DE60119145T2

DE60119145T2 - Ein antigen und ein adjuvans-peptid enthaltende impfstoffzusammensetzung

Info

Publication number: DE60119145T2
Application number: DE60119145T
Authority: DE
Inventors: Jörg Fritz; Frank Mattner; Wolfgang Zauner; Eszter Nagy; Michael Buschle
Original assignee: Intercell Austria AG
Current assignee: Valneva Austria GmbH
Priority date: 2000-10-18
Filing date: 2001-10-18
Publication date: 2007-02-01
Anticipated expiration: 2021-10-19
Also published as: HK1055899A1; RU2007146372A; HU228382B1; ES2263668T3; NO20031595D0; SK5752003A3; BRPI0114994B1; CA2426490C; CZ20031299A3; AU1232602A; DE60119145D1; CA2426490A1; KR20030043993A; BRPI0114994B8; JP4227407B2; JP2008222721A; CN1468109A; US8361476B2; WO2002032451A1; EP1326634B1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft Vakzine, welche mindestens ein Antigen und eine immunstimmulierende Substanz umfassen.
Beim Schutz des Wirtes vor eindringenden Pathogenen spielen zelluläre und humorale Effektoren eine Rolle, und er ergibt sich aus der gemeinsamen Wirkung sowohl der nicht-adaptiven (angeborenen) als auch der adaptiven (erworbenen) Immunität. Letztere basiert auf einer spezifischen immunologischen Erkennung, die durch die Rezeptoren vermittelt wird, ist vom Immunsystem jüngst erworben und ist nur bei Vertebraten vorhanden. Erstere entwickelte sich vor der Entwicklung der adaptiven Immunität und besteht aus einer Vielfalt von Zellen und Molekülen, die im ganzen Organismus mit dem Ziel verteilt sind, potentielle Pathogene unter Kontrolle zu halten (Boman, H. (2000)), (Zanetti, M (1997)).
B- und T-Lymphozyten sind die Vermittler der erworbenen Antigen-spezifischen adaptiven Immunität, einschließlich der Entwicklung eines immunologischen Gedächtnisses, welches das Hauptziel der Schaffung eines erfolgreichen Vakzins ist (Schijns, V. (2000)). Antigen-präsentierende Zellen (APCs) sind hochspezialisierte Zellen, die Antigene prozessieren können und ihre prozessierten Fragmente auf der Zelloberfläche zusammen mit Molekülen, die für die Lymphozyten-Aktivierung notwendig sind, präsentieren. Dies bedeutet, dass APCs für die Initiierung spezifischer Immunreaktionen sehr wichtig sind. Die Haupt-APCs für die Aktivierung der T-Lymphozyten sind die Dendriten-Zellen (Dcs), Makrophagen und B-Zellen, wogegen die Haupt-APCs für B-Zellen follikuläre Dendriten-Zellen sind. Im Allgemeinen sind Dcs die wirksamsten APCs hinsichtlich der Initiierung von Immunantworten, wobei sie schlafende Naive und Gedächtnis-B- und T-Lymphozyten stimulieren.
Das natürliche Ziel der APCs an der Peripherie (z.B. Dcs oder Langerhans-Zellen) ist es, Antigene zu fangen und zu prozessieren, wodurch sie aktiviert werden, und sie beginnen, Lymphozyten-co-stimulierende Moleküle zu exprimieren, zu Lymphoid-Organen wandern, Cytokine sezernieren und Antigene verschiedenen Populationen von Lymphozyten zu präsentieren, wobei sie Antigen-spezifische Immunantworten initiieren. Sie aktivieren nicht nur Lymphozyten, unter bestimmten Umständen machen sie auch T-Zellen für Antigene tolerant (Bancherau, J. (1998)).
Die Antigen-Erkennung durch T-Lymphozyten ist durch den größeren Histokompatibilitätskomplex (major histocompatibility com plex, MHC) eingeschränkt. Ein bestimmter T-Lymphozyt erkennt ein Antigen nur dann, wenn das Peptid an ein bestimmtes MHC-Molekül gebunden ist. Im Allgemeinen werden T-Lymphozyten nur in Gegenwart von Eigen-MHC-Molekülen stimuliert, und Antigen wird nur als Peptide, die an Eigen-MHC-Moleküle gebunden sind, erkannt. Die MHC-Einschränkung definiert die T-Lymphozyten-Spezifität hinsichtlich des erkannten Antigens und hinsichtlich des MHC-Moleküls, das sein Peptid-Fragment bindet.
Intrazelluläre und extrazelluläre Antigene stellen an das Immunsystem ganz verschiedene Herausforderungen, sowohl hinsichtlich einer Erkennung als auch hinsichtlich einer geeigneten Reaktion. Die Präsentation von Antigenen gegenüber den T-Zellen wird durch zwei verschiedene Klassen von Molekülen vermittelt – MHC-Klasse I (MHC-I) und MHC-Klasse II (MHC-II), die verschiedene Antigen-Prozessierungswege benützen. Man konnte hauptsächlich zwischen zwei Haupt-Antigenprozessierungsbahnen, die sich entwickelt haben, unterscheiden. Peptide, die aus intrazellulären Antigenen stammen, werden den CD8⁺-T-Zellen durch MHC-Klasse I-Moleküle präsentiert, die auf praktisch allen Zellen exprimiert werden, wogegen von extrazellulären Antigenen stammende Peptide den CD4⁺-Zellen durch MHC-II-Moleküle präsentiert werden (Monaco, J. (1992); Harding, C. (1995)). Es gibt jedoch bestimmte Ausnahmen zu dieser Dichotomie. Mehrere Studien zeigten, dass Peptide, die aus endozytosierten teilchenförmigen oder löslichen Proteinen generiert wurden, auf MHC-I-Molekülen in Makrophagen sowie in Dendriten-Zellen präsentiert werden (Harding, C. (1996); Brossart, P. (1997)). Daher sind APCs wie Dendriten-Zellen, die an der Peripherie sitzen, eine hohe Wirksamkeit zum Einfangen und Prozessieren extrazellulärer Antigene ausüben und sie auf MHC-I-Molekülen den T-Lymphozyten präsentieren, interessante Ziele, um sie extrazellulär mit Antigenen in vitro und in vivo zu pulsen.
Die wichtige und einzigartige Rolle der APCs, einschließlich der stimulierenden Wirkung auf verschiedene Typen von Leukozyten, spiegelt ihre zentrale Position als Ziele für geeignete Strategien bei der Entwicklung erfolgreicher Vakzine wider. Theoretisch ist ein Weg dazu die Verbesserung oder Stimulation ihres natürlichen Ziels, der Aufnahme von Antigen(en). Sobald sie mit den entsprechenden Antigenen, gegen die das Vakzin gerichtet ist, gepulst sind, sollten die APCs das (die) aufge nommene(n) Antigene zu prozessieren beginnen, wodurch sie aktiviert werden, Lymphozyten-co-stimulierende Moleküle exprimieren, zu Lymphoid-Organen wandern, Cytokine sezernieren und Antigene verschiedenen Populationen von Lymphozyten präsentieren, wodurch sie Immunreaktionen initiieren.
Aktivierte T-Zellen sezernieren im Allgemeinen eine Anzahl von Effektor-Zytokinen in stark regulierter Weise, z.B. Interleukin 2 (IL-2), IL-4, IL-5, IL-10 und Interferon-γ (IFN-γ). Die funktionelle Detektion von zytotoxischen T-Lymphozyten-Reaktionen auf spezifische Antigene (z.B. Tumor-Antigene, im Allgemeinen Antigene, die in einem Vakzin verabreicht werden) wird allgemein mittels eines ELISpot-Assays (enzyme-linked immunospot assay) überwachte, einer Technik, die die Cytokin-Produktion auf Einzelzell-Ebene analysiert. Bei der vorliegenden Erfindung wurde ein ELISpot-Assay für das Zellimmunität-fördernde Cytokin-IFN-γ verwendet, um die Peptid-spezifische T-Zellen-Aktivierung erfolgreich zu überwachen.
