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DE60125598T2 - Methode zur herstellung einer mikroflüssigkeitsstruktur, insbesondere eines "biochips", und damit erzeugte struktur - Google Patents

Methode zur herstellung einer mikroflüssigkeitsstruktur, insbesondere eines "biochips", und damit erzeugte struktur Download PDF

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DE60125598T2
DE60125598T2 DE60125598T DE60125598T DE60125598T2 DE 60125598 T2 DE60125598 T2 DE 60125598T2 DE 60125598 T DE60125598 T DE 60125598T DE 60125598 T DE60125598 T DE 60125598T DE 60125598 T2 DE60125598 T2 DE 60125598T2
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Germany
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membrane
microwells
microform
layer
microfluidic structure
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Bruno Le Pioufle
Horoyuki Fujita
Eiichi Tatsunokuchi TAMIYA
Laurent Griscom
Patrick Degenaar
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Original Assignee
Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
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Description

  • Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zum Herstellen einer Mikrofluidstruktur, insbesondere eines Biochips, und eine Struktur, die durch dieses Verfahren erhalten wird.
  • Es besteht ein steigendes Interesse in der biologischen und medizinischen Forschergemeinschaft mikro-bearbeitete Strukturen und Mikroelektronik für biologische Messungen oder Mikromanipulation zu integrieren. Mikrostrukturen zum schnellen Separieren und Isolieren von Zellen in biologischen Assays sind von großem Interesse für Forschungslaboratorien und die pharmazeutische Industrie. Zum Beispiel ist im Fall von neuralen Kulturen das gesteuerte Führen von Neuronen ein gewünschtes Merkmal eines Biochips für die Erforschung und das Verstehen der komplexen Entwicklung von neuralen Netzwerken.
  • Das neue Gebiet der Mikrofluidtechnik stellt sich durch Bereitstellen von kostengünstigen, biologisch kompatiblen und Einwegvorrichtungen zum Handhaben von kleinen Mengen biologischer Materialien und Chemikalien als Segen heraus. Mikrofluidstrukturen sind in Techniken wie der PCR und der kapillarelektrophoretischen Zellmanipulation unentbehrlich geworden. Diese Mikrofluidvorrichtungen werden häufig unter Verwenden einer Variante von Polydimethylsiloxan (PDMS) hergestellt, indem die Kanäle gewöhnlich durch Mikrogießen und Aufbringen auf ein Glassubstrat hergestellt werden. Diese Strukturen sind dennoch häufig geschlossene Strukturen, die auf zwei Dimensionen mit einem Eingangs- und einem Ausgangsende beschränkt sind. Komplexere Strukturen mit vielen Ebenen können durch Stapeln von mehreren Schichten von Mikrofluidstrukturen hergestellt werden, doch diese sind häufig schwierig abzugleichen und bieten keine genaue Ausrichtung im Mikromaßstab.
  • Der Gegenstand der Erfindung ist das Konzipieren einer neuen Mikrofluidstruktur, insbesondere eines Biochips, wobei die Mikrofluidstruktur eine dreidimensionale Geometrie aufweist.
  • Zu diesem Zweck stellt die Erfindung ein Verfahren zum Herstellen einer Mikrofluidstruktur, insbesondere eines Biochips bereit, wobei das Verfahren umfasst:
    • – Rotationsbeschichten einer ersten Resistschicht auf einer Seite eines Substrats und Backen der ersten Schicht in einem ersten Schritt;
    • – Belichten der ersten Resistschicht mit UV-Strahlung durch eine Maske zum Definieren von wenigstens der Geometrie von Mikronuten in einem zweiten Schritt;
    • – Rotationsbeschichten einer zweiten Resistschicht auf die erste Schicht, ohne die erste Schicht zu entwickeln, und Backen der zweiten Schicht in einem dritten Schritt;
    • – Belichten der zweiten Resistschicht mit UV-Strahlung durch eine Maske zum Definieren von wenigstens der Geometrie von vertikalen Mikrovertiefungen in einem vierten Schritt; und
    • – Entwickeln der Schichten in einem letzten Schritt, zum Erhalt einer dreidimensionalen Mikroform zum Verwenden beim Gießen einer Membran aus einem Polymermaterial, das zwischen der Mikroform und einer auf die Oberseite der Mikroform gepressten Platte injiziert wurde.
