DE60124863T3

DE60124863T3 - Gegen menschliche interleukin-1-beta gerichtete rekombinante antikörper

Info

Publication number: DE60124863T3
Application number: DE60124863T
Authority: DE
Inventors: Hermann Gram; E. Franco DI PADOVA
Original assignee: Novartis AG
Current assignee: Novartis AG
Priority date: 2000-01-21
Filing date: 2001-01-19
Publication date: 2010-05-20
Anticipated expiration: 2021-01-20
Also published as: CO5261584A1; WO2001053353A3; ES2274865T5; HUP0204156A3; US20110182894A1; NO329816B1; TR200201780T2; CN1395581B; MY155269A; KR20020073178A; CN1395581A; IL150551A; PE20011219A1; JP2007097598A; SK288054B6; IL150551A0; NO20023266D0; CZ20022531A3; US20090232803A1; HUP0204156A2

Description

Die Erfindung betrifft Antikörper gegen humanes Interleukin-I-beta (IL-1β) und die Verwendung solcher Antikörper zur Behandlung von Erkrankungen und Störungen, die durch IL-1 vermittelt werden.
Interleukin 1 (IL-1) ist eine Aktivität, die durch Zellen des Immunsystems gebildet wird, die als Mediator der Entzündungsreaktion der akuten Phase wirkt. Ungeeignete oder übermäßige Bildung von IL-1, insbesondere IL-1β, ist mit der Pathologie von verschiedenen Erkrankungen und Störungen assoziiert, wie Septikämie, septischer oder endotoxischer Schock, Allergien, Asthma, Knochenverlust, Ischämie, Schlaganfall, rheumatoider Arthritis und anderen entzündlichen Erkrankungen. Antikörper gegen IL-1β wurden zur Verwendung bei der Behandlung von IL-1-vermittelten Erkrankungen und Störungen vorgeschlagen, siehe beispielsweise WO 95 01 997 A und die Diskussion in der Einleitung hiervon.
Es wurden nun verbesserte Antikörper gegen humanes IL-1β zur Verwendung bei der Behandlung von IL-1-vermittelten Erkrankungen und Störungen hergestellt.
Die Erfindung liefert einen Antikörper gegen IL-1β, der die in Anspruch 1 angegebenen Eigenschaften aufweist.
Demnach liefert die Erfindung ein IL-1β bindendes Molekül, das eine Antigenbindungsspezifität für ein antigenes Epitop von reifem humanem IL-1β aufweist, das eine Schleife umfasst, die die Reste Gly 22, Pro 23, Tyr 24 und Glu 25 enthält, und das zur Hemmung der Bindung von IL-1β an dessen Rezeptor fähig ist und wobei das IL-1β bindende Molekül eine Antigenbindungsstelle umfasst, die zumindest eine variable Domäne der schweren Kette des Immunoglobulins (V_H) umfasst, die in Folge die hypervariablen Regionen CDR1, CDR2 und CDR3 umfasst, wie dies in SEQ ID Nr. 1 gezeigt ist, das heißt die CDR1 weist die Aminosäuresequenz Ser-Tyr-Trp-Ile-Gly auf, die CDR2 weist die Aminosäuresequenz Ile-Ile-Tyr-Pro-Ser-Asp-Ser-Asp-Thr-Arg-Tyr-Ser-Pro-Ser-Phe-Gln-Gly auf, und die CDR3 weist die Aminosäuresequenz Tyr-Thr-Asn-Trp-Asp-Ala-Phe-Asp-Ile auf und wobei das IL-1β bindende Molekül eine Antigenbindungsstelle umfasst, die mindestens eine variable Domäne der leichten Kette des Immunglobulins (V_L) umfasst, die in Folge die hypervariablen Regionen CDR1', CDR2' und CDR3' umfasst, wie dies in SEQ ID Nr. 2 gezeigt ist, das heißt die CDR1' weist die Aminosäuresequenz Arg-Ala-Ser-Gln-Ser-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Ala auf, die CDR2' weist die Aminosäuresequenz Asp-Ala-Ser-Asn-Arg-Ala-Thr auf und die CDR3' weist die Aminosäuresequenz Gln-Gln-Arg-Ser-Asn-Trp-Met-Phe-Pro auf.
Die Erfindung liefert ein IL-1β Bindemolekül, das sowohl variable Domänen der schweren Kette (V_H) als auch der leichten Kette (V_L) umfasst, worin das IL-1β Bindemolekül zumindest eine Antigenbindungsstelle enthält, die umfasst:

a) eine variable Domäne der schweren Kette des Immunglobulins (V_H), die in Folge die hypervariablen Regionen CDR1, CDR2 und CDR3 enthält, wobei CDR1 die Aminosäuresequenz Ser-Tyr-Trp-Ile-Gly aufweist, die CDR2 die Aminosäuresequenz Ile-Ile-Tyr-Pro-Ser-Asp-Ser-Asp-Thr-Arg-Tyr-Ser-Pro-Ser-Phe-Gln-Gly aufweist und die CDR3 die Aminosäuresequenz Tyr-Thr-Asn-Trp-Asp-Ala-Phe-Asp-Ile aufweist und
b) eine variable Domäne der leichten Kette des Immunglobulins (V_L), die in Folge die hypervariablen Regionen CDR1', CDR2' und CDR3' umfasst, wobei die CDR1' die Aminosäuresequenz Arg-Ala-Ser-Gln-Ser-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Ala aufweist, die CDR2' die Aminosäuresequenz Asp-Ala-Ser-Asn-Arg-Ala-Thr aufweist und die CDR3' die Aminosäuresequenz Gln-Gln-Arg-Ser-Asn-Trp-Met-Phe-Pro aufweist.

Falls nichts anderes angegeben ist, wird jede Polypeptidkette hierin als Aminosäuresequenz beschrieben, die am N-terminalen Ende beginnt und am C-terminalen Ende aufhört. Wenn die Antigenbindungsstelle sowohl die V_H als auch VL Domänen umfasst, können diese auf demselben Polypeptidmolekül liegen oder es kann vorzugsweise jede Domäne auf einer unterschiedlichen Kette liegen, wobei die V_H Domäne Teil einer schweren Kette des Immunglobulins oder des Fragments hiervon ist und V_L Teil einer leichten Kette des Immunglobulins oder Fragments hiervon ist.
Mit „IL-1β Bindemolekül” ist jedes Molekül gemeint, das zur Bindung des IL-1β Antigens entweder alleine oder assoziiert mit anderen Molekülen in der Lage ist. Die Bindungsreaktion kann durch Standardverfahren (qualitative Tests) einschließlich beispielsweise einem Biotest zur Bestimmung der Hemmung der IL-1β Bindung an den Rezeptor oder jede Art von Bindungstests gezeigt werden, wobei auf einen Negativkontrolltest Bezug genommen wird, worin ein Antikörper mit anderer Spezifität aber desselben Isotyps, beispielsweise ein anti-CD 25 Antikörper verwendet wird. Vorteilhafterweise kann die Bindung der IL-1β Bindemoleküle der Erfindung an IL-1β in einem kompetitiven Bindungstest gezeigt werden.
Beispiele für Antigen-bindende Moleküle umfassen Antikörper, wie sie von B-Zellen oder Hybridomen und Chimären gebildet werden, CDR-transplantierte oder humane Antikörper oder jedes Fragment hiervon, beispielsweise F(ab')₂ und Fab Fragmente.
Ein Einzelkettenantikörper besteht aus den variablen Domänen der schweren und leichten Ketten eines Antikörpers, die kovalent durch einen Peptidlinker verbunden sind, der aus gewöhnlich 10 bis 30 Aminosäuren vorzugsweise 15 bis 25 Aminosäuren besteht. Daher enthält eine solche Struktur nicht den konstanten Teil der schweren und leichten Ketten, und der kleine Peptidspacer dürfte weniger Antigenität aufweisen, als ein vollständiger konstanter Teil. Mit ”chimärer Antikörper” ist ein Antikörper gemeint, bei dem die konstanten Regionen der leichten und schweren Ketten oder beide humanen Ursprungs sind, während die variablen Domänen sowohl der leichten Ketten als auch der schweren Ketten nicht humanen Ursprungs sind (beispielsweise von der Maus) oder von einem unterschiedlichen humanen Antikörper stammen. Mit „CDR-transplantierter Antikörper” ist ein Antikörper gemeint, worin die hypervariablen Regionen (CDRs) von einem Donorantikörper stammen, wie nicht humanem (beispielsweise Maus) Antikörper oder einem unterschiedlichen humanen Antikörper, während alle anderen Teile des Immunglobulins, beispielsweise die konstanten Regionen und die hoch konservierten Teile der variablen Domänen, das heißt die Frameworkregionen, von einem Akzeptorantikörper stammen, beispielsweise einem Antikörper humanen Ursprungs. Ein CDR-transplantierter Antikörper kann jedoch wenige Aminosäuren der Donorsequenz in den Frameworkregionen enthalten, beispielsweise in den Teilen der Frameworkregionen, die zu den hypervariablen Regionen benachbart liegen. Mit „humaner Antikörper” ist ein Antikörper gemeint, bei dem die konstanten und variablen Regionen sowohl der schweren als auch der leichten Ketten alle humanen Ursprungs sind oder im wesentlichen zu den Sequenzen humanen Ursprungs identisch sind und nicht notwendigerweise vom gleichen Antikörper stammen und umfasst Antikörper, die von Mäusen gebildet werden, worin die Gene des variablen und konstanten Teils des Mausimmunglobulins durch ihre humanen Gegenstücke ersetzt wurden, wie dies beispielsweise allgemein in EP 0 546 073 B1 , US 5 545 806 A , US 5 569 825 A , US 5 625 126 A , US 5 633 425 A , US 5 661 016 A , US 5 770 429 A , EP 0 438 474 B1 und EP 0 463 151 B1 beschrieben ist.
Besonders bevorzugte IL-1β Bindemoleküle der Erfindung sind humane Antikörper, speziell der AAL 160 Antikörper, wie er hierin später in den Beispielen beschrieben ist.
Daher sind in den bevorzugten chimären Antikörpern die variablen Domänen sowohl der schweren als auch der leichten Ketten humanen Ursprungs, beispielsweise jene des AAL 160 Antikörpers, die in SEQ ID Nr. 1 und SEQ ID Nr. 2 gezeigt sind. Die Domänen der konstanten Region umfassen vorzugsweise geeignete humane Domänen der konstanten Region, wie dies beispielsweise in „Sequences of Proteins of Immunological Interest”, E. A. Kabat et al., US Department of Health and Human Services, Public Health Service, National Institute of Health beschrieben ist.
Hypervariable Regionen können mit jeder Art von Framework-Regionen verbunden sein, die bevorzugt humanen Ursprungs sind. Geeignete Framework-Regionen werden in E. A. Kabat et al., siehe obige Literaturstelle, beschrieben. Das bevorzugte Framework der schweren Kette ist ein humanes Framework der schweren Kette, beispielsweise das des AAL 160 Antikörpers, das in der SEQ ID Nr. 1 gezeigt ist. Es besteht der Reihe nach aus FR1, FR2, FR3 und FR4 Regionen. In ähnlicher Weise zeigt die SEQ ID Nr. 2 das bevorzugte AAL 160 Framework der leichten Kette, das der Reihe nach aus den FR1', FR2', FR3' und FR4' Regionen besteht.
Demnach liefert die Erfindung auch ein IL-1β bindendes Molekül, das mindestens eine Antigenbindungsstelle enthält, die entweder eine erste Domäne mit der Aminosäuresequenz enthält, die im wesentlichen identisch zu der in der SEQ ID Nr. 1 gezeigten ist, die mit der Aminosäure an der Position 1 beginnt und mit der Aminosäure an der Position 118 endet, oder eine wie oben beschriebene erste Domäne und eine zweite Domäne mit einer Aminosäuresequenz, die im wesentlichen identisch zu der in der Sequenzzuordnung Nr. 2 gezeigten ist, die mit der Aminosäure an der Position 1 beginnt und mit der Aminosäure an der Position 107 endet.
Gegen ein natürlich bei allen Menschen auftretendes Protein erzeugte monoklonale Antikörper werden typischerweise in einem nicht-humanen System entwickelt, beispielsweise in der Maus. Als direkte Konsequenz daraus ruft ein von einer Hybridomzelle gebildeter xenogener Antikörper bei Verabreichung an Menschen eine unerwünschte Immunantwort hervor, die hauptsächlich durch den konstanten Teil des xenogenen Immunglobulins verursacht wird. Dies beschränkt die Verwendung solcher Antikörper deutlich, da sie nicht über einen langen Zeitraum hinweg verabreicht werden können. Daher ist es insbesondere bevorzugt, Einzelketten-, chimäre, CDR-transplantierte oder speziell humane Antikörper zu verwenden, die höchstwahrscheinlich keine wesentliche allogene Reaktion hervorrufen, wenn sie Menschen verabreicht werden.
In Anbetracht des Vorangegangenen ist ein erfindungsgemäß bevorzugteres IL-1β bindendes Molekül aus einem humanen anti-IL-1β Antikörper ausgewählt, der zumindest enthält

