DE60117781T2

DE60117781T2 - Peptidderivate des apolipoproteins-a1/aii

Info

Publication number: DE60117781T2
Application number: DE60117781T
Authority: DE
Inventors: Tadahiko Thousand Oaks KOHNO
Original assignee: Amgen Inc
Current assignee: Amgen Inc
Priority date: 2000-04-21
Filing date: 2001-04-23
Publication date: 2006-11-23
Anticipated expiration: 2021-04-24
Also published as: DE60117781D1; WO2001081376A3; PT1290013E; EP1290013A2; WO2001081376A2; US20030040470A1; ES2260219T3; DK1290013T3; ATE319737T1; US6743778B2; EP1290013B1; AU5717301A; AU2001257173B2; MXPA02010324A; JP2003530870A; CA2407083A1

Description

Hintergrund der Erfindung
Es besteht ein Bedarf für rekombinante oder modifizierte therapeutische Wirkstoffe, die eine Apo-AI-amphipathische Helixpeptidaktivität haben.
Rekombinante und modifizierte Proteine sind eine neu entstehende Klasse von therapeutischen Wirkstoffen. Sinnvolle Modifikationen von Protein-therapeutischen Wirkstoffen beinhalten die Kombination aus der „Fc"-Domäne eines Antikörpers und einer Bindung an Polymere, wie zum Beispiel Polyethylenglycol (PEG) und Dextran. Solche Modifikationen werden im Detail in einer Patentanmeldung mit dem Titel „Modified Peptides as Therapeutic Agents", U.S. Anmeldenummer 09/428,082, PCT-Anmeldung-Nr. WO 99/25044, und werden in WO 97/34631 diskutiert.
Ein ganz unterschiedlicher Ansatz zur Entwicklung von therapeutischen Wirkstoffen ist das Screeningverfahren der Peptidbibliothek. Die Interaktion eines Proteinliganden mit seinem Rezeptor findet oft an einer relativ großen Grenzfläche statt. Wie jedoch für das humane Wachstumhormon und sein Rezeptor gezeigt, steuern nur einige wenige Schlüsselreste an der Grenzfläche an dem größten Teil der Bindungsenergie bei. Clackson et al. (1995), Science 267:383-6. Der Großteil des Proteinliganden stellt lediglich die Bindungsepitope in der richtigen räumlichen Struktur zur Verfügung oder dient Funktionen ohne Bezug zur Bindung. So können Moleküle von nur „Peptid"-Länge (2 bis 40 Aminosäuren) an das Rezeptorprotein eines gegebenen großen Proteinliganden binden. Solche Peptide können die Bioaktivität des großen Proteinliganden („Peptidagonisten") nachahmen oder durch kompetitive Bindung die Bioaktivität des großen Proteinliganden („Peptidantagonisten") inhibieren.
Die Phagen-Display-Peptidbibliotheken haben sich als eine einflußreiche Methode bei der Identifizierung solcher Peptidagonisten und -antagonisten herausgebildet. Siehe zum Beispiel Scott et al. (1990), Science 249:386; Devlin et al. (1990), Science 249:404; U.S. Patent Nr. 5,223,409, erhielt am 29. Juni 1993; U.S. Patent Nr. 5,733,731, erhielt am 31. März 1998; U.S. Patent Nr. 5,498,530, erhielt am 12. März 1996; U.S. Patent Nr. 5,432,018, erhielt am 11. Juli 1995; U.S. Patent Nr. 5,338,665, erhielt am 16. August 1994; U.S. Patent Nr. 5,922,545, erhielt am 13. Juli 1999; WO 96/40987, veröffentlicht am 19. Dezember 1996 und WO 98/15833, veröffentlicht am 16. April 1998. In solchen Bibliotheken werden willkürliche Peptidsequenzen durch Fusion mit Hüllproteinen von filamentösen Phagen dargestellt. Üblicherweise sind die dargestellten Peptide gegen eine Antikörper-immobilisierte extrazelluläre Domäne eines Rezeptors Affinitäts-eluiert. Die zurückbehaltenen Phagen können durch aufeinanderfolgende Runden der Affinitätsaufreinigung und der Repropagierung angereichert werden. Die besten Bindungspeptide können sequenziert werden, um Schlüsselreste innerhalb einer oder mehrerer strukturell verwandter Familien von Peptiden zu identifizieren. Siehe z. B. Cwirla et al. (1997), Science 276:1696-9, bei denen zwei unterschiedliche Familien identifiziert wurden. Die Peptidsequenzen können auch daraufhinweisen, welche Reste sicher durch Alanin-Scannen oder durch Mutagenese auf der DNA-Ebene ersetzt werden können. Mutagenesebibliotheken können erzeugt und gescreent werden, um die Sequenz der besten bindenden Moleküle noch weiter zu optimieren. Lowman (1997), Ann. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 26:401-24.
Strukturelle Analyse der Protein-Protein-Interaktion kann auch verwendet werden, um auf Peptide hinzuweisen, die die Bindungsaktivität der großen Proteinliganden nachahmen. Bei solch einer Analyse kann die Kristallstruktur, die Identität und die relative Orientierung der kritischen Reste des großen Proteinliganden andeuten, von denen ein Peptid konstruiert werden kann. Siehe, z. B. Takasaki et al. (1997), Nature Biotech. 15:1266-70. Diese analytischen Methoden können auch verwendet werden, um die Interaktion zwischen einem Rezeptorprotein und Peptiden, die durch Phagen-Display selektioniert wurden, was auf die weitere Modifikation der Peptide zur Erhöhung der Bindungsaffinität hinweisen kann, zu untersuchen.
Andere Methoden konkurrieren mit der Phagen-Display in der Peptidforschung. Eine Peptidbibliothek kann an das Carboxylende des lac-Repressors fusioniert werden und in E. coli exprimiert werden. Ein anderes E. coli-basiertes Verfahren erlaubt die Anzeige auf der äußeren Membran der Zelle durch Fusion mit einem Peptidoglycan-assoziierten Lipoprotein (PAL). Nachstehend werden diese und verwandte Verfahren kollektiv bezeichnet als „E. coli-Display". In einem anderen Verfahren wird die Translation von willkürlicher RNA vor der Ribosomenfreisetzung angehalten, was in einer Bibliothek von Polypeptiden mit ihren assoziierten, noch angehefteten RNA resultiert. Im folgenden wird auf diese und verwandte Methoden kollektiv Bezug genommen als „Ribosomen-Display". Andere Methoden verwenden Peptide, die mit RNA verbunden sind; zum Beispiel, PROfusiontechnology, Phylos, Inc. Siehe zum Beispiel, Roberts & Szostak (1997), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94; 12297-303. Im folgenden wird auf diese und verwandte Verfahren kollektiv als „RNA-Peptidscreening" Bezug genommen. Chemisch abgeleitete Peptidbibliotheken wurden entwickelt, bei denen die Peptide auf stabile, nicht-biologische Materialien immobilisiert wurden, wie zum Beispiel Polyethylenstäbchen oder Lösungsmittel-durchlässige Harze. Eine andere chemisch abgeleitete Peptidbibliothek verwendet die Photolithographie, um Peptide, die auf Glasträgern immobilisiert wurden, zu untersuchen. Im nachhinein wird auf diese und andere Verfahren kollektiv als „Chemisches-Peptidscreening" Bezug genommen. Chemisches Peptidscreening kann dadurch von Vorteil sein, daß es die Verwendung von D-Aminosäuren und anderen nicht natürlichen Analogen erlaubt sowie von Nicht-Peptidelementen. Sowohl die biologischen als auch die chemischen Verfahren werden in Wells & Lowman (1992), Curr. Opin. Biotechnol. 3:355-62 besprochen. Konzeptionell kann man von jedem Protein Peptidmimetika unter Verwendung von Phagen-Display, des RNA-Peptidscreeningverfahrens und der anderen oben erwähnten Verfahren entdecken.
Zusammenfassung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft therapeutische Wirkstoffe, die eine Aktivität ähnlich zu den Apo-AI-amphipathischem Helixpeptid haben, aber mit besseren pharmazeutischen Charakteristika (z. B. Halbwertszeit). Gemäß der vorliegenden Erfindung umfassen solche Verbindungen:

a) ein Apo-AI-amphipathisches Helixpeptid oder eine Apo-AI-amphipathische Helixpeptid-Mimetika-Domäne, vorzugsweise mit der Sequenz des Apo-AI-amphipathischen Helixpeptids oder Sequenzen, die mit Hilfe von Phagen-Display, dem RNA- Peptidscreeningverfahren oder anderen oben erwähnten Techniken davon abgeleitet wurden; und
b) ein Vehikel gemäß Anspruch 1, d. h. eine Fc-Domäne;

Weiterhin in Einklang mit der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zum Herstellen von therapeutischen Wirkstoffen, die eine Apo-AI-amphipathische Helixpeptidaktivität haben, das umfaßt:

a. Auswählen von mindestens einem Peptid, das Apo-AI-amphipathische Helixpeptidaktivität hat; und
b. kovalentes Anbinden des Peptides an ein Vehikel.

Das Vehikel ist eine Fc-Domäne. Schritt (a) wird vorzugsweise durch die Auswahl der SEQ ID NO: 7 oder einer Sequenz, die im Zufallsverfahren über über Phagen-Display, RNA-Peptidscreeningverfahren oder anderen hier erwähnten Techniken ermittelt worden ist, durchgeführt.
Die Verbindungen dieser Erfindung können durch Standard-synthetische Verfahren, durch rekombinante DNA-Techniken oder irgendwelche andere Verfahren zur Herstellung von Peptiden und Fusionsproteinen hergestellt werden. Verbindungen dieser Erfindung, die nicht Peptidanteile umfassen, können durch organische-chemische Standard-Reaktionen synthetisiert werden, zusätzlich zu peptidchemischen Standard-Reaktionen, falls zutreffend.
Die hauptsächliche Verwendung, die für die Verbindungen dieser Erfindung in Erwägung gezogen wird, ist die als therapeutische oder prophylaktische Wirkstoffe. Das Vehikelverbundene Peptid kann eine Aktivität haben, die vergleichbar zu oder sogar größer als der natürliche Ligand ist, der von dem Peptid nachgeahmt wird.
Die Verbindungen dieser Erfindung können für therapeutische oder prophylaktische Zwecke verwendet werden, indem sie mit geeigneten pharmazeutischen Trägermaterialien formuliert werden und indem eine wirksame Menge an einen Patienten verabreicht wird, wie zum Beispiel einem Menschen (oder einem anderen Säugetier), der dies benötigt. Andere verwandte Aspekte sind auch in der vorliegenden Erfindung beinhaltet.
Zahlreiche zusätzliche Aspekte und Vorteile der vorliegenden Erfindung werden nach Betrachtung der Figuren und der detaillierten Beschreibung der Erfindung offensichtlich werden.
Kurze Beschreibung der Figuren
1 zeigt exemplarische Fc-Dimere, die von einem IgG1-Antikörper abgeleitet sein können. „Fc" in der Figur repräsentiert jede der Fc-Varianten innerhalb der hier verwendeten Bedeutung der „Fc-Domäne". „X¹" und „X²" repräsentieren Peptide oder Kombinationen von Linkerpeptiden, wie im folgenden definiert. Die spezifischen Dimere sind wie folgt:

A, D: Einzel-Disulfid-gebundene Dimere. IgG1-Antikörper haben üblicherweise zwei Disulfidbindungen in der Scharnierregion zwischen den konstanten und variablen Domänen. Die Fc-Domäne in 2A und 2D können durch Verkürzung zwischen den beiden Disulfidbindungsstellen oder durch Substitution eines Cysteinylrestes mit einem unreaktiven Rest (z. B. Alanyl) gebildet werden. In 2A ist die Fc-Domäne mit dem Aminoterminus der Peptide verbunden; in 2D mit dem Carboxylterminus.
B, E: Doppelt-Disulfid-gebundene Dimere. Diese Fc-Domäne kann durch Verkürzung des Elternantikörpers gebildet werden, um beide Cysteinylreste in den Fc-Domänenketten beizubehalten oder durch Expression eines Konstruktes, das eine Sequenz, die solche eine Fc- Domäne kodiert, beinhaltet. In 2B ist die Fc-Domäne an dem Aminoterminus der Peptide-gebunden; in 2E an dem Carboxylterminus.
C, F: Nicht-kovalente Dimere. Diese Fc-Domäne kann durch Eliminierung der Cysteinylreste durch entweder Verkürzung oder Substitution gebildet werden. Man kann sich wünschen, die Cysteinylreste zu eliminieren, die sich durch Reaktion des Cysteinylrestes mit Cysteinylresten von anderen Proteinen, die in der Wirtszelle anwesend sind, gebildet haben. Die nicht-kovalente Bindung der Fc-Domänen ist ausreichend, um das Dimer zusammenzuhalten.

