DE60125386T2

DE60125386T2 - Verfahren zur Prävention einer durch Gefrieren induzierten Abnahme der Aktivität eines Proteins

Info

Publication number: DE60125386T2
Application number: DE60125386T
Authority: DE
Inventors: Shigeru Nakamori; Hiroshi Fukui-shi Takagi; Kenritsu Masakazu B-307 TAKAHASHI; Kazuhisa Fukui-shi TSUJIMOTO; Hideyuki Fukui-shi Yamada
Original assignee: Seiren Co Ltd
Current assignee: Seiren Co Ltd
Priority date: 2000-09-29
Filing date: 2001-10-01
Publication date: 2007-04-12
Anticipated expiration: 2021-10-02
Also published as: WO2002026800A1; US20030166186A1; DE60125386D1; US6887979B2; EP1321473A4; EP1321473B1; ATE348840T1; EP1321473A1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zum Schützen von Proteinen vor einer Denaturierung, welche auftritt, wenn die Proteine eingefroren werden. Weiterhin betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung von Polypeptiden zum Schützen von Proteinen vor einer solchen Denaturierung, die durch Gefrieren verursacht wird.
Auf dem Gebiet der Gentechnologie, Biochemie, Nahrungsmittel- und pharmazeutischen Industrie und dergleichen werden verschiedene Proteine, einschließlich Enzymen, häufig durch Einfrieren konserviert.
Es ist aus Troiskaya, Prikladnaya Biokhimiya i Microbiologiya (1980) 16: 254-256 bekannt, dass Sericin-Protein, eingeschlossen in Kryokonservierungsmittel vom Polymer-Typ, zur Kyrokonservierung einer Bakterienzelle selbst verwendet wird, ohne die Zelle zu zerstören.
SU1189448 handelt von einer Zusammensetzung, welche Sericinglutaminsäure zur Kryokonservierung von Rindersperma enthält.
Kroklina und Kulikov, Prikladnaya Biokhimiya i Microviologiya (1980) 16: 254-256 handelt von der Verwendung von Sericin während der Lyophilisierung von Bodenbakterien.
Allgemein ist von Proteinen bekannt, dass diese ihre hochdimensionale Struktur beim Einfrieren und Auftauen ändern. Wenn eine solche Denaturierung von Proteinen, die mit dem Einfrieren verbunden ist (hiernach gelegentlich Gefrierdenaturierung genannt), auftritt, kann die Proteinaktivität verringert oder vollständig verloren werden, was Probleme bei der Lagerung von Proteinen verursacht.
Herkömmlicherweise werden gewöhnlich, um eine solche Gefrierdenaturierung von Proteinen zu verhindern, Rinderserumalbumin (BSA), Glycerol, Zucker oder dergleichen zu den Proteinen zugegeben, damit diese zur Lagerung eingefroren aufbewahrt werden können.
Wenn jedoch die oben erwähnten Zusätze verwendet werden, ist Rinderserumalbumin (BSA) in seiner Beschaffung beschränkt und im Allgemeinen sehr teuer. Weiterhin können Seren, die aus Tieren stammen, aufgrund ihres möglichen Risikos von Virusinfektionen die Sicherheit nicht hinreichend gewährleisten. Weiterhin müssen Glycerol, Zucker oder dergleichen in einer Konzentration zugegeben werden, die so hoch wie 20% oder ähnlich ist, was die Aktivität der Proteine von Interesse beeinträchtigt. Weiterhin kann in diesem Fall ein Verfahren, um die oben erwähnten Zusätze zu entfernen, das von der Art der Proteine oder ihrer Verwendung abhängt, nach dem Einfrieren und Auftauen benötigt werden, was einem komplizierten Schritt der Entfernung erforderlich machen kann oder die Kosten erhöhen kann. Auch aus diesem Grund war die Verwendung dieser Zusätze nicht wünschenswert.
Demgemäß gibt es immer noch einen Bedarf für Mittel, um eine durch Gefrieren hervorgerufene Verminderung der Proteinaktivität oder eine Inaktivierung von Proteinen während Einfrier-/Auftau-Zyklen zu verhindern.
Die gegenwärtigen Erfinder haben vor kurzem gefunden, dass Polypeptide mit einer speziellen Aminosäure-Wiederholungssequenz bei der Verhinderung einer Verminderung der Aktivität oder der Inaktivierung von Proteinen wie z.B. Enzymen, die mit einer Gefrierdenaturierung verbunden ist, wirksam sind. Die vorliegende Erfindung basiert auf diesem Fund.
Demgemäß ist es eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Mittel bereit zu stellen, um eine durch Gefrieren hervorgerufene Verminderung der Aktivität eines Proteins zu verhindern.
Weiterhin ist ein Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung ein Verfahren zum Verhindern einer durch Gefrieren hervorgerufenen Verminderung der Aktivität eines Proteins, umfassend das Zugeben eines Polypeptids, das die folgende Aminosäuresequenz (I) umfasst, zu einem Protein von Interesse:
Ser-Ser-Thr-Gly-Ser-X1-Ser-X2-Thr-Asp-X3-X4-X5-X6-X7-X8-Gly-Ser-X9-Thr-Ser-Gly-Gly-Ser-Ser-Thr-Tyr-Gly-Tyr-Ser-Ser-X10-X11-X12-X13-Gly-X14-Val(I) (SEQ ID NO: 1) wobei:
X1 für Ser oder Thr steht,
X2 für Asn oder Thr steht,
X3 für Ser oder Ala steht,
X4 für Asn oder Ser steht,
X5 für Ser oder Thr steht,
X6 für Asn, Asp oder Lys steht,
X7 für Ser, Asn oder Lys steht,
X8 für Ala, Thr oder Val steht,
X9 für Ser oder Arg steht,
X10 für Asn, Ser, Asp oder Arg steht,
X11 für Ser, Asn, His oder Cys steht,
X12 für Arg oder Gly steht,
X13 für Asp oder Gly steht, und
X14 für Ser oder Arg steht.
Weiterhin wird die Verwendung eines Polypeptids offenbart, welches die oben erwähnte Aminosäuresequenz (I) umfasst, um ein Mittel herzustellen, welches die durch Gefrieren hervorgerufene Verminderung der Aktivität eines Proteins verhindert.
Gemäß dem Verfahren der vorliegenden Erfindung kann eine Verminderung der Aktivität eines Proteins während des Einfrierens/Auftauens von Proteinen wie z.B. Enzymen verhindert werden, die Stabilität von Proteinen während der Lagerung kann verbessert werden und der Anwendungsbereich der Proteine nach der Lagerung durch Einfrieren kann ausgedehnt werden. Das Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung ist extrem nützlich auf dem Gebiet der Nahrungsmittelindustrie, der pharmazeutischen Industrie und dergleichen.
1 zeigt Photographien, welche das Ergebnis der Coomassie-Färbung und das Ergebnis des Nachweises von Histidin-Tags durch Ni-NTA darstellen, was die Produktion von SP durch Genexpression in Escherichia coli bestätigt.
2 zeigt eine Photographie des Ergebnisses zur Bestätigung der Reinheit von SP, das durch Expression in Escherichia coli erzeugt wurde.
3 zeigt das Ergebnis eines Tests, um die Aktivität von SP beim Schützen eines Enzyms vor einer Gefrierbelastung auszuwerten.
[DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG]
Ein Verfahren zum Verhindern einer durch Gefrieren hervorgerufenen Verminderung der Aktivität eines Proteins gemäß der vorliegenden Erfindung umfasst das Zugeben eines Polypeptids, welches die oben erwähnte Aminosäuresequenz (I) umfasst, zu einem Protein von Interesse. In der oben erwähnten Aminosäuresequenz (I) stehen X1 bis X14 unabhängig für das Folgende:
X1 steht für Ser oder Thr, vorzugsweise Ser,
X2 steht für Asn oder Thr, vorzugsweise Asn,