Es wurde bereits früher gezeigt, dass Polykationen die Aufnahme von zur MHC-Klasse I passenden Peptiden in Tumorzellen wirksam verbessern, ein Peptid- oder Protein-Pulsverfahren, welches "TRANSloading" genannt wurde (Buschle, M. (1997)). Weiters zeigten wir, dass Polykationen Peptide oder Proteine in Antigenpräsentierende Zellen sowohl in vivo als auch in vitro "TRANSloaden" können (Buschle, M. (1998)). Außerdem schütze die Co-Injektion einer Mischung aus Poly-L-Arginin oder Poly-L-Lysin zusammen mit einem geeigneten Peptid als Vakzin Tiere vor Tumorwachstum in Maus-Modellen (Schmidt, W. (1997)). Dieses chemisch definierte Vakzin kann eine große Anzal von Antigen/Peptid-spezifischen T-Zellen induzieren. Es zeigte sich, dass dies teilweise auf eine verbesserte Aufnahme von Peptiden in APCs, die durch das Polykation vermittelt war, zurückzuführen war (Buschle, M. (1998)), was anzeigt, dass APCs, wenn sie in vivo mit Antigenen gepulst werden, eine T-Zellen-vermittelte Immunität gegen das verabreichte Antigen induzieren können.
Im Gegensatz zur adaptiven Immunität, die durch eine hochspezifische, jedoch relativ langsame Antwort gekennzeichnet ist, basiert die angeborene Immunität auf Effektor-Mechanismen, die durch Unterschiede in der Struktur mikrobieller Komponenten gegenüber dem Wirt ausgelöst werden. Diese Mechanismen können eine ziemlich rasche anfängliche Antwort auslösen, die haupt sächlich zur Neutralisierung schädlicher Agentien führt. Reaktionen angeborener Immunität sind die einzige Verteidigungsstrategie der niedrigeren Ordnung und wurden bei Vertebraten als die erste Verteidigungslinie des Wirts, bevor das adaptive System mobilisiert wird, beibehalten.
Bei höheren Vertebraten sind die Effektorzellen der angeborenen Immunität Neutrophile, Makrophagen und natürliche Killer-Zellen und wahrscheinlich auch Dendriten-Zellen (Mizukawa, N. (1999)), wogegen die humoralen Komponenten in dieser Bahn die Komplement-Kaskade und eine Vielfalt verschiedener Bindungsproteine sind (Boman, H. (2000)).
Eine rasche und wirksame Komponente der angeborenen Immunität ist die Produktion einer großen Vielfalt mikrobizider Peptide mit einer Länge von üblicherweise zwischen etwa 12 und etwa einhundert Aminosäureresten. Mehrere Hundert verschiedene antimikrobielle Peptide wurden aus einer Vielfalt von Organismen, die von Schwämmen, Insekten bis zu Tieren und Menschen reichen, isoliert, was auf eine weite Verbreitung dieser Moleküle hinweist. Antimikrobielle Peptide werden auch von Bakterien als antagonistische Substanzen gegen konkurrierende Organismen erzeugt.
In der EP 0 905 141 A1 ist ein Peptid-Fragment eines Limulus-anti-LPS-Faktors (LALF) mit antiviraler Wirkung geoffenbart. Dieses LALF-Peptid verbessert nicht spezifisch eine Immunantwort, sondern verbessert die nicht-spezifischen Verteidigungen mononuklearer Zellen und kann auch prophylaktisch verwendet werden, oder weiters kann das Peptid auch topisch auf eine Wundstelle aufgetragen werden, um eine verbesserte Wundheilung und Reparatur zu stimulieren.
Die Hauptquellen antimikrobieller Peptide sind Granula von Neutrophilen und Epithelzellen, die den Atem-, Magen-Darm- und Urogenital-Trakt auskleiden. Im Allgemeinen findet man sie an jenen anatomischen Stellen, die einer Mikroben-Invasion am meisten ausgesetzt sind, sie werden in innere Körperflüssigkeiten sezerniert oder in zytoplasmatischen Granula professioneller Phagozyten (Neutrophilen) gelagert (Ganz, T. (1997); Ganz, T. (1998); Ganz, T. (1999); Boman, H. (2000); Gudmundsson GH. (1999)).
Es wurde bereits früher gezeigt (österreichische Patentanmeldung A 1416/2000), dass natürlich vorkommende, von Cathelici din stammende antimikrobielle Peptide oder deren Derivate eine die Immunantwort stimulierende Aktivität besitzen und daher hochwirksame Adjuvantien darstellen.
Das Ziel der vorliegenden Erfindung ist es, ein Adjuvans/"Trägerpeptid" zu schaffen, das die Immunantwort auf ein spezifisches, gemeinsam verabreichtes Antigen stark verbessern kann und daher ein hochwirksames Adjuvans darstellt. Diese Aufgabe wird durch ein Vakzin gelöst, welches mindestens ein Antigen und ein Peptid mit einer Sequenz R₁-XZXZ_NXZX-R₂ aufweist,
wobei
– N eine ganze Zahl zwischen 3 und 7, vorzugsweise 5, ist,
– X ein positiv geladener natürlicher und/oder nicht-natürlicher Aminosäurerest ist,
– Z ein Aminosäurerest, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus L, V, I, F und/oder W, ist, und
– R₁ und R₂ unabhängig voneinander ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus -H, -NH₂, -COCH₃, -COH, einem Peptid mit bis zu 20 Aminosäureresten oder einer Peptid-reaktiven Gruppe oder einem Peptid-Linker mit oder ohne ein Peptid; X-R₂ auch ein Amid, Ester oder Thioester des C-terminalen Aminosäurerestes sein kann.
Außer den natürlich vorkommenden antimikrobiellen Peptiden wurden synthetische antimikrobielle Peptide erzeugt und untersucht. Es zeigte sich, dass das synthetische antimikrobielle Peptid KLKLLLLLKLK-NH₂ eine bedeutende chemotherapeutische Aktivität bei mit Staphylococcus aureus infizierten Mäusen hat; Human-Neutrophile wurden aktiviert, um das Superoxid-Anion (O₂ ^-) über Zell-oberflächen-Calreticulin zu erzeugen. Es zeigte sich, dass die genaue Anzahl und Position von K und L für die antimikrobielle Aktivität des synthetischen Peptids von kritischer Bedeutung ist (Nakajima, Y. (1997); Cho, J-H. (1999)).
Es zeigte sich nun überraschenderweise im Laufe der vorliegenden Erfindung, dass Peptide gemäß der vorliegenden Erfindung, die eine Sequenz R₁-XZXZ_NXZX-R₂ aufweisen, worin
– N eine ganze Zahl zwischen 3 und 7, vorzugsweise 5, ist,
– X ein positiv geladener natürlicher und/oder nicht-natürlicher Aminosäurerest ist,
– Z ein Aminosäurerest, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus L, V, I, F, und/oder W, ist, und
– R₁ und R₂ unabhängig voneinander ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus -H, -NH₂, -COCH₃, -COH, einem Peptid mit bis zu 20 Aminosäureresten oder einer Peptid-reaktiven Gruppe oder einem Peptid-Linker mit oder ohne ein Peptid; X-R₂ auch ein Amid oder Ester (oder sogar ein Thioester) des C-terminalen Aminosäurerestes sein kann,
(nachfolgend als "Peptid A" bezeichnet), antigene Peptide oder Proteine weit besser in APCs TRANSloaden können als bekannte Adjuvantien, einschließlich natürlich vorkommender antimikrobieller Peptide. Sie haben weiters eine starke Immunantwort-stimulierende Aktivität und stellen daher hoch wirksame Adjuvantien dar.