a) eine schwere Kette eines Immunglobulins oder ein Fragment hiervon, das umfasst (i) eine variable Domäne, die in Folge die hypervariablen Regionen CDR1, CDR2 und CDR3 enthält, und (ii) den konstanten Teil einer humanen schweren Kette oder ein Fragment hiervon, wobei CDR1 die Aminosäuresequenz Ser-Tyr-Trp-Ile-Gly aufweist, CDR2 die Aminosäuresequenz Ile-Ile-Tyr-Pro-Ser-Asp-Ser-Asp-Thr-Arg-Tyr-Ser-Pro-Ser-Phe-Gln-Gly aufweist und CDR3 die Aminosäuresequenz Tyr-Thr-Asn-Trp-Asp-Ala-Phe-Asp-Ile aufweist, und
b) eine leichte Kette eines Immunglobulins oder ein Fragment hiervon, die umfasst (i) eine variable Domäne, die die hypervariable CDR3' Region und auch die hypervariablen Regionen CDR1' und CDR2' enthält, und (ii) den konstanten Teil einer humanen leichten Kette oder ein Fragment hiervon, wobei CDR1' die Aminosäuresequenz Arg-Ala-Ser-Gln-Ser-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Ala aufweist, die CDR2' die Aminosäuresequenz Asp-Ala-Ser-Asn-Arg-Ala-Thr aufweist und die CDR3' die Aminosäueresequenz Gln-Gln-Arg-Ser-Asn-Trp-Met-Phe-Pro aufweist.

Alternativ dazu kann ein erfindungsgemäßes IL-1β bindendes Molekül aus einem einzelkettigen Bindungsmolekül ausgewählt werden, das eine Antigenbindungsstelle enthält, die folgendes umfasst:

a) eine erste Domäne, die in Folge die hypervariablen Regionen CDR1, CDR2 und CDR3 enthält, wobei die hypervariablen Regionen die in der SEQ ID Nr. 1 gezeigten Aminosäuresequenzen aufweisen,
b) eine zweite Domäne, die die hypervariablen Regionen CDR3' und CDR1' und CDR2 enthält, wobei die hypervariablen Regionen die in der SEQ ID Nr. 2 gezeigten Aminosäuresequenzen aufweisen, und
c) einen Peptidlinker, der entweder an den N-terminalen Teil der ersten Domäne und an den C-terminalen Teil der zweiten Domäne oder an den C-terminalen Teil der ersten Domäne und an den N-terminalen Teil der zweiten Domäne gebunden ist.

Es ist gut bekannt, dass geringe Änderungen in einer Aminosäuresequenz, wie Deletion, Addition oder Substitution von einer, wenigen oder sogar mehreren Aminosäuren zu einer Allelform des ursprünglichen Proteins führen können, die im wesentlichen die identischen Eigenschaften aufweist.
Daher meint der Ausdruck ”direkte Äquivalente hiervon” auch jedes IL-1β bindende Molekül mit einer einzelnen Domäne (Molekül X)

(i) worin die hypervariablen Regionen CDR1, CDR2 und CDR3 als Gesamtheit mindestens 80% homolog, vorzugsweise mindestens 90% homolog, insbesondere mindestens 95% homolog zu den in der SEQ ID Nr. 1 gezeigten hypervariablen Regionen sind und,
(ii) das zur Hemmung der Bindung von IL-1β an dessen Rezeptor im gleichen Ausmaß in der Lage ist, wie ein Referenzmolekül, das die zu denen von Molekül X identischen Framework-Regionen aufweist, aber die hypervariablen Regionen CDR1, CDR2 und CDR3, die zu denen in der SEQ ID Nr. 1 gezeigten identisch sind,

(i) worin die hypervariablen Regionen CDR1, CDR2, CDR3, CDR3' und optional CDR1' und CDR2' als Gesamtheit mindestens 80% homolog, vorzugsweise mindestens 90% homolog, insbesondere mindestens 95% homolog zu den in den SEQ ID Nr. 1 und 2 gezeigten hypervariablen Regionen sind und,
(ii) das zur Hemmung der Bindung von IL-1β an dessen Rezeptor im gleichen Ausmaß in der Lage ist, wie ein Referenzmolekül, das die zu denen von Molekül X' identischen Framework-Regionen aufweist, aber die hypervariablen Regionen CDR1, CDR2, CDR3, CDR3' und optional CDR1' und CDR2' zu denen in den SEQ ID Nr. 1 und 2 gezeigten identisch sind.

In der vorliegenden Beschreibung sind Aminosäuresequenzen zu mindestens 80% homolog zueinander, falls sie zumindest 80% identische Aminosäurereste in einer ähnlichen Position aufweisen, wenn die Sequenzen optimal übereinandergelegt werden, wobei Lücken oder Insertionen in den Aminosäuresequenzen als nicht-identische Reste gezählt werden.
Die Hemmung der Bindung von IL-1β an dessen Rezeptor kann bequem in verschiedenen Tests getestet werden, wie solchen Tests, die hierin später im Text beschrieben sind. Der verwendete IL-1β Rezeptor ist vorzugsweise der IL-1β Typ 1 Rezeptor. Mit dem Ausdruck ”im gleichen Ausmaß” ist gemeint, dass die Referenz und die entsprechenden Moleküle statistisch gesehen im wesentlichen identische IL-1β Bindungshemmkurven in einem der obigen Bioassays zeigen.
Beispielweise kann der verwendete Test ein Test der kompetitiven Hemmung der Bindung von IL-1β durch lösliche IL-1 Rezeptoren und den erfindungsgemäßen IL-1β Bindemolekülen sein.
Am bevorzugtesten enthält der humane II-1β Antikörper zumindest

a) eine schwere Kette, die eine variable Domäne mit einer Aminosäuresequenz enthält, die zu der in der SEQ ID Nr. 1 gezeigten identisch ist und mit der Aminosäure an der Position 1 beginnt und mit der Aminosäure an der Position 118 endet, und den konstanten Teil einer humanen schweren Kette, und
b) eine leichte Kette, die eine variable Domäne mit einer Aminosäuresequenz enthält, die zu der in der SEQ ID Nr. 2 gezeigten identisch ist und mit Glutaminsäure an der Position 1 beginnt und mit Glutaminsäure an der Position 107 endet, und den konstanten Teil einer humanen leichten Kette.