  • Beispielsweise besteht das Verfahren im Injizieren des Polymermaterials zwischen die Mikroform und eine auf die Oberseite der Mikroform gepressten Platte und im Backen des Polymermaterials bei einer Temperatur von ungefähr 70°C während angenähert einer Stunde, zum Bilden der Membran mit dem Mikrovertiefungen, die die Membran durchqueren und den Mikronuten auf einer Seite der Membran.
  • Vorteilhafterweise besteht das Verfahren im Verwenden eines Polymermaterials mit hydrophoben Eigenschaften zum Bilden der Membran und im Verwenden eines Substrats aus einem Material, das ebenso hydrophobe Eigenschaften aufweist, zum Erhalt einer natürlichen Haftung zwischen der Membran und dem Substrat.
  • Beispielsweise besteht das Verfahren im Verwenden eines Polymermaterials, wie Polydimethylsiloxan (PDMS), zum Bilden der Membran.
  • Vorteilhafterweise besteht das Verfahren im Hydrophilisieren der Mikrovertiefungen und der Mikronuten oder der Mikrokanäle der Membran durch eine Behandlung wie Sauerstoffplasmabehandlung.
  • Insbesondere besteht das Verfahren aus einem Inkontaktsetzen der Membran mit einem Glassubstrat vor Anwenden der Sauerstoffplasmabehandlung, wobei die Seite der Membran in Kontakt mit dem Glassubstrat ihre hydrophoben Eigenschaften beibehält.
  • In einer ersten Ausführungsform besteht das Verfahren im Erhalten einer Silicium-Mikroform durch ein reaktives Ionenätzen mit induktiv gekoppeltem Plasma (ICP RIE), wobei das Ätzen dreidimensional erfolgt und wenigstens ein erstes Ätzen zum Bilden der Mikronuten oder Mikrokanäle und ein zweites Ätzen zum Bilden der Mikrovertiefungen erfordert.
  • Vorteilhafterweise besteht das Verfahren in der ersten Ausführungsform im Aussetzen der erhaltenen Silicium-Mikroform unter eine CHF3-Plasmabehandlung zum Minimieren der Haftung zwischen der Oberfläche der erhaltenen Silicium-Mikroform und der in der Mikroform zu gießenden Membran.
  • In einer zweiten Ausführungsform besteht das Verfahren im Erhalten einer Resist-Mikroform durch wenigstens zwei aufeinander folgende UV-Bestrahlungen durch eine Maske und ohne dazwischen liegende Entwicklung, wobei die erste Bestrahlung Mittel zum Bilden der Mikronuten und die zweite Bestrahlung, nach Rotationsbeschichten der zweiten Resistschicht, Mittel zum Bilden der Mikrovertiefungen definiert.
  • Vorteilhafterweise besteht das Verfahren in der zweiten Ausführungsform in Verwenden eines Resistmaterials wie SU8.
  • Die Erfindung betrifft ebenso eine dreidimensionale Mikrofluidstruktur, wie sie durch das erfindungsgemäße Verfahren erhalten werden kann.
  • Die Kombination von mikro-bearbeiteten Biochips mit dreidimensional strukturierten Mikrofluidmembranen wird zu hoch parallelisierten Mikrosystemen führen, die geeignet sind einzelne Zellen oder kleine Gruppen von lebenden Zellen, in einer Anordnung von wenigstens ein paar hundert Vertiefungen, für die Abtastung oder für Manipulationszwecke zu isolieren. Diese so genannten Zellbiochips sind für die Industrie oder die Forschung von großem Interesse.