X3 steht für Ser oder Ala, vorzugsweise Ala,
X4 steht für Asn oder Ser, vorzugsweise Asn,
X5 steht für Ser oder Thr, vorzugsweise Ser,
X6 steht für Asn, Asp oder Lys, vorzugsweise Asn,
X7 steht für Ser, Asn oder Lys, vorzugsweise Asn,
X8 steht für Ala, Thr oder Val, vorzugsweise Ala,
X9 steht für Ser oder Arg, vorzugsweise Ser,
X10 steht für Asn, Ser, Asp oder Arg, vorzugsweise Asn,
X11 steht für Ser, Asn, His oder Cys, vorzugsweise Ser,
X12 steht für Arg oder Gly, vorzugsweise Arg,
X13 steht für Asp oder Gly, vorzugsweise Asp, und
X14 steht für Ser oder Arg, vorzugsweise Ser.
In der vorliegenden Erfindung kann das Polypeptid weiterhin ein Homologes der oben erwähnten Aminosäuresequenz (I) umfassen. Der Ausdruck „Homologes", der hierin verwendet wird, bedeutet ein Polypeptid mit einer Aminosäuresequenz der oben erwähnten Aminosäuresequenz (I), bei welcher eine oder mehrere (vorzugsweise eine oder einige) Aminosäuren deletiert, substituiert, insertiert oder addiert sind, welches immer noch die Funktion hat, eine durch Gefrieren hervorgerufene Verminderung (oder Inaktivierung) der Aktivität eines Proteins zu verhindern (gelegentlich in dieser Anmeldung als kryoprotektive Aktivität bezeichnet).
In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist die oben erwähnte Aminosäuresequenz (I) vorzugsweise die folgende Aminosäuresequenz (II); das Polypep tid gemäß der vorliegenden Erfindung umfasst nämlich vorzugsweise die folgende Aminosäuresequenz (II):
Ser-Ser-Thr-Gly-Ser-Ser-Ser-Asn-Thr-Asp-Ser-Asn-Ser-Asn-Ser-Ala-Gly-Ser-Ser-Thr-Ser-Gly-Gly-Ser-Ser-Thr-Tyr-Gly-Tyr-Ser-Ser-Asn-Ser-Arg-Asp-Gly-Ser-Val (II) (SEQ ID NO: 2).
Das Polypeptid gemäß der vorliegenden Erfindung kann typischerweise die Proteindenaturierung, typischerweise die Verminderung der Aktivität eines Proteins, die durch Gefrieren verursacht wird, welche beim Einfrieren eines Proteins von Interesse auftreten kann, verhindern, wenn es zu dem Protein von Interesse zugegeben wird.
Der Ausdruck „Verhindern einer durch Gefrieren hervorgerufenen Verminderung der Aktivität eines Proteins" bedeutet hierin das Verhindern einer Verminderung der Aktivität eines Proteins oder der Inaktivierung von Proteinen, welche verursacht werden kann, wenn ein Protein von Interesse eingefroren oder eingefroren und aufgetaut wird. Der Ausdruck beinhaltet ebenfalls das Beibehalten der Aktivität des Proteins, das Stabilisieren des Proteins und das Verhindern einer Proteindenaturierung.
In der vorliegenden Erfindung bedeutet das „Einfrieren" von Proteinen typischerweise, dass Proteine unter üblichen Einfrierlagerungsbedingungen, z.B. in einem Gefrierschrank unter 0°C, gehalten werden.
In der vorliegenden Erfindung sind Proteine, die eingefroren werden sollen, nicht besonders beschränkt und können jegliche Proteine sein, solange deren Aktivität durch Einfrieren vermindert wird oder verloren geht. In der vorliegenden Erfindung sind bevorzugte Beispiele solcher Proteine Enzyme. Beispiele für solche Enzyme beinhalten jene, die in der Industrie wichtig sind, wie beispielsweise Proteasen, Amylasen, Cellulasen, Lipasen, Restriktionsenzyme und Modifikationsenzyme.
Weiterhin wird die Verwendung von einem Polypeptid, welches die oben erwähnte Aminosäuresequenz (I) umfasst, zur Herstellung von Mitteln zum Verhindern einer durch Gefrieren hervorgerufenen Verminderung der Aktivität von Proteinen beschrieben.
Hier sind „Mittel zum Verhindern einer Verminderung der Aktivität" jene, welche eine Verminderung der Aktivität von Proteinen oder eine Inaktivierung von Proteinen, welche beim Einfrieren oder Auftauen der Proteine von Interesse verursacht werden kann, verhindern können. Die Formen, Dosen oder dergleichen der Mittel sind nicht besonders beschränkt.
Weiterhin kann das Polypeptid, welches die oben erwähnte Aminosäuresequenz (I) umfasst, wenn es in einer Zelle vorliegt, die mit einer Dehydratisierung der Zelle verbundene Belastung kontrollieren, welche die Zelle beeinträchtigt. Die Polypeptide können nämlich die Zelle vor der Dehydratisierungsbelastung schützen (gelegentlich in dieser Beschreibung als „Schutzfunktion gegenüber einer Dehydratisierungsbelastung" bezeichnet). In anderen Worten, das Polypeptid gemäß der vorliegenden Erfindung kann weiterhin in der Lage sein, der Zelle eine Toleranz gegenüber einer Dehydratisierungsbelastung zu verleihen. Beispiele für eine solche Zelle (oder Zielzelle) beinhalten Zellen von Mikroorganismen wie z.B. Escherichia coli, Bacillus subtilis und Hefe, Pilzen, Insekten, Tieren und Pflanzen.
Somit wird ein Verfahren offenbart, um einer Zielzelle eine Toleranz gegenüber einer Dehydratisierungsbelastung zu verleihen, welches umfasst: Einführen eines Polypeptids, welches die Aminosäuresequenz (I) umfasst, in die Zielzelle, um sich darin zu akkumulieren. Vorzugsweise umfasst dieses Verfahren zum Verleihen einer Toleranz gegenüber einer Dehydratisierungsbelastung einer Zielzelle das Transformieren der Zielzelle unter Verwendung eines rekombinanten Vektors (der später erklärt wird), welcher eine DNA umfasst, die ein Polypeptid codiert, welches die Aminosäuresequenz (I) umfasst. Weiterhin können in dieser Beschreibung die Ausdrücke „DNA" und „Gen" gelegentlich mit derselben Bedeutung verwendet werden.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung umfasst das Polypeptid vorzugsweise eine sich wiederholende Sequenz, bei welcher die oben erwähnte Aminosäuresequenz (I) wenigstens zweimal wiederholt wird. Die Verwendung des Polypeptids mit einer solchen sich wiederholenden Sequenz kann die Effektivität bei der Verhinderung einer Verminderung der Aktivität eines Proteins durch das Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung weiter verbessern.
Demgemäß beträgt die Anzahl der Wiederholungen der Aminosäuresequenz (I) in einem Polypeptid der vorliegenden Erfindung vorzugsweise wenigstens 2. Die größere Anzahl von Wiederholungen ist bevorzugt, um eine bemerkenswertere oben erwähnte Effektivität zu erreichen. Jedoch beträgt die Anzahl der Wiederholungen vorzugsweise 2 bis 8, insbesondere 2 bis 6 und am meisten bevorzugt 2 bis 4, wenn man die mögliche Kostensteigerung aufgrund des komplizierten Wiederholungsverfahrens und die Kompatibilität bei der Einführung in eine Zelle in Betracht zieht.
Ein Polypeptid, welches eine sich wiederholende Sequenz umfasst, in welcher die oben erwähnte Aminosäuresequenz (I) wenigstens zweimal wiederholt wird, kann beispielsweise wie folgt erhalten werden:
Zuerst wird eine DNA, welche eine sich wiederholende Sequenz codiert, in welcher die oben erwähnte Aminosäuresequenz (I) wenigstens zweimal wiederholt wird, geplant und dann unter Verwendung eines üblichen DNA-Synthesegeräts synthetisiert. Hier ist es wünschenswert, Erkennungsstellen für Restriktionsenzyme an beiden Enden der oben erwähnten Sequenz, um diese mit einem Vektor zu verknüpfen, und ein Translations-Stopp-Codon an dem 3'-Ende zu platzieren. Weiterhin können, wenn es nicht erwünscht ist, die gesamte Länge der DNA-Kette zu erhalten, wobei man die Zuverlässigkeit und Funktionsfähigkeit eines DNA-Synthesegeräts oder eines DNA-Reinigungsverfahrens berücksichtigt, zuerst segmentierte Fragmente hergestellt werden und dann miteinander verknüpft werden, um die gesamte Länge der DNA zu erhalten. Auf diese Weise kann eine DNA, welche eine sich wiederholende Sequenz von Interesse codiert, erhalten werden. Als nächstes wird die so erhaltene DNA exprimiert, um ein Polypeptid zu erhalten, indem beispielsweise ein im Folgenden beschriebenes Verfahren verwendet wird. So kann ein Polypeptid, welches eine sich wiederholende Sequenz (z.B. die folgende Sequenz (III)) umfasst, in welcher die Aminosäuresequenz (I) zweimal wiederholt wird, erhalten werden.
Aminosäuresequenz (III):
Ser-Ser-Thr-Gly-Ser-Ser-Ser-Asn-Thr-Asp-Ser-Asn-Ser-Asn-Ser-Ala-Gly-Ser-Ser-Thr-Ser-Gly-Gly-Ser-Ser-Thr-Tyr-Gly-Tyr-Ser-Ser-Asn-Ser-Arg-Asp-Gly-Ser-Val-Ser-Ser-Thr-Gly-Ser-Ser-Ser-Asn-Thr-Asp-Ser-Asn-Ser-Asn-Ser-Ala-Gly-Ser-Ser-Thr-Ser-Gly-Gly-Ser-Ser-Thr-Tyr-Gly-Tyr-Ser-Ser-Asn-Ser-Arg-Asp-Gly-Ser-Val (SEQ ID NO: 3).
Die Sequenz, welche aus den 38 Aminosäuren der oben erwähnten Aminosäuresequenz (I) besteht, wird im Folgenden als „SP" bezeichnet, und das Polypeptid, welches aus zwei Wiederholungen von dieser besteht, wird gelegentlich SP2 genannt.
Weiterhin kann in der vorliegenden Erfindung eine DNA, die SP4 codiert, welches 4 sich wiederholende SPs aufweist, erhalten werden, indem eine DNA, in welcher spezifische Restriktionsenzymstellen an beiden Enden einer DNA, welche SP2 codiert, angefügt wurden, welche durch ein PCR-Verfahren unter Verwendung spezifischer Primer synthetisiert wurde, erhalten wird und dann diese Restiktionsenzymstellen unter Verwendung von Restriktionsenzymen verknüpft werden. So kann unter Verwendung derselben Technik eine DNA, die SP6 codiert, eine DNA, die SP8 codiert, und dergleichen eine nach der anderen erhalten werden, und DNAs, die mehr sich wiederholende Sequenzen codieren, können nach Bedarf erhalten werden. Wie oben beschrieben können DNAs, die so erhalten wurden, exprimiert werden, um Polypeptide wie z.B. SP4, SP6 und SP8 zu erhalten.
Ein Polypeptid, welches eine sich wiederholende Sequenz mit wenigstens zwei Wiederholungen der Aminosäuresequenz (I) umfasst, kann in einer solchen Weise, wie sie oben beschrieben wird, erhalten werden; alternativ kann jedoch das oben erwähnte Polypeptid von Interesse erhalten werden, indem zuerst mehr als ein Polypeptid mit der Aminosäuresequenz (I) erhalten wird, indem beispielsweise das nachstehend beschriebene Verfahren verwendet wird, und dann diese nacheinander unter Verwendung eines herkömmlichen chemischen Verfahrens verknüpft werden.
In der vorliegenden Erfindung kann ein Polypeptid, welches die oben erwähnte Aminosäuresequenz (I) umfasst, entweder unter Verwendung verschiedener herkömmlicher Synthesemethoden erzeugt werden oder aus der Natur stammen. Da die Aminosäuresequenz dieses Polypeptids bestimmt wurde, kann es erhalten werden, indem seine gesamte Sequenz oder partiell synthetisiert wird, indem eine Sequenz verwendet wird, die aus der Natur stammt, und auf der Basis dieser Sequenz weiter synthetisiert wird.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung kann das Polypeptid von einem natürlichen Protein, Sericin, abgeleitet werden, und dementsprechend aus diesem Sericin erhalten werden, indem herkömmliche gentechnische Verfahren verwendet werden. Natürliches Sericin kann beispielsweise aus Seidendrüsengewebe der Seidenraupe, Kokons oder Rohseide erhalten werden. In der vorliegenden Erfindung beinhaltet Sericin zusätzlich zu Sericin selbst Hydrolyseprodukte dieses Proteins.
Weiterhin kann bei der vorliegenden Erfindung in Fällen, wo eine DNA, welche ein Polypeptid codiert, welches die oben erwähnte Aminosäuresequenz (I) umfasst, verfügbar ist oder erzeugt werden kann, das Polypeptid in einer transformierten Zelle erzeugt werden, welche durch Transformieren einer Wirtszelle mit dieser DNA erhalten wurde. Insbesondere kann ein Polypeptid gemäß der vorliegenden Erfindung erzeugt werden, indem eine Transformante kultiviert wird, welche durch Transformieren einer Wirtszelle unter Verwendung einer DNA, insbesondere eines rekombinanten Vektors, welcher ein DNA-Fragment, welches das Polypeptid gemäß der vorliegenden Erfindung codiert, in einer Form, die in der Wirtszelle amplifizierbar und replizierbar ist, enthält, erhalten wird. Bei der vorliegenden Erfindung kann nämlich das, was ein Wirt-Vektor-System genannt wird, zur Herstellung des Polypeptids verwendet werden. Bei der vorliegenden Erfindung können beim Anwenden eines solchen Wirt-Vektor-Systems verschiedene Methoden, die üblicherweise auf diesem Gebiet zur Konstruktion von Expressionsvektoren (rekombinanten Vektoren) und der Transformation verwendet werden, verwendet werden.
Somit wird gemäß einer anderen bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung das oben erwähnte Polypeptid durch ein Verfahren erhalten, welches umfasst:
Herstellen eines rekombinanten Vektors, welcher eine DNA umfasst, die ein Polypeptid codiert, welches die Aminosäuresequenz (I) umfasst,
Erhalten einer transformierten Zelle durch Transformieren einer Zelle unter Verwendung des rekombinanten Vektors,
Kultivieren der transformierten Zelle und
Gewinnen eines Polypeptids aus den resultierenden Zellen und/oder einer Kultur von diesen.
Bei der vorliegenden Erfindung kann eine DNA, die ein Gen enthält, welches das oben erwähnte Polypeptid codiert, insbesondere ein rekombinanter Vektor, erhalten werden, indem ein DNA-Fragment, welches das oben erwähnte Polypeptid codiert, in ein übli cherweise verwendetes Vektorsystem eingebaut wird. Bei der vorliegenden Erfindung ist es, wie oben erwähnt wurde, bevorzugt, dass dieser Vektor das codierende DNA-Fragment in einer sich wiederholenden Form enthält.
Ein Vektor, der in der vorliegenden Erfindung verwendet werden soll, kann aus üblicherweise verwendeten Vektoren, bei welchen ein Wirt-Vektor-System etabliert ist, wie z.B. Plasmiden, Viren, Phagen und Cosmidvektoren, ausgewählt werden, was von der Art einer zu verwendenden Wirtszelle abhängt. Insbesondere wird beispielsweise ein auf pBR, pUC oder pQE basierendes Plasmid oder ein λ-Bakteriophage verwendet, wenn Escherichia coli eine Wirtszelle ist, ein auf pUB basierender Vektor wird verwendet, wenn Bacillus subtilis eine Wirtszelle ist, und ein auf YEp oder Ycp basierender Vektor wird verwendet, wenn Hefe eine Wirtszelle ist. Ein Vektor, der in der vorliegenden Erfindung verwendet werden soll, ist vorzugsweise ein Plasmid.