Der konstante Teil einer humanen schweren Kette kann vom γ₁, γ₂, γ₃, γ₄, μ, α₁, α₂, δ oder ∊ Typ sein, vorzugsweise vom γ Typ, bevorzugter vom γ₁ Typ, während der konstante Teil der humanen leichten Kette vom κ oder λ Typ (der die λ₁, λ₂ und λ₃ Subtypen beinhaltet) sein kann, aber vorzugsweise vom κ Typ ist. Die Aminosäuresequenzen von allen diesen konstanten Teilen sind in Kabat et al, siehe obige Literaturstelle, wiedergegeben.
Ein erfindungsgemäßes IL-1β bindendes Molekül kann durch rekombinante DNA Techniken hergestellt werden. In Anbetracht dessen müssen ein oder mehrere DNA Moleküle, die das Bindemolekül kodieren, konstruiert, unter geeignete Kontrollsequenzen gestellt und in einen geeigneten Wirtsorganismus zur Expression transferiert werden.
Sehr allgemein formuliert werden demnach bereitgestellt

(i) DNA Moleküle, die für ein erfindungsgemäßes einkettiges IL-1β Bindemolekül, eine schwere und leichte Kette oder Fragmente hiervon eines erfindungsgemäßen IL-1β Bindemoleküls kodieren, und
(ii) die Verwendung der erfindungsgemäßen DNA Moleküle zur Herstellung eines erfindungsgemäßen IL-1β Bindemoleküls durch rekombinante Mittel.

Der gegenwärtige Stand der Technik sieht so aus, dass Fachleute in der Lage sind, mit der hier angegebenen Information die erfindungsgemäßen DNA Moleküle zu synthetisieren, das heißt die Aminosäuresequenzen der hypervariablen Regionen und die dafür kodierenden DNA Sequenzen. Ein Verfahren zur Konstruktion eines Gens für eine variable Domäne ist beispielsweise in EP 0 239 400 A beschrieben und kann kurz wie folgt zusammengefasst werden: Ein Gen, das eine variable Domäne eines mAk beliebiger Spezifität kodiert, wird kloniert. Die die Framework- und hypervariablen Regionen kodierenden DNA Segmente werden bestimmt und die die hypervariablen Regionen kodierenden DNA Segmente werden so entfernt, dass die für die Framework-Regionen kodierenden DNA Segmente mit geeigneten Restriktionsschnittstellen an den Verbindungspunkten fusioniert werden. Die Restriktionsschnittstellen können an den geeigneten Positionen durch Mutagenese des DNA Moleküls mittels Standardtechniken hergestellt werden. Doppelsträngige synthetische CDR Kassetten werden durch DNA Synthese gemäß den in den SEQ ID Nr. 1 oder 2 angegebenen Sequenzen hergestellt. Diese Kassetten werden mit klebrigen Enden geliefert, so dass sie an die Verbindungspunkte des Frameworks ligiert werden können.
Weiterhin ist es nicht notwendig, Zugang zu der mRNA einer produzierenden Hybridomzellinie zu haben, um ein DNA Konstrukt zu erhalten, das für die erfindungsgemäßen IL-1β Bindemoleküle kodiert. Daher gibt die WO 90 07 861 A vollständige Anleitungen zur Herstellung eines Antikörpers durch rekombinante DNA Techniken, wobei nur die schriftliche Information der Nukleotidsequenz des Gens gegeben ist. Das Verfahren umfasst die Synthese einiger Oligonukleotide, ihre Vervielfältigung durch die PCR Technik und ihr Spleißen unter Bildung der gewünschten DNA Sequenz.
Expressionsvektoren, die einen geeigneten Promotor oder Gene enthalten, die die konstanten Teile der schweren und leichten Kette enthalten, sind frei erhältlich. Daher kann ein einmal hergestelltes erfindungsgemäßes DNA Molekül bequem in einen geeigneten Expressionsvektor transferiert werden. Die DNA Moleküle, die Einzelkettenantikörper kodieren, können auch durch Standardverfahren hergestellt werden, wie beispielsweise in WO 88 1649 A beschrieben.
In Anbetracht des Vorangegangenen dürfte keine Hinterlegung einer Hybridomzelle oder Zelllinie notwendig sein, um den Kriterien einer ausreichenden Beschreibung zu entsprechen.
In einer bestimmten Ausführungsform umfasst die Erfindung erste und zweite DNA Konstrukte zur Herstellung eines IL-1β Bindemoleküls, wie sie im folgenden beschrieben werden: Das erste DNA Konstrukt kodiert eine schwere Kette oder ein Fragment hiervon und umfasst

a) einen ersten Teil, der eine abwechselnd Framework und hypervariable Regionen enthaltende variable Domäne kodiert, wobei die hypervariablen Regionen der Reihe nach CDR1, CDR2 und CDR3 sind, deren Aminosäuresequenzen in der SEQ ID Nr. 1 gezeigt sind und dieser erste Teil mit einem Codon beginnt, das für die erste Aminosäure der variablen Domäne kodiert, und mit einem Codon endet, das die letzte Aminosäure der variablen Domäne kodiert, und
b) einen zweiten Teil, der einen konstanten Teil einer schweren Kette oder ein Fragment hiervon kodiert, der mit einem die erste Aminosäure des konstanten Teils der schweren Kette kodierenden Codon beginnt und mit einem die letzte Aminosäure des konstanten Teils oder eines Fragments hiervon kodierenden Codon gefolgt von einem Stopcodon endet.

Vorzugsweise kodiert dieser erste Teil eine variable Domäne mit einer Aminosäuresequenz, die im wesentlichen zu der in der SEQ ID Nr. 1 gezeigten Aminosäuresequenz identisch ist und mit der Aminosäure an der Position 1 beginnt und mit der Aminosäure an der Position 118 endet. Bevorzugter weist der erste Teil die in der SEQ ID Nr. 1 gezeigte Nukleotidsequenz auf, die mit dem Nukleotid an der Position 1 beginnt und mit dem Nukleotid an der Position 354 endet. Der zweite Teil kodiert ebenfalls vorzugsweise den konstanten Teil einer humanen schweren Kette, bevorzugter den konstanten Teil der humanen γ₁ Kette. Dieser zweite Teil kann ein DNA Fragment genomischen Ursprungs (umfasst Introns) oder ein cDNA Fragment (ohne Introns) sein.
Das zweite DNA Konstrukt kodiert eine leichte Kette oder ein Fragment hiervon und umfasst

a) einen ersten Teil, der eine abwechselnd Framework und hypervariable Regionen enthaltende variable Domäne kodiert, wobei die hypervariablen Regionen CDR3' und optional CDR1 und CDR2' sind, wobei die Aminosäuresequenzen hiervon in der SEQ ID Nr. 2 gezeigt sind und dieser erste Teil mit einem Codon beginnt, das die erste Aminosäure der variablen Domäne kodiert und mit einem Codon endet, das die letzte Aminosäure der variablen Domäne kodiert, und
b) einen zweiten Teil, der einen konstanten Teil einer leichten Kette oder ein Fragment hiervon kodiert, der mit einem die erste Aminosäure des konstanten Teils der leichten Kette kodierenden Codon beginnt und mit einem die letzte Aminosäure des konstanten Teils oder eines Fragments hiervon kodierenden Codon endet, gefolgt von einem Stopcodon.