Andere Dimere können durch Verwendung von Fc-Domänen, die von unterschiedlichen Antikörpertypen abgeleitet sind (z. B. IgG2, IgM), gebildet werden.
2 zeigt die Struktur von bevorzugten Verbindungen der Erfindung, die Tandemwiederholungen des pharmakologisch aktiven Peptides aufweisen. 2A zeigt ein einzelnes Kettenmolekül und kann auch das DNA-Konstrukt für das Molekül repräsentieren. 2B zeigt ein Dimer, in dem der Linker-Peptidanteil auf nur einer Kette des Dimers anwesend ist. 2C zeigt ein Dimer, das den Peptidanteil auf beiden Ketten hat. Das Dimer von 2C wird sich spontan in bestimmten Wirtszellen bilden nach Expression eines DNA-Konstruktes, das die Einzelkette, die in 3A gezeigt ist, kodiert. In anderen Wirtszellen können die Zellen in Bedingungen plaziert werden, die die Bildung von Dimeren favorisieren, oder die Dimere können in vitro gebildet werden.
3 zeigt exemplarische Nukleinsäure- und Aminosäuresequenzen (SEQ ID NO: 1 bzw. 2) des humanen IgG1 Fc, das in dieser Erfindung verwendet werden kann.
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
Definition von Begriffen
Die Begriffe, die in dieser Beschreibung durchgehend verwendet werden, sind wie folgt definiert, außer wenn sie in bestimmten anderweitigen Fällen begrenzt sind.
Der Begriff „umfassend" bedeutet, daß eine Verbindung zusätzliche Aminosäuren auf einem oder beiden der N- oder C-Termini einer gegebenen Sequenz beinhalten kann. Natürlich sollten diese zusätzlichen Aminosäuren nicht signifikant die Aktivität der Verbindung stören.
Der Begriff „saurer Rest" bezieht sich auf Aminosäurereste in D- oder L-Form, die Seitenketten haben, die saure Gruppen umfassen. Exemplarische saure Reste beinhalten D und E.
Der Begriff „aromatischer Rest" bezieht sich auf Aminosäurereste in D- oder L-Form, die Seitenketten haben, die aromatische Gruppen umfassen. Exemplarische aromatische Reste beinhalten F, Y und W.
Der Begriff „basischer Rest" bezieht sich auf Aminosäurereste in D- oder L-Form, die Seitenketten haben, die basische Gruppen umfassen. Exemplarische basische Reste beinhalten H, K und R.
Der Begriff „hydrophiler Rest" bezieht sich auf Aminosäurereste in D- oder L-Form, die Seitenketten haben, die polare Gruppen umfassen. Exemplarische hydrophile Reste beinhalten C, S, T, N und Q.
Der Begriff „nicht-funktioneller Rest" bezieht sich auf Aminosäurereste in D- oder L-Form, die Seitenketten haben, denen saure, basische oder aromatische Gruppen fehlen. Exemplarische neutrale Aminosäurereste beinhalten M, G, A, V, I, L und Norleucin (Nle).
Der Begriff „Vehikel" bezieht sich auf eine Fc-Domäne.
Der Begriff „natives Fc" bezieht sich auf das Molekül oder die Sequenz, die die Sequenz eines Nicht-Antigen-bindenden Fragments umfasst, das aus dem Verdau des gesamten Antikörpers, ob in monomerer oder multimerer Form, resultiert. Die ursprüngliche Immunglobulinquelle des nativen Fc ist vorzugsweise menschlichen Ursprungs und kann jedes der Immunglobuline sein, obgleich IgG1 und IgG2 bevorzugt sind. Native Fcs sind aus monomeren Polypeptiden, die zu dimeren oder multimeren Formen durch kovalente (d. h. Disulfidbindungen), und nicht-kovalente Verbindungen verknüpft sein können. Die Anzahl der intermolekularen Disulfidbindungen zwischen Monomeruntereinheiten der nativen Fc-Moleküle reicht von 1 bis 4, abhängig von der Klasse (z. B. IgG, IgA, IgE) oder der Subklasse (z. B. IgG1, IgG2, IgG3, IgA1, IgGA2). Ein Beispiel eines nativen Fc ist ein Disulfidgebundenes Dimer, das aus dem Papainverdau eines IgG resultiert (siehe Ellison et al. (1982), Nucleic Acids Res. 10:4071-9). Der Begriff „natives Fc", wie er hier verwendet wird, ist generisch für die Monomer-, Dimer- und Multimerformen.
Der Begriff „Fc-Variante" bezieht sich auf ein Molekül oder eine Sequenz, die von einem nativen Fc modifiziert ist, aber immer noch eine Bindungsstelle für den Hilfsrezeptor, FcRn, umfaßt. Die Internationalen Anmeldungen WO 97/34631 (publiziert am 25. September 1997) und WO 96/32478, beschreiben beispielhafte Fc-Varianten sowie die Interaktion mit dem Hilfsrezeptor und sind hiermit durch Referenz in ihrer Gesamtheit miteinbezogen. So umfaßt der Begriff „Fc-Variante" ein Molekül oder eine Sequenz, die von einem nicht-menschlichen nativen Fc humanisiert wurde. Weiterhin umfaßt ein natives Fc die Stellen, die entfernt werden können, weil sie Struktureigenschaften oder biologische Aktivität zur Verfügung stellen, die nicht für die Fusionsmoleküle der vorliegenden Erfindung notwendig sind. So umfaßt der Begriff „Fc-Variante" ein Molekül oder eine Sequenz, dem eine oder mehrere native Fc-Stellen oder -Reste fehlen, die beeinflussen oder einbezogen sind in (1) der Bildung von Disulfidbindungen, (2) der Unverträglichkeit mit einer ausgewählten Wirtszelle, (3) der N-terminalen Heterogenität nach Expression in einer ausgesuchten Wirtszelle, (4) der Glykosylierung, (5) der Interaktion mit dem Komplement, (6) der Bindung an einen Fc-Rezeptor anders als einen Hilfsrezeptor oder (7) der Antikörper-abhängigen zellulären Zytotoxizität (ADCC). Fc-Varianten werden in weiterem Detail nachfolgend beschrieben.
Der Begriff „Fc-Domäne" umfaßt native Fc- und Fc-Variantenmoleküle und Sequenzen, wie oben definiert. Wie mit den Fc-Varianten und nativen Fcs beinhaltet der Begriff „Fc-Domäne" Moleküle in Monomer- oder Multimerform, sei es daß sie aus einem vollständigen Antikörper verdaut oder mit anderen Mitteln hergestellt wurden.
Der Begriff „Multimer", wie er auf Fc-Domänen oder Moleküle, die Fc-Domänen umfassen, angewendet wird, bezieht sich auf Moleküle, die zwei oder mehr Polypeptidketten haben, die kovalent, nicht-kovalent oder durch sowohl kovalente wie auch nicht-kovalente Interaktionen assoziiert sind. IgG-Moleküle bilden üblicherweise Dimere; IgM, Pentamere; IgD, Dimere und IgA, Monomere, Dimere, Trimere oder Tetramere. Multimere können durch Verwertung der Sequenz und der resultierenden Aktivität der nativen Ig-Quelle des Fc oder durch Derivatisieren (wie unten definiert) eines solchen nativen Fc gebildet werden.
Der Begriff „Dimer", wie er auf Fc-Domänen oder Moleküle, die Fc-Domänen umfassen, angewendet wird, bezieht sich auf Moleküle, die zwei Polypeptidketten haben, die kovalent oder nicht-kovalent verbunden sind. So sind exemplarische Dimere innerhalb des Umfangs dieser Erfindung solche wie sie in 2 gezeigt werden.
Die Begriffe „Derivatisieren" und „Derivat" oder „derivatisiert" umfassen jeweils Prozesse bzw. resultierende Verbindungen, in denen (1) die Verbindung einen zyklischen Anteil hat; zum Beispiel Quervernetzung zwischen Cysteinylresten innerhalb der Verbindung; (2) die Verbindung quervernetzt ist oder eine Quervernetzungsstelle hat; zum Beispiel hat die Verbindung einen Cysteinylrest und bildet daher quervernetzte Dimere in Kultur oder in vivo; (3) eine oder mehrere Peptidylbindungen durch eine Nicht-Peptidylbindung ersetzt worden ist; (4) der N-Terminus durch -NRR¹, NRC(O)R¹, -NRC(O)OR¹, -NRS(O)₂R¹, -NHC(O)NHR, eine Succinimidgruppe oder substituiertes oder nicht-substituiertes Benzyloxycarbonyl-NH-ersetzt ist, wobei R und R¹ und die Ringsubstituenten wie nachstehend definiert sind; (5) der C-Terminus durch -C(O)R² oder -NR³R⁴ ersetzt ist, wobei R², R³ und R⁴ wie im folgenden definiert sind; und (6) Verbindungen, in denen individuelle Aminosäurereste durch Behandlung mit Wirkstoffen, die mit ausgewählten Seitenketten oder terminalen Resten reagieren können, modifiziert sind. Derivate werden weiterhin im folgenden beschrieben.
Der Begriff „Peptid" bezieht sich auf Moleküle von 3 bis 40 Aminosäuren, wobei Moleküle aus 5 bis 60 Aminosäuren bevorzugt sind. Exemplarische Peptide können das amphipathische Apo-AI-Helixpeptid umfassen sowie Peptide, die eine oder mehrere Reste des amphipathische Apo-AI-Helixpeptides wahllos angeordnet haben, oder Peptide die wahllos angeordnete Sequenzen umfassen.
Der Begriff „im Zufallsverfahren ermittelt" (randomized") willkürlich angeordnet", wie er verwendet wird um sich auf Peptidsequenzen zu beziehen, bezieht sich auf vollständig zufällige Sequenzen (z. B. ausgewählt durch Phagen-Displayverfahren oder RNA-Peptidscreening) und Sequenzen, in denen ein oder mehrere Reste eines natürlich auftretenden Moleküls durch einen Aminosäurerest ersetzt ist, der nicht in dieser Position in dem natürlich vorkommenden Molekül erscheint. Exemplarische Verfahren zum Identifizieren von Peptidsequenzen beinhalten Phagen-Display, E. coli-Display, Ribosomen-Display, RNA-Peptidscreening, chemisches Screening und ähnliches.
Der Begriff „amphipathisches Apo-AI-Helixpeptid-Mimetikum" bezieht sich auf ein Molekül, das eine oder mehrere amphipathische Apo-AI-Helixpeptid-Aktivitätstestverfahrenparameter erhöht oder erniedrigt, wie es das amphipathische Apo-AI-Helixpeptid macht.
Der Begriff „amphipathischer Apo-AI-Helixpeptid-Antagonist" bezieht sich auf ein Molekül, das einen oder mehrere Testverfahrenparameter erhöht oder erniedrigt, im Gegensatz zu dem Effekt auf solche Parameter durch das amphipathische Apo-AI-Helixpeptid.
Zusätzlich sind physiologisch akzeptable Salze der Verbindungen dieser Erfindung auch hier umfaßt. Der Begriff „physiologisch akzeptable Salze" bezieht sich auf beliebige Salze, von denen bekannt ist oder später entdeckt wurde, daß sie pharmazeutisch akzeptabel sind. Einige spezielle Beispiele sind: Acetat; Trifluoracetat; Hydrohalogenid, wie zum Beispiel Hydrochlorid und Hydrobromid; Sulfat, Citrat; Tartrat; Glycolat und Oxalat.
Struktur von Verbindungen
Im Allgemeinen. Amphipathisches Apo-AI-Helixpeptid-bindende Aminosäuresequenzen sind in Spinivas et al., 1990, Virology 176:48-57; Owens et al (1990), J. Clin. Invest. 86:1142-1150; Mendez et al. (1994); J. Clin. Invest. 94(4):1698-1705; Sprinivas et al. (1991), J. Cell. Biochem. 45(2):224-237 und US-A-6046166 beschrieben.
Die vorliegenden Erfinder identifizierten besonders bevorzugte bekannte oder natürlich vorkommende Sequenzen. Diese Sequenzen können durch oben erwähnte Techniken im Zufallsverfahren ermittelt werden, wodurch eine oder mehrere Aminosäuren ausgetauscht sein können, während die Bindungsaktivität des Peptides erhalten bleibt oder sogar verbessert wird.
In den Stoffzusammensetzungen, die in Übereinstimmung mit dieser Erfindung hergestellt werden, kann das Peptid an das Vehikel über den N-Terminus oder C-Terminus des Peptides angehängt sein. So können die Vehikel-Peptidmoleküle dieser Erfindung durch die folgende Formel I beschrieben werden: (A1)a-F1-(A2)b wobei:

F¹: eine Fc-Domäne ist;
A¹ und A²: jeweils unabhängig ausgewählt sind aus -(L¹)_c-P¹, -(L¹)_c-P¹-(L²)_d-P², -(L¹)_c-P¹-(L²)_d-P²-(L³)_eP³ und -(L¹)_c-P¹-(L²)_d-P²-(L³)_e-P³-(L⁴)_f-P
P¹, P², P³ und P⁴: sind jeweils unabhängige Sequenzen des amphipathischen Apo-AI-Helixpeptides oder von amphipathischen Apo-AI-Helixpeptid-Mimetika-Domänen;
L¹, L², L³ und L⁴: jeweils unabhängige Linker sind; und
a, b, c, d, e und f: jeweils unabhängig 0 oder 1 sind, vorausgesetzt, daß mindestens eines von a und b 1 ist.

So umfaßt Verbindung I bevorzugte Verbindungen der Formel II A1-F1 und Multimere davon, wobei F¹ eine Fc-Domäne ist und an den C-Terminus von A¹ angehängt ist; F1-A2 IIIund Multimere davon, wobei F¹ eine Fc-Domäne ist und an den N-Terminus von A2 angehängt ist; F1-(L1)c-P1 IVund Multimere davon, wobei F¹ eine Fc-Domäne ist und an den N-Terminus von -(L¹)_c-P¹ angehängt ist; und F1-(L1)c-P1-(L2)d-P2 Vund Multimere davon, wobei F¹ eine Fc-Domäne ist und an den N-Terminus von -L¹-P¹-L²-P² angehängt ist.
Pepitide. Jede Anzahl von Peptiden kann in Verbindung mit der vorliegenden Verbindung verwendet werden. Peptide können einen Teil der Sequenz von natürlich vorkommenden Proteinen umfassen, können im Zufallsverfahren ermittelte Sequenzen sein, die von der Sequenz von natürlich vorkommenden Proteinen abgeleitet sind, oder können vollständig zufällig zusammengestellte Sequenzen sein. Phagen-Display und RNA-Peptidscreening im besonderen sind bei dem Erzeugen von Peptiden zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung nützlich.
Eine Peptidsequenz von besonderem Interesse hat die Formel
Asp Trp Leu Lys Ala Phe Tyr Asp Lys Val Ala Glu Lys Leu Lys Glu Ala Phe (SEQ ID NO: 7)
Moleküle dieser Erfindung, die diese Peptidsequenzen inkorporiert haben, können durch Methoden, die dem Fachmann bekannt sind, hergestellt werden. Jedes dieser Peptide kann in Tandem (d. h. sequentiell), mit oder ohne Linker, verbunden sein und einige Tandemverbundene Beispiele sind in Tabelle 2 dargestellt. Jedes Peptid, das ein Cysteinylrest enthält, kann mit einem anderen Cys-enthaltenden Peptid vernetzt werden, von dem eines oder beide mit einem Vehikel verknüpft sein kann. Jedes Peptid, das mehr als einen Cys-Rest hat, kann auch eine Intrapeptid-Disulfidbindung bilden. Jedes dieser Peptide kann derivatisiert sein, wie später beschrieben.
Zusätzliche nützliche Peptidsequenzen können aus konservativen und/oder nicht-konservativen Modifikationen der Aminosäuresequenzen der SEQ ID NO: 7 resultieren.
Konservative Modifikationen werden Peptide erzeugen, die funktionelle und chemische Charakteristika ähnlich denen des Peptids haben, von dem diese Modifikationen gemacht wurden. Im Gegensatz dazu können substantielle Veränderungen in den funktionellen und/oder chemischen Charakteristika der Peptide durch Auswählen der Substitutionen in der Aminosäuresequenz erzielt werden, die sich signifikant in ihrem Effekt auf das Beibehalten (a) der Struktur des molekularen Rückgrats in der Gegend der Substitution, zum Beispiel wie bei einer Blatt- oder helikalen Konformation, (b) der Struktur oder Hydrophobizität des Moleküls an der Targetstelle oder (c) der Größe des Moleküls unterscheiden.
Zum Beispiel kann eine „konservative Aminosäuresubstitution" eine Substitution eines nativen Aminosäurerestes mit einem nicht-nativen Rest umfassen, derart, daß es dort einen geringen oder keinen Effekt auf die Polarität oder die Ladung des Aminosäurerestes an dieser Position gibt. Weiterhin kann jeder native Rest in dem Polypeptid auch mit Alanin substituiert werden, wie es zuvor für die „Alanin-Scanning-Mutagenese" beschreiben wurde (siehe zum Beispiel MacLennan et al., 1998, Acta Physiol. Scand. Suppl. 643:55-67; Sasaki et al., 1998, Adv. Biophys. 35:1-24, das auch die Alanin-Sanning-Mutagenese diskutiert).
Erwünschte Aminosäuresubstitutionen (ob konservativ oder nicht-konservativ) können durch den Fachmann zu dem Zeitpunkt bestimmt werden, wenn solche Substitutionen erwünscht sind. Zum Beispiel können Aminosäuresubstitutionen verwendet werden, um wichtige Reste der Peptidsequenz zu identifizieren, oder um die Affinität des Peptides oder der Vehikel-Peptidmoleküle (siehe vorausgehende Formeln), wie oben beschrieben, zu erhöhen oder zu erniedrigen. Beispielhafte Aminosäuresubstitutionen sind in Tabelle 1 dargelegt.
Tabelle 1 – Aminosäuresubstitutionen
In einigen Ausführungsformen umfassen konservative Aminosäuresubstitutionen auch nicht-natürlich auftretende Aminosäurereste, die typischerweise durch chemische Peptidsynthese eingebaut werden, eher als durch Synthese in biologischen Systemen.
Wie in dem vorhergehenden Abschnitt „Definition von Begriffen" bemerkt, können natürlich auftretende Reste in Klassen eingeteilt werden, die auf gemeinsamen Seitenketteneigenschaften basieren, die für die Veränderung der Sequenz nützlich sein können. Zum Beispiel können nicht-konservative Substitutionen den Austausch eines Mitgliedes von einem dieser Klassen für ein Mitglied von einer anderen Klasse umfassen. Solche substituierten Reste können in Regionen des Peptides, die homolog mit nicht-menschlichen Orthologen sind, oder in die nicht-homologen Regionen des Moleküls eingeführt werden. Zusätzlich kann man auch Modifikationen unter Verwendung von P oder G, um auf die Kettenorientierung einzuwirken.
Bei der Durchführung solcher Modifikationen kann der hydropathische Index der Aminosäuren berücksichtigt werden. Jeder Aminosäure ist ein hydropathischer Index auf Basis ihrer Hydrophobizität und Ladungscharakteristika zugeteilt. Diese sind: Isoleucin (+4,5), Valin (+4,2); Leucin (+3,8), Phenylalanin (+2,8); Cystein/Cystin (+2,5); Methionin (+1,9); Alanin (+1,8); Glycin (–0,4); Threonin (–0,7); Serin (–0,8); Tryptophan (–0,9); Tyrosin (–1,3); Prolin (–1,6); Histidin(–3,2); Glutamat (–3,5); Glutamin (–3,5); Aspartat (–3,5); Asparagin (–3,5); Lysin (–3,9) und Arginin (–4,5).
Die Bedeutung des hydropathischen Aminosäureindex für das Übertragen der interaktiven biologischen Funktion auf ein Protein ist dem Fachmann verständlich. Kyte et al., J. Mol. Biol., 157:105-131 (1982). Es ist bekannt, daß gewisse Aminosäuren für andere Aminosäuren substituiert werden können, die einen ähnlichen hydropathischen Index oder Rang haben und die weiterhin eine ähnliche biologische Aktivität beibehalten. Wenn Änderungen, basierend auf dem hydropathischen Index gemacht werden, ist die Substitution von Aminosäuren, deren hydropathische Indizes innerhalb ± 2 sind, bevorzugt, die innerhalb ± 1 sind, sind besonders bevorzugt, und die, die innerhalb ± 0,5 sind, sind sogar noch mehr besonders bevorzugt.
Es ist auch dem Fachmann gut bekannt, daß die Substitution von ähnlichen Aminosäuren im Ergebnis auf Basis der Hydrophilie gemacht werden kann. Die größte lokale durchschnittliche Hydrophilie eines Proteins, wie bestimmt durch die Hydrophilie ihrer angrenzenden Aminosäuren, korreliert mit ihrer Immunogenizität und Antigenizität, d. h. mit einer biologischen Eigenschaft des Proteins.
Die folgenden Hydrophilie-Werte wurden den Aminosäureresten zugeordnet: Arginin (+3,0); Lysin (+3,0); Aspartat (+3,0 ± 1); Glutamat (+3,0 ± 1); Serin (+0,3); Asparagin (+0,2); Glutamin (+0,2); Glycin (0); Threonin (–0,4); Prolin (–0,5 ± 1); Alanin (–0,5); Histidin (–0,5); Cystein (–1,0); Methionin (–1,3); Valin (–1,5); Leucin (–1,8); Isoleucin (–1,8); Tyrosin (–2,3); Phenylalanin (–2,5); Tryptophan (–3,4). Wenn Änderungen, basierend auf ähnlichen Hydrophilie-Werten gemacht werden, ist die Substitution von Aminosäuren, deren Hydrophilie-Werte innerhalb ± 2 liegt, bevorzugt. Diejenigen, die innerhalb ± 1 liegen, sind besonders bevorzugt und diejenigen, die innerhalb ± 0,5 liegen, sind sogar noch mehr besonders bevorzugt. Man kann auch Epitope von primären Aminosäuresequenzen auf der Basis der Hydrophilie identifizieren. Diese Regionen werden auch als „epitopische Kernregionen" bezeichnet.
Ein Fachmann wird fähig sein, geeignete Varianten des Polypeptides, wie in den vorhergehenden Sequenzen dargelegt unter Verwendung gut bekannter Techniken zu bestimmen. Zum Identifizieren geeigneter Gegenden des Moleküls, die verändert werden können ohne daß die Aktivität zerstört wird, kann ein Fachmann auf Gegenden abzielen, von denen man glaubt, daß diese für die Aktivität nicht wichtig sind. Zum Beispiel kann, wenn ähnliche Polypeptide mit ähnlichen Aktivitäten von der gleichen Spezies oder von anderen Spezies bekannt sind, ein Fachmann die Aminosäuresequenz eines Peptides mit ähnlichen Peptiden vergleichen. Mit solch einem Vergleich kann man Reste und Bereiche der Moleküle identifizieren, die bei ähnlichen Polypeptiden konserviert sind. Es wird klar sein, daß Veränderungen in Gegenden eines Peptides, die relativ zu solchen ähnlichen Peptiden nicht konserviert sind, wenig wahrscheinlich nachteilig die biologische Aktivität und/oder die Struktur des Peptides beeinflussen würden. Ein Fachmann würde auch wissen, daß selbst in relativ konservierten Regionen man chemisch ähnliche Aminosäuren für die natürlich auftretenden Reste substituieren kann, während die Aktivität beibehalten wird (konservative Aminosäurerestesubstitutionen). Daher können selbst Gegenden, die für die biologische Aktivität oder für die Struktur wichtig sein können, konservativen Aminosäuresubstitutionen unterzogen werden, ohne die biologische Aktivität zu zerstören oder ohne nachteilig die Peptidstruktur zu beeinflussen.
Zusätzlich kann ein Fachmann Struktur-Funktionsstudien überprüfen und Reste in ähnlichen Peptiden identifizieren, die für die Aktivität oder Struktur wichtig sind. Im Hinblick auf solch einen Vergleich kann man die Bedeutung von Aminosäureresten, die Aminosäureresten entsprechen, die wichtig für die Aktivität oder Struktur in ähnlichen Peptiden sind, in einem Peptid vorhersagen. Ein Fachmann kann sich für chemisch ähnliche Aminosäuresubstitutionen für solche vorhergesagten wichtigen Aminosäurereste der Peptide entscheiden.
Ein Fachmann kann auch die dreidimensionale Struktur und die Aminosäuresequenz im Verhältnis zu dieser Struktur in ähnlichen Polypeptiden analysieren. Im Hinblick auf diese Information kann ein Fachmann die Ausrichtung der Aminosäurereste eines Peptides hinsichtlich seiner dreidimensionalen Struktur vorhersagen. Ein Fachmann kann sich dafür entscheiden, keine radikalen Veränderungen für Aminosäurereste zu machen, von denen vorhergesagt wurde, daß sie auf der Oberfläche des Proteines sind, weil solche Reste an wichtigen Interaktionen mit anderen Molekülen beteiligt sein können. Außerdem kann ein Fachmann Testvarianten generieren, die eine einzelne Aminosäuresubstitution an jedem erwünschten Aminosäurerest enthalten. Diese Varianten können dann unter Verwendung von Aktivitätstestverfahren gescreent werden, die dem Fachmann bekannt sind. Solche Daten können verwendet werden, um Informationen über geeignete Varianten zu erfassen. Zum Beispiel, wenn man entdeckt, daß eine Veränderung zu einem bestimmten Aminosäurerest in zerstörter oder unerwünscht reduzierter oder ungeeigneter Aktivität resultiert, würden Varianten mit solch einer Veränderung vermieden werden. In anderen Worten, basierend auf der Information, die von solchen Routineexperimenten erfaßt wurden, kann ein Fachmann leicht die Aminosäuren bestimmen, bei denen weitere Substitutionen vermieden werden sollten, entweder alleine oder in Kombination mit anderen Mutationen.
Eine Anzahl von wissenschaftlichen Publikationen haben sich der Vorhersage der Sekundärstruktur gewidmet. Siehe Moult, J. Curr. Op. in Biotech., 7(4):422-427 (1996), Chou et al., Biochemistry, 13(2):222-245 (1974); Chou et al., Biochemistry, 113(2):211-222 (1974); Chou et al., Adv. Enzymol. Relat. Areas Mol. Biol., 47:45-148 (1978) Chou et al., Ann. Rev. Biochem., 47:251-276 und Chou et al., Biophys. J. 26:367-384 (1979). Außerdem sind derzeit Computerprogramme erhältlich, um bei der Vorhersage der Sekundärstruktur behilflich zu sein. Eine Methode des Vorhersagens der Sekundärstruktur basiert auf Homologie-Modellierung. Zum Beispiel haben zwei Polypeptide oder Proteine, die eine Sequenzidentität von größer als 30% oder eine Ähnlichkeit größer als 40% haben, oft ähnliche strukturelle Topologien. Der kürzliche Zuwachs der Protein-Struktur-Datenbank (PDB) hat verstärkte Vorhersagbarkeit der Sekundärstruktur bereitgestellt, inklusive die mögliche Anzahl von Faltungen innerhalb einer Polypeptid- oder Proteinstruktur. Siehe Holm et al., Nucl. Acid. Res., 27(1):244-247 (1999). Es ist vorgeschlagen worden (Brenner et al., Curr. Op. Struct. Biol., 7(3):369-376 (1997)), daß eine limitierte Anzahl von Faltungen in einem gegebenen Polypeptid oder Protein vorhanden sind und daß, sobald eine kritische Anzahl von Strukturen gelöst ist, strukturelle Vorhersagen dramatisch in ihrer Exaktheit zunehmen werden.
Zusätzliche Verfahren zum Vorhersagen der Sekundärstruktur beinhalten das „Einfädeln" ("Threading") (Jones, D., Curr. Opin. Struct. Biol., 7(3):377-87 (1997); Sippl et al., Structure, 4(1):15-9 (1996)), „Profilanalyse" (Bowie et al., Science, 253:164-170 (1991); Gribskov et al., Meth. Enzym., 183:146-159 (1990); Gribskov et al., Proc. Nat. Acad. Sci., 84(13):4355-8 (1987), und „evolutionäre Verbindung" ("evolutionary linkage") (siehe Home, oben und Brenner, oben).
Vehikel. Diese Erfindung benötigt die Anwesenheit von mindestens einem Vehikel (F¹), angehängt an ein Peptid durch den N-Terminus, C-Terminus oder eine Seitenkette von einem der Aminosäurereste.
Eine Fc-Domäne ist das Vehikel. Die Fc-Domäne kann an den N- oder C-Terminus der Peptide oder an beide N- und C-Termini fusioniert werden. Die Fusion an den N-Terminus ist bevorzugt.
Wie oben bemerkt, sind Fc-Varianten geeignete Vehikel innerhalb des Umfangs dieser Erfindung. Ein natives Fc kann umfangreich modifiziert werden, um eine Fc-Variante in Einklang mit dieser Erfindung zu bilden, vorausgesetzt, die Bindung an den Hilfsrezeptor bleibt erhalten; siehe zum Beispiel WO 97/34631 und WO 96/32478. In solchen Fc-Varianten kann man eine oder mehrere Stellen eines nativen Fc entfernen, das strukturelle Eigenschaften oder die funktionelle Aktivität zur Verfügung stellt, die nicht von den Fusionsmolekülen dieser Erfindung benötigt werden. Man kann diese Stellen zum Beispiel durch Substituieren oder Deletieren von Resten entfernen, durch Einfügen von Resten in die Stelle oder durch Verkürzung von Teilen, die diese Stelle enthält. Die eingefügten oder substituierten Reste können auch veränderte Aminosäuren sein, wie zum Beispiel Peptidmimetika oder D-Aminosäuren. Fc-Varianten können für eine Reihe von Gründen wünschenswert sein, von denen einige unten beschrieben sind. Exemplarische Fc-Varianten beinhalten Moleküle und Sequenzen, in denen:

1. Die Stellen, die an der Bildung von Disulfidbindungen beteiligt sind, entfernt sind. Solches Entfernen kann eine Reaktion mit anderen Cystein-enthaltenden Proteinen vermeiden, die in der Wirtszelle anwesend sind die dazu verwendet wird, um die Moleküle der Erfindung herzustellen. Zu diesem Zweck kann das Cystein-enthaltende Segment an dem N-Terminus verkürzt werden oder Cysteinreste können deletiert oder mit anderen Aminosäuren (z. B. Alanyl, Seryl) substituiert werden. Insbesondere kann man das N-terminale 20-Aminosäuresegment der SEQ ID NO: 2 verkürzen oder deletieren oder die Cysteinreste an den Positionen 7 und 10 der SEQ ID NO: 2 substituieren. Selbst, wenn die Cysteinreste entfernt worden sind, können die Einzelketten Fc-Domänen immer noch eine dimere Fc-Domäne bilden, die nicht-kovalent zusammengehalten wird.
2. Ein natives Fc wird modifiziert, um es mit einer ausgewählten Wirtszelle verträglicher zu machen. Zum Beispiel kann man die PA-Sequenz in der Nähe des N-Terminus eines typischen nativen Fc entfernen, das von einem Verdauungsenzym in E. coli, wie zum Beispiel Proliniminopeptidase, erkannt werden kann. Man kann auch einen N-terminalen Methioninrest hinzufügen, besonders dann, wenn das Molekül rekombinant in einer bakteriellen Zelle, wie zum Beispiel E. coli, exprimiert wird. Die Fc-Domäne der SEQ ID NO: 2 ist eine solche Fc-Variante.
3. Ein Teil des N-Terminus eines nativen Fc wird entfernt, um die N-terminale Heterogenität zu verhindern, wenn es in einer ausgewählten Wirtszelle exprimiert wird. Zu diesem Zweck kann man jede der ersten 20 Aminosäurereste des N-Terminus deletieren, besonders diejenigen an den Positionen 1, 2, 3, 4 und 5.
4. Eine oder mehrere Glykosylierungsstellen werden entfernt. Reste, die typischerweise glykosyliert sind (z. B. Asparagin), können eine zytolytische Reaktion bewirken. Solche Reste können deletiert oder mit unglycosylierten Resten (z. B. Alanin) substituiert werden.
5. Stellen, die an einer Interaktion mit dem Komplement beteiligt sind, wie zum Beispiel die C1q-Bindungsstelle, werden entfernt. Zum Beispiel kann man die EKK-Sequenz des humanen IgG1 deletieren oder substituieren. Die Komplement-Rekrutierung könnte für die Moleküle dieser Erfindung nicht vorteilhaft sein und sollte daher mit solch einer Fc-Variante vermieden werden.
6. Stellen werden entfernt, die die Bindung an Fc-Rezeptoren anders als an einen Hilfsrezeptor beeinflussen. Ein natives Fc kann Stellen für Interaktion mit bestimmten weißen Blutkörperchen haben, die nicht für die Fusionsmoleküle der vorliegenden Erfindung erforderlich sind und deshalb entfernt werden können.
7. Die ADCC-Stelle wird entfernt. ADCC-Stellen sind dem Fachmann bekannt; siehe zum Beispiel Molec. Immunol. 29(5):633-9 (1992) in Bezug auf die ADCC-Stellen in IgG1. Auch diese Stellen sind nicht für die Fusionsmoleküle der vorliegenden Erfindung erforderlich und können deshalb entfernt werden.
8. Wenn der native Fc von einem nicht humanen Antikörper stammt, kann der native Fc humanisiert werden. Um normalerweise einen nativen Fc zu humanisieren, wird man ausgewählte Reste in dem nicht-humanen nativen Fc mit Resten, die normalerweise in humanem nativen Fc gefunden werden, substitieren. Techniken für die Antikörper-Humanisierung sind dem Fachmann bekannt.