Vorzugsweise ist der C-Terminus nicht modifiziert (COOH oder COO^–), da diese Form noch besser als die amidierte Form des Peptids ist.
Im Bereich der vorliegenden Erfindung kann die Sequenz an ihrem Carboxy-Ende amidiert sein oder eine weitere Aminosäuresequenz tragen; vorzugsweise ist jedoch das Carboxy-Ende frei.
Weiters können im Bereich der vorliegenden Erfindung alle X, die in den Peptiden A umfasst sind, denselben Aminosäurerest darstellen können. Vorzugsweise repräsentiert X jedoch in einem Peptid A nur einen spezifischen Aminosäurerest, z.B. entweder K oder R, usw.. Dasselbe kann in Bezug auf Z angewendet werden: alle Z in den Peptiden A können eine einzige Aminosäure-Spezies oder verschiedene Aminosäure-Spezies sein: z.B. entweder L oder V usw.. Dies gilt besonders für den Z_N-Teil in der Mitte der Formel, welcher z.B. L₅ oder L₃ sowie LVIFW, LILFLLIW, WIF, W₃L₂ sein kann, und alle anderen Kombinationen dieses Motivs, die zwischen 3 und 7 Aminosäuren, vorzugsweise von 4 bis 6 Aminosäurereste, insbesondere 5 Aminosäurereste, lang sind. Diese Reste sind auch für den R₁- und R₂-Teil bevorzugt (z.B. dass mehr als 50%, vorzugsweise mehr als 80%, insbesondere mehr als 90% von R₁ und/oder R₂ L, I, F, V und/oder W sind, wenn R₁ und/oder R₂ Peptide sind. Vorzugsweise sind R₁ und R₂ gleich, vorteilhaft sind beide H (d.h., freie Amino- oder Carboxy-Termini).
Im Bereich der vorliegenden Erfindung umfasst der Ausdruck "nicht-natürlich" jeglichen Aminosäurerest, der nicht natürlich vorkommt bzw. nicht in natürlichen Proteinen vorkommt.
Das Peptid R₁-KLKL₅KLK-R₂ ist speziell bevorzugt, es sind jedoch auch R₁-KIKL5KIK-R₂, R₁-KVKL₅KVK-R₂, R₁-KFKL₅KVK-R₂, R₁-KLKL₆KLK-R₂, R₁-KWKW₅KLK-R₂, R₁-KWKWL₃WKWK-R₂, R₁-KLKL₄KLK-R₂ oder Permutationen in Bezug auf die Positionen von I, F, V, W und L vorteilhaft.
Selbstverständlich kann das Vakzin auch zwei oder mehrere Antigene, je nach der gewünschten Immunantwort, umfassen. Das (die) Antigen(e) kann (können) auch modifiziert sein, um die Immunantwort weiter zu verbessern.
Vorzugsweise werden die Proteine oder Peptide, die von viralen oder bakteriellen Pathogenen, von Pilzen oder Parasiten sowie von Tumor-Antigenen (Krebs-Vakzine) oder Antigenen mit einer putativen Rolle bei Autoimmunerkrankungen stammen, als Antigene (einschließlich derivatisierter Antigene, wie glykosylierter, 1ipidisierter, glykolipidisierter oder hydroxylierter Antigene) verwendet. Weiters können Kohlehydrate, Lipide oder Glykolipide selbst als Antigene verwendet werden. Der Derivatisierungsprozess kann die Reinigung eines spezifischen Proteins oder Peptids aus dem Pathogen, die Inaktivierung des Pathogens sowie die proteolytische oder chemische Derivatisierung oder Stabilisierung eines solchen Proteins oder Peptids inkludieren. Alternativ kann auch das Pathogen selbst als Antigen verwendet werden. Die Antigene sind vorzugsweise Peptide oder Proteine, Kohlehydrate, Lipide, Glykolipide oder Mischungen davon.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform werden T-Zellen-Epitope als Antigene verwendet. Alternativ kann auch eine Kombination aus T-Zellen-Epitopen und B-Zellen-Epitopen bevorzugt sein.
Die in den vorliegenden Zusammensetzungen zu verwendenden Antigene sind nicht von kritischer Bedeutung. Auch Mischungen verschiedener Antigene können natürlich gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet werden. Vorzugsweise werden Proteine oder Peptide, die von einem viralen oder bakteriellen Pathogen oder von Pilzen oder Parasiten stammen, als solche Antigene verwendet (einschließlich derivatisierter Antigene oder glykosylierter oder lipidisierter Antigene oder Polysaccharide oder Lipide). Eine andere bevorzugte Quelle für Antigene sind Tumor-Antigene. Bevorzugte Pathogene sind ausgewählt aus dem Humanen Immundefizienz-Virus (HIV), Hepatitis A und B-Viren, Hepatitis C-Virus (HCV), Rous Sarcoma-Virus (RSV), Epstein Barr-Virus (EBV), Influenza-Virus, Rotavirus, Staphylococcus aureus, Chlamydia pneumonias, Chlamydia Trachomatis, Mycobacterium tuberculosis, Streptococcus pneumoniae, Bacillus anthracis, Vibrio cholerae, Plasmodium sp. (Pl. falciparum, Pl. vivax, etc.), Aspergillus sp. oder Candida albicans. Antigene können auch Moleküle sein, die von Krebszellen exprimiert sind (Tumor-Antigene). Der Derivatisierungsprozess kann die Reinigung eines spezifischen Proteins aus dem Pathogen/den Krebszellen, die Inaktivierung des Pathogens sowie die proteolytische oder chemische Derivatisierung oder Stabilisierung eines solchen Proteins inkludieren. Auf dieselbe Weise können auch Tumor-Antigene (Krebs-Vakzine) oder Autoimmun-Antigene in der pharmazeutischen Zusammensetzung gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet werden Mit solchen Zusammensetzungen kann eine Tumor-Impfung oder eine Behandlung für Autoimmun-Erkrankungen durchgeführt werden.
Im Fall von Peptid-Antigenen ist die Verwendung von Peptid-Mimotopen/Agonisten/Superagonisten/Antagonisten oder von Peptiden, die in bestimmten Positionen verändert sind, ohne die immunologischen Eigenschaften zu beeinträchtigen, oder von Nicht-Peptid-Mimotopen/Agonisten/Superagonisten/Antagonisten in der vorliegenden Erfindung mit inkludiert. Peptid-Antigene können auch Verlängerungen entweder am Carboxy- oder am Amino-Terminus des Peptid-Antigens enthalten, die die Interaktion mit der (den) polykationischen Verbindungen) oder der (den) immunstimulierenden Verbindungen) erleichtern. Für die Behandlung von Autoimmun-Erkrankungen können Peptid-Antagonisten angewendet werden.
Antigene können auch derivatisiert werden, um Moleküle zu inkludieren, die die Antigen-Präsentation und das Targeting von Antigenen auf Antigen-präsentierende Zellen zu verbessern.
In einer Ausführungsform der Erfindung dient die pharmazeutische Zusammensetzung dazu, eine Toleranz für Proteine oder Protein-Fragmente und Peptide, die an Autoimmun-Erkrankungen beteiligt sind, zu vermitteln. In diesen Ausführungsformen verwendete Antigene dienen dazu, das Immunsystem tolerant zu machen oder Immunantworten gegen an Autoimmunprozessen beteiligte Epitope niederzuregulieren.
Vorzugsweise ist das Antigen ein Peptid, das aus 5 bis 60, vorzugsweise 6 bis 30, insbesondere 8 bis 11 Aminosäureresten besteht. Antigene dieser Länge erwiesen sich als für die T-Zellen-Aktivierung besonders geeignet. Die Antigene können weiters mit einem Schwanz gekoppelt werden, beispielsweise gemäß A 657/2000, US 5,726,292 oder WO 98/01558.