Vorzugsweise kodiert dieser erste Teil für eine variable Domäne mit einer Aminosäuresequenz, die im wesentlichen zu der in der SEQ ID Nr. 2 gezeigten Aminosäuresequenz identisch ist und mit der Aminosäure an der Position 1 beginnt und mit der Aminosäure an der Position 107 endet. Bevorzugter weist der erste Teil die in der SEQ ID Nr. 2 gezeigte Nukleotidsequenz auf und beginnt mit dem Nukleotid an der Position 1 und endet mit dem Nukleotid an der Position 321. Ebenfalls bevorzugt kodiert der zweite Teil vorzugsweise für den konstanten Teil einer humanen leichten Kette, insbesondere den konstanten Teil der humanen κ Kette.
Die Beschreibung umfasst auch IL-1β Bindemoleküle, worin einer oder mehrere der Reste von CDR1, CDR2, CDR3, CDR1', CDR2' oder CDR3' gegenüber den in SEQ ID Nr. 1 und SEQ ID Nr. 2 gezeigten Resten verändert sind, beispielsweise durch Mutation, wie ortsspezifische Mutagenese der entsprechenden DNA Sequenzen. Die Offenbarung umfasst die DNA Sequenzen, die für solche veränderten IL-1β Bindemoleküle kodieren. Insbesondere umfasst die Offenbarung IL-1β Bindemoleküle, worin einer oder mehrere Reste aus CDR1' oder CDR2' gegenüber Resten verändert wurden, die in SEQ ID Nr. 2 gezeigt sind.
In den ersten und zweiten DNA Konstrukten sind der erste und der zweite Teil vorzugsweise durch ein Intron getrennt und es kann bequemerweise zwischen dem ersten und zweiten Teil liegenden Intron ein Enhancer platziert werden. Das Vorkommen eines solchen Enhancers, der transkribiert aber nicht translatiert wird, könnte eine effiziente Transkription unterstützen. Die ersten und zweiten DNA Kon strukte enthalten den Enhancer des Gens der schweren Kette, wobei ein humaner Ursprung vorteilhaft ist.
Jedes der DNA Konstrukte wird unter die Kontrolle geeigneter Kontrollsequenzen gestellt, insbesondere unter die Kontrolle eines geeigneten Promotors. Es kann jede Art von Promotor verwendet werden, vorausgesetzt, dass dieser an den Wirtsorganismus angepasst ist, in den die DNA Konstrukte für die Expression transferiert werden. Falls die Expression jedoch in einer Säugerzelle stattfindet, ist besonders der Promotor eines Immunglobulingens oder ein Cytomegalievirus (CMV) Promotor bevorzugt, beispielsweise ein humaner CMV Promotor.
Der gewünschte Antikörper kann in einer Zellkultur oder in einem transgenen Tier hergestellt werden. Ein geeignetes transgenes Tier kann gemäß den Standardtechniken erhalten werden, die die Mikroinjektion der unter geeigneter Kontrolle stehenden ersten und zweiten DNA Konstrukte in Eier und den Transfer der so hergestellten Eier in geeignete pseudo-schwangere Weibchen und die Selektion eines den gewünschten Antikörper sekretierenden Abkömmlings beinhalten.
Falls die Antikörperketten in einer Zellkultur gebildet werden, müssen die DNA Konstrukte entweder in einem einzelnen Expressionsvektor oder in 2 getrennte aber kompatible Expressionsvektoren inseriert werden, wobei letztere Möglichkeit bevorzugt ist.
Demnach liefert die Erfindung auch einen Expressionsvektor, der zur Replikation in einer prokaryontischen oder eukaryontischen Zelllinie fähig ist und die oben beschriebenen DNA Konstrukte enthält.
Der ein DNA Konstrukt enthaltende Expressionsvektor wird dann in einen geeigneten Wirtsorganismus transferiert. Falls die DNA Konstrukte getrennt in zwei Expressionsvektoren inseriert werden, können sie einzeln transferiert werden, das heißt ein Vektortyp pro Zelle, oder kotransferiert werden, wobei die letztere Möglichkeit zu bevorzugen ist. Ein geeigneter Wirtsorganismus kann ein Bakterium, eine Hefe oder eine Säugerzellinie sein, wobei letztere bevorzugt ist. Bevorzugter sollte die Säugerzellinie lymphoiden Ursprungs sein, wie beispielsweise eine Myelom-, Hybridom-, oder normal immortalisierte B-Zelle, die bequemerweise endogen keine schwere oder leichte Kette eines Antikörpers bildet.
Zur Expression in Säugerzellen ist es bevorzugt, dass die für das IL-1β Bindemolekül kodierende Sequenz in die Wirtszell-DNA innerhalb eines Lokus integriert wird, der eine starke Expression des IL-1β Bindemoleküls erlaubt oder fördert. Zellen, worin die für das IL-1β Bindemolekül kodierende Sequenz in einen solch bevorzugten Lokus inseriert ist, können auf der Grundlage der Menge an IL-1β Bindemolekül ausgewählt werden, das sie exprimieren. Jeder geeignete Selektionsmarker, kann zur Herstellung von Wirtszellen verwendet werden, die die für das IL-1β Bindemolekül kodierende Sequenz enthalten, wobei beispielsweise ein dhfr Gen/Methotrexat oder äquivalentes System verwendet werden kann. Bevorzugte Systeme zur Expression der erfindungsgemäßen IL-1β Bindemoleküle umfassen GS-basierte Amplifikations-/Selektionssysteme, wie jene, die in EP 0 256 055 B1 , EP 0 323 997 B1 und EP 0 338 841 B1 beschrieben sind. Vorzugsweise kann auch der Vektor andere Sequenzen enthalten, wie dies zur Erleichterung der Expression, Prozessierung und des Exports des exprimierten Proteins gewünscht ist, wobei der Vektor typischerweise eine Signalsequenz enthalten kann, die mit der kodierenden Sequenz assoziiert ist.
In einem weiteren Aspekt wird ein Verfahren zur Herstellung eines IL-1β Bindemoleküls bereitgestellt, das gekennzeichnet ist durch (i) Kultivieren eines Organismus, der mit einem wie oben definierten Expressionsvektor transformiert ist, und (ii) Gewinnen des IL-1β Bindemoleküls aus der Kultur.
Gemäß der vorliegenden Erfindung wurde festgestellt, dass der AAL 160 Antikörper eine Bindespezifität für das antigene Epitop von humanem IL-1β aufweist, das die Schleife umfasst, welche die Reste Gly 22, Pro 23, Tyr 24 und Glu 25 von reifem humanem IL-1β enthält. (Reste Gly 22, Pro 23, Tyr 24 und Glu 25 von reifem, humanem IL-1β entsprechen jeweils den Resten 138, 139, 140 und 141 des humanen IL-1β Vorläufers). Dieses Epitop scheint außerhalb der Erkennungsstelle des IL-1 Rezeptors zu liegen und es ist daher sehr überraschend, dass Antikörper gegen dieses Epitop, beispielsweise der AAL 160 Antikörper, zur Hemmung der Bindung von IL-1β an seinen Rezeptor fähig sind. Antikörper, speziell chimäre und CDR-transplantierte Antikörper und speziell humane Antikörper, die eine Bindespezifität für das antigene Epitop von reifem, humanem IL-1β aufweisen, das die Schleife umfasst, welche die Reste Glu 22, Pro 23, Tyr 24 und Glu 25 enthält und die zur Hemmung der Bindung von IL-1β an dessen Rezeptor fähig sind und die Verwendung solcher Antikörper zur Behandlung von IL-1 vermittelten Erkrankungen und Störungen werden offenbart.
Daher umfasst die Beschreibung in einem weiteren Aspekt einen Antikörper gegen IL-1β, der die Antigen-bindende Spezifität für ein antigenes Epitop von humanem IL-1β aufweist, das die Schleife umfasst, die die Reste Gly 22, Pro 23, Tyr 24 und Glu 25 von reifem, humanem IL-1β enthält und der zur Hemmung der Bindung von IL-1β an dessen Rezeptor fähig ist.
In einem weiteren Aspekt umfasst die Offenbarung

i) die Verwendung eines Antikörpers gegen IL-1β, der eine antigenbindende Spezifität für ein antigenes Epitop von reifem, humanem IL-1β aufweist, das die Schleife umfasst, die die Reste Gly 22, Pro 23, Tyr 24, und Glu 25 enthält und der zur Hemmung der Bindung von IL-1β an dessen Rezeptor fähig ist, zur Behandlung einer durch IL-1 vermittelten Erkrankung oder Störung,
ii) ein Verfahren zur Behandlung einer durch IL-1 vermittelten Erkrankung oder Störung bei einem Patienten, die die Verabreichung einer wirksamen Menge eines Antikörpers gegen IL-1β an den Patienten umfasst, welche eine antigenbindende Spezifität für ein antigenes Epitop von reifem, humanem IL-1β aufweist, das die Schleife umfasst, die die Reste Gly 22, Pro 23, Tyr 24, und Glu 25 enthält und der zur Hemmung der Bindung von IL-1β an dessen Rezeptor fähig ist,
iii) eine pharmazeutische Zusammensetzung, die umfasst einen Antikörper gegen IL-1β, der eine antigenbindende Spezifität für ein antigenes Epitop von reifem, humanem IL-1β aufweist, das die Schleife umfasst, die die Reste Gly 22, Pro 23, Tyr 24 und Glu 25 enthält und der zur Hemmung der Bindung von IL-1β an dessen Rezeptor fähig ist, in Kombination mit einem pharmazeutisch annehmbaren Hilfsstoff, Verdünnungsmittel oder Träger, und
iv) die Verwendung eines Antikörpers gegen IL-1β, der eine antigenbindende Spezifität für ein antigenes Epitop von reifem, humanem IL-1β aufweist, das die Schleife umfasst, die die Reste Gly 22, Pro 23, Tyr 24 und Glu 25 enthält und der zur Hemmung der Bindung von IL-1β an dessen Rezeptor fähig ist, zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung einer durch IL-1 vermittelten Erkrankung oder Störung.