Bevorzugte Fc-Varianten beinhalten die folgenden. In SEQ ID NO: 2 (3A und 3B) kann das Leucin an der Position 15 mit Glutamat substituiert werden. Das Glutamat an Position 99 mit Alanin; und die Lysine an den Positionen 101 und 103 mit Alaninen. Zusätzlich können ein oder mehrere Tyrosinreste durch Phenylalaninreste ersetzt werden.
Linker. Jede „Linker"-Gruppe ist fakultativ. Wenn anwesend, ist ihre chemische Struktur nicht kritisch, da sie in erster Linie als ein Abstandhalter dient. Der Linker ist vorzugsweise aus Aminosäuren, die durch Peptidbindungen verbunden sind. So ist in bevorzugten Ausführungsformen der Linker aus 1 bis 20 Aminosäuren, die durch Peptidbindungen verbunden sind, wobei die Aminosäuren aus 20 natürlich auftretenden Aminosäuren ausgewählt sind. Einige von diesen Aminosäuren können glycosyliert sein, was dem Fachmann gut bekannt ist. In einer bevorzugteren Ausführungsform sind die 1 bis 20 Aminosäuren ausgewählt aus Glycin, Alanin, Prolin, Asparagin, Glutamin und Lysin. Noch bevorzugter ist ein Linker aus einer Mehrheit von Aminosäuren, die sterisch ungehindert sind, so wie zum Beispiel Glycin und Alanin. Solche bevorzugten Linker sind Polyglycine (besonders (Gly)₄, (Gly)₅), Poly(Gly-Ala) und Polyalanine. Andere spezifische Beispiele von Linkern sind:
(Gly)₃Lys(Gly)₄ (SEQ ID NO: 3);
(Gly)₃AsnGlySer(Gly)₂ (SEQ ID NO: 4);
(Gly)₃Cys(Gly)₄ (SEQ ID NO: 5); und
GlyProAsnGlyGly (SEQ ID NO: 6).
Um die obige Nomenklatur zu erklären, bedeutet zum Beispiel (Gly)₃Lys(Gly)₄ Gly-Gly-Gly-Lys-Gly-Gly-Gly-Gly (SEQ ID NO: 3). Einzel-Aminosäure-Linker (z. B. -Ala- oder -Gly-) sind bevorzugte Linker, und Kombinationen von Gly und Ala sind auch bevorzugt. Die Linker, die hier gezeigt werden, sind exemplarisch; Linker innerhalb des Umfangs dieser Erfindung können viel länger sein und können andere Reste beinhalten.
Nicht-Peptidlinker sind auch möglich. Zum Beispiel könnten Alkyllinker, wie zum Beispiel -NH-(CH₂)_s-C(O)-, wobei s = 2-20, verwendet werden. Diese Alkyllinker können weiterhin durch jede nicht sterisch gehinderte Gruppe substituiert sein, wie zum Beispiel niedere Alkyle (z. B. C₁-C₆), niedere Acyle, Halogen (z. B. Cl, Br), CN, NH₂, Phenyl, etc. Ein beispielhafter Nicht-Peptidlinker ist ein PEG-Linker,
wobei n derart ist, daß der Linker ein Molekulargewicht von 100 bis 5.000 kD hat, vorzugsweise 100 bis 500 kD. Die Peptidlinker können verändert werden, um Derivate in der gleichen Art und Weise wie oben beschrieben, zu bilden.
Derivate. Die Erfinder ziehen auch in Erwägung, den Peptid- und/oder Vehikelanteil der Verbindungen zu derivatisieren. Solche Derivate können die Löslichkeit, Absorption, biologische Halbwertszeit und ähnliches der Verbindungen verbessern. Die Reste können alternativ jede unerwünschte Nebenwirkung der Verbindung und ähnliches eliminieren oder abschwächen. Exemplarische Derivate beinhalten Verbindungen in denen:

1. Die Verbindung oder ein Teil davon zyklisch ist. Zum Beispiel kann der Peptidanteil modifiziert werden, um zwei oder mehrere Cys-Reste (z. B. in dem Linker) zu enthalten, die durch Bildung von Disulfidbindung zyklisiert werden können.
2. Die Verbindung quervernetzt wird oder zum Quervernetzen zwischen Molekülen fähig gemacht wird. Zum Beispiel kann der Peptidanteil modifiziert werden, um einen Cys-Rest zu enthalten, und dadurch fähig zu sein, eine intermolekulare Disulfidbindung mit einem ähnlichen Molekül zu bilden. Die Verbindung kann auch durch ihren C-Terminus quervernetzt werden, wie in dem Beispiel unten gezeigt.
3. Eine oder mehrere Peptidyl [-C(O)NR-]-Verknüpfungen (Bindungen) durch eine Nicht-Peptidylverknüpfung ersetzt werden. Exemplarische Nicht-Peptidylverknüpfungen sind -CH₂-Carbamat [-CH₂-OC(O)NR-], Phosphonat, -CH₂-Sulfonamid [-CH₂-S(O)₂NR-], Harnstoff [-NHC(O)NH-], -CH₂-sekundäres Amin und alkyliertes Peptid [-C(O)NR⁶-, wobei R⁶ ein niederes Alkyl ist].
4. Der N-Terminus derivatisiert wird. Üblicherweise kann der N-Terminus acyliert oder durch ein substituiertes Amin modifiziert werden. Exemplarische N-terminale Derivatgruppen beinhalten -NRR¹ (anders als -NH₂), -NRC(O)R¹, -NRC(O)OR¹, -NRS(O)₂R¹, -NHC(O)NHR¹, Succinimid oder Benzyloxycarbonyl-NH-(CBZ-NH-), wobei R und R¹ jedesmal unabhängig Wasserstoff oder ein niederes Alkyl sind und wobei der Phenylring mit 1 bis 3 Substituenten substituiert sein kann, die ausgewählt sind aus der Gruppe, bestehend aus C₁-C₄-Alkyl, C₁-C₄-Alkoxy, Chlor und Brom.
5. Der freie C-Terminus deriviatisiert wird. Typischerweise wird der C-Terminus verestert oder amidiert. Exemplarische C-terminale Derivatgruppen beinhalten zum Beispiel -C(O)R², wobei R² ein niederes Alkoxy oder -NR³R⁴ ist, worin R³ und R⁴ unabhängig Wasserstoff oder C₁-C₈-Alkyl (vorzugsweise C₁-C₄-Alkyl) sind.
6. Eine Disulfidbindung mit einer anderen ersetzt wird, vorzugsweise ein stabilerer quervernetzter Rest (z. B. ein Alkylen). Siehe z. B. Bhatnagar et al. (1996), J. Med. Chem. 39:3814-9; Alberts et al. (1993) Thirteenth Am. Pep. Symp., 357-9.
7. Eine oder mehrere individuelle Aminosäurereste modifiziert werden. Verschiedene derivatisierende Wirkstoffe sind bekannt, daß sie spezifisch mit ausgewählten Seitenketten oder terminalen Resten reagieren, wie im Detail unten beschrieben wird.