  • Insbesondere ist die Erfindung nützlich, wo eine große Anzahl von parallelen Manipulationen an Zellen durchgeführt werden muss. Die vorgeschlagene dreidimensionale Mikrofluidstruktur in der Zellen in einer Anordnung von Mikrovertiefungen angeordnet sind, welche unterhalb der Oberfläche durch Mikrofluidkanäle verbunden sind, kann folgende Anwendungsmöglichkeiten haben:
    • – Pharmakologie und Hochleistungsselektion wo hoch parallelisierte Techniken absolut notwendig sind: in der dreidimensionalen Mikrofluidstruktur sind die Vertiefungen, die einzelne Zellen enthalten, zu einem Mikrofluidnetzwerk unterhalb der Oberfläche verbunden, was das Zuführen von pharmazeutischen Produkten (sehr wenig Produkte, schnell, hoch parallelisiert) erlaubt.
    • – Gentransfer, da heutige Transfektionstechniken nicht effizient sind und der Zellchip der Erfindung eine Schlüsselvorrichtung sein könnte, die geeignet ist einzelne Zellen als Anordnung für die Analyse und Optimierung der Transfektion zu isolieren,
    • – ex-vivo Kultur und gerichtetes Wachstum von Neuronen für Grundlagenforschung, und
    • – Zell-Biosensoren (Messung von Umweltwirkungen und Schadstoffwirkungen auf Zellen).
  • Andere Eigenschaften, Vorteile und Details der Erfindung werden aus der folgenden erläuternden Beschreibung mit Bezug auf die zugehörige Zeichnungen, die nur als Beispiele gegeben werden, deutlich, und in denen:
  • 1 eine unvollständige perspektivische Ansicht einer dreidimensionalen Mikrofluidstruktur ist, die gemäß dem Verfahren der Erfindung hergestellt wurde, und
  • 2a bis 2e schematische Ansichten zum Erläutern des Verfahrens der Erfindung entsprechend einer bevorzugten Ausführungsform sind.
  • Eine dreidimensionale Mikrofluidstruktur 1 entsprechend einer Ausführungsform der Erfindung ist in 1 dargestellt.
  • Die dreidimensionale Mikrofluidstruktur 1 wird durch wenigstens eine Membran 3 und ein Substrat 5 gebildet. Die Membran 3 schließt wenigstens eine Anordnung von vertikalen Mikrovertiefungen 7, die die Membran 3 durchqueren, ein und longitudinale Mikronuten 9, die auf einer der Seiten der Membran angeordnet sind und wenigstens einige der Mikrovertiefungen 7 untereinander verbinden.
  • Diese dreidimensionale Mikrofluidstruktur 1 wird direkt durch Gießen entsprechend einem ersten oder einem zweiten Verfahren erhalten.
  • Das erste Verfahren erlaubt das Erhalten einer Silicium-Mikroform durch ein tiefes Plasmaätzen (ICP RIE reaktives Ionenätzen mit induktiv gekoppelten Plasma). Das Ätzen muss dreidimensional sein und wenigstens zwei Ebenen des Ätzens sind erforderlich: eine für die Mikrokanäle und eine für die offenen Vertiefungen.
  • Vorteilhafterweise ist die Oberfläche der dreidimensionalen Mikrofluidstruktur von einem kohlenstoffhaltigen Polymer bedeckt, das mittels Aussetzen der Oberfläche unter ein CHF3-Plasma zum Minimieren der Haftung zwischen der Oberfläche der erhaltenen Silicium-Mikroform und der in der Mikroform zu gießenden Membran, erhalten wird.
