenaustauscherharz zu verwenden, um die spezifische Bioaktivität zu verbessern. WO 98/20039 (Tabelle auf Seite 11), LH-Reinigung und gereinigtes LH ist beschrieben worden, kein rekombinanter Ursprung von LH wird beschrieben, extrahiertes rohes HMG (humanes menopausales Gonadotropin) aus Urin von Menopausalen oder Postmenopausalen.
Hakola K. et al., Recombinant forms of rat and human luteinising hormone and folliclestimulating hormone: Comparison of functions in vitro and in vivo; Journal of Endocrinology 158 (1998), 441–448 beschreibt ein hoch gereinigtes menschliches rekombinantes LH (99,9% Reinheit ein 15900 IU/mg durch in vivo-Bioassay).
Herkömmliche Fraktionierungsverfahren sind für die Herstellung von menschlichem luteinisierendem Hormon aus Urin (LH) mit einer Wirksamkeit von 982 IU/mg durch biologischen Assay und 1166 IU durch Radioimmunoassay beschrieben worden (Donini S. & Donini P., Acta endocr., Copenh. 63, Suppl. 142, 257–277, 1969). Ein Immunoadsorbens von Kaninchen-Antiserum für gereinigtes menschliches Choriongonadotropin (HCG) wurde verwendet, um LH aus den Haupt- und Nebenfraktionen zu isolieren, die während der Herstellung von follikelstimulierendem Hormon (FSH) aus menopausalem Urin erhalten wurden (van Hell, H., Schuurs A. H. W. M. & den Hollander, F. C., In Symposium on gonadotrophins, New York, 17 June 1971. Eds B. B. Saxena, C. G. Beling & H. M. Gandy. New York: John Wiley & Son, Inc, 1972). Die erhaltene Präparation hatte höhere LH-Wirksamkeiten, aber auch höhere FSH : LH-Verhältnisse als diejenigen, die von Donini & Donini (1969) hergestellt waren.
Rekombinantes LH hat den Vorteil, dass es frei von anderen Gonadotropinhormonen, wie FSH und TSH, ist. Die rohe Präparation von rekombinantem LH enthält jedoch sämtliche anderen Proteine und Verunreinigungen der Zelle, die bei seiner rekombinanten Herstellung verwendet werden, und ein Verfahren zum Erhalt einer absoluten Reinheit von rekombinantem luteinisierendem Hormon ist hoch erwünscht.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Wir haben nun festgestellt, dass eine rohe Präparation von LH, abgeleitet aus einer Probe des Kulturmediums, erhalten nach dem rekombinanten Verfahren oder aus einem rohen Konzentrat von postmenopausalem Urin auf einen solchen Grad gereinigt werden kann, dass das erhaltene LH praktisch frei von Proteinen und/oder anderen Verunreinigungen ist, die in der rohen LH-Präparation enthalten sind. Abhängig von dem Ausgangsmaterial sind das Protein und andere Verunreinigungen humanen Ursprungs (Ausgangsmaterial: humane menopausale Gonadotropine) oder Wirtszellursprungs, z.B. CHO im Falle einer CHO-Wirtszelle.
Das Reinigungsverfahren basiert auf der Verwendung der Ionenaustauschchromatografie mit einem Anionenaustauscherharz und Reversed Phase HPLC. Die optionale weitere Verwendung einer Gelpermeationssäule erlaubt die Entfernung von sämtlichen restlichen Spuren von Verunreinigungen aus der reinen LH-Präparation. Optimale Ergebnisse werden erhalten, wenn zwei Stufen von Ionenaustauschchromatografie und zwei Stufen von Reversed Phase HPLC durchgeführt werden.
Das Verfahren der Erfindung kann zur Reinigung von rekombinanter LH verwendet werden, ausgehend von einer Probe eines Kulturmediums, das nach dem rekombinanten Verfahren erhalten wird, derart, dass das erhaltene hoch gereinigte LH praktisch frei ist von z.B. häufig in dem Kulturmedium enthaltenen FBS-Proteinen, Nukleinsäuren oder anderen Verunreinigungen, die in den für das rekombinante Verfahren verwendeten Wirtszellen vorhanden sind.