Lysinylreste und aminoterminale Reste können mit Bernsteinsäure- oder anderen Carbonsäureanhydriden zur Reaktion gebracht werden, die die Ladung der Lysinylreste umkehren. Andere geeignete Reagenzien zum Derivatisieren von Alpha-Amino-enthaltenden Resten beinhalten Imidoester, wie zum Beispiel Methylpicolinimidat; Pyridoxalphosphat; Pyridoxal; Chlorborhydrid; Trinitrobenzolsulfonsäure; O-Methylisoharnstoff; 2,4-Pentandion und die Transaminase-katalysierte Reaktion mit Glyoxylat.
Arginylreste können durch Reaktion mit irgendeinem oder einer Kombination von verschiedenen konventionellen Reagenzien, einschließlich Phenylglyoxal, 2,3-Butandion, 1,2-Cyclohexandion und Ninhydrin modifiziert werden. Derivatisierung der Arginyl-Reste erfordert, daß die Reaktion unter alkalischen Bedingungen durchgeführt wird, wegen des hohen pKa der Guanidin-funktionalen Gruppe. Weiterhin können diese Reagenzien mit den Gruppen von Lysin sowie der Arginin-Epsilon-Aminogruppe reagieren.
Spezifische Modifikationen der Tyrosylreste sind ausführlich studiert worden, mit besonderem Interesse für die Einführung von Spektralmarkierungen in Tyrosylreste durch Reaktion mit aromatischen Diazonium-Verbindungen oder Tetranitromethan. Am üblichsten werden N-Acetylimidizol und Tetranitromethan verwendet, um O-Acetyltyrosylspezies bzw. 3-Nitro-Derivate zu bilden.
Carboxyl-Seitenkettengruppen (Aspartyl oder Glutamyl) können selektiv durch die Reaktion mit Carbodiimiden (R'-N=C=N-R'), wie zum Beispiel 1-Cyclohexyl-3-(2-morpholinyl)-(4-ethyl)-carbodiimid oder 1-Ethyl-3-(4-azonia-4,4-dimethylpentyl)-carbodiimid, modifiziert werden. Weiterhin können Aspartyl- und Glutamyl-Reste zu Asparaginyl- und Glutaminylresten durch Reaktion mit Ammoniumionen umgewandelt werden.
Glutaminyl und Asparaginylreste können zu den entsprechenden Glutamyl- und Aspartylresten deamidiert werden. Alternativ werden diese Reste unter mild sauren Bedingungen deamidiert. Jede Form dieser Reste fällt in den Umfang dieser Erfindung.
Cysteinylreste können durch Aminosäurereste oder andere Gruppen ersetzt werden, entweder um die Disulfidbindung zu eliminieren oder umgekehrt, um die Vernetzung zu stabilisieren. Siehe z. B. Bhatnagar et al. (1996), J. Med. Chem. 39:3814-9.
Die Derivatisierung mit bifunktionalen Wirkstoffen ist für die Vernetzung der Peptide oder ihrer funktionalen Derivate mit einer wasserunlöslichen Trägermatrix oder mit anderen makromolekularen Vehikeln nützlich. Gewöhnlich verwendete Quervernetzungswirkstoffe beinhalten z. B. 1,1-Bis(diazoacetyl)-2-phenylethan, Glutaraldehyd, N-Hydroxysuccinimidester, zum Beispiel Ester mit 4-Azidosalicylsäure, homobifunktionelle Imidoester, einschließlich Disuccinimidylester, wie zum Beispiel 3,3'-Dithiobis(succinimidylpropionat), und bifunktionelle Maleimide, wie zum Beispiel Bis-N-maleimid-1,8-octan. Derivatisierende Wirkstoffe, wie zum Beispiel Methyl-3-[(p-azidophenyl)dithio]propioimidat erzeugen photo-aktivierbare Intermediate, die fähig sind, Quervernetzungen in der Anwesenheit von Licht zu bilden. Alternativ werden reaktive wasserunlösliche Matrizen, wie zum Beispiel Cyanogenbromid-aktivierte Kohlenwasserstoffe und die reaktiven Substrate, die in den US-Patenten Nr. 3,969,287; 3,691,016; 4,195,128; 4,247,642; 4,229,537 und 4,330,440 beschrieben sind, für die Proteinimmobilisierung verwendet.
Kohlenhydrat (Oligosaccharid)-Gruppen können in geeigneter Weise an Stellen, die bekanntermaßen Glycosylierungsstellen in Proteinen sind, angehängt werden. Im allgemeinen werden O-verknüpfte Oligosaccharide an Serin (Ser) oder Threonin (Thr) Reste angehängt, während N-verknüpfte Oligosaccharide an Asparagin (Asn) Reste angehängt werden, wenn sie ein Teil der Sequenz Asn-X-Ser/Thr sind, wobei X jede Aminosäure sein kann mit Ausnahme von Prolin. X ist vorzugsweise eine der 19 natürlich vorkommenden Aminosäuren außer Prolin. Die Strukturen der N-verknüpften und O-verknüpften Oligosaccharide und die Zuckerreste, die in jedem Typ gefunden werden, sind unterschiedlich. Ein Zuckertyp, der gewöhnlicherweise in beiden gefunden wird, ist N-Acetylneuraminsäure (bezeichnet als Sialinsäure). Sialinsäure ist üblicherweise der terminale Rest von sowohl N-verknüpften als auch O-verknüpften Oligosacchariden und aufgrund ihrer negativen Ladung kann sie der glycosylierten Verbindung saure Eigenschaften verleihen. Solche Stelle(n) können in den Linker der Verbindungen dieser Erfindung inkorporiert werden und werden vorzugsweise durch eine Zelle während der rekombinanten Produktion der Polypeptidverbindungen (z. B. in Säugetierzellen, wie zum Beispiel CHO, BHK, COS), glycosyliert. Jedoch können diese Stellen weiterhin durch synthetische oder semi-synthetische Verfahren, die dem Fachmann bekannt sind, glycosyliert werden.
Andere mögliche Modifikationen beinhalten die Hydroxylierung von Prolin und Lysin, die Phosphorylierung von Hydroxylgruppen von Seryl- oder Threonylresten, die Oxidation des Schwefelatoms in Cys, die Methylierung der Alpha-Aminogruppen von Lysin-, Arginin- und Histidin-Seitenketten. Creighton, Proteins: Structure and Molecule Properties (W.H. Freeman & Co., San Francisco), S. 79-86 (1983).
Verbindungen der vorliegenden Erfindung können auch auf DNA-Ebene verändert werden. Die DNA-Sequenz von jedem Teil der Verbindung kann in Codons geändert werden, die mit der gewählten Wirtszelle verträglicher sind. Für E. coli, die die bevorzugte Wirtszelle ist, sind optimierte Codons dem Fachmann bekannt. Codons können substituiert werden, um Restriktionsstellen zu eliminieren, oder um stille Restriktionsstellen einzuführen, die beim Prozessieren der DNA in der ausgewählten Wirtszelle helfen können. Die Vehikel, Linker und Peptid-DNA-Sequenzen können modifiziert werden, um jede der vorher erwähnten Sequenzveränderungen einzufügen.
Methoden der Herstellung
Die Verbindungen dieser Erfindung können insgesamt in transformierten Wirtszellen unter Verwendung rekombinanter DNA-Techniken hergestellt werden. Um das zu machen, wird ein rekombinantes DNA-Molekül, das für das Peptid kodiert, hergestellt. Verfahren zum Herstellen solcher DNA-Moleküle sind dem Fachmann bekannt. Zum Beispiel können Sequenzen, die für die Peptide kodieren, von der DNA unter Verwendung geeigneter Restriktionsenzyme ausgeschnitten werden. Alternativ kann das DNA-Molekül unter Verwendung chemischer Synthesetechniken, wie zum Beispiel der Phosphoramidatmethode, synthetisiert werden. Auch eine Kombination dieser Techniken kann verwendet werden.
Die Erfindung beinhaltet auch eine Vektor, der fähig ist, Peptide in einem geeigneten Wirt zu exprimieren. Der Vektor umfaßt das DNA-Molekül, das für die Peptide kodiert, die operativ an geeignete Expressionskontrollsequenzen verknüpft sind. Verfahren zum Durchführen dieser operativen Verknüpfung, entweder bevor oder nachdem das DNA-Molekül in den Vektor inseriert ist, sind dem Fachmann bekannt. Expressionskontrollsequenzen beinhalten Promotoren, Activatoren, Enhancer, Operatoren, ribosomale Bindungsstellen, Startsignale, Stoppsignale, Cap-Signale, Polyadenylierungssignale und andere Signale, die an der Kontrolle der Transkription oder Translation beteiligt sind.
Der resultierende Vektor, der das DNA-Molekül beinhaltet, wird zur Transformation eines geeigneten Wirtes verwendet. Diese Transformation kann unter Verwendung von Verfahren, die dem Fachmann bekannt sind, durchgeführt werden.
Jede der großen Anzahl von erhältlichen und gut bekannten Wirtszellen kann bei der Ausübung dieser Erfindung verwendet werden. Die Auswahl eines geeigneten Wirts ist abhängig von einer Anzahl von Faktoren, die von dem Fachmann verstanden sind. Diese beinhalten zum Beispiel die Kompatibilität mit dem gewählten Expressionsvektor, die Toxizität der Peptide, die durch das DNA-Molekül kodiert sind, die Transformationsrate, die Leichtigkeit der Gewinnung der Peptide, die Expressionscharakteristika, die Biosicherheit und die Kosten. Ein Gleichgewicht dieser Faktoren muß von dem Verständnis geleitet sein, daß nicht alle Wirte gleich effektiv für die Expression einer bestimmten DNA-Sequenz sind. Innerhalb dieser allgemeinen Richtlinien beinhalten nützliche mikrobielle Wirte Bakterien (wie zum Beispiel E. coli sp.), Hefe (wie zum Beispiel Saccaromyces sp.) und andere Pilze, Insekten-, Pflanzen-, Säuger- (einschließliche menschliche) Zellen in Kultur oder andere, dem Fachmann bekannte Wirte.
Danach wird der transformierte Wirt kultiviert und aufgereinigt. Wirtszellen können unter herkömmlichen Fermentationsbedingungen kultivier werden, so daß die erwünschten Verbindungen exprimiert werden. Solche Fermentationsbedingungen sind dem Fachmann gut bekannt. Schließlich werden die Peptide aus der Kultur durch Methoden, die dem Fachmann bekannt sind, aufgereinigt.
Die Verbindungen können auch durch synthetische Verfahren hergestellt werden. Zum Beispiel können Festphasesynthesetechniken verwendet werden. Geeignete Techniken sind dem Fachmann gut bekannt und beinhalten diejenigen, die in Merrifield (1973), Chem. Polypeptides, S. 335-61 (Katsoyannis und Panayotis Hrsg.); Merrifield (1963), 1. Am. Chem. Soc. 85:2149; Davis et al. (1985), Biochem. Intl. 10:394-414; Stewart und Young (1969), Solid Phase Peptide Synthesis; US-Pat. Nr. 3,941,763; Finn et al. (1976), The Proteins (3. Aufl.) 2:105-253; und Erickson et al. (1976), The Proteins (3. Aufl.) 2:257-527 beschrieben werden. Die Festphasesynthese ist die bevorzugte Technik zur Herstellung individueller Peptide, da sie das kosteneffektivste Verfahren zum Herstellen kleiner Peptide ist.
Verbindungen, die derivatisierte Peptide enthalten oder die Nicht-Peptidgruppen enthalten, können durch gut bekannte organische-chemische Techniken synthetisiert werden.
Verwendungen der Verbindungen
Die Verbindungen dieser Erfindung haben eine pharmakologische Aktivität, die aus ihrer Apo-AI-amphipathischen Helixpeptid-Mimetika-Aktivität resultiert.
Agonisten oder Mimetika des Apo-AI-amphipathischen Helixpeptids sind nützlich bei der Behandlung von:

• Hypercholesterinämie
• viraler Infektion, insbesondere HSV- und HIV-Infektion;