  • Das zweite Verfahren erlaubt das Erhalten einer dicken Resistform, wobei das verwendete Resistmaterial z. B. SU8 ist. Im Allgemeinen sind wenigstens zwei aufeinander folgende UV-Bestrahlungen durch eine Maske, ohne dazwischen liegende Entwicklung erforderlich, was es erlaubt die dreidimensionale Geometrie der Membran zu definieren. Konkret erlaubt wenigstens eine erste Bestrahlung das Definieren der Geometrie der Mikrokanäle und eine zweite Bestrahlung erlaubt, nach Rotationsbeschichten der zweiten Resistschicht, das Definieren der Geometrie der Mikrovertiefungen. Das Ausrichten der beiden Geometrien kann ohne Entwickeln des Resistmaterials von aufeinander folgenden Schichten durchgeführt werden: tatsächlich verändert die UV-Bestrahlung den Refraktionsindex des bestrahlten Resistmaterials und daher werden die gerichteten Oberflächen sichtbar. Eine komplexere Struktur könnte durch Rotationsbeschichten und UV-Bestrahlung von aufeinander folgenden Schichten erhalten werden. Die gesamte Geometrie der Mikroform wird dann in einem bestimmten Entwickler entwickelt.
  • Insbesondere besteht das Verfahren, wie in 2a dargestellt, in einem ersten Schritt, dem Rotationsbeschichten einer ersten Schicht 11 aus SU8 auf die Oberfläche eines Substrats 13. Die Dicke dieser ersten Schicht 11 beträgt ungefähr 20 μm bis 300 μm, wobei diese Dicke durch die Geschwindigkeit und die Dauer des Rotationsbeschichtungsverfahrens bestimmt wird. Dann wird die erste Schicht 11 gebacken.
  • In einem zweiten Schritt wird, wie es in 2 dargestellt ist, die erste Resistschicht 11 einer UV-Bestrahlung durch eine Maske (nicht dargestellt) zum Definieren wenigstens der Geometrie 9a der Mikronuten 9, unterworfen.
  • In einem dritten Schritt wird, wie es in 2c dargestellt ist, ohne Entwicklung der ersten Schicht 11, eine zweite Resistschicht 15 auf die erste Schicht 11 rotationsbeschichtet. Die Dicke der zweiten Schicht 15 wird ebenso durch die Geschwindigkeit und die Dauer des Rotationsbeschichtungsverfahrens bestimmt, wobei die Dicke ungefähr 20 μm bis 300 μm beträgt. Die zweite Schicht 15 wird dann gebacken.
  • In einem vierten Schritt wird, wie es in 2d dargestellt ist, die zweite Resistschicht 15 einer UV-Bestrahlung durch eine Maske (nicht dargestellt) zum Bestimmen wenigstens der Geometrie 7a der Mikrovertiefungen 7 unterworfen.
  • In einem letzten Schritt wird, wie es in 2e dargestellt ist, die Struktur auf eine Weise entwickelt, die per se bekannt ist, um eine dreidimensionale Mikroform 20 einschließlich Mitteln zum Definieren der longitudinalen Mikronuten 9 und vertikalen Mikrovertiefungen 7 zu erhalten. Das Ausrichten der Schichten 11 und 15 wird infolge der Veränderung des Refraktionsindexes der belichteten Oberflächen durchgeführt, die durch Mikroskopie sichtbar werden.
  • Die dreidimensionale Mikroform 20, die durch eines der zwei dargestellten Verfahren erhalten wird, wird dann zum Gießen einer Membran aus einem Polymermaterial, wie Polydimethylsiloxan (PDMS), das hydrophobe Eigenschaften aufweist, verwendet. Das Polymer (PDMS) wird zwischen die Form und eine Polyacrylplatte injiziert, die auf die Oberfläche der Formstruktur gepresst ist. Nach einer Stunde des Backens bei 70°C wird die Membran gebildet: Mikrovertiefungen durchqueren die Membran und Mikrokanäle werden auf einer der Membranseiten gebildet.
  • In einer ersten Ausführungsform kann die mikro-gegossene Membran eine dreidimensionale Mikrofluidstruktur festlegen.
  • In einer zweiten Ausführungsform ist, wie es in 1 dargestellt ist, die mikro-gegossene Membran mit dem Substrat 5 verbunden.
