DE60109948T2

DE60109948T2 - Ein streptomyces-stamm zur bekämpfung von pflanzenkrankheiten

Info

Publication number: DE60109948T2
Application number: DE60109948T
Authority: DE
Inventors: Lori Jo Lehman; Caiyao Yuan; Jimmy Encio Orjala; Randy Jay Mccoy; Denise Carol Manker; Pamela Gail Marrone; Jorge Isaac Jimenez Santamaria
Original assignee: AgraQuest Inc
Current assignee: AgraQuest Inc
Priority date: 2000-09-27
Filing date: 2001-09-27
Publication date: 2006-02-02
Anticipated expiration: 2021-09-28
Also published as: EP1322170B1; JP5148802B2; DE60109948D1; US6524577B1; ATE292385T1; KR20030034222A; AU9485401A; WO2002026041A2; US6852317B2; CR6933A; IL155087A0; WO2002026041A9; AU2001294854B2; WO2002026041A3; JP2004512834A; BR122013013171B1; NZ525481A; BR0114192B1; EP1322170A2; US20030031741A1

Description

Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung liegt auf dem Gebiet der Biopestizide.
Hintergrund der Erfindung
Seit einer Anzahl von Jahren ist bekannt, dass verschiedene Mikroorganismen biologische Aktivität zeigen, so dass sie zur Kontrolle von Pflanzenkrankheiten brauchbar sind. Obwohl auf dem Gebiet der Identifizierung und Entwicklung biologischer Pestizide zur Kontrolle verschiedener Pflanzenkrankheiten von ackerbaulicher und gartenbaulicher Wichtigkeit Fortschritte gemacht wurden, sind die meisten der in Gebrauch befindlichen Pestizide noch synthetische Verbindungen. Viele dieser chemischen Fungizide wurden durch die Umweltschutzbehörde als karzinogen eingestuft und sind für wildlebende Tiere und Pflanzen und andere Nicht-Zielspezies toxisch. Außerdem können Pathogene Resistenzen gegen chemische Pestizide entwickeln (Schwinn et al., 1991).
Biologische Kontrolle bietet eine attraktive Alternative zu synthetischen chemischen Fungiziden. Biopestizide (lebende Organismen und die natürlicherweise von diesen Organismen erzeugten Verbindungen) können sicherer, biologisch abbaubarer und weniger kostspielig zu entwickeln sein.
Die Actinomyceten, einschließlich der Streptomyceten, sind bekannte Erzeuger antimykotischer Metaboliten (Lechavalier und Waksman, 1962; Lechavalier, 1988). Mehrere von Actinomyceten erzeugte Antibiotika werden routinemäßig im landwirtschaftlichen Rahmen verwendet, wie Streptomycin und Terramycin zur Feuerbrandkontrolle.
Streptomyceten haben sowohl in vitro als auch in vivo Aktivität gegen Pflanzenpathogene gezeigt. Axelrood et al. (1966) isolierte 298 Actinomyceten aus Douglas-Tannenwurzeln. Näherungsweise 30% dieser Stämme zeigten in vitro antimykotische Aktivität gegen Fusarium, Cylindrocarpon und/oder Pythium. Yuan und Crawford (1995) berichteten, dass Streptomyces lydicus WYEC108 sowohl starke antimykotische Aktivität in vitro als auch Hemmung von Pythium-Wurzelfäule in Topftests mit Erbsen- oder Baumwollsaat zeigte. Reddi und Rao (1971) kontrollierten Pythium-Umfallkrankheit bei Tomaten und Fusarium-Welke von Baumwolle mit Streptomyces ambofaciens. Rhizoctonia-Wurzelfäule wurde durch Streptomyces hygroscopicus var. geldanus kontrolliert (Rothrock und Gottlieb, 1984). Diese Autoren berichteten, dass die Kontrolle von der von diesem Stamm in sito erzeugten Geldanamycin-Konzentration abhängig war. Diesselben Autoren sahen auch einen Schutz von Sojabohnen vor Phytophthora megasperma var. sojae durch Streptomyces herbaricolor und Streptomyces coeruleofuscus (1984). Chamberlain und Crawford (1999) sahen in vitro und in vivo Antagonismus von Pilzpathogenen von Turfgras durch den Stamm S. hygroscopicus YCED9). Crawford (1996) patentierte die Verwendung dieses Stamms zur Kontrolle von Pflanzenpathogenen in dem US-Patent 5 527 526. Suh (1998) patentierte 2 Streptomyces sp., die gegen Rhizoctonia solani und Phytophthora capsici aktiv waren. Ein Streptomyces griseoviridis-Produkt gegen Fusarium spp. und andere Bodenpathogene ist als Mycostop^TM auf dem Markt.