Pharmazeutische Zusammensetzungen
Im Allgemeinen. Die vorliegende Erfindung stellt auch Verfahren zur Verwendung pharmazeutischer Zusammensetzungen der erfinderischen Verbindungen zur Verfügung. Solche pharmazeutischen Zusammensetzungen können für die Anwendung für Injektion oder für orale, pulmonale, nasale, transdermale oder andere Formen der Anwendung verwendet werden. Im allgemeinen umfaßt die Erfindung pharmazeutische Zusammensetzungen, die effektive Mengen einer Verbindung der Erfindung umfassen, zusammen mit pharmazeutisch akzeptablen Verdünnungsmitteln, Konservierungsmitteln, Lösungshilfsmitteln, Emulgatoren, Hilfsstoffen und/oder Trägern. Solche Zusammensetzungen beinhalten Verdünnungsmittel mit unterschiedlichem Puffergehalt (z. B. Tris-HCl, Acetat, Phosphat), pH und Ionenstärke; Zusatzstoffe, wie zum Beispiel Detergenzien und löslich machende Wirkstoffe (z. B. Tween 80, Polysorbat 80), Antioxidantien (z. B. Ascorbinsäure, Natriummetabisulfit), Konservierungsmittel (z. B. Thimersol, Benzylalkohol) und Füllmittel (z. B. Laktose, Mannitol); Aufnahme des Materials in partikuläre Zubereitungen von polymeren Verbindungen, wie zum Beispiel Polymilchsäure, Polyglycolsäure, usw. oder in Liposomen. Hyaluronsäure kann auch verwendet werden, und dies kann den Effekt einer verlängerten Verweildauer im Kreislauf haben. Solche Zusammensetzungen können den physikalischen Zustand, die Stabilität, die Freisetzungsrate in vivo und die Clearance-Rate in vivo der anwesenden Proteine und Derivate beeinflussen. Siehe z. B. Reinington's Pharmaceutical Sciences, 18. Aufl. (1990, Mack Publishing Co., Easton, PA 18042), Seiten 1435-1712. Die Zusammensetzungen können in flüssiger Form hergestellt werden oder können als trockenes Pulver, wie zum Beispiel in lyophilisierter Form vorliegen. Implantierbare Formulierungen zur verzögerten Freisetzung werden auch in Erwägung gezogen, ebenso wie transdermale Formulierungen.
Orale Dosierungsformen. Für die Verwendung in Erwägung gezogen werden orale feste Dosierungsformen, die in Kapitel 89 von Remington's Pharmaceutical Sciences, (1990), 18. Aufl., Mack Publishing Co., Easton, PA 18042 im allgemeinen beschrieben sind. Feste Dosierungsformen beinhalten Tabletten, Kapseln, Pillen, Pastillen oder Bonbons, Verkapselungen oder Pellets. Auch liposomale oder proteinoide Verkapselung kann verwendet werden, um die vorliegenden Zusammensetzungen zu formulieren (wie zum Beispiel proteinoide Mikrosphären, über die in dem US-Patent Nr. 4,925,673 berichtet wird). Liposomale Verkapselung kann verwendet werden, und die Liposomen können mit verschiedenen Polymeren derivatisiert werden (z. B. US-Patent Nr. 5,013,556). Eine Beschreibung der möglichen festen Dosierungsformen für das Therapeutikum ist in Kapitel 10 von Marshall, K. Modern Pharmaceutics (1979), herausgegeben von G. S. Banker und C. T. Rhodes, gegeben. Im allgemeinen wird die Formulierung die erfinderische Verbindung und inerte Ingredienzen beinhalten, die für den Schutz gegen das Magenumfeld und für die Freisetzung des biologisch aktiven Materials in dem Darm sorgen.
Auch besonders in Erwägung gezogen werden orale Dosierungsformen der obigen erfinderischen Verbindungen. Wenn notwendig, können die Verbindungen chemisch modifiziert werden, so daß eine orale Abgabe wirksam ist. Im allgemeinen ist die in Erwägung gezogene chemische Modifikation das Verknüpfen von mindestens einer Gruppe an das Verbindungsmolekül selbst, wobei die besagte Gruppe (a) die Inhibition der Proteolyse und (b) die Aufnahme in den Blutstrom vom Magen oder vom Darm erlaubt. Auch erwünscht ist die Zunahme in der allgemeinen Stabilität der Verbindung und die Zunahme der Zirkulationszeit im Körper. Gruppen, die als kovalent verknüpfte Vehikel in dieser Erfindung nützlich sind, können auch für diesen Zweck verwendet werden. Beispiele für solche Gruppen sind: PEG, Copolymere von Ethylenglycol und Propylenglycol, Carboxymethylcellulose, Dextran, Polyvinylalkohol, Polyvinylpyrrolidin und Polyprolin. Siehe zum Beispiel Abuchowski und Davis, Soluble Polymer-Enzyme Adducts, Enzymes as Drugs (1981), Hocenberg und Roberts, Hrsg., Wiley-Interscience, New York, NY, S. 367-83; Newmark, et al. (1982), J. Appl. Biochem. 4:185-9. Andere Polymere, die verwendet werden können, sind Poly-1,3-Dioxolan und Poly-1,3,6-Tioxocan. Bevorzugt für die pharmazeutische Verwendung sind, wie oben angezeigt, PEG-Reste.
Für die oralen Abgabe ist es auch möglich, ein Salz einer modifizierten aliphatischen Aminosäure zu verwenden, wie zum Beispiel Natrium-N-(8-[2-Hydroxybenzoyl]amino)caprylat (SNAC), als einen Träger, um die Absorption der therapeutischen Verbindungen dieser Erfindung zu verstärken. Die klinische Wirksamkeit einer Heparinformulierung unter Verwendung von SNAC wurde in einer Phase II Studie gezeigt, die von Emisphere Technologies durchgeführt wurde. Siehe US-Patent Nr. 5,792,451, „Oral drug delivery composition and methods".
Die Verbindungen dieser Erfindung können in die Formulierung als feine Multipartikel in Form von Granulaten oder Pellets mit einer Partikelgröße von etwa 1 mm eingefügt werden. Die Formulierung des Materials für die Kapselabreichung könnte auch als ein Pulver, leicht zusammengedrückte Stopfen oder sogar Tabletten erfolgen. Das Therapeutikum könnte durch Komprimierung hergestellt werden.
Farbstoffe und Aromastoffe können alle miteinbezogen sein. Zum Beispiel kann das Protein (oder Derivat) formuliert sein (wie zum Beispiel durch Liposomen- oder Mikrosphärenverkapselung) und dann weiterhin innerhalb eines eßbaren Produktes enthalten sein, wie zum Beispiel in einem gekühlten Getränk, das Farbstoffe und Aromastoffe enthält.
Man kann das Volumen der Verbindung der Erfindung mit einem inerten Material verdünnen oder erhöhen. Diese Verdünnungsmittel können Kohlenhydrate, insbesondere Mannitol, α-Lactose, wasserfreie Lactose, Cellulose, Saccharose, modifizierte Dextrane und Stärke enthalten. Gewisse anorganische Salze können auch als Füllmittel verwendet werden, einschließlich Calciumtriphosphat, Magnesiumcarbonat und Natriumchlorid. Einige kommerziell erhältliche Verdünnungsmittel sind Fast-Flo, Emdex, STA-Rx 1500, Emcompress und Avicell.
Zersetzungsmittel können in der Formulierung des Therapeutikums in eine feste Dosierungsform miteingeschlossen werden. Materialien, die als Zersetzungsmittel verwendet werden, beinhalten, sind aber nicht begrenzt auf, Stärke, einschließlich des kommerziellen Zersetzungsmittels das auf Stärke basiert, Explotab. Natriumstärkeglycolat, Amberlit, Natriumcarboxymethylcellulose, Ultramylopectin, Natriumalginat, Gelatine, Orangenschale, saure Carboxylmethylcellulose, natürliche Schwämme und Bentonit können alle verwendet werden. Eine andere Form der Zersetzungsmittel sind die unlöslichen kationischen Austauschharze. Pulverisierte Gummis können auch als Zersetzungsmittel verwendet werden und als Bindemittel, und diese können pulverisierte Gummis beinhalten, wie zum Beispiel Agar, Karaya oder Traganth. Algensäure und sein Natriumsalz können auch als Zersetzungsmittel verwendet werden.
Bindemittel können verwendet werden, um den therapeutischen Wirkstoff zusammenzuhalten, um eine harte Tablette zu bilden und beinhalten Materialien von natürlichen Produkten, wie zum Beispiel Akazie, Traganth, Stärke und Gelatine. Andere beinhalten Methylcellulose (MC), Ethylcellulose (EC) und Carboxymethylcellulose (CMC). Polyvinylpyrrolidon (PVP) und Hydroxypropylmethylcellulose (HPMC) könnten beide in alkoholischen Lösungen verwendet werden, um das Therapeutikum zu granulieren.
Ein Anti-Reibungsmittel kann in die Formulierung des Therapeutikums miteinbezogen werden, um das Anhaften während des Formulierungsprozesses zu verhindern. Gleitmittel können auch als eine Schicht zwischen dem Therapeutikum und der Wand der Hohlform verwendet werden, und diese können beinhalten, sind aber nicht beschränkt auf Stearinsäure, einschließlich seiner Magnesium- und Calciumsalze, Polytetrafluorethylen (PTFE), flüssiges Paraffin, pflanzliche Öle und Wachse. Lösliche Gleitmittel können auch verwendet werden, wie zum Beispiel Natriumlaurylsulfat, Magnesiumlaurylsulfat, Polyethylenglycol der verschiedenen Molekulargewichte, Carbowax 4000 und 6000.
Gleitstoffe, die die Fließeigenschaften des Wirkstoffes während der Formulierung verbessern und die Umlagerung während der Komprimierung unterstützen, können hinzugefügt werden. Die Gleitstoffe können Stärke, Talg, pyrogenes Siliciumoxid und hydrierte Siliciumaluminate beinhalten.
Um die Auflösung der Verbindung dieser Erfindung in die wäßrige Umgebung zu unterstützen, könnte ein Tensid als ein Benetzungsmittel hinzugefügt werden. Tenside können anionische Detergenzien beinhalten, wie zum Beispiel Natriumlaurylsulfat, Dioctylnatriumsulfosuccinat und Dioctylnatriumsulfonat. Kationische Detergenzien könnten verwendet werden und könnten Benzalkoniumchlorid oder Benzethoniumchlorid beinhalten. Die Liste von potentiellen, nicht-ionischen Detergenzien, die in die Formulierung als Tenside aufgenommen werden können, sind Lauromacrogol 400, Polyoxyl 40 Stearat, Polyoxyethylenhydriertes Rizinusöl 10, 50 und 60, Glycerinmonostearat, Polysorbat 40, 60, 65 und 80, Saccharosefettsäureester, Methylcellulose und Carboxymethylcellulose. Diese Tenside können in der Formulierung des Proteines oder Derivates entweder alleine oder als ein Gemisch in verschiedenen Verhältnissen anwesend sein.