  • Beispielsweise kann das Substrat 5 aus einem Elektronikchip bestehen, der wenigstens Mikroelektroden 22 umfasst, die mit einem elektronischen Schaltkreis durch Mikroleiter 24 verbunden sind. Die Mikroelektroden 22 können vergoldet werden und das Substrat 5 ist vorteilhafterweise aus einem Material mit hydrophoben Eigenschaften.
  • Die Membran wird direkt auf den elektronischen Chip unter einem Mikroskop aufgebracht, so dass die Mikrovertiefungen mit den Elektroden des Elektronikchips ausgerichtet werden können. Die Membran und der Elektronikchip haften aufgrund ihrer hydrophoben Eigenschaften aneinander.
  • Vorteilhafterweise sind die Mikroleiter 24 und das Substrat 5 durchsichtig, um die Mikrofluidstruktur durch Mikroskopie visualisieren zu können. Zum Beispiel wird das Substrat 5 durch eine Glasplatte gebildet und die Mikroleiter 24 sind aus ITO (Indiumzinnoxid). Im Allgemeinen werden die Materialien ausgewählt, um die Biokompatibilität der Mikrofluidstruktur mit biologischen Substanzen und lebenden Zellen sicher zu stellen, die mit der Mikrofluidstruktur behandelt werden. Wenn die verwendeten Materialien die Bedingung der Biokompatibilität nicht erfüllen, werden diese entsprechend behandelt, d. h. mit einer geeigneten Beschichtung.
  • Die Mikrovertiefungen und die Mikrokanäle müssen hydrophil gemacht werden, um es den Zellen zu erlauben in die Mikrovertiefungen zu gelangen, und um es wässrigen biochemischen Verbindungen zu erlauben in die Mikrokanäle zu gelangen. Andererseits muss die Oberfläche der Mikromembran, die dem elektronischen Chip gegenüberliegt ihre hydrophoben Eigenschaften beibehalten, um die Haftung zwischen beiden Oberflächen zu bewahren. Zum Beispiel wird eine Sauerstoffplasmabehandlung auf der Membran angewandt, während diese auf einem Glassubstrat befestigt ist (unterschiedlich zu dem Substrat des elektronischen Chips): das Plasma dringt ein und verändert die Eigenschaften der Mikrovertiefungen und Mikrokanäle, wodurch ihre Oberflächen hydrophil gemacht werden.
  • In Allgemeinen haben in einer dreidimensionalen Mikrofluidstruktur, die durch das erfindungsgemäße Verfahren erhalten wird, die Mikrovertiefungen der Membran von 30 μm bis 100 μm variierende Dimensionen, und die Membran hat eine Dicke von ungefähr 40 μm bis 300 μm. Darüber hinaus haben die Mikrokanäle einen rechteckigen Abschnitt, dessen Größen von 10 μm bis 300 μm variieren und die Anzahl der Mikrovertiefungen kann in einem Bereich von 100 bis 10000/cm2 umfasst sein.

Claims (11)

  1. Verfahren zum Herstellen einer Mikrofluidstruktur, insbesondere eines Biochips, umfassend: – Rotationsbeschichten einer ersten Resistschicht (11) auf eine Seite eines Substrats (13) und Backen der ersten Schicht (11) in einem ersten Schritt; – Belichten der ersten Resistschicht (11) mit UV-Strahlung durch eine Maske zum Definieren von wenigstens der Geometrie (9a) von Mikronuten (9) in einem zweiten Schritt; – Rotationsbeschichten einer zweiten Resistschicht (15) auf die erste Schicht (11), ohne die erste Schicht (11) zu entwickeln, und Backen der zweiten Schicht (15) in einem dritten Schritt; – Belichten der zweiten Resistschicht (15) mit UV-Strahlung durch eine Maske zum Definieren von wenigstens der Geometrie (7a) von vertikalen Mikrovertiefungen (7) in einem vierten Schritt; und – Entwickeln der Schichten (11, 15) in einem letzten Schritt, zum Erhalt einer dreidimensionalen Mikroform (20) zum Verwenden beim Giessen einer Membran aus einem Polymermaterial, das zwischen der Mikroform und einer auf die Oberseite der Mikroform gepressten Platte injiziert wurde.