Für die Zwecke der vorliegenden Beschreibung ist ein Antikörper zur „Hemmung der Bindung von IL-1β fähig”, falls der Antikörper zur Hemmung der Bindung von IL-1β an dessen Rezeptor im wesentlichen im selben Ausmaß wie der AAL 160 Antikörper fähig ist, worin „im selben Ausmaß” die oben definierte Bedeutung hat.
In der vorliegenden Beschreibung umfasst der Ausdruck „durch IL-1 vermittelte Erkrankung” alle Erkrankungen und medizinischen Zustände, in denen IL-1 eine Rolle spielt, ob direkt oder indirekt, in der Erkrankung oder dem medizinischen Zustand, einschließlich der Verursachung, Entwicklung, dem Fortschritt, der Persistenz oder der Pathologie der Erkrankung oder des Zustands.
In der vorliegenden Beschreibung beziehen sich die Ausdrücke ”Behandlung” oder ”behandeln” sowohl auf die prophylaktische als auch präventive Behandlung wie auch die heilende oder Erkrankungsmodifizierende Behandung, einschließlich der Behandlung des Patienten, der einem Risiko ausgesetzt ist, sich die Erkrankung zuzuziehen oder in Verdacht steht, die Erkrankung sich zugezogen zu haben, wie auch Patienten, die krank sind oder eine Diagnose erhalten haben, an einer Erkrankung oder einem medizinischen Zustand zu leiden und umfasst die Unterdrückung des klinischen Rückfalls.
Erfindungsgemäße Antikörper besitzen eine Bindespezifität für das antigene Epitop von reifem, humanem IL-1β, welche die Schleife umfassen, die die Reste Glu 22, Pro 23, Tyr 24 und Glu 25 umfasst, und die zur Hemmung der Bindung von IL-1β an den Rezeptor fähig sind. Vorzugsweise besitzen erfindungsgemäße Antikörper eine Bindespezifität für dieses Epitop von humanem IL-1β, wenn das humane IL-1β unter nativen, beispielsweise normalen physiologischen Bedingungen, nicht unter denaturierten Bedingungen vorliegt, beispielsweise nicht in Gegenwart eines Denaturierungsmittels, wie SDS. Die erfindungsgemäßen Antikörper können mit nicht-humanen IL-1βs kreuzreagieren, die antigene Epitope umfassen, welche Gly am Rest 22, Pro am Rest 23, Tyr am Rest 24 und Glu am Rest 25 umfassen und die zum entsprechenden humanen Epitop sehr ähnlich sind. Beispielsweise können erfindungsgemäße Antikörper mit IL-1βs von Primaten kreuzreagieren, wie IL-1 vom Rhesusaffen, vom Hundaffen oder vom Krallenaffen.
Vorteilhafterweise sind die erfindungsgemäßen Antikörper humane Antikörper, am bevorzugtesten der AAL 160 Antikörper oder direkte Äquivalente hiervon.
Die erfindungsgemäßen Antikörper blockieren die Wirkungen von IL-1β auf die Zielzellen und sind so zur Verwendung bei der Behandlung von IL-1 vermittelten Erkrankungen und Störungen indiziert. Diese und andere pharmakologische Aktivitäten der erfindungsgemäßen Antikörper können in Standardtestverfahren gezeigt werden, wie dies beispielsweise im folgenden beschrieben ist:
1. Neutralisierung der durch humanes IL-1β vermittelten Aktivierung des IL-8 Promotors
Das Potential zur Neutralisation der IL-1β abhängigen zellulären Signalübertragung wird in einem Reportergentest bestimmt.
Die humane Melanomzelllinie G361 wird stabil mit einem Luciferasereportergenkonstrukt transfiziert, das auf dem humanen IL-8 Promotor basiert. Die Reportergenexpression und die Aktivität hängt von IL-1β oder TNFα in dieser Zelllinie ab. Die Zellen werden mit 300 pg/ml rekombinantem, humanem IL-1β oder dem Äquivalent von 100 pg/ml in konditioniertem Medium in Gegenwart von verschiedenen Konzentrationen des erfindungsgemäßen Antikörpers oder eines IL-1 Rezeptorantagonisten stimuliert, die zwischen 6 und 18 000 pM liegen. Der chimäre Antikörper Simulect^® (Basiliximab) wird als passende Isotypenkontrolle verwendet. Die Luciferaseaktivität wird in einem Chemilumineszenztest quantifiziert. Die erfindungsgemäßen Antikörper haben typischerweise eine HK₅₀ von etwa 1 nM (beispielsweise etwa 0,2 bis etwa 5 nM), wenn sie in diesem Test getestet werden.
2. Neutralisation der IL-1β abhängigen Produktion von PGE₂ und Interleukin-6 durch primäre humane Fibroblasten
Die Bildung von PGE₂ und IL-6 hängt in primären, humanen Hautfibroblasten von IL-1β ab. TNFα alleine kann diese Entzündungsmediatoren nicht effizient induzieren, ergibt aber mit IL-1 eine Synergie. Es werden primäre Hautfibroblasten als Ersatzmodell für eine durch IL-1 induzierte zelluläre Aktivierung verwendet.
Primäre, humane Fibroblasten werden mit rekombinantem IL-1β oder konditioniertem Medium von LPS-stimulierten humanen PBMCs in Gegenwart von verschiedenen Konzentrationen an erfindungsgemäßen Antikörpern oder IL-1RA im Bereich von 6 bis 18 000 pM stimuliert. Der chimäre anti-CD25 Antikörper Simulect^® (Basiliximab) wird als passende Isotypenkontrolle verwendet. Der Überstand wird nach einer Stimulierung für 16 h entnommen und auf IL-6 durch ELISA oder PGE₂ durch RIA getestet. Die erfindungsgemäßen Antikörper haben typischerweise HK₅₀s zur Hemmung der IL-6 Bildung von etwa 1 nM oder weniger (beispielsweise von etwa 0,1 bis etwa 1 nM) und für die Hemmung der PGE₂ Bildung von etwa 1 nM (beispielsweise von etwa 0,1 bis etwa 1 nM), wenn sie wie oben getestet werden.
Wie in den obigen Tests angedeutet, blockieren die erfindungsgemäßen Antikörper stark die Wirkungen von IL-1β. Demnach haben die erfindungsgemäßen Antikörper die folgende pharmazeutische Brauchbarkeit:
Die erfindungsgemäßen Antikörper sind zur Prophylaxe und Behandlung von IL-1 vermittelten Erkrankungen oder medizinischen Zuständen brauchbar, beispielsweise entzündlichen Zuständen, Allergien und allergischen Zuständen, Hypersensitivitätsreaktionen, Autoimmunerkrankungen, schweren Infektionen und Organ- oder Gewebetransplantatabstossung.
Beispielsweise können die erfindungsgemäßen Antikörper zur Behandlung von Empfängern von Transplantaten, wie Herz, Lunge, kombinierte Herz-Lunge, Leber, Niere, Pankreas, Haut oder Cornea und zur Prävention der Graft-versus-Host Erkrankung verwendet werden, wie sie nach einer Knochenmarkstransplantation vorkommt.
Die erfindungsgemäßen Antikörper sind besonders brauchbar zur Behandlung, Prävention oder Linderung einer Autoimmunerkrankung und von entzündlichen Zuständen, insbesondere entzündlichen Zuständen mit einer Ätiologie, die eine Autoimmunkomponente umfasst, wie Arthritis (beispielsweise rheumatoide Arthrits, Arthritis chronica progrediente und Arthritis deformans) und rheumatischen Erkrankungen, einschließlich entzündlichen Zuständen und rheumatischen Erkrankungen, einschließlich Knochenverlust, entzündlicher Schmerz, Hypersensitivität (einschließlich sowohl Atemwegshypersensitivität als auch dermale Hypersensitivität) und Allergien. Spezifische Autoimmunerkrankungen, für die die erfindungsgemäßen Antikörper verwendet werden können, umfassen autoimmune hämatologische Störungen (einschließlich beispielsweise hämolytische Anämie, aplastische Anämie, reine Erythrozytenanämie und idiopathische Thrombozytopenie), systemischen Lupus erythematodes, Polychondritis, Sklerodermie, Wegener'sche Granulomatose, Dermatomyositis, chronisch aktive Hepatitis, Myasthenia gravis, Psoriasis, Steven-Johnson Syndrom, idiopathische Sprue, autoimmune entzündliche Darmerkrankungen (einschließlich beispielsweise Colitis ulcerosa, Morbus Crohn und irritables Darmsyndrom), endokrine Ophthalmopathie, Graves Erkrankung, Sarkoidose, Multiple Sklerose, primäre biliäre Zirrhose, juvenilen Diabetes (Diabetes mellitus Typ I), Uveitis (vordere und hintere), Keratokonjunktivitis sicca und Frühlingskeratokonjunktivitis, interstitielle Lungenfibrose, psoriatische Arthritis und Glomerulonephritis (mit und ohne nephrotischem Syndrom, beispielsweise einschließlich einem idiopathisch nephrotischem Syndrom oder der Minimal Change Nephropathie).
Die erfindungsgemäßen Antikörper sind auch brauchbar zur Behandlung, Prävention oder Linderung von Asthma, Bronchitis, Pneumoconiose, Pulmonalemphysem und anderen obstruktiven oder inflammatorischen Erkrankungen der Atemwege.
Die erfindungsgemäßen Antikörper sind brauchbar zur Behandlung von unerwünschten akuten und hyperakuten inflammatorischen Reaktionen, die durch IL-1 vermittelt werden oder eine IL-1 Bildung umfassen, speziell IL-1β oder die Förderung der TNF Freisetzung durch IL-1, beispielsweise akuten Infektionen, beispielsweise septischem Schock (beispielsweise Endotoxinschock und Atemstresssyndrom beim Erwachsenen), Meningitis, Pneumonie und schweren Verbrennungen und zur Behandlung von Kachexie oder Schwächesyndrom, die mit einer morbiden TNF Freisetzung assoziiert sind, bedingt durch Infektion, Krebs oder Organstörung, speziell AIDS-bedingte Kachexie, beispielsweise assoziiert mit oder bedingt durch eine HIV Infektion.