Ein Plasmid, das in der vorliegenden Erfindung verwendbar ist, enthält vorzugsweise einen Marker zum Selektieren einer Transformante. Beispiele für solche Marker beinhalten Gene, welche eine Resistenz gegen Arzneimittel wie z.B. Ampicillin und Kanamycin verleihen, und Gene, welche einen Nährstoffbedarf komplementieren. Weiterhin kann in der vorliegenden Erfindung die Wiederherstellung der β-Galactosidase-Aktivität durch ein spezifisches Peptid, das durch eine Vektor-DNA wie z.B. ein Plasmid erzeugt wird, und ein Peptid, das in einer Wirtszelle codiert wird, ebenfalls als ein Selektionsmarker verwendet werden.
Weiterhin weist in der vorliegenden Erfindung eine DNA, die als der rekombinante Vektor verwendet werden soll, vorzugsweise DNAs, die zum Exprimieren eines Polypeptids, welches die oben erwähnte Aminosäuresequenz (I) umfasst, notwendig sind, wie z.B. einen Promoter, ein Transkriptionsstartsignal, ein Translationsstoppsignal, ein Transkriptionskontrollsignal wie z.B. ein Transkriptionsterminationssignal und ein Translationskontrollsignal auf.
Die vorliegende Erfindung stellt eine Transformante zur Verfügung, welche durch Transformieren einer Wirtszelle mit dem oben erwähnten rekombinanten Vektor erhalten wird.
Bei der vorliegenden Erfindung kann jegliche Wirtszelle verwendet werden, solange ihr Wirt-Vektor-System etabliert ist. Beispiele für eine solche Wirtszelle beinhalten Escherichia coli, Bacillus subtilis, Hefen und Pilze.
Wenn eine Wirtszelle Escherichia coli, Bacillus subtilis, eine Hefe oder ein Pilz ist, kann ein Sekretionsvektor, welcher das oben erwähnte Polypeptid von Interesse extrazellulär sekretiert, als ein Vektor verwendet werden.
Gemäß noch einer anderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung kann das oben erwähnte Polypeptid ein chimäres Protein sein, bei welchem ein Polypeptid, das die oben erwähnte Aminosäuresequenz (I) umfasst, und ein heterologes Polypeptid (z.B. ein anderes funktionales Protein) hybridisiert sind.
Ein chimäres Protein kann hergestellt werden, indem eine DNA exprimiert wird, welche das chimäre Protein codiert, das durch DNA-Fusion unter Verwendung einer DNA, welche ein Polypeptid codiert, das die oben erwähnte Aminosäuresequenz (I) umfasst, und einer DNA, welche ein heterologes Polypeptid codiert, erzeugt wurde.
Die vorliegende Erfindung wird weiter durch die folgenden Beispiele veranschaulicht, welche nicht als eine Beschränkung der Erfindung gedacht sind.
Chemische Synthese von Genfragmenten, welche ein Polypeptid mit kryoprotektiver Aktivität codieren
Ein Gen (im Folgenden serD genannt), welches ein Polypeptid codiert, das aus der oben erwähnten Aminosäuresequenz von SP2 (der oben erwähnten Sequenz (III) (SEQ ID NO: 3)) besteht, wurde geplant. Hier war eine Erkennungsstelle (Ile-Glu-Gly-Arg) für eine Protease (Faktor Xa) an dem N-Terminus von SP2 lokalisiert, um ein anderes fusioniertes Polypeptid abzuspalten. Weiterhin wurde das oben erwähnte Gen geplant, indem die Codonverwendungshäufigkeit von Escherichia coli (Ikemura, T. und Ozeki, H., Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol., 47, 1087 (1983)) in Betracht gezogen wurde, um die Restriktionsenzym-Erkennungsstellen (PstI, EcoRI) für die Verknüpfung mit einem Vektor an beiden Enden (5'- und 3'-Ende) von serD zu platzieren und zwei Translations-Stopp-Codons an der 3'-terminalen Seite anzufügen.
Als nächstes wurde das geplante Gen chemisch synthetisiert, indem die Phosphoramidit-Chemie auf einem DNA-Synthesegerät (Applied Biosystems) angewendet wurde. In diesem Fall wurde, indem die Zuverlässigkeit und Funktionsfähigkeit der derzeitigen DNA-Synthesegeräte und DNA-Reinigungsmethoden in Betracht gezogen wurden, die DNA in Form von unterteilten Fragmenten mit jeweils ca. 60 bis 70 Basen synthetisiert.
Die genannte sich wiederholende Einheit SP besteht aus 38 Aminosäureresten, nämlich 114 Basen. Unter Berücksichtigung der Stabilität der Genprodukte wird eine DNA, die SP2 codiert (serD), in welcher eine sich wiederholende Einheit von 38 Aminosäureresten zweimal wiederholt wird, als eine Grundeinheit der synthetisierten DNA verwendet. Daher ist ein Gen mit wenigstens 228 Basen notwendig. Da weiterhin die DNA als eine doppelsträngige Kette eingebaut werden muss, muss die zweifache Menge an DNA synthetisiert werden.
In der Praxis ist die Einführung von Stopp-Codons und der Restriktionsenzymstellen zur Verknüpfung jedes Fragments mit einem Plasmid ebenfalls für das synthetische Gen, das SP2 codiert, notwendig. Daher wurde die Gesamtheit des Gens, welches SP2 codiert, in 4 Fragmente unterteilt, so dass 4 Paare von vorne und hinten, d.h. die Gesamtmenge von 8 DNA-Ketten, synthetisiert wurden.
Die 8 synthetisierten DNA-Fragmente waren wie folgt:
serD Fragment (1)
5'-GTGATCAATCGAAGGTCGCTCGAGTACTGGTTCTTCTTCTAACACCGACTCTAACT CTAAC-3' (SEQ ID NO: 4)
serD Fragment (2)
5'-TCTGCTGGTTCTTCTACCTCTGGTGGTTCTTCTACCTACGGTTACTCTTCTAACT CTCGTGACGGTTCT-3' (SEQ ID NO: 5)
serD Fragment (3)
5'-GTTTCTTCTACCGGTTCTTCTTCTAACACCGACTCTAACTCTAACTCTGCTGGTT CTTCTACCTC-3' (SEQ ID NO: 6)
serD Fragment (4)
5'-TGGTGGTTCTTCTACCTACGGTTACTCTTCTAACTCTCGTGACGGATCCGTTTAA TAGCTGAGCG-3' (SEQ ID NO: 7)
serD Fragment (1')
5'-CAGAGTTAGAGTTAGAGTCGGTGTTAGAAGAAGAACCAGTACTCGAGCGACCTTC GATTGATCACTGCA-3' (SEQ ID NO: 8)
serD Fragment (2')
5'-AAACAGAACCGTCACGAGAGTTAGAAGAGTAACCGTAGGTAGAAGAACCACCAGA GGTAGAAGAACCAG-3' (SEQ ID NO: 9)
serD Fragment (3')
5'-ACCAGAGGTAGAAGAACCAGCAGAGTTAGAGTTAGAGTCGGTGTTAGAAGAAGAA CCGGTAGAAG-3' (SEQ ID NO: 10)
serD Fragment (4')
5'-AATTCGCTCAGCTATTAAACGGATCCGTCACGAGAGTTAGAAGAGTAACCGTAGG TAGAAGAACC-3' (SEQ ID NO: 11)
Konstruktion eines Gens (serD) welches SP2 codiert
Die acht Fragmente (ca. 70 bp), die wie oben erwähnt synthetisiert wurden, wurden durch einen Annealing-Prozess mit Fragmenten, die jeweils einen komplementären Sequenzteil aufwiesen, zu doppelsträngigen Ketten gemacht, um vier doppelsträngige DNA-Fragmente zu erhalten, wodurch serD konstruiert wurde.
Weiterhin wurde das 5'-Ende des synthetisierten Genfragments phosphoryliert, indem T4-Polynukleotidkinase verwendet wurde, da kein Phosphor am 5'-Ende der DNA vorlag, welche das Oligonukleotid codierte, das durch die chemische Synthese erhalten wurde.
Und zwar wurden die folgenden Komponenten in ein Röhrchen (hergestellt von der Eppendorf Co.) gegeben, für 1 Stunde bei 37°C umgesetzt und dann bei 70°C für 5 Minuten erwärmt, um das Enzym zu inaktivieren.