Das Verfahren der Erfindung kann auch für die Reinigung von LH aus Urin, ausgehend von einem rohen Konzentrat von postmenopausalem Urin, und für die Reinigung von LH aus anderen Spezies, insbesondere Säugern, einschließlich z.B. Rind, Pferd, Schwein, Schaf, Ratte, Maus und Affe, verwendet werden.
Es ist daher eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren zur Reinigung von LH aus einer Probe bereitzustellen, umfassend die kombinierte Verwendung von Ionenaustauschchromatografie mit einem Anionenaustauscherharz und Reversed Phase HPLC. Das Verfahren umfasst die Schritte des Unterwerfens der Probe (falls notwendig, konzentriert) der Ionenaustauschchromatografie mit einem Anionenaustauscherharz und das Unterwerfen des Eluats der Reversed Phase HPLC. Ein weiterer Schritt des Aufbringens des Eluats auf eine Gelpermeationssäule kann zusätzlich durchgeführt werden.
Abhängig von der Reinheit der Ausgangspräparation werden die Ionenaustauschchromatografie mit einem Anionenaustauscherharz und die Reversed Phase HPLC bevorzugt zweimal durchgeführt, um optimale Ergebnisse aus dem Reinigungsverfahren zu erhalten. Ein solches Verfahren kann die Schritte umfassen:

(a) Eluieren der Probe durch eine DEAE-Sepharose-Ionenaustauschchromatografiesäule;
(b) Eluieren durch eine Q-Sepharose-Ionenaustauschchromatografiesäule;
(c) Eluieren durch eine Silica C18-Reversed Phase HPLC-Säule;
(d) wiederum Eluieren durch eine Silica C18-Reversed Phase HPLC-Säule [optional mit einem vom Schritt (c) verschiedenen Eluierungsmittel]; und
(e) Eluieren durch eine Gelpermeationssäule.

In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird die Elution durch die DEAE-Sepharose-Ionenaustauschchromatografie in einem Natriumphosphatpuffer bei pH 8 durchgeführt.
Die Elution durch die Q-Sepharose-Ionenaustauschchromatografie wird bevorzugt in einem Ammoniumacetatpuffer bei pH 7,5 durchgeführt.
Der Reversed Phase HPLC-Schritt (c) wird bevorzugt mit 2-Propanol/Ammoniumacetat als mobile Phase durchgeführt.
Der Reversed Phase HPLC-Schritt (d) wird bevorzugt mit 2-Propanol/Tris-HCl als mobile Phase durchgeführt.
Das LH der vorliegenden Erfindung ist bevorzugt humanes LH und ist am bevorzugtesten rekombinantes humanes LH, abgeleitet aus dem Kulturmedium von Säugerzellen (bevorzugt CHO-Zellen), die in dem rekombinanten Verfahren verwendet werden.
Es ist eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung, eine pharmazeutische Zusammensetzung bereitzustellen, die eine therapeutisch wirksame Menge des rekombinanten LH umfasst, hergestellt durch das rekombinante Verfahren, wie vorstehend beschrieben, zusammen mit geeigneten Arzneimittelträgern, wie Sucrose, die für die Stabilisierung des lyophilisierten Produkts notwendig sind. Die pharmazeutische Zusammensetzung des rekombinanten LH ist besonders für subkutane Verabreichung geeignet.
AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Die Erfindung stellt ein Verfahren für die Reinigung von LH bereit, insbesondere für die Reinigung von rekombinantem LH aus einer rohen Präparation in dem Kulturmedium des rekombinanten Verfahrens. r-hLH wird mit einem hohen Reinheitsgrad und hoher spezifischer Aktivität erhalten, praktisch frei von fötalen Rinderserumproteinen (FBS-Proteine), falls in dem Kulturmedium vorhanden, und von Nukleinsäuren oder anderen Verunreinigungen, die in den Wirtszellen enthalten sind, die in dem rekombinanten Verfahren verwendet werden.