Das Antigen kann mit den Peptiden der vorliegenden Erfindung gemischt oder auf andere Weise spezifisch formuliert sein, z.B. als Liposon, Retard-Formulierung etc.. Das Antigen kann auch kovalent oder nicht-kovalent an das Peptid gemäß der vorliegenden Erfindung gebunden sein. Vorzugsweise sind die Antigene kovalent an das Peptid als R₁- oder R₂-Reste oder an Seitenketten der Aminosäurereste des Peptids, insbesondere an die K- und R-Seitenkette, gebunden.
Die relativen Mengen der Ingredienzien der vorliegenden Zusammensetzung hängen sehr von den Notwendigkeiten der individuellen Zusammensetzung ab. Vorzugsweise werden zwischen 10 ng und 1 g Antigen und Peptid A verwendet. Bevorzugte Mengen an Antigen/Peptid A liegen im Bereich von 0,1 bis 1000 μg Antigen pro Vakzination und 0,1 bis 1000 μg Peptid A. Die Zusammensetzung gemäß der vorliegenden Erfindung kann weiters Hilfssubstanzen, wie Puffer, Salze, Stabilisatoren, Immunstimulantien, Antioxidantien usw., oder andere Wirksubstanzen, wie Entzündungshemmer oder antinozizeptive Arzneistoffe, enthalten.
Die vorliegenden Zusammensetzungen können an einen Patienten, z.B. einem Impfkandidaten, in wirksamen Mengen, z.B. in wöchentlichen, zweiwöchentlichen oder monatlichen Intervallen verabreicht werden. Patienten, die mit der vorliegenden Zusammensetzung zu behandeln sind, können auch wiederholt oder nur einmal geimpft werden. Eine bevorzugte Verwendung der vorliegenden Erfindung ist die aktive Immunisierung, insbesondere von Menschen oder Tieren, die keinen Schutz gegen das spezifische Antigen haben.
Die vorliegende Zusammensetzung kann subkutan, intramuskulär, rektal, intravenös, intradermal, intrapinnal, transdermal sowie durch orale Aufnahme verabreicht werden.
Selbstverständlich kann das Vakzin gemäß der vorliegenden Erfindung jedwede weitere Substanz, wie beispielsweise jeden anderen pharmazeutisch akzeptablen Träger usw. umfassen. Das Vakzin gemäß der vorliegenden Erfindung kann gemäß bekannter Verfahren formuliert werden, z.B. als i.v.-Vakzine, DNA-Vakzine, transdermale Vakzine, topische Vakzine, intranasale Vakzine und als Kombinationsvakzine. Die Dosierung kann mittels Standardverfahren für Vakzine, die Verbesserungen der bekannten Vakzine sind, ausgewählt werden, es ist jedoch eine niedrigere Dosierung als beim bekannten Vakzin für denselben Schutz möglich und daher bevorzugt.
Vorzugsweise ist das Vakzin in lagerbarer Form, z.B. lyophilisiert, gegebenenfalls in Kombination mit einer geeigneten Rekonstitutionslösung, vorgesehen.
Die Aminosäurereste gemäß der vorliegenden Erfindung können D- oder L-Aminosäuren sein. Vorzugsweise gehören alle oder zumindest mehr als 80% der Reste nur einer Spezies (D oder L) an. Am meisten bevorzugt sind alle Aminosäuren im Peptid gemäß der vorliegenden Erfindung von derselben Spezies (D oder L). In einigen Formen kann das Peptid gemäß der vorliegenden Erfindung auch zusätzliche Aminosäurereste aufweisen, die in der Sequenz von Peptid A insertiert sind, jedoch sollten keine A, G und T-Reste im hydrophoben Teil (Z, Z_N) des Peptids enthalten sein.
Vorzugsweise ist in der Peptidsequenz X ein Aminosäurerest ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus K, R, Ornithin und/oder Homoarginin. Wiederum kann das X eines Peptids A verschiedene Aminosäurereste, ausgewählt aus dieser Gruppe, sein, vorzugsweise ist X entweder K oder R oder Ornithin oder Homoarginin in einem Peptid A.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist X in der Peptidsequenz K. Das Peptid A, welches diese Aminosäure als X aufweist, erwies sich als besonders stark für die Induktion einer Immunantwort.
Vorzugsweise ist in der Peptidsequenz Z ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus L, V, I, F und/oder W. Wie für X erwähnt wurde, kann auch das Y in einem Peptid A verschiedene Aminosäurereste darstellen. Es ist jedoch bevorzugt, dass Z eines Peptids q nur ein Aminosäurerest ist, z.B entweder L oder V oder I oder F oder W, wobei L und I-Reste am meisten bevorzugt sind, gefolgt von F, gefolgt von V und gefolgt von W (L>I>F>V>W).
Noch mehr bevorzugt steht Z in der Peptidsequenz A für L (oder I, insbesondere L). Dadurch kann das Peptid A eine besonders starke Immunantwort hervorrufen.
Am meisten bevorzugt ist das Peptid A H-KLKLLLLLKLK-H. Selbstverständlich soll auch die physiologische Form dieses Peptids (beispielsweise mit einem protonisierten N-Terminus (NH₃ ⁺) und einem entprotonisierten C-Terminus (COO^–)) als von dieser Formel (wie für alle Peptide gemäß der vorliegenden Erfindung) mit eingeschlossen gelten.
Gemäß einer weiteren vorteilhaften Ausführungsform ist/sind in der Peptidsequenz R₁ und/oder R₂ 10 bis 20 Aminosäurereste.
Dadurch ist ein Peptid A vorgesehen, welches eine Länge aufweist, mit welcher eine besonders starke Immunantwort hervorgerufen oder verbessert wird.
Gemäß einer vorteilhaften Ausführungsform der vorliegenden Erfindung sind die Aminosäurereste von R₁ und/oder R₂ nicht negativ geladene Aminosäurereste.
Wiederum können die Aminosäurereste natürliche und/oder nicht natürliche Aminosäurereste sein. Durch Hinzufügen nichtnegativ geladener Aminosäurereste entweder an einem oder an beiden Enden des Peptids A weist dieses Peptid eine starke Fähigkeit zur Verbesserung oder Induktion einer Immunantwort auf.
Vorzugsweise bilden R₁ und/oder R₂ einen hydrophoben Schwanz für das Peptid A. Daher sind die Aminosäurereste von R₁ und/oder R₂ vorzugsweise ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus L, V, I, F, und/oder W. Noch mehr bevorzugt sind die Aminosäurereste von R₁ und/oder R₂ ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus L, I und/oder F. Am meisten bevorzugt sind die zusätzlichen Aminosäurereste L. Diese Peptide A weisen eine besonders starke Fähigkeit auf, eine stärkere Immunantwort hervorzurufen.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung sind die Aminosäurereste von R₁ und/oder R₂ positiv geladene natürliche und/oder nicht natürliche Aminosäurereste. Vorzugsweise sind die zusätzlichen Aminosäurereste ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus K, R, Ornithin und/oder Homoarginin. Noch mehr bevorzugt sind die Aminosäurereste von R₁ und/oder R₂ K. Diese Peptide A zeigen auch eine besonders gute Fähigkeit, die Immunantwort zu verbessern.
Es ist bevorzugt, dass die Aminosäurereste von R₁ und/oder R₂ ausgewählt sind aus der ersten Gruppe (bestehend aus L, V, I, F und/oder W) oder aus der zweiten Gruppe (bestehend aus positiv geladenen Aminosäureresten). Es ist jedoch auch möglich, dass die Aminosäurereste von R₁ und/oder R₂ aus beiden Gruppen für ein einziges Peptid A ausgewählt sind.