Einzelnes Oligonukleotid 100 pmol (in Wasser) 7,5 μl

10 × Puffer* 1 μl

10 mM ATP 1 μl

T4-Polynukleotidkinase (Takara Shuzo Co., Ltd.) 0,5 μl (5 Einheiten) 10 μl

[* 10 ×Tris-HCl Puffer: 650 mM (pH 7,6), 100 mM MgCl₂, 150 mM Dithiothreitol, 10 mM Spermidin.]

Eine 5 μl-Portion von jeder der DNAs wurde in einem Röhrchen (hergestellt von der Eppendorf Co.) gemischt und zur Verknüpfung bei 16°C für 30 Minuten umgesetzt, indem ein Takara Ligationskit Version II (Takara Shuzo Co., Ltd.) verwendet wurde, um die vier DNA-Fragmente aneinander stoßend zu verknüpfen. Nach der Reaktion wurde eine Agarosegelelektrophorese durchgeführt, und ein DNA-Fragment mit ca. 270 bp wurde aus dem Gel gewonnen. Das resultierende DNA-Fragment wies eine PstI-Erkennungsstelle am 5'-Ende und eine EcoRI-Erkennungsstelle am 3'-Ende auf.
Weiterhin wurde das DNA-Fragment mit einer geeigneten Menge des Plasmids pUC19 (Yanisch-Perron, C. et al., Gene, 33, 103 (1985)), das vorher mit PstI und EcoRI geschnitten wurde, gemischt, und es wurde eine Ligationsreaktion für 1 Stunde bei 16°C durchgeführt, indem ein Takara Ligationskit Version II (Takara Shuzo Co., Ltd.) verwendet wurde.
Als nächstes wurde die resultierende Reaktionsmischung in den Escherichia coli-Stamm JM109 (recA1, Δlac-proAB, endA1, gryA96, thi-1, hsdR17, supE44, relA1, λ^–, (F'traD36, proAB, lacI q Z ΔM15)) eingeführt.
Weiterhin ist dieser E. coli-Stamm JM109 ein Stamm, in welchem bei der Transformation von auf pUC basierender Plasmid-DNA oder der Transduktion von M13-Phagen-Vektor-DNA ein LacZα-Peptid, das von der Vektor-DNA erzeugt wird, und lacZΔM15, welches von JM109F' codiert wird, die β-Galactosidase-Aktivität wieder herstellen, was eine Selektion von Rekombinanten erleichtert.
Demgemäß bilden in einem Medium, das IPTG (Isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid) und X-Gal (5-Brom-4-chlor-3-indol-β-D-galactosid) enthält, Zellen dieses Stammes JM109, welche das Plasmid pUC19 tragen, blaue Kolonien, welche eine β-Galactosidase-Aktivität anzeigten. Da andererseits die β-Galactosidase-Aktivität in dem Stamm JM109, welcher ein rekombinantes Plasmid trägt, in welches ein fremdes DNA-Fragment eingefügt wurde, nicht wieder hergestellt werden kann, bilden Zellen dieses Stammes weiße Kolonien. Die rekombinanten Plasmide können dadurch selektiert werden.
Demgemäß wurden Plasmide aus gebildeten weißen Kolonien präpariert und einer DNA-Sequenzierung unterzogen (Sanger, F. et al., J. Mol. Biol., 143, 161 (1980)), um einen Klon zu selektieren, welcher eine serD-Basensequenz (Fragment) aufwies, welche exakt dieselbe war wie geplant.
Das rekombinante Plasmid mit dem serD-Gen, das so erhalten wurde, wird hierin pUC-serD genannt.
Polymerisation von SP
Die Polymerisation von SP wurde wie folgt durchgeführt.
pET-serD
Ein Fragment, welches serD enthielt, welches durch Spalten des oben erwähnten pUC-serD mit Bcl1 und Bpu1102I erhalten wurde, wurde mit dem Vektor pET3a (Novagen), welcher vorher mit den Restriktionsenzymen BamH1 und Bpu1102I gespalten wurde, gemischt, und eine Ligationsreaktion wurde für 1 Stunde bei 16°C durchgeführt, indem ein Takara Ligationskit Version II (Takara Shuzo Co., Ltd.) verwendet wurde.
Als nächstes wurde die resultierende Reaktionsmischung wie oben beschrieben in den E. coli-Stamm JM109 eingeführt. Ein Plasmid wurde aus einer so erhaltenen Transformante präpariert, einer DNA-Sequenzierung unterzogen, und es wurde dann bestätigt, dass dieses die Sequenz von serD aufwies.
Das rekombinante Plasmid, welches das serD-Gen, das so erhalten wurde, aufwies, wird hierin pET-serD genannt.
pET-serT
Als nächstes wurde ein serD-Gen, welches XhoI-Stellen an beiden Enden des synthetisierten serD-Gens angefügt hatte, für SP2 durch die PCR-Methode erhalten. Die PCR-Reaktion wurde durch ein gewöhnliches Verfahren durchgeführt, indem ein Ex Taq (Takara Shuzo Co., Ltd.) verwendet wurde. Die Primer, die hierin verwendet wurden, sind wie folgt:
5'-AAGGTCGCTCGAGTACCGGT-3' (SEQ ID NO: 12)
5'-CGCTCAGACTCGAGACAGAT-3' (SEQ ID NO: 13)
Als nächstes wurde das serD-Gen mit den angefügten XhoI-Stellen an beiden Enden mit der XhoI-Stelle von pET-serD verknüpft, indem die Restriktionsenzymstellen benutzt wurden, um das Plasmid pET-serT mit einem Gen, das SP4 bestehend aus 4 sich wiederholenden SPs codierte, zu konstruieren.
pET-serH
In ähnlicher Weise wurde ein serD-Gen, in welchem eine BamHI-Stelle an das 5'-Ende angefügt war, durch die PCR-Methode erhalten.
Durch Benutzung der Restriktionsenzymstellen wurde das resultierende serD mit der BamHI-Stelle von pET-serT verknüpft, um das Plasmid pET-serH, welches ein Gen aufwies, das SP6 bestehend aus 6 sich wiederholenden SPs codierte, zu konstruieren.
Primer, die hierin verwendet wurden, um die BamHI-Stelle in das serD-Gen einzuführen, sind wie folgt:
5'-GTTTTCCCAGTCACGAC-3' (SEQ ID NO: 14)
5'-ATCGGATCCGTCTCGAGTACT-3' (SEQ ID NO: 15)
pET-serO
In ähnlicher Weise wurde ein serD-Gen, in welchem eine ScaI-Stelle an das 3'-Ende angefügt war, durch die PCR-Methode erhalten.
Durch Benutzung der Restriktionsenzymstellen wurde das resultierende serD mit der ScaI-Stelle von pET-serH verknüpft, um das Plasmid pET-serO, welches ein Gen aufwies, das SP8 bestehend aus 8 sich wiederholenden SPs codierte, zu konstruieren.
Primer, die hierin verwendet wurden, um die ScaI-Stelle in das serD-Gen einzuführen, sind wie folgt:
5'-CAGGAAACAGATATGAC-3' (SEQ ID NO: 16)
5'-GCTAGTACTCGAAACGGATC-3' (SEQ ID NO: 17)
Konstruktion des Expressionsplasmids für E. coli
Konstruktion von pOE-NHserD
Ein Fragment, welches serD enthielt, das durch Spalten von pUC-serD mit PstI und EcoRI erhalten wurde, wurde mit dem Plasmid pBSIISK+, welches vorher mit PstI und EcoRI gespalten wurde, gemischt, und eine Ligationsreaktion wurde für 1 Stunde bei 16°C durchgeführt, indem ein Takara Ligationskit Version II (Takara Shuzo Co., Ltd.) verwendet wurde.
Als nächstes wurde die resultierende Reaktionsmischung wie oben beschrieben in den E. coli-Stamm JM109 eingeführt. Ein Plasmid wurde aus einer so erhaltenen Transformante präpariert, mit welchem bestätigt wurde, dass das serD-Gen (ca. 270 bp) richtig eingefügt war.
Das rekombinante Plasmid mit dem serD-Gen, das so erhalten wurde, wird hierin pBS-serD genannt.
Als nächstes wurde ein Fragment, welches serD enthielt, das durch Spalten von pBS-serD mit BclI und HindIII erhalten wurde, mit einem hochexprimierenden Vektor pQE30 für E. coli (Qiagen), welcher vorher mit BclI und HindIII gespalten wurde, gemischt, und eine Ligationsreaktion wurde für 1 Stunde bei 16°C durchgeführt, indem ein Takara Ligationskit Version II (Takara Shuzo Co., Ltd.) verwendet wurde.
Als nächstes wurde die resultierende Reaktionsmischung wie oben beschrieben in den E. coli-Stamm JM109 eingeführt.
Ein Plasmid wurde aus einer so erhaltenen Transformante präpariert, mit welchem bestätigt wurde, dass das serD-Gen (ca. 270 bp) richtig eingefügt war.
Das rekombinante Plasmid mit dem serD-Gen, das so erhalten wurde, wird hierin pQE-NHserD genannt.
Hier wurde ein 6 × His-Tag so geplant, dass es an dem N-Terminus von SP2 lokalisiert war. Die Aminosäuresequenz des exprimierten Polypeptids ist in SEQ ID NO: 18 gezeigt.
Konstruktion von pOE-NHLserT, pOE-NHLserH und pOE-NHLserO
Die oben erwähnten Plasmide pET-serT, pET-serH und pET-serO wurden mit NheI gespalten, um Fragmente zu erhalten, welche serT, serH und serO enthielten, und diese Fragmente wurden jeweils mit der XbaI-Stelle von pBSIISK+ verknüpft, um rekombinante Plasmide zu konstruieren. Diese rekombinanten Plasmide wurden dann mit ScaI und HindIII gespalten, um Fragmente herzustellen, welche die Gene serT, serH und serO enthielten, die SP4, SP6 bzw. SP8 codierten. Die so hergestellten Genfragmente wurden jeweils mit einem hochexprimierenden Vektor pQE30 für E. coli verknüpft, um die einzelnen Expressionsplasmide pQE-NHLserT, pQE-NHLserH und pQE-NHLserO zu konstruieren.
Hier wurden 6 × His-Tags so geplant, dass diese an den N-Termini von SP4, SP6 und SP8 lokalisiert waren.
Die Aminosäuresequenzen der exprimierten Polypeptide sind in SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20 und SEQ ID NO: 21 gezeigt.
Induktion und Bestätigung der Expression eines Gens, welches SP codiert, in E. coli
Herstellung einer E. coli-Transformante
Die Expressionsvektoren pQE-NHserD, pQE-NHLserT, pQE-NHLserH und pQE-NHLserO, in welche Gene, die SPs codierten, eingebaut waren, und der Vektor pQE allein als eine Kontrolle wurden jeweils in den E. coli-Stamm JM109 (recA1, Δlac-proAB, endA1, gryA96, thi-1, hsdR17, supE44, relA1, λ^–, (F'traD36, proAB, lacI q Z ΔM15)) eingeführt. Da der Expressionsvektor pQE für E. coli ein Ampicillin-Resistenzgen als einen Selektionsmarker trägt, wurden Transformanten als ampicillinresistente Kolonien selektiert.
Induktion der Expression
E. coli JM109-Transformanten, die jeweils ein Expressionsplasmid trugen, in welches ein Gen, das SP codierte, eingebaut war, wurden in einem M9 + 2% Casaminosäure-Medium, welches mit 50 μg/ml Ampicillin ergänzt war, bei 37°C über Nacht unter Schütteln kultiviert. Die resultierende Kultur wurde in demselben Medium bei einer Konzentration von 2% inokuliert, und die Kultivierung wurde bei 37°C unter Schütteln fortgesetzt.
IPTG (Isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid) wurde zu der so erhaltenen Kultur bei einer Endkonzentration von 1 mM zugegeben, wenn die Extinktion bei 610 nm 0,3 bis 0,5 erreichte, und die Kultivierung wurde für 4 Stunden fortgesetzt.
Bestätigung der Expression
Nach der Kultivierung wurde der Kulturüberstand durch Zentrifugation entfernt, und die resultierenden Zellen wurden in einer Pufferlösung [50 mM Na-Phosphat (pH 7,8), 300 mM NaCl] von 1/10 des Volumens des Kulturmediums resuspendiert. Dann wurden die Zellen durch Beschallung (200 W, ca. 30 Minuten) aufgebrochen, um einen zellfreien Extrakt herzustellen.
Ein Teil des zellfreien Extrakts wurde durch ein gewöhnliches Verfahren einer SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese unterzogen. Eine Coomassie-Färbung des resultierenden Gels bestätigte das exprimierte SP als eine dicke Bande.
Weiterhin wurde das SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophoresemuster auf eine Nitrocellulosemembran übertragen, wonach das Histidin-Hexamer (6 × His)-Tag, das an die N-terminale Seite von SP angefügt war, durch eine chemische Farbreaktion unter Verwendung von HRP-markiertem Ni-NTA (Nitrilotriessigsäure) (Qiagen) nachgewiesen wurde, und somit wurde die Produktion des Ziel-SP bestätigt.
Weiterhin bestätigte das Ergebnis der N-terminalen Aminosäuresequenzierung des Peptids unter Verwendung eines Edman-Abbaus, dass es die Aminosäuresequenz, wie sie geplant wurde, aufwies.