Die Erfindung ist zur Verwendung mit biologischen Materialien bestimmt, insbesondere rohe Mischungen, die LH und andere verunreinigende Proteine enthalten, hierin als Ausgangsmaterialproben bezeichnet. Die nachstehend im Einzelnen beschriebenen Beispiele verwenden Ausgangsmaterialproben, die r-hLH enthalten, erhalten aus dem Kulturüberstandsmedium aus einem Bioreaktor. Alternativ ist die Probe humanes menopausales Gonadotropin (hMG), ein rohes Konzentrat von postmenopausalem Urin.
Die Probe wird gebildet durch frisches Sammeln von Zellkulturüberstandsmedium, das durch einen Bioreaktor geleitet wird. Es wird bevorzugt durch Filtration geklärt. Die rohe Lösung kann dann konzentriert, falls notwendig, und der Ultrafiltration unterworfen werden, um Material mit Molekulargewichten kleiner als 10 zu entfernen. Die Ultrafiltration erlaubt auch die Änderung des Puffers zu Natriumphosphat, pH 8.
Nach den vorbereitenden Schritten wird die Probe dann der Ionenaustauschchromatografie mit einem Anionenaustauscherharz und der Reversed Phase HPLC unterworfen, die bevorzugt jeweils zweimal durchgeführt werden. Der erste Ionenaustauschschritt wird bevorzugt mit DEAE-Sepharose durchgeführt. Dies ist im Wesentlichen ein LH-"Durchfluss"-schritt, in welchem ein großer Teil der Nicht-LH-proteine eliminiert werden. Der zweite Ionenaustauscherschritt wird bevorzugt mit einer Q-Sepharose-Säule durchgeführt. Dies ist ebenfalls ein LH-"Durchfluss"-schritt und ist ausgelegt, um potenzielle DNA und Wirtszelle- oder Mediumproteinverunreinigungen zu entfernen. In einer bevorzugten Ausführungsform wird dieser Schritt bei etwa 5°C durchgeführt, wobei mit Ammoniumacetatpuffer bei pH 7,5 eluiert wird.
Die Reversed Phase-Chromatografie auf Silica C18 wird ebenfalls bevorzugt zweimal durchgeführt und ist wirksam zum Entfernen von Spurenmengen von FBS, Zellprotein und Endotoxinverunreinigungen. Der erste HPLC-Schritt wird bevorzugt mit 2-Propanol/Ammoniumacetat als mobile Phase durchgeführt. Der zweite Reversed Phase HPLC-Schritt wird bevorzugt unter Verwendung von 2-Propanol/Tris-HCl als mobile Phase durchgeführt. Die Retentatlösung wird dann konzentriert und kann mit Ammoniumhydrogencarbonat, pH 8, gewonnen werden. Das konzentrierte Produkt wird bevorzugt der Gelpermeationschromatografie auf Sephacryl S100 HR unterworfen. In diesem Schritt wird eine Trennung auf der Grundlage der Molekülgröße erreicht mit dem Eluieren mit Ammoniumhydrogencarbonat pH 8, und das Eluat wird dann bevorzugt einer Filtration, um virale Verunreinigungen zu entfernen, dann einer Ultrafiltration auf Membranen mit 10 kD-Ausschluss in Natriumphosphatpuffer pH 8 unterworfen. Nach der Filtration wird die gereinigte LH-Masse bevorzugt in sterilen Flaschen bei niedriger Temperatur gelagert.
BEISPIEL 1
Reagenzien

Eisessig, analytische Reinheit (Ph. Eur.)
Ammoniumacetat, analytische Reinheit
Ammoniumhydrogencarbonat, analytische Reinheit (B. P.)
Zweibasisches Natriumphosphat, analytische Reinheit
Chlorwasserstoffsäure, analytische Reinheit (Ph. Eur.)
Phosphorsäure, analytische Reinheit (Ph. Eur.)
2-Propanol, analytische Reinheit (Ph. Eur.)
Natriumchlorid, analytische Reinheit (Ph. Eur.)
Monobasisches Natriumphosphat, analytische Reinheit
Natriumhydroxid-Pellets, analytische Reinheit (Ph. Eur.)
Trifluoressigsäure (TFA), HPLC-Reinheit
Tris(hydroxymethyl)aminomethan, analytische Reinheit
Wasser zur Injektion (WFI) (Ph. Eur.)