EP-A-0 408 811 beschreibt einen Stamm von S. griseoviridis, der ein Heptaen-Antibiotikum erzeugt, das gegen Pflanzen-Pilzpathogene brauchbar ist.
WO 96/29874 beschreibt die Verwendung der Sporen oder des Kulturmediums von zwei Stämmen von S. mashuensis zur Kontrolle von Pilzpathogenen.
Zusammenfassung der Erfindung
Es wird eine neue, Antibiotikum erzeugende Streptomyces sp. bereitgestellt, die nur für bestimmte spezifische Pflanzenpathogene antimykotische Aktivität zeigt. Ebenfalls bereitgestellt wird ein Verfahren zur Behandlung oder zum Schützen von Pflanzen vor Pilzinfektionen, aufweisend das Aufbringen einer wirksamen Menge einer Antibiotikum erzeugenden Streptomyces sp. mit allen Identifizierungskennzeichen der NRRL-Zugangsnummer B-30145. Die Erfindung betrifft auch fungizide Zusammensetzungen, aufweisend diesen neuen Streptomyces-Stamm und die von diesem Stamm erzeugten Antibiotika und Metaboliten, entweder alleine oder in Kombination mit anderen chemischen und biologischen Pestiziden.
Die Antibiotikum erzeugende Streptomyces sp. kann als eine Suspension in einer Voll-Bouillonkultur oder als ein Antibiotikum enthaltender Überstand, der von einer Voll-Bouillonkultur einer Antibiotikum erzeugenden Streptomyces sp. erhalten wurde, bereitgestellt werden. Ebenfalls bereitgestellt wird ein neues Butanol-lösliches Antibiotikum, das spezifische antimykotische Aktivität zeigt, und ein Verfahren zur Isolierung des neuen Butanol-löslichen Antibiotikums.
Kurze Beschreibung der Figuren
1A ist das analytische HPLC-Chromatogramm der aktiven Fraktion 6 (Microsorb C18, 10 cm × 4,6 mm, 100 Å, Strömungsrate 1 mL/min, UV-Nachweis bei 220 nm, Acetonitril + 0,05% TFA/Wasser + 0,05% Gradient wie folgt: 0–30 min, 5–65%; 30–40 min, 65–100%; 40–45 min, 100%).
1B ist das UV-Spektrum des aktiven Peaks, der in dem in 1A beschriebenen Chromatogramm bei 14,755 Minuten eluiert.
2A ist das analytische HPLC-Chromatogramm der aktiven Fraktion 7 unter denselben in 1A beschriebenen Bedingungen.
2B ist das UV-Spektrum des aktiven Peaks, der in dem in 2A beschriebenen Chromatogramm bei 16,146 Minuten eluiert.
3 ist das C-8 HPLC-Chromatogramm des Methanol-Eluats aus dem in Verfahren B beschriebenen Diaion HP-20-Harz-Schritt (HP Zorbax Eclips XDB-C8-Säule, 5 μm, 150×4,6 mm, Strömungsrate 0,8 mL/min, UV-Nachweis bei 220 nm, Aufzeichnungsgeschwindigkeit 2 mm/min. Lösungsmittel A, 25:5:70 Acetonitril/Methanol/Wasser. Lösungsmittel B, 65:5:30 Acetonitril/Methanol/Wasser. Gradient: 100% A bei 0 Minuten erhöht auf 3% B während 20 Minuten).
4 ist das ¹H-NMR-Spektrum (400 MHz, CD₃OD) des halbreinen aktiven Metaboliten, der bei dem Reinigungsverfahren A erhalten wurde.
5 ist das ¹³C-NMR-Spektrum (100 MHz, CD₃OD) des halbreinen aktiven Metaboliten, der bei dem Reinigungsverfahren A erhalten wurde.
6 ist das LC ESI-MS (Liquid Chromatography ElectroSpray Impact-Mass Spectrum) des Peaks A, der bei dem Reinigungsverfahren B erhalten wurde (Microsorb C18, 10 cm × 4,6 mm, 100Å, Strömungsrate 1 mL/min, Acetonitril + 0,02% TFA/Wasser + 0,02% Gradient wie folgt: 0–30 min, 5–65%; 30–40 min, 65–100%; 40–45 min, 100%).
7 ist das LC ESI-MS Liquid Chromatography ElectroSpray Impact-Mass Spectrum) des Peaks B, der bei dem Reinigungsverfahren B erhalten wurde (Microsorb C18, 10 cm × 4,6 mm, 100Å, Strömungsrate 1 mL/min, Acetonitril + 0,02% TFA/Wasser + 0,02% Gradient wie folgt: 0–30 min, 5–65%; 30–40 min, 65–100%; 40–45 min, 100%).