Die erfindungsgemäßen Antikörper sind besonders brauchbar zur Behandlung von Erkrankungen des Knochenmetabolismus, einschließlich Osteoarthritis, Osteoporose und anderen entzündlichen Arthritiden und Knochenverlust im allgemeinen, einschließlich altersbedingtem Knochenverlust und insbesondere Periodontalerkrankung.
Die erfindungsgemäßen Antikörper können zur Behandlung von Krebsarten verwendet werden, insbesondere IL-1 abhängigen Tumoren.
Für diese Indikationen hängt die geeignete Dosierung beispielsweise natürlich von dem im einzelnen verwendeten erfindungsgemäßen Antikörper, dem Wirt, der Verabreichungsart und der Art und Schwere des zu behandelnden Zustands ab. Bei einer prophylaktischen Verwendung erhält man im allgemeinen jedoch befriedigende Ergebnisse bei Tagesdosen von etwa 0,1 mg bis 5 mg pro Kilogramm Körpergewicht. Ein erfindungsgemäßer Antikörper wird bequemerweise parenteral, intravenös, beispielsweise in eine antekubitale oder sonstige periphere Vene, intramuskulär oder subkutan verabreicht. Eine prophylaktische Behandlung umfasst typischerweise die Verabreichung des erfindungsgemäßen Moleküls einmal täglich bis einmal wöchentlich für 2 bis 4 Wochen.
Pharmazeutische Zusammensetzungen der Erfindung können auf herkömmliche Weise hergestellt werden. Eine erfindungsgemäße Zusammensetzung wird vorzugsweise in lyophilisierter Form geliefert. Zur sofortigen Verabreichung wird sie in einem geeigneten wässrigen Träger gelöst, beispielsweise sterilem Wasser zur Injektion oder steriler gepufferter, physiologischer Kochsalzlösung. Falls es gewünscht wird, eine Lösung mit einem größeren Volumen zur Verabreichung durch Infusion statt einer Bolusinjektion, beispielsweise einer s. c. Bolusinjektion, herzustellen, ist es vorteilhaft, humanes Serumalbumin oder das eigene heparinisierte Blut des Patienten bei der Herstellung in die Kochsalzlösung einzuarbeiten. Das Vorkommen im Überschuss eines solchen physiologisch inerten Proteins verhindert den Verlust des Antikörpers durch Adsorption an die zusammen mit der Infusionslösung verwendeten Gefäß- und Schlauchwände. Falls Albumin verwendet wird, beträgt eine geeignete Konzentration 0,5 bis 4,5 Gewichtsprozent der Kochsalzlösung.
Die Erfindung wird ferner nur durch Erläuterung in den folgenden Beispielen beschrieben, die sich auf die Figuren im Anhang beziehen:
Die 1, welche eine Graphik ist, die die kompetitive Hemmung der AAL 160 Bindung an IL-1β durch lösliche IL-1 Typ I und Typ II Rezeptoren zeigt.
Die 2, welche eine Graphik ist, die die Hemmung des durch IL-1β induzierten Fiebers in einem Rattenmodell durch AAL 160 zeigt.
Die 3, welche eine Graphik ist, die die Dauer der Wirkung von AAL 160 bei Fieber der Ratte zeigt, das durch IL-1β induziert wurde.
Beispiele
Transgene Mäuse, die so verändert wurden, dass sie das humane IgG/κ Repertoire anstelle des Mausimmunglobulinrepertoires exprimieren (Fishwild et al., 1996, Nat. Biotechnol., 14, 845–851) werden verwendet, um Antikörper gegen humanes IL-1β zu erzeugen. B Zellen aus diesen Mäusen werden durch eine Standardhybridomtechnologie immortalisiert und man erhält Maushybridomzellen, die den humanen IgG1/κ Antikörper AAL 160.
Beispiel 1: Erzeugung der Hybridome und Reinigung des Antikörpers
Genetisch veränderte Maus 66 (Medarex Inc. Annadale, NJ) werden mit rekombinantem humanem IL-1β (50 μg) s. c. an mehreren Stellen in Adjuvans immunisiert. Die Maus wird weitere fünfmal mit der letzten Injektion drei Tage vor der Fusion geboostert. Am Tag der Fusion wird die Maus 66 durch CO₂ Inhalation getötet und die Milzzellen (4,1 × 10⁷) werden durch ein Routineverfahren mittels PEG 4000 mit einer gleichen Anzahl an PAI-O Zellen, einer Mausmyelomzelllinie, fusioniert. Die fusionierten Zellen werden in 624 Vertiefungen (1 ml/Vertiefung) ausplattiert, worin eine Fütterlage an peritonealen Mauszellen (Balb C Mäuse) in mit HAT supplementiertem RPMI 1640 mit 10% hitzeinaktiviertem fetalem Kälberserum und 5 × 10^–5 M β-Mercaptoethanol enthalten sind. Die Überstände werden gewonnen und in ELISA getestet und auf monoklonale Antikörper gescreent, die gegen IL-1β reagieren. Es werden 5 monoklonale Antikörper der IgG/κ Subklasse identifiziert. Die Klonierung wird mittels 4 Mikrotiterplatten mit 96 Vertiefungen ausgeführt, wobei 0,5 Zellen pro Vertiefung ausplattiert werden. Nach 2 Wochen werden die Vertiefungen mit einem invertierten Mikroskop inspiziert. Der Überstand wird aus Vertiefungen gewonnen, die positives Wachstum aufweisen und eine Bildung von monoklonalen anti-IL-1β Antikörpern, wird durch ELISA evaluiert. 1 bis 2 Liter konditionierter Überstand aus vier Subklonen des ursprünglich identifizierten Hybridoms Nr. 476 werden hergestellt und die Antikörper werden durch Affinitätschromatographie auf einer Protein A Säule gereinigt.
Reinheit und partielle Aminosäuresequenzen der schweren und leichten Kette Aminosäuresequenzierung
Die leichten und schweren Ketten des gereinigten Antikörpers AAL 160 werden durch SDS PAGE getrennt und die aminoterminalen Aminosäuren werden durch Edmanabbau bestimmt. Die Reinheit des Antikörpers, der in diesen Untersuchungen verwendet wird, beträgt ≥ 90% gemäß Sequenzierung. Die cDNA Sequenzen, die für die variablen Domänen der schweren und leichten Kette kodieren, werden durch PCR Amplifizierungen der cDNA erhalten, die aus mRNA aus den klonierten Hybridomzellen erhalten wurde und vollkommen sequenziert. Die aminoterminalen Sequenzen der variablen Domäne der schweren und leichten Kette und die entsprechenden DNA Sequenzen werden im folgenden angegeben, worin die CDRs fett gedruckt sind.
SEQ ID Nr. 1
SEQ ID Nr. 2
Die DNA Sequenzen, die für die variablen Domänen der schweren und leichten Ketten kodieren und die entsprechenden Aminosäuresequenzen von AAL 160 sind auch in den begleitenden Sequenzlisten als SEQ ID Nr. 1 bis 4 angegeben.
Konstruktion der Expressionsvektoren für die schwere und leichte Kette
Die klonierten für V_L und V_H kodierenden Sequenzen werden durch PCR amplifiziert und durch geeignete Restriktionsstellen in Kassettenvektoren inseriert, die den Immunglobulinpromotor, die Signalsequenzen des RFT2 Antikörpers (Heinrich et al., (1989) J. Immunol. 143, 3589–3597), einen Teil der J-Segmente und eine Spleißdonorstelle liefern. Die Kassette der leichten Kette, die die gesamte V_L Region, den Promotor und die Signalsequenz zur Sekretion enthält, wird in einen geeigneten Expressionsvektor überführt, der das humane Ck Gen, den Enhancer der schweren Kette des Immunglobulins und die modifizierte dhfr cDNA der Maus zur Selektion auf Metothrexat (MTX) enthält.
Die Kassette der schweren Kette wird demnach in einen Expressionsvektor überführt, der das humane IgG1 Gen, den Enhancer der schweren Kette des Immunglobulins und das Neomycinresistenzgen zur Selektion enthält.
Sowohl die schwere als auch die leichte Kette liegen in einer Konfiguration im Expressionsvektor vor, die der genomischen Konfiguration von umgelagerten Immunglobulingenen gleicht, was für eine starke Expression entscheidend sein dürfte.
Für eine Antikörperbildung werden die obigen Vektoren in die geeignete Wirtszelllinie, beispielsweise die SP2/0 Zelllinie kotransfiziert, Zellen, die die Vektorsequenzen enthalten, werden durch Metothrexatselektion selektiert und die selektierten Zelllinien werden kultiviert, um den AAL 160 Antikörper zu exprimieren. Alternativ dazu kann ein GS basierendes Amplifkations-/Selektionssystem, wie dies, welches in EP 0 256 055 B , EP 0 323 997 B oder EP 0 338 841 B1 beschrieben ist, verwendet werden, wobei der dhfr Selektionsmarker durch eine für GS kodierende Sequenz ersetzt wird.
Beispiel 2: Biochemische und biologische Daten
Der monoklonale Antikörper AAL 160 kann die Aktivität von Interleukin 1β in vitro neutralisieren. Der monoklonale Antikörper wird ferner durch die Bindung an rekombinante, humane IL-1β Biacoreanalyse charakterisiert. Die Art der Neutralisierung wird durch kompetitive Bindungsstudien mit löslichen IL-1 Rezeptoren untersucht. Die biologische Aktivität des Antikörpers AAL 160 gegenüber rekombinantem und natürlich gebildetem IL-1β wird in primären, humanen Zellen bestimmt (Beispiel 3), die auf eine Stimulierung durch IL-1β reagieren.
2.1 Bestimmung der Dissoziationsgleichgewichtskonstante