Das Peptid kann an den Peptid A-Kern der vorliegenden Erfindung durch normale Peptid-Bindungen oder über Peptid-reaktive Gruppen oder Peptid-Linker gebunden sein. Peptid-reaktive Gruppen sind chemische Gruppen, die zur Bindung von Peptiden oder Proteinen geeignet sind. Daher kann der N- oder C-Terminus des vorliegenden Peptids A chemisch modifiziert werden, so dass er eine chemische Modifikation (z.B. Iminothioan, 3-Mercaptopro pionyl,...) aufweist, die die kovalente Befestigung eines Peptids bzw. eines Antigens gestattet. Alternativ kann das Peptid A einen geeigneten Peptid-Linker aufweisen, d.h. ein Linker-Molekül, das eine Verbindung zwischen dem Kern-Peptid A (z.B. dem Peptid ohne R₁ und/oder R₂) und beispielsweise einem daran gebundenen oder daran bindbaren Antigen bilden kann. Das Peptid gemäß der vorliegenden Erfindung kann mit oder ohne das Peptid/Antigen, das an die Peptid-reaktive Gruppe gebunden ist, und/oder den Peptid-Linker vorhanden sein. Solche chemischen Modifikationen und geeignete Peptid-Linker sind für den Fachmann gut verfügbar.
Vorzugsweise weist das Vakzin mindestens eine weitere, die Immunantwort stimulierende Substanz auf. Als Immunantwort stimulierende Substanz kann jede Substanz oder jedes Molekül verwendet werden, von welcher (welchem) bekannt ist, dass es als Adjuvans wirksam ist. Solche Substanzen sind in WO 93/19768 geoffenbart. Andere Substanzen können beispielsweise Polykationen, wie z.B. Polylysin oder Polyarginin, sein. Andere Adjuvantien können Bestandteile in Form von Partikeln, wie z.B. Silikagel oder Dextran-Kügelchen, sein, die klein genug sind, so dass sie in die Zellen eindringen können. Die Zugabe dieser weiteren, die Immunantwort stimulierenden Substanz macht das Vakzin sogar noch wirksamer.
Vorzugsweise umfasst die pharmazeutische Zusammensetzung gemäß der vorliegenden Erfindung, insbesondere in der Form eines Vakzins, weiters ein polykationisches Polymer, vorzugsweise ein polykationisches Peptid, insbesondere Polyarginin, Polylysin oder ein antimikrobielles Peptid.
Die gemäß der vorliegenden Erfindung zu verwendende(n) polykationische(n) Verbindung(en) kann (können) jede polykationische Verbindung sein, die die charakteristische Wirkung gemäß der WO 97/30721 zeigt. Bevorzugte polykationische Verbindungen sind ausgewählt aus basischen Polypeptiden, organischen Polykationen, basischen Polyaminosäuren oder Mischungen davon. Diese Polyaminosäuren sollten eine Kettenlänge von mindestens 4 Aminosäureresten haben. Besonders bevorzugt sind Substanzen, die Peptid-Bindungen enthalten, wie Polylysin, Polyarginin und Polypeptide, die mehr als 20%, insbesondere mehr als 50%, basische Aminosäuren in einem Bereich von mehr als 8, insbesondere mehr als 20, Aminosäurresten oder Mischungen davon, enthalten. Andere bevor zugte Polykationen und ihre pharmazeutischen Zusammensetzungen sind in der WO 97/30721 (z.B. Polyethylenimin) und WO 99/38528 beschrieben. Vorzugsweise enthalten diese Polypeptide zwischen 20 und 500 Aminosäurereste, insbesondere zwsichen 30 und 200 Reste.
Diese polykationischen Verbindungen können chemisch oder rekombinant erzeugt sein oder aus natürlichen Quellen stammen. Kationische (Poly-)Peptide können auch polykationische antibakterielle mikrobielle Peptide sein. Diese (Poly-)Peptide können prokaryontischen oder eukaryontischen Ursprungs sein oder chemisch oder rekombinant erzeugt sein. Die Peptide können auch zur Klasse der natürlich vorkommenden antimikrobiellen Peptide gehören. Solche Wirtsverteidigungs-Peptide oder Defensive sind auch eine bevorzugte Form des polykationischen Polymers gemäß der vorliegenden Erfindung. Im Allgemeinen wird eine Verbindung, die als Endprodukt eine, vorzugsweise durch APCs (einschließlich Dendriten-Zellen) vermittelte, Aktivierung (oder Niederregulierung) des adaptiven Immunsystems ermöglicht, als polykationisches Polymer verwendet.
Besonders bevorzugt zur Verwendung als polykationsiche Substanz bei der vorliegenden Erfindung sind von Cathelicidin stammende antimikrobielle Peptide oder Derivate davon (A 1416/2000), insbesondere antimikrobielle Peptide, die aus Säuger-Cathelicidinen, vorzugsweise von Mensch, Rind oder Maus, stammen.
Weiters können auch neuroaktive Verbindungen, wie (humanes) Wachstumshormon (wie z.B. in der WO 01/24822 beschrieben), als Immunstimulantien verwendet werden.
Zu den aus natürlichen Quellen stammenden polykationischen Verbindungen zählen HIV-REV oder HIV-TAT (abgeleitete kationische Peptide, Antennapedia-Peptide, Chitosan oder andere Chitin-Derivate), oder andere Peptide, die von diesen Peptiden oder Proteinen durch biochemische oder rekombinante Produktion abgeleitet wurden. Andere bevorzugte polykationische Verbindungen sind Cathelin oder verwandte oder abgeleitete Substanzen von Cathelicidin, insbesondere Maus-, bovine oder insbesondere humane Catheline und/oder Cathelicidine.
Verwandte oder abgeleitete Cathelicidin-Substanzen enthalten die ganze oder Teile der Cathelicidin-Sequenz mit mindestens 15–20 Aminosäureresten. Derivatisierungen können die Substitution oder Modifikation der natürlichen Aminosäuren durch Aminosäuren, die nicht zu den 20 Standard-Aminosäuren zählen, umfassen. Außerdem können weitere kationische Reste in solche Cathelicidin-Moleküle eingeführt werden. Vorzugsweise sind diese Cathelicidin-Moleküle mit der Antigen/Vakzin-Zusammensetzung gemäß der vorliegenden Erfindung kombiniert. Überraschenderweise erwiesen sich diese Cathelin-Moleküle jedoch auch als Adjuvans für ein Antigen wirksam ohne den Zusatz weiterer Adjuvantien. Es ist daher möglich, solche Cathelicidin-Moleküle als effiziente Adjuvantien in Vakzin-Formulierungen mit oder ohne weitere immunaktivierende Substanzen zu verwenden.
Vorzugsweise ist die die Immunantwort stimulierende Substanz ein Cytokin. Cytokine spielen bei der Aktivierung und Stimulierung von B-Zellen, T-Zellen und NK-Zellen, Makrophagen, Dendriten-Zellen und verschiedenen anderen Zellen, die an der Induktion von Immunantworten beteiligt sind, eine wichtige Rolle. Jedes Cytokin, welches die Immunantwort auf das (die) Antigen(e) zusätzlich verbessert, kann verwendet werden. Vorzugsweise umfasst das Vakzin gemäß der vorliegenden Erfindung weiters eine immunstimulierende/immunogene Nukleinsäure, vorzugsweise ein Desoxyinosin enthaltendes Oligodesoxynukleotid, ein Desoxyuridin enthaltendes Oligodesoxynukleotid, ein ein methyliertes oder unmethyliertes CG-Motiv enthaltendes Oligodesoxynukleotid oder ein Inosin und Cytidin enthaltendes Nukleinsäuremolekül.