Zusatzstoffe können auch in der Formulierung beinhaltet sein, um die Aufnahme der Verbindung zu verstärken. Zusatzstoffe, die möglicherweise diese Eigenschaft haben, sind zum Beispiel die Fettsäuren Ölsäure, Linolsäure und Linolensäure.
Eine kontrollierte Freisetzungsformulierung kann wünschenswert sein. Die Verbindung dieser Erfindung könnte in eine inerte Matrix aufgenommen werden, die die Freisetzung durch Diffusion oder durch Sickermechanismen ("leaching mechanisms"), z. B. durch Gummis, erlaubt. Langsam degenerierende Matrizen können auch in die Formulierung aufgenommen werden, z. B. Alginate, Polysaccharide. Eine andere Form der kontrollierten Freisetzung der Verbindungen dieser Erfindung ist mit Hilfe eines Verfahrens, das auf dem Orostherapeutischen System (Alza Corp.) basiert, d. h. der Wirkstoff wird in eine semi-permeable Membran eingeschlossen, die erlaubt, daß Wasser eintritt und den Wirkstoff durch eine kleine schmale Öffnung aufgrund osmotischer Effekte herausdrückt. Einige enterische Beschichtungen haben auch einen verzögerten Freisetzungseffekt.
Andere Beschichtungen können für die Formulierung verwendet werden. Diese beinhalten eine Anzahl von Zuckern, die in einem Beschichtungstiegel appliziert werden können. Der therapeutische Wirkstoff könnte auch in einer Film-beschichteten Tablette gegeben werden, und die Materialien, die in diesem Fall verwendet werden, sind in zwei Gruppen geteilt. Die erste sind die nicht-entertichen Materialien und beinhalten Methylcellulose, Ethylcellulose, Hydroxyethylcellulose, Methylhydroxyethylcellulose, Hydroxypropylcellulose, Hydroxypropylmethylcellulose, Natriumcarboxymethylcellulose, Providon und die Polyethylenglycole. Die zweite Gruppe besteht aus den enterischen Materialien, die gewöhnlich Ester der Phthalsäure sind.
Ein Gemisch von Materialien kann verwendet werden, um die optimale Filmbeschichtung zu erreichen. Die Filmbeschichtung kann in einem Tiegelbeschichter oder in einem Flüssigkeit oder durch Komprimierungsbeschichtung durchgeführt werden.
Pulmonale Darreichungsformen. Hier wird auch die pulmonale Darreichung des vorliegenden Proteins (oder der Derivate davon) in Erwägung gezogen. Das Protein (oder Derivat) wird an die Lungen eines Säugers während des Inhalierens abgegeben durchläuft durch die lungenepitheliale Schleimhaut in den Blutstrom. (Andere Berichte hierüber beinhalten Adjei et al., Pharma. Res. (1990) 7:565-9; Adjei et al., (1990), Internatl. J. Pharmaceutics 63:135-44 (Leuprolidacetat); Braquet et al. (1989). J. Cardiovasc. Pharmacol. 13 (Suppl. 5): S. 143-146 (Endothelin-1); Hubbard et al. (1989), Annals Int. Med. 3:206-12 (α1-Antitrypsin); Smith et al. (1989), J. Clin. Invest. 84:1145-6 (α1-Proteinase); Oswein et al. (März 1990), „Aerosolization of Proteins", Proc. Symp. Resp. Drug Delivery II, Keystone, Colorado (rekombinantes menschliches Wachstumshormon); Debs et al. (1988), J. Immunol 140:3482-8 (Interferon-γ und Tumornekrosefaktor α) und Platz et al., US-Patent Nr. 5,284,656 (Granulocytenkolonie-stimulierender Faktor).
Für die Verwendung bei der Ausübung dieser Erfindung wird ein weiter Bereich von mechanischen Vorrichtungen in Erwägung gezogen, die für die pulmonale Abgabe der therapeutischen Produkte entworfen wurden, einschließlich, aber nicht beschränkt auf Zerstäuber, Inhalatoren mit angemessener Dosis und Pulver-Inhalatoren, die alle dem Fachmann bekannt sind. Einige spezielle Beispiele von kommerziell erhältlichen Vorrichtungen, geeignet für die Ausübung dieser Erfindung, sind der Ultravent-Zerstäuber, hergestellt von Mallinckrodt, Inc. St. Louis, Missouri; der Acorn II Zerstäuber, hergestellt von Marquest Medical Products, Englewood, Colorado; der Ventolin-Inhalator mit angemessener Dosis, hergestellt von Glaxo Inc. Research Triangle Park, North Carolina und der Spinhaler Pulverinhalator, hergestellt von Fisons Corp. Bedford, Massachusetts.
Alle diese Vorrichtungen erfordern die Verwendung von Formulierungen, die für das Verabreichen der erfinderischen Verbindung geeignet sind. Typischerweise ist jede Formulierung für den Typ der verwendeten Vorrichtung spezifisch und kann die Verwendung eines geeigneten Treibmaterials beinhalten, zusätzlich zu den Verdünnungsmitteln, Hilfsstoffen und/oder bei der Therapie nützlichen Trägern.
Die erfinderische Verbindung sollte am vorteilhaftesten in Partikelform hergestellt werden, mit einer durchschnittlichen Partikelgröße von weniger als 10 μm (oder Mikrons), am bevorzugtesten 0,5 bis 5 μm, für die effektivste Darreichung zur distalen Lunge.
Pharmazeutisch akzeptable Träger beinhalten Kohlenstoffe, wie zum Beispiel Trehalose, Mannitol, Xylitol, Saccharose, Lactose und Sorbitol. Andere Inhaltsstoffe zur Verwendung in den Formulierungen können DPPC, DOPE, DSPC und DOPC beinhalten. Natürliche oder synthetische Tenside können verwendet werden. PEG kann verwendet werden (sogar getrennt von seiner Verwendung beim Derivatisieren des Proteins oder Analogs). Dextrane, wie zum Beispiel Cyclodextran, können verwendet werden. Gallensalze und andere verwandte Verstärker können verwendet werden. Cellulose und Cellulosederivate können verwendet werden. Aminosäuren können verwendet werden, wie zum Beispiel für die Verwendung in einer Pufferformulierung.
Auch die Verwendung von Liposomen, Mikrokapseln oder Mikrosphären, Einschlußkomplexe oder andere Typen von Trägern wird in Erwägung gezogen.
Formulierungen, die für die Verwendung mit einem Zerstäuber, entweder Düse oder Ultraschall, geeignet sind, werden üblicherweise die erfinderische Verbindung umfassen, die in Wasser bei einer Konzentration von ungefähr 0,1 bis 25 mg des biologisch aktiven Proteins pro ml der Lösung aufgelöst ist. Die Formulierung kann auch einen Puffer beinhalten und einen einfachen Zucker (z. B. für die Proteinstabilisierung und die Regulation des osmotischen Druckes). Die Zerstäuberformulierung kann auch ein Tensid enthalten, um die Oberflächen-induzierte Aggregation des Proteins, das durch die Atomisierung der Lösung bei der Aerosolbildung verursacht wird, zu reduzieren oder zu verhindern.
Formulierungen für die Verwendung mit einer Inhalatorvorrichtung mit angemessener Dosis werden im allgemeinen ein fein verteiltes Pulver umfassen, das die erfinderische Verbindung enthält, suspendiert in einem Treibmittel mit der Unterstützung eines Tensides. Das Treibmittel kann jedes konventionelles Material sein, das für diese Zwecke verwendet wird, wie zum Beispiel Chlorfluorkohlenstoff, ein Hydrochlorfluorkohlenstoff, ein Hydrofluorkohlenstoff oder ein Kohlenwasserstoff, einschließlich Trichlorfluormethan, Dichlordifluormethan, Dichlortetrafluorethanol und 1,1,1,2-Tetrafluorethan oder Kombinationen davon. Geeignete Tenside beinhalten Sorbitantrioleat und Sojalecithin. Ölsäure kann auch als ein Tensid nützlich sein.
Formulierungen zur Abgabe aus einer Pulverinhalatorvorrichtung werden ein fein verteiltes trockenes Pulver umfassen, das die erfinderische Verbindung enthält, und es kann auch ein Füllmittel enthalten, wie zum Beispiel Lactose, Sorbitol, Saccharose, Mannitol, Trehalose oder Xylitol in Mengen, die die Verteilung des Pulvers von der Vorrichtung erleichtern, z. B. 50 zu 90 Gew.% der Formulierung.
Nasale Darreichungsformen. Die nasale Verabreichung der erfinderischen Verbindung wird auch in Erwägung gezogen. Die nasale Darreichung erlaubt die Passage des Proteins in den Blutstrom direkt nach Verabreichung des therapeutischen Produkts in die Nase, ohne die Notwendigkeit der Ablagerung des Produktes in der Lunge. Formulierungen für nasale Verabreichung beinhalten diese mit Dextran oder Cyclodextran. Verabreichung via Transport quer durch die Schleimhäute wird auch in Erwägung gezogen.
Dosierungen. Das Dosierungsschema, das in einem Verfahren zur Behandlung der oben beschriebenen Zustände beinhaltet ist, wird durch den anwesenden Arzt bestimmt werden, unter Beachtung verschiedener Faktoren, die die Wirkung der Wirkstoffe modifizieren, z. B. das Alter, die Kondition, das Körpergewicht, Geschlecht und die Ernährung des Patienten, die Schwere jeglicher Infektion, die Zeit der Verabreichung und andere klinische Faktoren. Im allgemeinen sollte das tägliche Schema in dem Bereich von 0,1-1.000 mg der erfinderischen Verbindung pro Kilogramm Körpergewicht sein, vorzugsweise 0,1-150 mg pro Kilogramm.
Speziell bevorzugte Ausführungsformen
Die Erfinder haben bevorzugte Strukturen für die bevorzugten Peptide bestimmt, die in Tabelle 2 unten aufgelistet sind. Das Symbol „A" kann jeder der hier beschriebenen Linker sein oder kann einfach eine normale Peptidbindung repräsentieren (d. h. so daß kein Linker anwesend ist). Tandemwiederholungen und Linker sind zur Klarheit separat durch Gedankenstriche gezeigt.
Tabelle 2 – bevorzugte Ausführungsformen
„F¹" ist eine Fc-Domäne, wie sie vorher hier definiert wurde. Zusätzlich zu diesen, die in der Tabelle 2 aufgelistet sind, ziehen die Erfinder weiterhin Heterodimere in Erwägung, bei denen jeder Strang eines Fc-Dimers mit einer unterschiedlichen Peptidsequenz verknüpft ist; zum Beispiel, wobei jedes Fc mit einer unterschiedlichen Sequenz, ausgewählt von Tabelle 1, verknüpft ist.
Alle Verbindungen dieser Erfindung können durch Verfahren, die in der PCT-Anmeldung Nr. WO 99/25044 beschreiben sind, hergestellt werden.