Die Assoziations- und Dissoziationsratenkonstante für die Bindung von rekombinantem humanem IL-1β an AAL 160 wird durch BIAcore Analyse bestimmt. AAL 160 wird immobilisiert und die Bildung von rekombinantem IL-1β wird in einem Konzentrationsbereich von 0,5 bis 12 nM durch eine Oberflächenplasmonresonanz gemessen. Das gewählte Format erlaubt das Bindungsereignis von IL-1β an AAL 160 gemäß einer 1:1 Stöchiometrie. Die Datenanalyse wird mittels der BIAevaluation Software ausgeführt.

Assoziationsratenkonstante [M^–1s^–1]	(n = 15)	(3,91 ± 0,14) × 10⁵	Mittel ± SEM
Dissoziationsratenkonstante [s^–1]	(n = 15)	(1,53 ± 0,05) × 10^–4	Mittel ± SEM
Dissoziationsgleichgewichtskonstante K_D [M]	(n = 15)	(396,6 ± 19,5) × 10^–12	Mittel ± SEM

AAL 160 bindet an rekombinantes, humanes IL-1β mit einer hohen Affinität.
2.2 Kompetitive Hemmung der Bindung an lösliche IL-1 Rezeptoren
Bindungskompetitionsstudie mit löslichen IL-1 Typ I und II Rezeptoren
Der Vergleich zwischen AAL 160 und löslichen, humanen IL-1 Typ I und Typ II Rezeptoren wird durch Biacore gemessen. AAL 160 wird auf der Oberfläche des Chips immobilisiert und rekombinantes humanes IL-1β (8 nM) wird zur Bindung an AAL 160 in Abwesenheit oder Anwesenheit von steigenden Konzentrationen an rekombinantem, humanem löslichem Rezeptor I (0 bis 10 nM) oder Rezeptor 11 (0 bis 80 nM) injiziert. Die erhaltenen Ergebnisse sind in 1 gezeigt. Die Bindung von NVP AAL 160 NX-1 an IL-1β konkurriert sowohl mit dem IL-1 Rezeptor Typ I als auch Typ II.
2.3 Reaktivitätsprofil gegenüber humanem IL-1α, humanem IL-1RA und IL-1β von Nager- und Affenarten

Das Reaktivitätsprofil von AAL 160 gegenüber humanem IL-1α, IL-1RA und IL-1β von der Maus, der Ratte, dem Kaninchen und dem Hundsaffen wird durch Biacore Analyse bestimmt. AAL 160 wird immobilisiert und die untersuchten Cytokine werden in einer Konzentration von 8 nM (oder 20 nM wie im Fall von IL-1β) angewendet.

	Prozent Gesamtbindung ± SEM
Humanes IL-1β	100
Humanes IL-1α	0,7 ± 0,7 (n = 3)
Humanes IL-1RA	1,2 ± 1,2 (n = 3)
Maus IL-1β	2,8 ± 1,5 (n = 3)
Ratten IL-1β	3,0 ± 2,5 (n = 3)
Cynomolgus IL-1β	96,4 ± 6,8 (n = 3)
Kaninchen IL-1β	12,1 ± 2,3 (n = 4)

AAL 160 reagiert nicht signifikant kreuz mit humanem IL-1α, humanem IL-1RA oder IL-1β der Maus, der Ratte oder des Kaninchens. Die Reaktivität gegenüber IL-1β vom Hundsaffen ist im wesentlichen identisch zum humanen Cytokin.
Beispiel 3: Neutralisierung der IL-1β abhängigen Produktion von PGE₂ und Interleukin 6 durch primäre, humane Fibroblasten
Die Bildung von PGE₂ und IL-6 in primären, humanen Hautfibroblasten hängt von IL-1β ab. THFα alleine kann diese Entzündungsmediatoren nicht effizient induzieren, ergibt aber mit IL-1 eine Synergie. Es werden primäre Hautfibroblasten als Ersatzmodell für eine durch IL-1 induzierte zelluläre Aktivierung verwendet.

Primäre, humane Fibroblasten werden mit rekombinantem IL-1β oder konditioniniertem Medium von LPS-stimulierten humanen PBMCs in Gegenwart von verschiedenen Konzentrationen an AAL 160 oder IL-1RA im Bereich von 6 bis 18 000 pM stimuliert. Der chimäre anti-CD25 Antikörper Simulect^® (Basiliximab) wird als passende Isotypenkontrolle verwendet. Der Überstand wird nach einer Stimulierung für 16 h entnommen und auf IL-6 durch ELISA oder PGE₂ durch RIA getestet.

	AAL 160 HK₅₀ ± SEM (n ≥ 3)	IL-1Ra HK₅₀ ± SEM (n ≥ 3)
IL-6 Sekretion Rekombinant	0,34 ± 0,037 nM	n. d.
IL-6 Sekretion konditioniertes Medium	0,6 ± 0,09 nM	0,03 ± 0,001 nM
PGE₂ Produktion konditioniertes Medium	0,79 ± 0,17 nM	n. d.

AAL 160 blockiert effektiv die Bildung von IL-6 und PGE₂ in humanen Hautfibroblasten mit einer HK₅₀, die sowohl für das rekombinante als auch natürliche II-1β ähnlich ist.
Beispiel 4: In vivo Wirksamkeit und Wirkdauer von AAL 160
Wirksamkeit
Die in vivo Wirksamkeit des anti-hull-1β Antikörpers AAL 160 wird in einem Rattenmodell getestet, bei dem Fieber durch eine i. v. Injektion von huIL-1β (100 ng/Ratte) induziert wird. Der Antikörper verursacht eine Dosis-abhängige Hemmung der Fieberreaktion über einen Dosisbereich von 1,3 und 10 μg/kg i. v. (n = 6 Ratten) – siehe 2. CHI 621 (Stimulect^®, Basiliximab) wird als Kontrollantikörper verwendet.
Wirkdauer:
Die Wirkdauer von AAL 160 wird in Ratten folgendermaßen untersucht, die durch IL-1β hervorgerufenes Fieber haben: Der Antikörper wird i. v. entweder 24 Stunden oder 30 Minuten (Standardprotokoll) vor der Induktion von Fieber durch eine i. v. Injektion von humanem IL-1β injiziert und die Körpertemperatur wird 2 und 4 Stunden später gemessen. Ein ähnliches Ausmaß an Hemmung der Fieberreaktion wird zu beiden Zeiten beobachtet (siehe 3). Wie erwartet ist der Kontrollantikörper CHI 621 (Simulect^®, Basiliximab) zu beiden Zeitpunkten unwirksam. Diese Feststellung deutet an, dass der AAL 160 Humanantikörper als wirksame Form für zumindest 24 Stunden in der Ratte vorkommt und nicht metabolisiert, ausgeschieden oder an die Gewebe während dieser Zeit gebunden wird.
Beispiel 5: Röntgenuntersuchungen von AAL 160 Fab und dessen Komplex mit IL-1β
Strukturbestimmung von AAL 160 Fab mit einer Auflösung von 2,0 Å:
Ein Datensatz sehr guter Qualität mit einer 2,0 Å Auflösung (R_sym = 0,051, Vollständigkeit = 99,9%, Redundanz = 8,2) wird aus einem Fab Kristall gewonnen, der durch Dampfdiffusion mit der Technologie des hängenden Tropfens bei pH 9,5 in 50% PEG 200, 0,1 M CHES gewonnen wurde. Der Kristall weist eine Raumgruppe P2₁2₁2₁ mit Einheitszelldimensionen von a = 62,17 Å, b = 89,83 Å und c = 123,73 Å und einem Fab Molekül pro Symmetrieeinheit auf (Matthews Koeffizient: 3,6 Å³/Da, geschätzter Lösemittelgehalt: 66%). Die Struktur wird durch einen molekularen Ersatz bestimmt und wird zu einem schließlichen kristallographischen R-Faktor von 0,209 präzisiert (freier R-Faktor = 0,261). Das schließliche Modell umfasst die Reste 1 bis 213 der leichten Kette, 1 bis 131 und 138 bis 218 der schweren Kette, 387 Wassermoleküle und 1 PEG Molekül. Die schließliche Elektronendichte ist für alle CDR Reste bis auf Trp 94 (CDR3) der leichten Kette gut definiert. Die Position der Seitenkette dieses Rests ist nicht korrekt definiert in den zwei Kristallformen, die bisher untersucht wurden, was nahe legt, dass es in Abwesenheit eines gebundenen Antigens sehr mobil ist.
Die Kristallisation des Fab Komplexes mit IL-1β und ein vorläufiges Experimentalmodell des Komplexes: E werden wenige Kristalle von AAL 160 Fab im Komplex mit dem Antigen IL-1β aus einer 76 mg/ml Stammlösung des 1:1 Komplexes in 2,0 M Ammoniumsulfat, 0,1 M Tris pH 8,5 erhalten. Die Kristalle wachsen sehr langsam über einen Zeitraum von mehreren Wochen. Sie brechen schwach bis etwa 3,2 Å auf der eigenen Quelle. Es wird ein vorläufiger Datensatz gewonnen und es wird ein molekularer Austausch mittels der hochauflösenden Strukturen von freiem Fab und humanem IL-1β (J. P. Priestle et al., EMBO J. 7, 339, (1988)) als Ausgangsmodelle versucht. Die Berechnungen ergeben eine sehr klare und unzweifelhafte Lösung, wenn die Fv und Fc Teile des Fab als getrennte Module verwendet werden (Korrelation 67,1%, R-Faktor 0,354 nach einem AMORE FITTING Schritt unter Verwendung der Daten zwischen 8,0 und 3,5 Å). Der anschließende Vergleich der freien und gebundenen Formen des Fab zeigt, dass der Ellenbogenwinkel in den zwei Strukturen sehr unterschiedlich ist. Die Ergebnisse der molekularen Austauschberechnungen liefern ein erstes molekulares Modell der Wechselwirkungen zwischen dem Antigen IL-1β und dem monoklonalen Antiköper AAL 160. Eine vorübergehende Analyse dieser Wechselwirkungen zeigt, dass 1) IL-1β enge Wechselwirkungen zu allen drei CDRs der schweren Kette und zu CDR3 der leichten Kette ausübt. Im Gegensatz dazu beteiligen wenige Wechselwirkungen CDR1 und CDR2 der leichten Kette. 2) Die Schleife, die die Reste Gly 22, Pro 23, Tyr 24 und Glu 25 von reifem IL-1β umfasst, bindet an das Zentrum der antigenbindenden Stelle und scheint eine Schlüsselkomponente des Epitops zu sein. Interessanterweise liegt diese Schleife nicht in der Region des Moleküls, die sich von dem von Maus IL-1β am meisten unterscheidet. Pro 23, Tyr 24 und Glu 25 sind konserviert, aber der Rest 22 ist ein Gly in humanem IL-1β und ein Asp im Maus IL-1β. Ein Vergleich der Kristallstrukturen von humanem (PDB Eintrag 2i1b) und Maus IL-1β (PDB Eintrag 8i1b) zeigt, dass diese Punktmutation zu einer sehr unterschiedlichen Konformation der Hauptkette um Pro 23 führt. Dieser lokale Strukturunterschied stimmt mit dem beobachteten Fehlen der Kreuzreaktivität von AAL 160 in Bezug auf das Mauscytokin überein.
Sequenzliste