Die gemäß der vorliegenden Erfindung zu verwendenden immunogenen Nukleinsäuren können synthetischen, prokaryontischen und eukaryontischen Ursprungs sein. Im Fall des eukaryontischen ursprungs sollte die DNA von – auf den phylogenetischen Baum bezogen – weniger entwickelten species (z.B. Insekten, aber auch anderen) stammen. Bei einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist das immunogene Oligodesoxynukleotid (ODN) ein synthetisch erzeugtes DNA-Molekül oder eine Mischung solcher Moleküle. Derivate oder Modifikationen von ODNs, wie mit Thiophosphat substituierte Analoga (Thiophosphat-Reste substituieren Phosphat) wie beispielsweise in den U.S.-Patenten US 5,723,335 und US 5,663,153 beschrieben, und andere Derivate und Modifikationen, die vorzugsweise die immunstimulierende(n) Zusammensetzung(en) stabilisieren, aber ihre immunologischen Eigenschaften nicht verändern, sind ebenfalls inkludiert. Ein bevorzugtes Sequenz-Motiv ist ein Sechs-Basen-DNA-Motiv, das ein (unmethyliertes) CpG-Dinukleotid, flankiert von zwei 5'-Purinen und zwei 3'-Pyrimidinen (5'-Pur-Pur-C-G-Pyr-Pyr-3'), enthält. Die in den ODNs gemäß der vorliegenden Erfindung enthaltenen CpG-Motive sind in mikrobieller DNA häufiger als in DNA von höheren Vertebraten und weisen Unterschiede in den Methylierungsmustern auf. Überraschenderweise sind Sequenzen, die Maus-APCs stimulieren, für humane Zellen nicht sehr effizient. Bevorzugte palindromische oder nicht-palindromische ODNs zur Verwendung gemäß der vorliegenden Erfindung sind z.B. in den österreichischen Patentanmeldungen A 1973/2000, A 805/2001, im EP 0 468 520 A2 , in der WO 96/02555, WO 98/16247, WO 98/18810, WO 98/37919, WO 98/40100, WO 98/52581, WO 98/52962, WO 99/51259 und WO 99/56755 geoffenbart, die aller durch Hinweis darauf hierin mit einbezogen sind. Abgesehen davon, dass sie das Immunsystem stimulieren, neutralisieren bestimmte ODNs einige Immunantworten. Diese Sequenzen sind ebenso in der vorliegenden Erfindung mit eingeschlossen, beispielsweise für Anwendungen zur Behandlung von Autoimmunerkrankungen. Die ODNs/DNAs können chemisch oder rekombinant erzeugt sein oder aus natürlichen Quellen stammen. Bevorzugte natürliche Quellen sind Insekten.
Alternativ können auch Nukleinsäuren auf Basis von Inosin und Cytidin (wie beispielsweise in der PCT/EP01/06437 beschrieben) oder Desoxynukleinsäuren, die Desoxyinosin- und/oder Desoxyuridin-Reste enthalten (in den österreichischen Patentanmeldungen A 1973/2000 und A 805/2001 beschrieben) vorzugsweise als immunstimulierende Nukleinsäuren für die vorliegende Erfindung verwendet werden.
Natürlich können auch Mischungen verschiedener immunogener Nukleinsäuren gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet werden. Ein anderer Aspekt der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung des Peptids, welches die Sequenz R₁-XZXZ_NXZX-R₂ (Peptid A), wie oben definiert, aufweist, für die Herstellung eines Adjvuans, um die Immunantwort auf mindestens ein Antigen zu verbessern.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird das Adjuvans einem Vakzin zugegeben. Es ist natürlich möglich, das Adjuvans dem Säuger direkt zu verabreichen, z.B. vorzugsweise vor der Impfung. Es ist jedoch für die Verabreichung einfacher, das Adjuvans einem Vakzin zuzusetzen, welches dann alles auf einmal dem Säuger verabreicht wird.
Gemäß einem weiteren Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Impfung eines Säugers, einschließlich Menschen, gegen ein spezifisches Antigen oder eine Gruppe von spezifischen Antigenen, welches Verfahren die Verabreichung einer wirksamen Menge eines Vakzins gemäß der vorliegenden Erfindung an diesen zu impfenden Säuger, einschließlich Menschen, umfasst. Alternativ umfasst das Verfahren die Verabreichung einer wirksamen Menge eines Adjuvans, umfassend das Peptid A wie voranstehend beschrieben, wonach ein Vakzin verabreicht wird.
Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele und Figuren genauer beschrieben, doch ist die Erfindung natürlich nicht auf diese eingeschränkt.
1 zeigt die TRANSloading-Kapazität des (synthetischen, antimikrobiellen) Peptids KLKLLLLLKLK (SEQ. ID. No. 1) im Vergleich zu verschiedenen, früher beschriebenen "Trägerpeptiden".
2 zeigt die Wirksamkeit vom Peptidvarianten gemäß der vorliegenden Erfindung im Vergleich zu anderen Peptiden.
3 zeigt die Menge der IFN-γ-produzierenden Zellen in Mäusen, die mit einem antigenen Peptid in Verbindung mit dem (synthetischen, antimikrobiellen) Peptid KLKLLLLLKLK geimpft wurden.
BEISPIELE
Beispiel 1
TRANSloading muriner Makrophagen mit einem synthetischen, antimikrobiellen Peptid als "Trägerpeptid"
Um zu testen, ob das (synthetische, antimikrobielle) Peptid KLKLLLLLKLK als "Trägerpeptid" für Antigene funktionieren kann, um APCs in vitro zu TRANSloaden, was heißt, die Antigen-Aufnahme in APCs zu verbessern, wurde ein Fluoreszens-markiertes Peptid als antigenes Peptid verwendet. Es wurde mit verschiedenen Konzentrationen von KLKLLLLLKLK und anderen früher beschriebenen "Trägerpeptiden", wie angegeben, gemischt.
Um die Effizienz der Peptid-Abgabe dieser verschiedenen "Trägerpeptide" zu vergleichen, wurde die Menge der Peptid-Aufnahme in APCs überwacht, indem P388D1-Zellen (murine Monozyten-Makrophagen-Antigen-präsentierende Zelllinie; erworben von ATCC (TIB-63)) 1 h lang bei 37°C mit einer konstanten Menge von mit Fluorescein-markiertem Peptid alleine oder in Kombination mit verschiedenen "Trägerpeptiden" in den angegebenen Konzentra tionen inkubiert wurden. Vor dem Analysieren der Zellen durch Durchfluß-Zytometrie wurden die Zellen extensiv gewaschen, um freies Peptid zu entfernen. Die relative Menge des von den Zellen aufgenommenen, mit Fluorescein markierten Peptids wurde mittels Durchfluß-Zytometrie gemessen.
Das verwendete antigene Peptid ist ein von Influenza-Haemagglutinin stammendes MHC-Klasse I (Kd)-Bindungspeptid (Buschle, M. (1997)). 2 μg dieses antigenen Peptids (FL-LFEAIEG-FI) wurden mit 3 verschiedenen Mengen jedes Trägerpeptids gemischt, getestet bei Konzentrationen, die 101,7, 50,9 und 5,09 nMol positive Ladungen repräsentieren. (1 zeigt die -fache Steigerung an verbesserter Peptid-Aufnahme im Vergleich zum Peptid alleine):
Peptid FL-LFEAIEGFI gemischt mit

(1) + Poly-L-Arginin (pR 60; 60-mer)
(2) + murinem, von Cathelicidin stammendem antimikrobiellem Peptid (mCRAMP); SEQ. ID. No. 2
(3) + LL-37; SEQ. ID. No. 3
(4) + L-Indolicidin; SEQ. ID. No. 4
(5) + KLKLLLLLKLK (freier C-Terminus); SEQ. ID. No. 1
(6) + linearem, bovinem Dodecapeptid; SEQ. ID. No. 5
(7) + zyklisiertem, bovinem Dodecapeptid

Während bekannt ist, dass die Fluoreszenz bei Zellen, die nur mit Peptid alleine behandelt wurden, gering ist (wie früher gezeigt), wurde eine intensive Fluoreszenz von "TRANSloaded" Zellen insbesondere bei solchen Zellen gefunden, die mit dem (synthetischen, antimikrobiellen) Peptid KLKLLLLLKLK als "Trägerpeptid" "TRANSloaded" wurden, was anzeigt, dass es APCs mit einem antigenen Peptid sehr effizient pulsen kann.