Genaue Beschreibung
Die vorliegende Erfindung stellt einen neuen Stamm von Streptomyces Sp. oder Mutanten davon mit antimykotischer Aktivität nur für spezifische Pflanzenpathogene wie Alternaria, Phytophthora, Botrytis, Rhizoctonia und Sclerotinia, bereit. Dieser neue Stamm wurde am 20. Juli 1999 unter den Bedingungen des Butapester Vertrags über die internationale Anerkennung der Hinterlegung von Mikroorganismen für die Zwecke von Patentverfahren bei NRRL unter der Zugangsnummer B-30145 hinterlegt. Die Erfindung umfaßt auch Verfahren zur Verhinderung oder Behandlung von Pilzerkrankungen bei Pflanzen unter Verwendung derartiger Bakterienstämme oder Antibiotika enthaltender Überstände oder reiner Antibiotika, die von derartigen Bakterienstämmen erhalten wurden. Die Erfindung umfaßt auch ein Butanol-lösliches antimykotisches Antibiotikum mit einem Molekulargewicht von weniger als 10.000 Dalton, mit Stabilität gegen Basen- und Hitzebehandlung von 1 Stunde bei 80° C, und mit Labilität gegen Säurebehandlung.
Definitionen
Die Singularform "ein", "eine" und "der", "die" "das" umfaßt die Pluralformen, wenn der Zusammenhang nicht klar etwas anderes vorgibt. Beispielsweise umfaßt der Begriff "eine Zelle", eine Mehrzahl von Zellen einschließlich Gemische davon.
Der Begriff "aufweisend" soll bedeuten, dass die Zusammensetzungen und Verfahren die angegebenen Elemente umfassen, aber andere nicht ausschließen. "Bestehend im wesentlichen aus" soll, wenn es zur Definition von Zusammensetzungen und Verfahren verwendet wird, den Ausschluß anderer Elemente von irgendeiner wesentlichen Bedeutung für die Kombination bedeuten. Daher würde eine im wesentlichen aus den Elementen, wie sie hierin definiert sind, bestehende Zusammensetzung Spuren-Verunreinigungen aus dem Isolierungs- und Reinigungsverfahren und landwirtschaftlich annehmbare Träger nicht ausschließen. "Bestehend aus" soll den Ausschluß von mehr als Spuren- Elementen anderer Bestandteile und wesentlicher Verfahrensschritte zur Anwendung der Zusammensetzungen dieser Erfindung bedeuten. Durch jeden dieser Übergangsbegriffe definierte Ausführungsformen sind innerhalb des Umfangs dieser Erfindung.
"Biologische Kontrolle", wie hierin verwendet, ist definiert als Kontrolle eines Pathogens oder Infekts durch die Verwendung eines zweiten Organismus. Bekannte Mechanismen der biologischen Kontrolle umfassen Enterobakterien, die Wurzelfäule durch Pilze kontrollieren, die um Raum auf der Oberfläche der Wurzel konkurrieren. Bakterielle Toxine, wie Antibiotika, wurden zur Kontrolle von Pathogenen verwendet. Das Toxin kann isoliert und direkt auf die Pflanze aufgebracht werden, oder die Bakterienspezies kann verabreicht werden, so dass sie das Toxin in situ erzeugt.
Der Begriff "Pilz" oder "Pilze" umfaßt eine breite Vielfalt kernhaltiger, Sporentragender Organismen, die kein Chlorophyll haben. Zu Beispielen von Pilzen gehören Hefen, Schimmelpilze, Mehltaupilze, Rostpilze und Ständerpilze.
Der Begriff "Bakterien" umfaßt irgendeinen prokaryotischen Organismus, der keinen gesonderten Kern hat.
"Pestizid" bedeutet die Fähigkeit einer Substanz, die Sterblichkeit von Pflanzenschädlingen zu erhöhen oder die Wachstumsrate von Pflanzenschädlingen zu hemmen.
"Fungizid" bedeutet die Fähigkeit einer Substanz, die Sterblichkeit von Pilzen zu erhöhen, oder die Wachstumsrate von Pilzen zu hemmen.
"Antibiotikum" umfaßt irgendeine Substanz, die in der Lage ist, einen Mikroorganismus zu töten oder zu hemmen. Antibiotika können von einem Mikroorganismus oder durch ein synthetisches Verfahren oder halbsynthetisches Verfahren erzeugt werden. Der Begriff umfaßt daher eine Substanz, die Pilze hemmt oder tötet, beispielsweise Cycloheximid oder Nystatin.
"Antimycoticum" umfaßt irgendeine Substanz, die in der Lage ist, Pilze zu töten oder das Wachstum von Pilzen zu hemmen.