Summarisches Fließdiagramm des Reinigungsverfahrens
Die Tabelle 1 ist ein Fließdiagramm, welches das r-hLH-Reinigungsverfahren zusammenfasst, wobei die Funktionsprinzipien von jedem der Zwischenschritte angegeben sind.
Tabelle 1: Fließdiagramm, welches das r-hLH-Reinigungsverfahren zusammenfasst
Klärung, Konzentration, Dialyse und Filtration von Ernten (Schritt I)
In diesem Schritt (Schritt I) wird der Puffer zu einer kontrollierten Zusammensetzung geändert, und eine vorläufige Konzentration wird erreicht. Dieser Schritt wird bei etwa +5°C durchgeführt und wird individuell für jede Ernte während des Produktionszyklus des Bioreaktors wiederholt. Ein bevorzugter Temperaturbereich ist 5 ± 3°C.
(i) Klärung von Ernten
Nach den Erhalt von frisch gesammeltem Kulturmedium aus einem Bioreaktor wird das Material bevorzugt verarbeitet, beginnend mit der Klärung der Überstandslösung durch Filtration.
(ii) Konzentration/Dialyse von Ernten
Die Membranen, gelagert in 0,05 M Natriumhydroxid zwischen Einsätzen, werden mit WFI gespült, bis der pH auf etwa 8 abfällt.
Der Äquilibrierungspuffer, 0,05 M Natriumphosphat pH 8, ersetzt das Wasser. Nach dem Konditionieren wird die rohe r-hLH-Lösung aus dem Bioreaktor konzentriert und dialysiert, um Material mit Molekulargewichten von kleiner als 10 kD (Membranausschluss 10 kD) zu entfernen.
Das erhaltene Konzentrat wird bei etwa –15°C gelagert.
Ionenaustauschchromatografie auf DEAE-Sepharose CL-6B (Schritt II)
Der Chromatografieschritt ist ein r-hLH-"Durchfluss"-schritt, in welchem ein großer Teil der Nicht-r-hLH-proteine eliminiert wird, und die Lösung wird weiter konzentriert und dialysiert. Die Chromatografiestufen, wo Produkt durch die Säule geführt wird, werden in einem kalten Raum durchgeführt.
(i) Ionenaustauschchromatografie auf DEAE-Sepharose CL-6B
Die Säule wird mit einem schwach geladenen Anionenaustauscherharz, Diethylaminoethan-Sepharose (DEAE) gepackt, zuerst mit 0,15 M Natriumphosphat pH 8 äquilibriert. Ein bevorzugter pH-Bereich ist 8 ± 0,3.
Die Säule wird dann mit dem laufenden Puffer, 0,025 M Natriumphosphat pH 8, konditioniert. Ein bevorzugter pH-Bereich ist 8 ± 0,3.
Die r-hLH-Lösung wird auf die Säule durch eine Filtervorrichtung geladen, die sich auf der Säule als Wächter befindet.
Die Säule wird mit 0,025 M Natriumphosphat pH 8 beschickt. Ein bevorzugter pH-Bereich ist 8 ± 0,3. Das chromatografische Verfahren wird durch Spektrophotometrie bei 280 nm überwacht.
Der Anfangsausfluss wird verworfen, bis die Grundlinie die Absorptionsmarke von 5% erreicht.
Die r-hLH enthaltende nicht gebundene Fraktion wird gesammelt, bis die Grundlinie auf 10% abgefallen ist.
(ii) Ultrafiltration
Eine Ultrafiltrationsvorrichtung, ausgerüstet mit einer 100 kD-Ausschlussmembran, gelagert in 0,05 M NaOH, wird mit WFI gespült, bis der pH des Permeats etwa 8 beträgt.
Das Wasser wird durch den Äquilibrierungspuffer, 0,08 M Ammoniumacetat pH 7,5, ersetzt. Ein bevorzugter pH-Bereich ist 7,5 ± 0,3.
Die durch den Ionenaustauschchromatografieschritt erhaltene r-hLH-Lösung wird durch die 100 kD-Membran ultrafiltriert, und die Permeatfraktion wird gesammelt.
Das Ultrafilter wird mit aliquoten Anteilen von 0,08 M Ammoniumacetat pH 7,5 gewaschen, und sämtliche Waschfraktionen werden in der Permeatlösung gesammelt.