Die Ergebnisse der oben erwähnten Cooomassie-Färbung und des Histidin-Tag-Nachweises durch Ni-NTA sind in 1 gezeigt.
Reinigung von SP
Da Peptide, welche durch Expression erzeugt werden, in hohem Maße hydrophil sind und praktisch keine hochdimensionale Struktur bilden, werden sie durch ein Behandeln für 10 Minuten bei 100°C nicht ausgefällt. Unter Benutzung dieser Eigenschaft wurde der zellfreie Extrakt, welcher durch Beschallung hergestellt wurde, für 10 Minuten bei 100°C behandelt und dann für 5 Minuten bei 6.500 Upm zentrifugiert, um denaturierte Proteine, die aus E. coli stammten, auszufällen und SP aus dem Überstand als eine lösliche Fraktion zu gewinnen.
Als nächstes wurde SP aus dem Überstand des zellfreien Extrakts unter Verwendung des QIAexpress Ni-NTA Proteinreinigungssystems (Qiagen) gereinigt. Dieses QIAexpress Ni-NTA Proteinreinigungssystem kann ein Protein mit einem Histamin-Hexamer (6 × His)-Tag reinigen, indem dessen hohe Affinität zu Ni-NTA (Nitrilotriessigsäure) benutzt wird.
Test zur Auswertung der kryoprotektiven Aktivität bei einem Enzym
Herstellung von SP
Eine E. coli JM109-Transformante, welche ein Expressionsplasmid (pQE-NHserD) trug, in welches ein Gen, das SP codierte, eingebaut war, wurde in einem M9 × 2% Casaminosäure-Flüssigmedium, welches mit 50 μg/ml Ampicillin ergänzt war, über Nacht bei 37°C unter Schütteln kultiviert. Als nächstes wurde die Kultur in demselben Medium bei einer Konzentration von 2% inokuliert, und die Kultivierung wurde bei 37°C unter Schütteln fortgesetzt.
IPTG (Isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid) wurde bei einer Endkonzentration von 1 mM zugegeben, wenn die Extinktion bei 610 nm 0,3 bis 0,5 erreichte, um die Genexpression zu induzieren, und die Kultivierung wurde für 4 Stunden fortgesetzt.
Nach der Kultivierung wurde der Kulturüberstand durch Zentrifugation entfernt, und die resultierenden Zellen wurden in einer Pufferlösung [50 mM Na-Phosphat (pH 7,8), 300 mM NaCl] von 1/10 des Volumens des Kulturmediums resuspendiert. Dann wurden die Zellen durch Beschallung (200 W, ca. 30 Minuten) aufgebrochen, um einen zellfreien Extrakt herzustellen.
Unter Verwendung eines Teils des zellfreien Extrakts wurden gemäß gewöhnlichen Verfahren eine SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese und eine Coomassie-Färbung durchgeführt, um die Expression von SP zu bestätigen.
Unter Benutzung der oben erwähnten Eigenschaft von SP, das durch Expression erzeugt wurde, wurde der zellfreie Extrakt, welcher durch Beschallung hergestellt wurde, durch Erwärmen für 10 Minuten bei 100°C behandelt und dann für 5 bis 20 Minuten bei 6.500 bis 12.000 Upm zentrifugiert, um denaturierte Proteine, die aus E. coli stammten, auszufällen und SP aus dem Überstand als eine lösliche Fraktion zu gewinnen.
Als nächstes wurde SP, das nach der Wärmebehandlung im Überstand enthalten war, unter Verwendung des QIAexpress Ni-NTA Proteinreinigungssystems (Qiagen) weiter gereinigt. Bei diesem QIAexpress Ni-NTA Proteinreinigungssystem wird ein Protein mit einem Histamin-Hexamer (6 × His)-Tag absorbiert, indem die hohe Affinität zu Ni-NTA (Nitrilotriessigsäure) benutzt wird, und dann mit einer 0,02-1,0 M Imidazol-Lösung eluiert.
Das gereinigte SP wurde durch SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese und Coomassie-Färbung bestätigt (2). Weiter wurde die SP-Konzentration durch das BCA-Verfahren, welches verbreitet für die Proteinquantifizierung verwendet wird, gemessen.
Auswertungstest (kryoprotektive Aktivität bei LDH)
SP, welches durch die Expression in E. coli erzeugt wurde, wurde im Hinblick auf die Schutzaktivität gegenüber einem Verlust der enzymatischen Aktivität, der durch Einfrieren/Auftauen verursacht wird, gemessen.
Lactatdehydrogenase (LDH) wurde als ein Modellenzym verwendet. Lactatdehydrogenase (LDH) ist ein Enzym, welches bei einem Prozess der Erzeugung von L-Milchsäure aus Brenztraubensäure in einem glycolytischen Stoffwechselweg wirkt. Von LDH ist bekannt, dass es in hohem Maße empfindlich ist gegenüber einer Gefrierbelastung und dazu neigt, seine Aktivität durch Einfrier-/Auftau-Prozesse zu verlieren (K. Goller, E.A. Galinski, Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic 7 (1999) Seiten 37-45).
Das LDH-Reaktionssystem wird wie folgt gezeigt:
L-Milchsäure + NAD⁺ ⟺ Brenztraubensäure + NADH + H⁺
Eine kommerzielle LDH (5.000 U/ml) (Oriental Yeast Co., Ltd., aus Schweineherz) wurde mit einer 50 mM Kaliumphosphatpufferlösung verdünnt, um eine Enzymlösung mit ca. 250 Einheiten herzustellen. Die so hergestellte Enzymlösung wurde über Nacht bei 4°C dialysiert, um Ammoniumsulfat und dergleichen, das in der kommerziellen Enzymlösung enthalten war, vollständig zu entfernen.
Die dialysierte Enzymlösung wurde mit einer 50 mM Kaliumphosphatpufferlösung verdünnt, um eine LDH-Lösung mit ca. 4 Einheiten herzustellen.
Eine Kaliumphosphatpufferlösung und die LDH-Lösung wurden gemischt, und die resultierende Mischung wurde bei 25°C vorinkubiert, wonach Natriumpyruvat und NADH rasch zugegeben wurden und die Änderung der Extinktion bei 340 nm für 5 Minuten gemessen wurde, indem ein Spektrophotometer (Beckman, DU640) verwendet wurde.
Die Zusammensetzung einer Reaktionslösung zur Messung der LDH-Aktivität und die Messbedingungen für das Spektrophotometer sind nachstehend gezeigt. [Zusammensetzung der Reaktionslösung]