Der Begriff "Kultivieren" betrifft die Vermehrung von Organismen auf oder in Medien verschiedener Arten. "Voll-Bouillonkultur" betrifft eine flüssige Kultur, die sowohl Zellen als auch Medien enthält. "Überstand" betrifft die flüssige Bouillon, die zurückbleibt, wenn in der Bouillon gezüchtete Zellen durch Zentrifugieren, Filtration, Sedimentation oder andere in der Technik wohl bekannte Mittel entfernt werden.
Eine "wirksame Menge" ist eine Menge, die ausreicht, um vorteilhafte oder gewünschte Ergebnisse zu bewirken. Eine wirksame Menge kann in einer oder mehreren Anwendungen verabreicht werden. Hinsichtlich Behandlung und Schutz ist eine "wirksame Menge" die Menge, die ausreichend ist, um das Fortschreiten der Pilz- oder Bakterien-Krankheitszustände zu verbessern, zu stabilisieren, umzukehren, zu verlangsamen oder zu verzögern.
"Positive Kontrolle" bedeutet eine Verbindung, von der bekannt ist, dass sie Pestizidaktivität hat. Zu "positiven Kontrollen" gehören, aber ohne darauf beschränkt zu sein, im Handel erhältliche chemische Pestizide. Der Begriff "negative Kontrolle" bedeutet eine Verbindung, von der bekannt ist, dass sie keine Pestizidaktivität hat. Beispiele für negative Kontrollen sind Wasser oder Ethylacetat.
Der Begriff "Lösungsmittel" umfaßt irgendeine Flüssigkeit, die eine andere Substanz in Lösung hält. "Lösungsmittel-extrahierbar" bezieht sich auf irgendeine Verbindung, die sich in einem Lösungsmittel löst und die dann aus dem Lösungsmittel isoliert werden kann. Beispiele von Lösungsmitteln umfassen, aber ohne darauf beschränkt zu sein, organische Lösungsmittel wie Ethylacetat.
Der Begriff "Metabolit" bezeichnet irgendeine Verbindung, Substanz oder ein Nebenprodukt einer Fermentation eines Mikroorganismus, der Pestizidaktivität hat. Antibiotisch wie oben definiert ist ein Metabolit, der gegen einen Mikroorganismus spezifisch aktiv ist.
Der Begriff "Mutant" bezieht sich auf eine Variante des Mutterstamms sowie Verfahren zum Erhalten eines Mutanten oder einer Variante, worin die Pestizidaktivität größer ist als die durch den Mutterstamm ausgeübte. Der "Mutterstamm" ist hierin als der ursprüngliche Streptomyces-Stamm vor der Mutagenese definiert. Um solche Mutanten zu erhalten, kann der Mutterstamm mit einer Chemikalie wie N-Methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidin, Ethylmethansulfon, oder durch Bestrahlung unter Verwendung von Gamma-, Röntgen- oder UV-Bestrahlung, oder durch andere Mittel, die Praktikern auf dem Gebiet wohl bekannt sind, behandelt werden.
Eine "Zusammensetzung" soll eine Kombination eines Wirkstoffs und einer anderen Verbindung, einem Träger oder einer Zusammensetzung, inert (beispielsweise ein nachweisbares Mittel oder eine Markierung oder ein flüssiger Träger) oder aktiv, wie ein Hilfsstoff, bedeuten. Beispiele für landwirtschaftliche Träger werden unten angegeben.
Wir beschreiben einen neuen, Antibiotika-erzeugenden Stamm von Streptomyces sp. NRRL Nr. B-30145 und Mutanten davon, die nur auf spezifische Pflanzenpathogene antimykotische Aktivität ausüben. Ebenfalls bereitgestellt wird ein aus der Kultur isolierter Überstand sowie eine Zusammensetzung, die die Kultur aufweist. Nach einem weiteren Aspekt weisen die Zusammensetzungen außerdem mindestens ein chemisches oder biologisches Pestizid auf.
Ein von dem Streptomyces sp.-Stamm erzeugter Metabolit wird ebenfalls durch diese Erfindung bereitgestellt. Der Metabolit zeigt Aktivität gegen pflanzenpathogene Pilze und ist hitzestabil und basenstabil, ist säurelabil und hat ein Molekulargewicht von weniger als 10.000 Dalton. Der Metabolit kann beispielsweise ein Molekulargewicht [M+H⁺] zwischen etwa 925 bis zwischen etwa 865 haben.