Beipiel 2
„TRANSloaden" muriner Makrophagen mit diversen, synthetischen antimikrobiellen Peptiden als „Trägerpeptide"
Diverse synthetische, antimikrobielle Peptide der Sequenz R₁-XZXZ_NXZX-R₂ wurden getestet, um als „Trägerpeptid" für Antigene zu fungieren, um APCs in vitro zu „TRANSloaden", was bedeutet, die Antigen-Aufnahme in APCs zu verbessern. Zu diesem Zweck wurde ein Fluoreszenz-markiertes Peptid als antigenes Peptid verwendet. Es wurde mit verschiedenen Konzentrationen von Pepti den, die eine Sequenz R₁-XZXZ_NXZX-R₂ umfassten, und anderen früher beschriebenen „Trägerpeptiden", wie angegeben, gemischt.
Um die Effizienz der Peptid-Abgabe dieser verschiedenen "Trägerpeptide" zu vergleichen, wurde die Menge der Peptid-Aufnahme in APCs überwacht, indem P388D1-Zellen (murine Monozyten-Makrophagen-Antigen-präsentierende Zelllinie; erworben von ATCC (TIB-63)) 1 h lang bei 37°C mit einer konstanten Menge von mit Fluorescein-markiertem Peptid alleine oder in Kombination mit verschiedenen "Trägerpeptiden" in den angegebenen Konzentrationen inkubiert wurden. Vor dem Analysieren der Zellen mittels Durchfluß-Zytometrie wurden die Zellen extensiv gewaschen, um freies Peptid zu entfernen. Die relative Menge des von den Zellen aufgenommenen, mit Fluorescein markierten Peptids wurde mittels Durchfluß-Zytometrie gemessen.
Das verwendete antigene Peptid ist ein von Influenza-Haemagglutinin stammendes MHC-Klasse I (Kd)-Bindungspeptid (Buschle, M. (1997)). 3 μg dieses antigenen Peptids (FL-LFEAIEG-FI) wurden mit 3 verschiedenen Mengen jedes Trägerpeptids gemischt, getestet bei Konzentrationen, die 101,7, 50,9 und 5,09 nMol positive Ladungen repräsentieren. (2 zeigt die -fache Steigerung an verbesserter Peptid-Aufnahme im Vergleich zum Peptid alleine):
Peptid FL-LFEAIEGFI gemischt mit:

(1) Poly-L-Arginin (60-mer)
(2) Hp(2–20), einem Cecropin-artigen antibakteriellen Peptid, das vom ribosomalen Protein L1 von Helicobacter pylori stammt; SEQ. ID. No. 6
(3) LALF-Peptid: SEQ. ID No. 7
(4) murinem, von Cathelicidin stammendem antimikrobiellem Peptid; SEQ. ID. No. 2
(5) KAKAAAAAKAK-NH₂; SEQ. ID. No:8
(6) KGKGGGGGKGK-NH₂; SEQ. ID. No:9
(7) KTKTTTTTKTK-NH₂; SEQ. ID. No:10
(8) KLKLVIFWKLK-NH₂; SEQ. ID. No:11
(9) KVKVVVVVKVK-NH₂; SEQ. ID. No:12
(10) KWKWWWWWKWK-NH₂; SEQ. ID. No:13
(11) KFKFFFFFKFK-NH₂; SEQ. ID. No:14
(12) RLKLLLLLKLR-NH₂; SEQ. ID. No:15
(13) RLRLLLLLRLR-NH₂; SEQ. ID. No:16
(14) KLKLLLLLKLK-NH₂; SEQ. ID. No:17
(15) KLKLLLLLKLK-COOH (freier C-Terminus); SEQ. ID. No.1

Während bekannt ist, dass die Fluoreszenz bei Zellen, die nur mit Peptid alleine behandelt wurden, gering ist (wie früher gezeigt), wurde eine intensive Fluoreszenz von "TRANSloaded" Zellen insbesondere bei solchen Zellen gefunden, die mit dem Peptid umfassend eine Sequenz R₁-XZXZ_NXZX-R₂ (einschließlich der oben erwähnten bevorzugten Ausführungsformen) als "Trägerpeptid" "TRANSloaded" wurden, was anzeigt, dass die Peptide gemäß der vorliegenden Erfindung APCs mit einem antigenen Peptid sehr effizient pulsen können.
Beispiel 3
Testen der Fähigkeit, die Induktion Peptid-spezifischer T-Zellen-Reaktionen in vivo zu verbessern.
Um die Fähigkeit des (synthetischen, antimikrobiellen) Peptids KLKLLLLLKLK, die Induktion von Peptid-spezifischen T-Zellen-Reaktionen in vivo zu verbessern, zu testen, wurden Gruppen von 4 Mäusen (C57BL/6, weiblich, 8 Wochen alt, H-2b) subkutan 3 Mal (Tage 0, 28 und 56) in die Flanke ein antigenes Melanom-Peptid (100 μg), das von TRP-2 (Maus-Tyrosinase-related Protein-2) stammte, alleine oder in Kombination mit entweder Poly-L-Arginin oder dem (synthetischen, antimikrobiellen) Peptid KLKLLLLLKLK als "Trägerpeptid") injiziert. Die Mengen des verwendeten (synthetischen, antimikrobiellen) Peptids KLKLLLLL-KLK repräsentieren vier verschiedene Mengen bei Konzentrationen, die die gleiche Menge (100 μg) an Poly-L-Arginin hinsichtlich μg, die gleiche (168 μg), die doppelte (336 μg) und die dreifache (504 μg) Menge an Poly-L-Arginin hinsichtlich positiver Ladungen darstellen. Die Gruppen der Mäuse erhielten Folgendes injiziert (angegebene Mengen/pro Maus).

(1) 100 μg Peptid
(2) 100 μg Peptid + 100 μg Poly-L-Arginin (pR 60)
(3) 100 μg Peptid + 100 μg KLKLLLLLKLK
(4) 100 μg Peptid + 168 μg KLKLLLLLKLK
(5) 100 μg Peptid + 336 μg KLKLLLLLKLK
(6) 100 μg Peptid + 504 μg KLKLLLLLKLK

12 Tage nach der 3. Impfung wurden dränierte (inguinale) Lymphknoten entfernt, und die Lymphknotenzellen (3) wurden ex vivo mit von TRP-2 (Maus-Tyrosinase-related Protein-2)-Peptid aktiviert, um IFN-γ-produzierende, spezifische Zellen in einem ELLISpot-Test zu bestimmen (Anzahl der IFN-y-ELISpots pro Million Lymphknotenzellen).
3 zeigt, dass die Injektion von Peptid plus zunehmende Mengen an KLKLLLLLKLK in Mäusen zu viel mehr IFN-γ-produzierenden spezifischen Zellen führte als wenn Mäusen Peptid alleine oder in Kombination mit Poly-L-Arginin injiziert wurde. Es wurde auch bestätigt, dass das Peptid KLKLLLLLKLK keine IFN-γ-produzierenden, Peptid-spezifischen T-Zellen hervorruft (wie mittels ELISpot-Test bestätigt), d.h. dass nur nicht-KLKLLLLLKLK-spezifische T-Zellen bei den vorliegenden Versuchen erhalten wurden.