(iii) Konzentration/Dialyse
Eine Ultrafiltrationsvorrichtung, die mit einer 10 kD-Ausschlussmembran ausgerüstet ist, gelagert in 0,05 M NaOH, wird mit WFI gespült, bis der pH der Permeatfraktion etwa 8 beträgt. Das Wasser wird durch den Äquilibrierungspuffer, 0,08 M Ammoniumacetat pH 7,5, ersetzt.
Die r-hLH-Lösung wird konzentriert. Ammoniumacetat, 0,08 M pH 7,5, wird zu dem Retentat zugesetzt, und die Lösung wird konzentriert. Die Dialyse wird fortgesetzt, bis der pH und die Leitfähigkeit des Retentats gleich sind wie diejenigen des eintretenden Puffers. Das erhaltene Retentat wird gewonnen.
Ionenaustauschchromatografie auf Q-Sepharose mit raschem Durchfluss (Schritt III)
Dieser Schritt ist ebenfalls ein r-hLH-"Durchfluss"-schritt und ist ausgelegt, um potenzielle DNA und Wirtszelle- oder Mediumproteinverunreinigungen zu entfernen.
(i) Säuleäquilibrierung
Das Konditionieren der Säule wird mit laufendem Puffer, 0,08 M Ammoniumacetatpuffer pH 7,5, durchgeführt. Ein bevorzugter pH-Bereich ist 7,5 ± 0,3.
(ii) r-hLH-Reinigungsschritt auf Q-Sepharose FF
Die r-hLH-Lösung wird durch eine Filtervorrichtung aufgebracht, die sich auf der Q-Sepharose-Säule als Wächter befindet.
Die Säule wird weiter mit 0,08 M Ammoniumacetat pH 7,5 gewaschen.
Der Anfangsausfluss wird verworfen, bis die Grundlinie die 5% Absorptionsmarke erreicht.
Die r-hLH enthaltende nicht gebundene Fraktion wird gesammelt, bis die Grundlinie auf 10% abgefallen ist.
Die r-hLH-Lösung aus Schritt III kann gefroren für die nachfolgende Verwendung gelagert werden. Wenn sie bei einer Temperatur von –15°C oder darunter gelagert wird, wird das r-hLH-Zwischenprodukt bei +5 ± 3°C aufgetaut, typischerweise über eine Zeit von 24 ± 8 Stunden, bevor die Reversed Phase HPLC (Schritt IV) durchgeführt wird.
Erste präparative Reversed Phase HPLC (Schritt IV)
Dieser Schritt, durchgeführt bei Raumtemperatur, ist wirksam zur Entfernung von Spurenmengen von FBS/CHO-Protein und Endotoxinverunreinigungen.
(i) Säulenpackung und Harzaktivierung
Die Säule wird mit weitporigem C18 Siliciumdioxid gepackt, und, falls es neu ist, wird das C18-Harz mit 2-Propanol konditioniert.
(ii) Säuleäquilibrierung
Die Säule wird mit 12,4% Gew./Gew. 2-Propanol in 0,05 M Ammoniumacetatpuffer pH 7 äquilibriert. Ein bevorzugter pH-Bereich ist 7 ± 0,2.
(iii) pH und Volumeneinstellungen der r-hLH-Lösung aus Schritt III
Die r-hLH-Lösung wird mit konzentrierter Essigsäure auf pH 7 eingestellt. Ein bevorzugter pH-Bereich ist 7 ± 0,2.
Das Volumen der r-hLH-Lösung wird dann durch die Zugabe von 2-Propanol eingestellt, um eine Endkonzentration von 2-Propanol gleich 12,4% Gew./Gew. zu erhalten.
(iv) Filtration der eingestellten r-hLH-Lösung
Die mit einem 0,22 μm-Filter ausgerüstete Filtrationsvorrichtung wird mit 12,4% Gew./Gew. 2-Propanol in 0,05 M Ammoniumacetatpuffer pH 7 gewaschen. Ein bevorzugter pH-Bereich ist 7 ± 0,2.
Die eingestellte r-hLH-Lösung wird filtriert.