Der eine oder die mehreren von dem Streptomyces sp.-Stamm erzeugten Metaboliten zeigen UV-Absorption zwischen etwa 215 nm und 220 nm. Der Metabolit kann aus einer Vielfalt von Molekülen zusammengesetzt sein, ein schließlich, aber nicht beschränkt auf, Propargylalkohol-Segmente [C=C-CH(OH)], sauerstoffhaltige Methin-Kohlenstoffe (X-CH-Y) oder eine Zuckereinheit. Beispielsweise kann der Metabolit mindestens zwei Propargyl-Segmente, mehrere sauerstoffhaltige Methin-Kohlenstoffe (beispielhaft z.B. 5 bis 10) und/oder eine Zuckereinheit aufweisen. Alternativ kann der eine oder die mehreren Metaboliten, die von dem Streptomyces sp.-Stamm erzeugt werden, dasselbe Kohlenstoffgerüst teilen und sich im Grad der Sauerstoffhaltigkeit unterscheiden.
Die vorliegende Erfindung stellt auch antimykotische Zusammensetzungen bereit, die einen Metaboliten aufweisen, der von Streptomyces erzeugt und nach einem Verfahren isoliert wurde, welches aufweist:

(a) Aufgeben einer Voll-Bouillonkultur des Streptomyces sp.-Stamms NRRL Nr. B-30145 oder von Mutanten davon, die alle Identifizierungskennzeichen von NRRL Nr. B-30145 haben, auf ein nicht-ionisches polymeres Absorbens-Harz;
(b) Eluieren des Metaboliten mit einem Alkohol;
(c) Absuchen des Eluats von Schritt (b) mit einem Bioassay auf Fraktionen des Eluats, die antimykotische Aktivität zeigen;
(d) Aufgeben der Fraktionen des Eluats, die antimykotische Aktivität zeigen, von Schritt (c) auf eine HPLC-Säule; und
(e) Eluieren des Metaboliten mit einem organischen Lösungsmittel.

Das Verfahren kann außerdem das Waschen des Harzes mit Wasser vor dem Schritt (b) und das Absuchen des Eluats von Schritt (e) mit einem Bioassay, um antimykotische Aktivität zeigende Fraktionen auszuwählen, aufweisen.
Die Voll-Bouillonkultur von Schritt (a) kann vor dem Zugeben zu dem nichtionischen polymeren Absorbens-Harz gefriergetrocknet und mit einer wässe rigen Lösung (z. B. Wasser) erneut suspendiert werden. In einer bevorzugten Ausführungsform ist die zu dem Harz zugegebene Voll-Bouillonkultur eine homogenisierte zellfreie Voll-Bouillonkultur. Beispiele für nicht-ionisches polymeres Absorbens-Harz, das verwendet werden kann, umfassen, aber ohne darauf beschränkt zu sein, Supelco Sepabead SP-207 oder Supelco Diaon HP-20.
Das zur Entfernung des Metaboliten in Schritt (b) verwendete Eluierungsmittel kann ein Alkohol oder ein Gradient von wässerigem Alkohol sein. Als ein Beispiel, Methanol oder ein Gradient von wässerigem Methanol kann als das Eluierungsmittel verwendet werden (z. B. Beispiel 6).
Der Bioassay von Schritt (c) kann irgendein Assay sein, der antimykotische Aktivität prüft. Beispiele solcher Bioassays umfassen, aber ohne darauf beschränkt zu sein, den Agar-Diffusionsassay oder den Objektträger-Keimungsassay. Beispielsweise kann der Bioassay ein Keimungsassay mit Monilinia fructiocola und/oder Alternaria brassicicola sein.
Beispiele einer HPLC-Säule, die in Schritt (d) verwendet werden kann, umfassen, aber ohne darauf beschränkt zu sein, C-18 oder C-8. Beispiele des organischen Lösungsmittels, das zur Entfernung des Metaboliten von der HPLC-Säule verwendet werden kann, umfassen, aber ohne darauf beschränkt zu sein, einen Acetonitril-Wasser-Gradienten (z. B. Beispiel 6).
Der Metabolit kann auch als eine Zusammensetzung mit einem Träger oder alternativ mit mindestens einem chemischen oder biologischen Pestizid formuliert werden.
Zur Erzielung einer guten Dispersion und Anhaftung der Zusammensetzungen innerhalb der vorliegenden Erfindung kann es vorteilhaft sein, die Voll-Bouillonkultur, den Überstand und/oder Metaboliten/das Antibiotikum mit Bestandteilen zu formulieren, die die Dispersion und Anhaftung unterstützen. Geeignete Formulierungen werden Fachleuten auf dem Gebiet bekannt sein (benetzbare Pulver, Granalien und dergleichen, oder sie können in einem geeigneten Medi um mikroverkapselt werden und dergleichen, Flüssigkeiten wie wässerige fließfähige Medien und wässerige Suspensionen und emulgierbare Konzentrate). Andere geeignete Formulierungen werden Fachleuten auf dem Gebiet bekannt sein.