0,1 M Kaliumphosphatpuffer (pH 7,0) 3,00 ml

25,4 mM Natriumpyruvat 0,10 ml

NADH [10 mg/ml (10 mM Tris)] 0,05 ml

Lactatdehydrogenase (LDH aus Schweineherz, 4 U/ml) 0,02 ml

3,17 ml
[Messbedingungen]

Wellenlänge: 340 nm
Länge des optischen Weges: 1 cm
Temperatur: 25°C

Die LDH-Aktivität wurde anhand der Änderung bei NADH (Änderung der Extinktion bei 340 nm) unter Verwendung der folgenden Formel (i) bestimmt, (ΔA/min·V·D)/(ε·d·v) = IU/ml (i)worin

ΔA/min: = Änderung der Extinktion bei 340 nm pro Minute,
V: = endgültiges Flüssigkeitsvolumen (3,17 ml),
D: = endgültige Verdünnungsrate,
ε: = molekularer Absorptionskoeffizient von NADH bei 340 nm (6,3 × 10³ l·mol^–1 cm^–1),
d: = Länge des optischen Weges (1 cm) und
v: = Volumen der Enzymlösung (0,02 ml).

Das gereinigte SP wurde bei Konzentrationen von 0,01 % und 0,05% zu den LDH-Lösungen (ca. 4 Einheiten/ml), welche durch die oben erwähnte Methode hergestellt wurden, zugegeben.
Um Kontroll-LDH-Lösungen zum Vergleich herzustellen, wurde Rinderserumalbumin (BSA) (Sigma, Rinderalbumin Fraktion V), welches als ein Mittel zur Verhinderung einer durch Gefrieren hervorgerufenen Verminderung der Aktivität eines Proteins verwendet wird, in einer Konzentration von 0% (nur Kaliumphosphatpuffer), 0,01 % und 0,05% zu den LDH-Lösungen zugegeben.
Die so hergestellten Proben-LDH-Lösungen werden wie folgt zusammengefasst:
LDH [4 Einheiten/ml],
LDH [4 Einheiten/ml] + 0,01% SP
LDH [4 Einheiten/ml] + 0,05% SP
LDH [4 Einheiten/ml] + 0,01 % BSA
LDH [4 Einheiten/ml] + 0,05% BSA
Als nächstes wurde eine 100 μl-Portion von jeder der hergestellten Proben in ein 1,5 ml-Teströhrchen gegeben und für 1 Minute mit flüssigem Stickstoff eingefroren. Dann wurde nach einem Auftauen bei 30°C für 5 Minuten die LDH-Aktivität durch die oben erwähnte Methode gemessen. Die verbleibende LDH-Aktivität für jede Probe nach sich wiederholenden Einfrier-/Auftau-Zyklen wurde ausgedrückt, indem die LDH-Aktivität vor dem Einfrieren auf 100% gesetzt wurde.
Die verbleibende LDH-Aktivität in den Proben ohne SP wurde durch die sich wiederholenden Einfrier-/Auftau-Zyklen deutlich verringert und betrug nach 8 Einfrier-/Auftau-Zyklen ca. 3%, während die Probe mit SP ca. 90% verbleibende Aktivität aufwies.
Die oben erwähnten Ergebnisse sind in 3 gezeigt.
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Verfahren zum Verhindern einer durch Gefrieren hervorgerufenen Verminderung der Aktivität eines Proteins, umfassend die Zugabe eines Polypeptids, das die folgende Aminosäuresequenz (I) umfasst, zu einem Protein von Interesse: Ser-Ser-Thr-Gly-Ser-X1-Ser-X2-Thr-Asp-X3-X4-X5-X6-X7-X8-Gly-Ser-X9-Thr-Ser-Gly-Gly-Ser-Ser-Thr-Tyr-Gly-Tyr-Ser-Ser-X10-X11-X12-X13-Gly-X14-Val (I) (SEQ ID NO: 1) wobei: X1 für Ser oder Thr steht, X2 für Asn oder Thr steht, X3 für Ser oder Ala steht, X4 für Asn oder Ser steht, X5 für Ser oder Thr steht, X6 für Asn, Asp oder Lys steht, X7 für Ser, Asn oder Lys steht, X8 für Ala, Thr oder Val steht, X9 für Ser oder Arg steht, X10 für Asn, Ser, Asp oder Arg steht, X11 für Ser, Asn, His oder Cys steht, X12 für Arg oder Gly steht, X13 für Asp oder Gly steht, und X14 für Ser oder Arg steht.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Aminosäuresequenz (I) die folgende Aminosäuresequenz (II) ist: Ser-Ser-Thr-Gly-Ser-Ser-Ser-Asn-Thr-Asp-Ser-Asp-Ser-Asn-Ser-Ala-Gly-Ser-Ser-Thr-Ser-Gly-Gly-Ser-Ser-Thr-Tyr-Gly-Tyr-Ser-Ser-Asn-Ser-Arg-Asp-Gly-Ser-Val (II) (SEQ ID NO: 2).
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei das Polypeptid eine sich wiederholende Sequenz umfasst, in welcher die Aminosäuresequenz (I) wenigstens zweimal wiederholt wird.
Verfahren nach Anspruch 1, 2 oder 3, wobei das Polypeptid ein chimäres Protein ist.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Polypeptid durch ein Verfahren erhalten wird, welches umfasst: – einen rekombinanten Vektor bereitstellen, welcher eine DNA umfasst, die ein Polypeptid codiert, welches die Aminosäuresequenz (I) umfasst, – eine Zelle mit dem rekombinanten Vektor transformieren, um eine Transformante zu erhalten, und – die Transformante kultivieren und ein Polypeptid aus den resultierenden Zellen und/oder der Kultur von diesen gewinnen.
Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 5, wobei das Protein von Interesse ein Enzym ist.