Der Rezipient wird mit aliquoten Teilen von 12,4% Gew./Gew. 2-Propanol in 0,05 M Ammoniumacetatpuffer pH 7 gespült, filtriert, und die Spülungen werden mit der r-hLH-Lösung vereinigt. Ein bevorzugter pH-Bereich ist 7 ± 0,2.
(v) r-hLH-Reinigungsschritt auf der ersten C18 RP-HPLC-Säule
Die r-hLH-Lösung wird auf die Säule aufgebracht, und die Chromatografie wird durch UV-Spektrofotometrie bei 280 nm überwacht.
Auf die Säule wird 12,4% Gew./Gew. 2-Propanol in 0,05 M Ammoniumacetatpuffer pH 7 aufgebracht, bis A₂₈₀ auf die Grundlinie zurückfällt, wonach die nicht gebundene Fraktion verworfen wird.
Die Elution des r-hLH wird anschließend mit einer mobilen Phase von 2-Propanol/Ammoniumacetat 0,05 M über einen linearen Gradienten von 14,7% bis 20,7% Gew./Gew. 2-Propanol durchgeführt.
Das r-hLH wird fraktioniert, wenn A₂₈₀ zu steigen beginnt. Sämtliche Fraktionen der r-hLH-Spitze, deren Höhen größer als 20% der ganzen Skala sind, werden vereinigt.
Zweite präparative Reversed Phase HPLC-Säule (Schritt V)
Dieser Schritt, durchgeführt bei Raumtemperatur, ist wirksam zur Entfernung von Spurenmengen von FBS/CHO-Protein und Endotoxinverunreinigungen.
(i) Säulenpackung und Harzaktivierung
Die Säule wird mit weitporigem C18 Siliciumdioxid gepackt, und, falls neu, wird das C18-Harz mit 2-Propanol konditioniert.
(ii) Säuleäquilibrierung
Die Säule wird mit 14,7% Gew./Gew. 2-Propanol in 0,5 M Tris-HCl-Puffer pH 7 äquilibriert. Ein bevorzugter pH-Bereich ist 7 ± 0,2.
(iii) Volumen- und pH-Einstellungen der r-hLH-Lösung aus Schritt IV
2 M Tris-HCl-Puffer pH 7 wird zu der r-hLH-Probe zugesetzt, um die Konzentration von 2-Propanol auf etwa die gleiche zu erniedrigen wie diejenige in dem Säuleäquilibrierungspuffer (14,7% Gew./Gew.).
Die r-hLH-Lösung wird auf pH 7 mit 12 M HCl eingestellt. Ein bevorzugter pH-Bereich ist 7 ± 0,2.
(iv) r-hLH-Reinigungsschritt auf der zweiten C18 RP-HPLC-Säule
Die r-hLH-Lösung wird auf die Säule aufgebracht, und die Chromatografie wird durch UV-Spektrofotometrie bei 280 nm überwacht.
Auf die Säule wird 14,7% Gew./Gew. 2-Propanol in 0,5 M Tris-HCl-Puffer pH 7 aufgebracht. Ein bevorzugter pH-Bereich ist 7 ± 0,2. Die nicht gebundene Fraktion wird verworfen.
Die Elution des r-hLH wird anschließend mit einer mobilen Phase von 2-Propanol/0,5 M Tris-HCl über einen linearen Gradienten von 14,7% bis 20,7% Gew./Gew. 2-Propanol durchgeführt.
Das r-hLH wird fraktioniert, wenn A₂₈₀ zu steigen beginnt. Sämtliche Fraktionen der r-hLH-Spitze, deren Höhen größer sind als 20% der ganzen Skala, werden vereinigt.
(v) Dialyse
Die r-hLH-Lösung aus dem zweiten C18 RP-HPLC-Schritt wird mit WFI verdünnt. Bevorzugt werden 8 Volumina WFI verwendet.
Die verdünnte r-hLH-Lösung wird durch Ultrafiltration auf einer 10 kD-Membran (vgl. Schritt VI) gegen WFI dialysiert. Aliquote Teile von 0,5 M Ammoniumhydrogencarbonat pH 8 werden anschließend zugesetzt, und die Dialyse wird fortgesetzt, bis die Charakteristiken des Ammoniumhydrogencarbonat-Puffers erfüllt sind.