Der Stamm, die Kultur, der Überstand und der isolierte Metabolit sind brauchbar zum Schützen oder Behandeln von Pflanzen, Früchten und Wurzeln vor bzw. gegen Pilzinfektionen durch Aufbringen einer wirksamen Menge der aktiven Formulierung auf die Pflanze, die Frucht oder die Wurzel. Die Formulierungen sind besonders geeignet zum Behandeln oder Verhindern von Infektionen, die von einem Pilz verursacht werden, der ausgewählt ist aus der Gruppe, die aus Alternaria solani, Botrytis cinerea, Rhizoctonia sp., Sclerotinia sp. und Phytophthora sp. besteht.
Vollständige bibliographische Zitate aller hierin zitierten Patente und Veröffentlichungen sind am Ende der Beschreibung, unmittelbar vor den Ansprüchen, zu finden.
Die folgenden Beispiele werden zur Veranschaulichung der Erfindung bereitgestellt.
Beispiele
Beispiel 1
Charakterisierung des Stamms NRRL Nr. 8-30145
NRRL Nr. B-30145 wurde auf der Basis von 16S-rRNA-Sequenzierung identifiziert. Das zur Erzeugung der 16S-rRNA-Gendatensequenz verwendete Protokoll (Acculab Customer Handbook v. 1.0) wird wie folgt beschrieben.
Das 16S-rRNA-Gen wird aus genomischer DNA, die aus Bakterienkolonien isoliert wurde, durch PCR amplifiziert. Für die Amplifizierung verwendete Primer entsprechen den E. coli-Positionen 005 und 531. Die Amplifikationsprodukte werden unter Verwendung von Mikrocon 100 (Amicon) Molekulargewicht-Sperrmembranen (cut-off Membranen) von überschüssigen Primern und dNTPs gereinigt und durch Laufen lassen eines Teils der Produkte auf einem Agarosegel hinsichtlich Qualität und Menge geprüft.
Zyklus-Sequenzierung der 16S rRNA-Amplifikationsprodukte wird unter Verwendung von AmpliTaq FS DNA-Polymerase und dRhodamin-Farbstoff-Terminatoren durchgeführt. Überschüssige Farbstoff-dRhodamin markierte Terminatoren wurden unter Verwendung einer Sephadex G-50 spin-Säule aus den Sequenzierungsreaktionen entfernt. Die Produkte wurden durch Zentrifugieren gesammelt, unter Vakuum getrocknet und bei –20° C eingefroren, bis sie zur Aufbringung bereit waren. Die Proben werden in einer Lösung von Formamid/blauem Dextran/EDTA erneut suspendiert und vor dem Aufbringen denaturiert. Die Proben werden auf einem DNA-Sequenzierungsgerät ABI Prism 377 der Elektrophorese unterzogen. Die Daten werden unter Verwendung von DNA-Aufbereitungs- und Assembly-Software von PE/Applied Biosystem's analysiert. Sobald man die Sequenzen erhalten hat werden sie unter Verwendung von MicroSeq^TM-Sequenzanalyse-Software mit der Microseq^TM-Datenbank von PE/Applied Biosystem's verglichen. Die Sequenzen werden auch mit der Genbank und dem Ribosomalen Datenbank-Projekt (RDP Ribosomal Database Project) verglichen.
Die Ergebnisse der 16S rRNA-Sequenzierung identifizierten NRRL Nr. B-30145 als eine Streptomyces sp. Dieser Stamm kann zu der Spezies S. mashuensis (früher Streptoverticillium mashuense) oder einer verwandten Spezies gehören, wie von den Sequenzierungsergebnissen nahegelegt. Die beste Übereinstimmung war Streptomyces mashuensis mit einem Übereinstimmungswert von 98%.