  2. Verfahren gemäß Anspruch 1, bei dem die erste (11) und die zweite Schicht (15) aus einem SU8-Material hergestellt sind.
  3. Verfahren gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, bestehend im Backen des Polymermaterials bei einer Temperatur von ungefähr 70°C während angenähert einer Stunde zum Bilden der Membran mit den Mikrovertiefungen, die die Membran durchqueren und der Mikronuten auf einer der Seiten der Membran.
  4. Verfahren gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, bestehend in der Verwendung eines Polymermaterials mit hydrophoben Eigenschaften zum Erhalt einer natürlichen Haftung zwischen der Membran und dem Substrat.
  5. Verfahren gemäß Anspruch 4, bestehend in der Verwendung eines Polymermaterials, wie Polydimethylsiloxan (PDMS), zum Bilden der Membran.
  6. Verfahren gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, bestehend im Hydrophilisieren der Mikrovertiefungen und der Mikronuten oder Mikrokanäle der Membran durch eine Behandlung wie Sauerstoff-Plasmabehandlung.
  7. Verfahren gemäß Anspruch 6, bestehend in einem Inkontaktsetzen der Membran mit einem Glassubstrat vor Anwenden der Sauerstoff-Plasmabehandlung, wobei die Seite der Membran in Kontakt mit dem Glassubstrat ihre hydrophoben Eigenschaften beibehält.
  8. Verfahren gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, bestehend im Erhalten einer Silicium-Mikroform durch ein reaktives Ionenätzen mit induktiv gekoppeltem Plasma (ICP RIE), wobei das Ätzen dreidimensional erfolgt und wenigstens ein erstes Ätzen zum Bilden der Mikronuten oder Mikrokanäle und ein zweites Ätzen zum Bilden der Mikrovertiefungen erfordert.
  9. Verfahren gemäß Anspruch 8, bestehend im Aussetzen der erhaltenen Silicium-Mikroform unter eine CHF3-Plasmabehandlung zum Minimieren der Haftung zwischen der Oberfläche der erhaltenen Silicium-Mikroform und der in der Mikroform zu gießenden Membran.
  10. Mikrofluidstruktur, wie nach einem Verfahren gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche hergestellt, wobei die Struktur wenigstens eine aus einem Polymermaterial hergestellte Membran umfasst und wenigstens Mikrovertiefungen und Mikronuten oder Mikrokanäle einschließt, die die Mikrovertiefungen miteinander verbinden, wobei die Membran eine dreidimensionale Mikro-Struktur darstellt, dadurch gekennzeichnet, dass die Mikrovertiefungen der Membran von 30 μm bis 100 μm variierende Dimensionen besitzt, dass die Membran eine Dicke von ungefähr 40 μm bis 300 μm besitzt, dass die Mikrokanäle einen rechteckigen Abschnitt besitzen, dessen Größen von 10 μm bis 300 μm variieren, und dass sie Anzahl der Mikrovertiefungen in einem Bereich von 100 bis 10000/cm2 umfasst sein können.
  11. Mikrofluidstruktur nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass das (die) für die Mikrofluidstruktur verwendete(n) Materialien) biokompatibel oder durch eine spezifische Beschichtung mit den biologischen Substanzen und lebenden Zellen, die von der Mikrofluidstruktur behandelt werden sollen, biokompatibel gemacht wird (werden).
DE60125598T 2001-06-08 2001-06-08 Methode zur herstellung einer mikroflüssigkeitsstruktur, insbesondere eines "biochips", und damit erzeugte struktur Expired - Lifetime DE60125598T2 (de)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
PCT/EP2001/007058 WO2002100542A1 (en) 2001-06-08 2001-06-08 Method of manufacturing a microfluidic structure, in particular a biochip, and structure obtained by said method_________________

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