Die Retentatlösung wird auf ein Endvolumen von etwa 1 Liter konzentriert und gewonnen. Das Ultrafilter wird mit 0,5 M Ammoniumhydrogencarbonat pH 8 gewaschen, und die Ultrafiltrationswaschflüssigkeiten werden mit dem Retentat vereinigt und optional weiter konzentriert. Diese weitere Konzentration ist abhängig von der Größe der in dem nächsten Schritt, d.h. Schritt VI, verwendeten Säule.
Gelpermeationschromatografie auf Sephacryl S100 HR und Ultrafiltration (Schritt VI)
In diesem Schritt wird eine Trennung auf der Grundlage der Molekülgröße erreicht, und die Lösung wird einer Ultrafiltration unterworfen. Sämtliche Vorgänge, die in diesem Schritt durchgeführt werden, werden bei etwa +5°C durchgeführt. Ein bevorzugter Temperaturbereich ist +5°C ± 3.
(i) Gelpermeationschromatografie auf Sephacryl S100 HR
Die Säule wird mit Sephacryl S100 HR gepackt und wird zuerst mit WFI äquilibriert.
Die Säule wird dann mit 0,5 M Ammoniumhydrogencarbonat pH 8 äquilibriert.
Auf die Säule wird 0,5 M Ammoniumhydrogencarbonat pH 8 aufgebracht. Das chromatografische Verfahren wird durch Spektrofotometrie bei 280 nm überwacht.
Das r-hLH wird fraktioniert, wenn A₂₈₀ zu steigen beginnt. Sämtliche Fraktionen der r-hLH-Spitze, deren Höhen größer sind als 20% der ganzen Skala, werden vereinigt.
Die r-hLH-Lösung, eluiert aus der Sephacryl S100 HR-Säule, wird dann vorzugsweise durch ein Filter, z.B. Virosolve^®, geführt, um virale Verunreinigungen zu entfernen.
(ii) Dialyse und Konzentration von r-hLH
Die Membranen (Ultrafiltrationsmembranen 10 kD), gelagert in 0,05 M Natriumhydroxid zwischen Reinigungsvorgängen, werden mit WFI gespült, bis der pH auf etwa 8 absinkt.
Die verdünnte r-hLH-Lösung wird dialysiert (durch Ultrafiltrationsmembranen 10 kD) gegen WFI. Aliquote Teile von 0,01 M Natriumphosphatpuffer pH 8 werden anschließend zugesetzt, und die Dialyse wird fortgesetzt, bis die Charakteristiken des Natriumphosphatpuffers erfüllt sind.
Falls notwendig, wird die Retentatlösung auf ein Endvolumen von etwa 500 ml konzentriert und gewonnen. Das Ultrafilter wird mit 0,01 M Natriumphosphatpuffer pH 8 gewaschen, und die Ultrafilterwaschflüssigkeiten werden mit dem Retentat vereinigt.
Ein weiterer optionaler LH-Konzentrationsschritt kann abhängig von der für die Lagerung ausgewählten Bedingung durchgeführt werden.
Die r-hLH-Lösung wird filtriert und das Filtrat in einem sterilen Gefäß gesammelt.
Die gereinigte r-hLH-Masse wird bevorzugt in sterilen Flaschen bei etwa –15°C gelagert.
Reagenzien, Puffer, Eluierungsmittel und Chemikalien
Chromatografische Harze
Die folgenden chromatografischen Harze werden derzeit in dem Reinigungsverfahren verwendet. Äquivalente Harze können ebenfalls in dem Reinigungsverfahren verwendet werden.
Die Lieferanten sind:

Amersham Pharmacia Biotech, Waters Corporation

Björkgatan 30 34 Maple Street

S-751 84, Uppsala Milford, MA 01757

Schweden USA
ERGEBNISSE
Biologische Aktivität
Die biologische Aktivität von verschiedenen Ansätzen von r-LH nach der Reinigung mit dem Verfahren der vorliegenden Erfindung ist in der Tabelle 2 wiedergegeben. Die Proteinkonzentration (mg LH-Protein/ml) ist durch Spektrofotometrie bei 276,5 nm bestimmt worden unter Verwendung des experimentell abgeleiteten Absorptionsvermögens auf der Grundlage einer Aminosäuresequenzanalyse a = 0,812.