Dieses Beispiel zeigt deutlich, dass das (synthetische, antimikrobielle) Peptid KLKLLLLLKLK die Induktion von Peptid-spezifischen T-Zellen-Reaktionen in vivo verbessert.
Zusammenfassend zeigte das (synthetische, antimikrobielle) Peptid KLKLLLLLKLK eine hohe "TRANSloading" und immunstimulierende Effizienz, was anzeigt, dass die Peptide A fähig sind, APCs mit antigenen Peptiden in vitro und in vivo sehr effizient zu pulsen und gute Adjuvantien/"Trägerpeptide" für antigene Peptide bei der Induktion adaptiver Immunantworten sind.
Literaturstellen:

Banchereau, et al. (1998), "Dendritic cells and the control of immunity", Nature 392(6673): 245–52.
Boman (2000), "Innate immunity and the normal microflora", Immunol. Rev. 173: 5–16.
Brossart, et al. (1997), "Presentation of exogenous protein antigens on major histocompatibility complex class I molecules by dendritic cells: pathway of presentation and regulation by cytokines", Blood 90(4): 1594–9.
Buschle, et al. (1998), "Chemically defined, cell-free cancer vaccines: use of tumor antigen-derived peptides or polyepitope proteins for vaccination", Gene Therapy and molecular Biology 1: 309–21.
Buschle, et al. (1997), "Transloading of tumor antigen-derived peptides into antigen-presenting cells", Proc. Natl. Acad. Sci., USA 94(7): 3256–61.
Cho, et al. (1999), "Activation of human neutrophils by a synthetic anti-microbial peptide, KLKLLLLLKLK-NH₂, via cell surface calreticulin", Eur. J. Biochem. 266: 878–85.
Ganz, et al. (1997), "Antimicrobial peptides of leukocytes", Curr. Opin. Hematol. 4(1): 53–8.
Ganz, T., (1998), "Antimicrobial peptides of vertebrates", Curr. Opin. Immunol. 10(1): 41–4.
Ganz, et al. (1999), "Antibiotic peptides from higher eukaryotes: biology and applications." Mol. Med. Today 5(7): 292–7.
Gudmundsson, et al. (1999), "Neutrophil antibacterial peptides, multifunctional effector molecules in the mammalian immune system", J. Immunol. Methods 232(1–2): 45–54.
Harding (1995), "Phagocytic processing of antigens for pre sentation by MHC molecules", Trends in Cell Biology 5(3): 105–09.
Harding (1996), "Class I MHC presentation of exogenous antigens", J. Clin. Immunol. 16(2): 90–6.
Mizukawa, et al. (1999), "Presence of defensin in epithelial Langerhans cells adjacent to oral carcinomas and precancerous lesions", Anticancer Res. 19(4B): 2669–71.
Monaco (1992), "A molecular model of MHC class-I-restricted antigen processing", Immunol. Today 13(5): 173–9.
Nakajima, et al. (1997), "Chemotherapeutic activity of synthetic antimicrobial peptides: correlation between chemotherapeutic activity and neutrophil-activating activity", FEBS Lett. 415: 64–66.
Schijns (2000), "Immunological concepts of vaccine adjuvant activity", Curr. Opin. Immunol. 12(4): 456–63.
Schmidt, et al. (1997), "Cell-free tumor antigen peptide-based cancer vaccines", Proc. Natl. Acad. Sci., USA 94(7): 3262–7.
Zanetti, et al. (1997), "The cathelicidin family of antimicrobial peptide precursors: a component of the oxygenindependent defense mechanisms of neutrophils", Ann. N. Y. Acad. Sc. 832: 147–62.

SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Vakzin, dadurch gekennzeichnet, dass es mindestens ein Antigen und ein Peptid mit einer Sequenz R₁-XZXZ_NXZX-R₂ aufweist, wobei – N eine ganze Zahl zwischen 3 und 7, vorzugsweise 5, ist, – X ein positiv geladener natürlicher und/oder nicht-natürlicher Aminosäurerest ist, – Z ein Aminosäurerest, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus L, V, I, F und/oder W, ist, und – R₁ und R₂ unabhängig voneinander ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus -H, -NH₂, -COCH₃, -COH, einem Peptid mit bis zu 20 Aminosäureresten oder einer Peptid-reaktiven Gruppe oder einem Peptid-Linker mit oder ohne ein Peptid; X-R₂ auch ein Amid, Ester oder Thioester des C-terminalen Aminosäurerestes sein kann.
Vakzin nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass in der Peptidsequenz X ein Aminosäurerest ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus K, R, Ornithin und/oder Homoarginin ist.
Vakzin nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass X in der Peptidsequenz K ist.
Vakzin nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass Z in der Peptidsequenz ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus L, I, und/oder F.
Vakzin nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass Z in der Peptidsequenz für L steht.
Vakzin nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Peptidsequenz H-KLKLLLLLKLK-H ist.
Vakzin nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass in der Peptidsequenz R₁ und/oder R₂ 10 bis 20 Aminosäurereste ist (sind).
Vakzin nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass die Aminosäurereste von R₁ und/oder R₂ nicht negativ geladene Amino säurereste sind.
Vakzin nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass die Aminosäurereste von R₁ und/oder R₂ ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus L, V, I, F und/oder W.
Vakzin nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass die Aminosäurereste von R₁ und/oder R₂ ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus L, I, und/oder F.
Vakzin nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass die Aminosäurereste von R₁ und/oder R₂ L sind.
Vakzin nach einem der Ansprüche 7 bis 11, dadurch gekennzeichnet, dass die Aminosäurereste von R₁ und/oder R₂ positiv geladene, natürliche und/oder nicht-natürliche Aminosäurereste sind.
Vakzin nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass die Aminosäurereste von R₁ und/oder R₂ ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus K, R, Ornithin und/oder Homoarginin.
Vakzin nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, dass die Aminosäurereste von R₁ und/oder R₂ K sind.
Vakzin nach einem der Ansprüche 1 bis 14, dadurch gekennzeichnet, dass es mindestens eine weitere, die Immunantwort stimulierende Substanz umfasst.
Vakzin nach einem der Ansprüche 1 bis 15, dadurch gekennzeichnet, dass es weiters eine immunstimulierende Nukleinsäure, vorzugsweise ein Desoxyinosin enthaltendes Oligodesoxynukleotid, ein Desoxyuridin enthaltendes Oligodesoxynukleotid, ein ein CG-Motiv enthaltendes Oligodesoxynukleotid oder ein Inosin und Cytidin enthaltendes Nukleinsäuremolekül umfasst.
Vakzin nach einem der Ansprüche 1 bis 16, dadurch gekennzeichnet, dass es weiters ein Cytokin als die Immunantwort stimulierende Substanz aufweist.
Vakzin nach einem der Ansprüche 1 bis 17, dadurch gekennzeichnet, dass es weiters ein polykationisches Peptid, eine neuroaktive Verbindung oder ein Hormon mit Wachstumsfaktor-Aktivität aufweist.
Verwendung des Peptids, welches die Sequenz R₁-XZXZ_NXZX-R₂, wie in einem der Ansprüche 1 bis 18 definiert, aufweist, als Adjuvans zur Herstellung eines Medikaments zur Verbesserung der Immunantwort auf mindestens ein Antigen.
Verwendung nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, dass das Peptid die Aufnahme von mindestens einem Antigen in Antigenpräsentierende Zellen (APC) verbessert.
Verwendung nach Anspruch 19 oder 20, dadurch gekennzeichnet, dass das Peptid einem Vakzin zugesetzt wird.