Beispiel 2
Aktivität von NRRL Nr. B-30145 gegen Pflanzenpathogene in in vitro-Kultur (Zonenassay)

NRRL Nr. B-30145 wurde unter Verwendung von zwei verschiedenen in vitro-Assays gegen eine Gruppe verschiedener Pflanzenpathogene getestet. Der Agar-Diffusions(zonen)-Assay besteht darin, entweder pflanzenpathogene Sporen auf die Oberfläche eines Agarmediums aufzubringen, um einen ganzen Wachstumsrasen zu erzeugen, oder ein in der Mitte der Petri-Schale angebrachtes Mycel-Agarplättchen zu verwenden, das wachsen und den Agar besiedeln wird. Kreisförmige Vertiefungen von näherungsweise 7,0 mm Durchmesser werden unter Verwendung einer Pipette, die an einer Vakuumpumpe angebracht ist, aus dem Agar entfernt. Fermentationsproben von NRRL Nr. B-30145 werden zusammen mit bekannten Standards und Wasser-Kontrollen zu jeder Vertiefung zugegeben. Die Platten werden unter Umgebungsbedingungen, die für jedes Pathogen förderlich sind, drei bis vier Tage lang inkubiert. Die Ergebnisse bestehen aus einer Zone ohne Pathogenwachstum um die Vertiefung herum, oder einer stark reduzierten Menge an Pathogenwachstum um die Vertiefung herum, oder keiner Beeinflussung. Die Größe und Art der Zone wird für jede Probe aufgezeichnet. Die Ergebnisse für NRRL Nr. B-30145 in Agar-Diffusionsassays sind in Tabelle 1 angegeben. Die Ergebnisse innerhalb der Agardiffusion waren variabel; die Diffusion durch Agar kann gehemmt sein. Tabelle 1: Aktivität von NRRL Nr. B-30145 gegen ausgewählte Pflanzenpathogene in dem Agar-Diffusions(zonen)-Assay.

Alternaria brassicicola	keine Zone/schwache Aktivität
Botrytis cinerea	schwache Aktivität
Monilinia fructicola	keine Zone
Phytophthora capsici	mäßige Aktivität
Pythium sp.	schwache Aktivität
Colletotrichum acutatum	keine Zone
Rhizoctonia solani	keine Zone
Sclerotinia sclerotiorum	keine Zone

Die zweite Art von in vitro-Assay, die zum Testen des Pathogenspektrums von NRRL Nr. B-30145 durchgeführt wurde, war der Objektträger-Keimungsassay.
Fermentationsproben von NRRL Nr. B-30145 bei verschiedenen Verdünnungen wurden auf Glas-Objektträger mit Vertiefung (25 mm × 75 mm mit einer 1,75 mm tiefen Vertiefung mit 18 mm Durchmesser) aufgegeben, und ein gleiches Volumen an Pathogensporen wurde mit der Probe gemischt. Die Objektträger wurden auf befeuchteten Papierhandtüchern in verschlossenen Kunststoffbehältern bei Raumtemperatur über Nacht inkubiert. Die Ergebnisse werden durch Betrachten der Fermentationsprobe/Sporensuspensionsprobe unter Verwendung eines zusammengesetzten Mikroskops bei 100-facher Vergrößerung bestimmt. Typische Ergebnisse bestehen aus einem Fehlen von Keimung des Pathogen-Brutkörpers oder stark verringerter Keimung und/oder stark verringertem Wachstum. Zusätzlich können verschiedene Arten von Mißbildungen des Anfangswachstums aus den Pathogensporen auftreten. Das Spektrum der Aktivität von NRRL Nr. B-30145 ist in Tabelle 2 angegeben. Vollständige Hemmung der Sporenkeimung trat bei niedrigen Konzentrationen der Fermentationsproben auf. Tabelle 2: Aktivität von NRRL Nr. B-30145 gegen ausgewählte Pflanzenpathogene in dem Objektträger-Keimungsassay.

Alternaria brassicicola keine Keimung keine Keimung

Alternaria dauci keine Keimung

Botrytis cinerea keine Keimung

Monilinia fructicola keine Keimung
Beispiel 3
Aktivität von NRRL gegen Pflanzenpathogene in Pflanzen-Bioassay-Tests
Die Aktivität von NRRL Nr. B-30145 wurde gegen Tomaten-Braunfäule (Phytophthora infestans), Tomaten-Dürrfleckenkrankheit (Alternaria solani), Edelfäulepilz (Botrytis cinerea), Turf-Braunflecken (Rhizoctonia sp.) und gegen Erdnuß-Brennflecken- und Fruchtfäule (Sclerotinia minor) getestet. Alle Tests wurden unter kontrollierter Umgebung im Labor mit Pflanzenmaterial, das unter typischen gewerblichen Gewächshausbedingungen aus der Saat gezüchtet worden war, durchgeführt.