Die mittlere spezifische Aktivität der r-LH-Präparation ist besonders hoch und beträgt etwa 25000 IU/mg (LH-Protein).
Tabelle 2 Spezifische Aktivität von r-hLH-Masseansätzen
Formulierungen
Gefriergetrocknete Formulierungen sind mit hoch gereinigter rekombinanter LH der vorliegenden Erfindung entwickelt worden.
Als typisches Beispiel wurde eine gefriergetrocknete Formulierung mit einer Aktivität von 75 IU in Ampullen DIN 2R unter Verwendung von Sucrose als Arzneimittelträger hergestellt (Tabelle 3), die bei 4°C einige Monate stabil war.
Tabelle 3

Claims

Verfahren zur Reinigung von LH aus einer Probe, umfassend die Verwendung von Ionenaustauschchromatografie mit einem Anionenaustauscherharz und Reversed Phase HPLC.
Verfahren gemäß Anspruch 1, umfassend die Schritte: (a) Unterwerfen der Probe der Ionenaustauschchromatografie zum Herstellen eines ersten Eluats, (b) Unterwerfen des ersten Eluats der Reversed Phase HPLC zum Herstellen eines zweiten Eluats und (c) Aufbringen des zweiten Eluats auf eine Gelpermeationschromatografie.
Verfahren gemäß Anspruch 1, worin die Ionenaustauschchromatografie und die Reversed Phase HPLC zweimal durchgeführt werden.
Verfahren gemäß Anspruch 1, umfassend die Schritte: (a) Eluieren der Probe durch eine DEAE-Sepharose-Ionenaustauschchromatografiesäule, (b) Eluieren durch eine Q-Sepharose-Ionenaustauschchromatografiesäule, (c) Eluieren durch eine Silica C18-Reversed Phase HPLC-Säule, (d) weiteres Eluieren durch eine Silica C18 Reversed Phase HPLC-Säule und (e) Eluieren durch eine Gelpermeationssäule.
Verfahren gemäß Anspruch 4, worin die Elution durch die DEAE-Sepharose-Ionenaustauschchromatografie in Natriumphosphatpuffer bei pH 8 durchgeführt wird.
Verfahren gemäß Anspruch 4, worin die Elution durch die Q-Sepharose-Ionenaustauschchromatografie in Ammoniumacetatpuffer bei pH 7,5 durchgeführt wird.
Verfahren gemäß Anspruch 4, worin der Reversed Phase HPLC-Schritt (c) mit 2-Propanol/Ammoniumacetat als mobile Phase durchgeführt wird.
Verfahren nach Anspruch 4, worin der Reversed Phase HPLC-Schritt (d) mit 2-Propanol/Tris-HCl als mobile Phase durchgeführt wird.
Verfahren gemäß Anspruch 1, worin LH humanes LH ist.
Verfahren gemäß Anspruch 1, worin die Probe ein Kulturmedium aus CHO-Zellen ist.
Rekombinantes hLH mit einer spezifischen Bioaktivität von 20522 bis 31229 IU/mg.
Rekombinantes hLH gemäß Anspruch 11 mit einer spezifischen Bioaktivität von etwa 25000 IU/mg.
Verwendung von rekombinantem hLH gemäß Anspruch 11 oder 12 zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung einer Fruchtbarkeitsstörung.
Pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend eine therapeutisch wirksame Menge des rekombinanten hLH gemäß Anspruch 11 oder 12 und geeignete Arzneimittelträger dafür.
Pharmazeutische Zusammensetzung gemäß Anspruch 14, worin der Arzneimittelträger Sucrose ist.
Pharmazeutische Zusammensetzung gemäß Anspruch 15, weiter umfassend Tween 20, Dinatriumphosphat-Dihydrat und Mononatriumphosphat-Monohydrat.
Pharmazeutische Zusammensetzung gemäß einem der Ansprüche 14 bis 16 für subkutane Verabreichung.