Claims

Stoffzusammensetzung der Formel (A1)a-F1-(A2)b und Multimere davon, wobei: F¹ eine Fc-Domäne ist; A¹ und A² jeweils unabhängig ausgewählt sind von -(L¹)_c-P¹, -(L¹)_c-P¹-(L²)_d-P², -(L¹)_c-P¹-(L²)_d-P²-(L³)_eP³ und -(L¹)_c-P¹-(L²)_d-P²-(L³)_c-P³-(L⁴)_f-P⁴; P¹, P², P³ und P⁴ jede unabhängig voneinander Sequenzen des amphipathischen Helixpeptids von Apolipoprotein AI (Apo-AI) oder der Apo-AI amphipathischen Helixpeptid-mimetischen Domänen sind; L¹, L², L³ und L⁴ jede unabhängige Linker sind; und a, b, c, d, e und f jede unabhängig 0 oder 1 sind, vorausgesetzt, dass mindestens eines von a und b 1 ist.
Stoffzusammensetzung nach Anspruch 1 der Formeln A1-F1 oder F1-A2.
Stoffzusammensetzung nach Anspruch 1 der Formel F1-(L1)c-P1.
Stoffzusammensetzung nach Anspruch 1 der Formel F1-(L2)c-P1-(L2)d-P2.
Stoffzusammensetzung nach Anspruch 1, wobei F¹ eine IgG Fc-Domäne ist.
Stoffzusammensetzung nach Anspruch 1, wobei F¹ eine IgG1 Fc-Domäne ist.
Stoffzusammensetzung nach Anspruch 1, wobei F¹ die Sequenz von SEQ ID NO: 2 umfaßt.
Stoffzusammensetzung nach Anspruch 1, wobei das Apo-AI amphipathische Helixpeptid oder die Apo-AI amphipathische Helixpeptid-minetische Domänensequenz die Formel Asp-Tryp-Leu-Lys-Ala-Phe-Tyr-Asp-Lys-Val-Ala-Glu-Lys-Leu-Lys-Glu-Ala-Phe (SEQ ID NO: 7) aufweist.
Stoffzusammensetzung nach Anspruch 8, wobei F¹ eine IgG Fc-Domäne ist.
Stoffzusammensetzung nach Anspruch 9, wobei F¹ eine IgG1 Fc-Domäne ist.
Stoffzusammensetzung nach Anspruch 1, die eine Sequenz, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NOs: 8, 9, 10 und 11 aufweist.