Claims

Antikörper gegenüber IL-1β, der eine Antigenbindungsspezifität für ein antigenes Epitop von reifem humanem IL-1β aufweist, das eine Schleife umfasst, die die Reste Gly 22, Pro 23, Tyr 24 und Glu 25 enthält, und der zur Hemmung der Bindung von IL-1β an dessen Rezeptor fähig ist und wobei das IL-1β bindende Molekül eine Antigenbindungsstelle umfasst, die zumindest eine variable Domäne der schweren Kette des Immunoglobulins (V_H) umfasst, die in Folge die hypervariablen Regionen CDR1, CDR2 und CDR3 umfasst, wie dies in SEQ ID Nr. 1 gezeigt ist, das heißt die CDR1 weist die Aminosäuresequenz Ser-Tyr-Trp-Ile-Gly auf, die CDR2 weist die Aminosäuresequenz Ile-Ile-Tyr-Pro-Ser-Asp-Ser-Asp-Thr-Arg-Tyr-Ser-Pro-Ser-Phe-Gln-Gly auf, und die CDR3 weist die Aminosäuresequenz Tyr-Thr-Asn-Trp-Asp-Ala-Phe-Asp-Ile auf und wobei das IL-1β bindende Molekül eine Antigenbindungsstelle umfasst, die mindestens eine variable Domäne der leichten Kette des Immunglobulins (V_L) umfasst, die in Folge die hypervariablen Regionen CDR1', CDR2' und CDR3' umfasst, wie dies in SEQ ID Nr. 2 gezeigt ist, das heißt die CDR1' weist die Aminosäuresequenz Arg-Ala-Ser-Gln-Ser-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Ala auf, die CDR2' weist die Aminosäuresequenz Asp-Ala-Ser-Asn-Arg-Ala-Thr auf und die CDR3' weist die Aminosäuresequenz Gln-Gln-Arg-Ser-Asn-Trp-Met-Phe-Pro auf.
IL-1β bindendes Molekül gemäß Anspruch 1, das ein humaner Antikörper ist.
IL-1β bindendes Molekül nach einem der Ansprüche 1 bis 2 zur Verwendung als Medikament.
Verwendung eines IL-1β bindenden Moleküls nach einem der Ansprüche 1 bis 2 zur Herstellung eines Medikaments zur Prävention oder Behandlung einer durch IL-1 vermittelten Erkrankung oder Störung von akuten und hyperakuten Entzündungsreaktionen, akuten Infektionen, septischem Schock, Endotoxinschock, Schocklunge, Meningitis, Pneumonie und schweren Verbrennungen, Kachexie oder Schwächesyndrom, Krebs, Organdysfunktion, mit AIDS verbundener Kachexie oder zur Prävention oder Behandlung von entzündlichen Zuständen, Allergien und allergischen Zuständen, Hypersensitivitätsreaktionen, Autoimmunerkrankungen, schweren Infektionen, Organ- oder Gewebetransplantantabstoßung, Autoimmunerkrankung, Arthritis, rheumatoider Arthrits, Arthritis chronica progrediente, Arthritis deformans, rheumatoiden Erkrankungen, Entzündungsschmerz, Hypersensitivität, Atemwegshypersensitivität, dermaler Hypersensitivität, Allergien, hämatologischen Autoimmunstörungen, hämolytischer Anämie, aplastischer Anämie, reiner Erythrozytenanämie und idiopathischer Thrombozytopenie, systemischem Lupus erythematodes, Polychondritis, Sclerodermie, Wegenerscher Granulomatose, Dermatomyositis, chronischer aktiver Hepatitis, Myasthenia gravis, Psoriasis, Steven-Johnson Syndrom, idiopathischer Sprue, autoimmuner entzündlicher Darmerkrankung, Colitis ulcerosa, Morbus Crohn, Reizdarmsyndrom, endokriner Ophthalmopathie, Morbus Basedow, Sarkoidose, Multipler Sklerose, primärer biliärer Zirrhose, juvenilem Diabetes, Diabetes mellitus Typ I, Uveitis (anteriorer und posteriorer), Keratoconjunktivitis sicca, vernaler Keratoconjunktivitis, interstitieller Lungenfibrose, psoriatrischer Arthritis und Glomerulonephritis, idiopathischem nephrotischem Syndrom, Minimal- Change Nephropathie, Asthma, Bronchitis, Pneumoconiose, Lungenemphysem und anderen obstruktiven oder entzündlichen Erkrankungen der Atemwege, Erkrankungen des Knochenmetabolismus, Osteoarthritis, Osteoporose, anderen entzündlichen Arthritiden, Knochenverlust im Allgemeinen, altersbedingtem Knochenverlust, Periodontalerkrankung, Krebsarten und IL-1 abhängigen Tumoren.
Erstes DANN-Konstrukt, das für eine schwere Kette oder ein Fragment hiervon kodiert, das (i) einen ersten Teil, der für eine variable Domäne kodiert, die alternierend Framework und hypervariable Regionen umfasst, wobei die hypervariablen Regionen in Folge CDR1, CDR2 und CDR3 sind, deren Aminosäuresequenzen in 1 gezeigt sind, wobei der erste Teil mit einem Codon beginnt, das für die erste Aminosäure der variablen Domäne kodiert, und mit einem Codon endet, das für die letzte Aminosäure der variablen Domäne kodiert, und (ii) einen zweiten Teil, der für einen konstanten Teil der schweren Kette kodiert, der mit einem Codon beginnt, das für die erste Aminosäure des konstanten Teils der schweren Kette kodiert, und mit einem Codon endet, das für die letzte Aminosäure des konstanten Teils kodiert, wonach ein Stopcodon folgt, umfasst, und ein zweites DNA Konstrukt, das für eine leichte Kette kodiert, das (iii) einen ersten Teil, der für eine variable Domäne kodiert, die alternierend Framework und hypervariable Regionen umfasst, wobei die hypervariablen Regionen CDR3' und optional CDR1' und CDR2' sind, deren Aminosäuresequenzen in SEQ ID Nr. 2 gezeigt sind, wobei der erste Teil mit einem Codon beginnt, das für die erste Aminosäure der variablen Domäne kodiert, und mit einem Codon endet, das für die letzte Aminosäure der variablen Domäne kodiert, und (iv) einen zweiten Teil, der für einen konstanten Teil der leichten Kette kodiert, der mit einem Codon beginnt, das für die erste Aminosäure des konstanten Teils der leichten Kette kodiert, und mit einem Codon endet, das für die letzte Aminosäure des konstanten Teils kodiert, wonach ein Stopcodon folgt, umfasst.
Expressionsvektor, der zur Replikation in einer prokaryontischen oder eukaryontischen Zelllinie fähig ist, die DNA Konstrukte nach Anspruch 5 umfasst.
Verfahren zur Herstellung eines IL-1β bindenden Moleküls, das (i) ein Kultivieren eines Organismus, der mit einem Expressionsvektor nach Anspruch 6 transformiert ist, und (ii) ein Gewinnen des IL-1β bindenden Moleküls aus der Kultur umfasst.
Pharmazeutische Zusammensetzung, die einen Antikörper gegen IL-1β nach Anspruch 1 in Kombination mit einem pharmazeutisch akzeptablen Hilfsstoff, Verdünnungsmittel oder Träger umfasst.