Tomaten-Braunfäule – Phytophthora infestans
Das Pathogen wird auf Roggenagar in Standard-Petrischalen bei 16° C im Dunkeln wachsen lassen. Sporenträger werden durch Fluten der Platte mit Wasser und Abschaben des Mycels, um die Sporenträger zu entfernen, gesammelt. Die Sporenträger-Suspension wird durch Gaze passiert, quantitativ bestimmt und auf 1,0 × 10° eingestellt. Tomatensämlinge im Stadium des dritten bis fünften Blattes werden unter Verwendung einer Künstler-Spritzpistole bei 40 psi bis zum Ablaufen mit der Fermentationsprobe von NRRL Nr. B-30145 besprüht. Die behandelten Sämlinge werden bei Raumtemperatur mindestens zwei Stunden lang lufttrocknen lassen, dann durch leichtes Besprühen der oberen Oberflächen der Tomatensämlinge unter Verwendung eines von Hand gehaltenen Sprühers mit der Sporenträger-Suspension inokuliert. Die inokulierten Sämlinge werden in mit Wasser gefüllte, flache Behälter mit massivem Boden gebracht und dann mit einer Kunststoff-Kuppel abgedeckt, um die Feuchtigkeit der Blätter beizubehalten. Die flachen Behälter wurden vier Tage lang bei 20° C mit einer Beleuchtungsdauer von 14 Stunden inkubiert, wobei sie dauernd von den Kunststoff-Kuppeln bedeckt waren. Die Sämlinge werden dann nach einer Krankheits-Bewertungsskala von 0 bis 5 bewertet, wobei 0 keinen Symptomen entspricht, und 5 einer Kolonisierung der Blätter durch das Pathogen von 75% oder mehr entspricht. Ein typisches Beispiel eines Braunfäule-Tests ist in Tabelle 3 angegeben.
Tabelle 3: Ergebnisse der mit NRRL Nr. B-30145 gegen das Braunfäule-Pathogen Phytophthora infestans behandelten Tomatensämlinge.
Die Proben sind unterschiedliche Fermentierungen von NRRL Nr. B-30145
D.I. bedeutet Krankheitsindex (Disease Index).
Tomaten-Dürrfleckenkrankheit – Alternaria solani
Das Pathogen wird zuerst auf im Handel erhältlichem Difco Kartoffel-Dextrose-Agar (PDA, potato dextrose agar) bei 22–25° C unter 14-stündiger Belichtung wachsen lassen, bis die gesamte Platte bedeckt ist. Der Pilz und das Agarmedium werden dann in kleine Quadrate von näherungsweise 10 mm im Quadrat geschnitten und mit der Pilz-Seite nach oben auf ein spezialisiertes Sporenbildungsmedium (S-Medium: 20 g Sucrose, 20 g Calciumcarbonat, 20 g Bacto-Agar pro Liter) gelegt. Die S-Medium-Platten werden mit einer dünnen Schicht Wasser geflutet und zwei bis drei Tage lang bei 22–25° C unter 14-stündiger Belichtung inkubiert, bis vollständige Sporenbildung des Pathogens auftritt. Die Platten werden dann mit Wasser geflutet, und die Agar-Quadrate werden von der Platte geschabt. Die Suspension wird durch Gaze passiert, und die Sporen werden quantitativ bestimmt und auf 1,0 × 10⁵ eingestellt. Die Tomatensämlinge im Stadium des 3. bis 5. Blatts werden dann wie vorher beschrieben mit einer Künstler-Spritzpistole bis zum Ablaufen besprüht. Die behandelten Sämlinge werden trocknen lassen und dann mit der Sporen-Suspension inokuliert. Die Sämlinge werden in flache Behälter gebracht und abgedeckt, wie vorher beschrieben, und bei 25° C mit einer Belichtungsdauer von 14 Stunden inkubiert. Die Sämlinge werden auf der Basis einer Skala von 0 bis 5 bewertet, wie vorher beschrieben. Die Ergebnisse eines typischen Tests sind in Tabelle 4 angegeben.
Tabelle 4: Aktivität von NRRL Nr. B-30145 gegen das Dürrfleckenkrankheit-Pathogen Alternaria solani.
Pfeffer-Edelfäulepilz-Botrytis cinerea
Das Pathogen wird auf Standard-PDA bei 22° C unter einer 14-stündigen Belichtungsdauer wachsen lassen, bis das Pilzwachstum die Platte vollständig bedeckt hat (7–9 Tage). Die Sporen werden durch Fluten der Platte mit Wasser und dann sanftes Schaben mit einem Spatel, um die Sporen zu entfernen, gesammelt. Die Sporen-Suspension wird durch Gaze passiert und quantitativ bestimmt und auf 1,5 × 10⁶ eingestellt. Die Peffersämlinge werden bis zum Stadium von 4 bis 6 echten Blättern wachsen lassen, und die Fermentations-Proben werden unter Verwendung einer Künstler-Spritzpistole auf die oberen Blattoberflächen gesprüht, wie vorher beschrieben. Die behandelten Sämlinge werden inokuliert, in flache Behälter gebracht und mit Kunststoff-Kuppeln abgedeckt. Die flachen Behälter werden 2,5 Tage lang bei 20° C unter dauernde Dunkelheit gebracht. Die Sämlinge werden auf einer Skala von 0 – 5 bewertet, wie vorher beschrieben. Tabelle 5 stellt Ergebnisse von zwei typischen Tests dar.
Tabelle 5: Aktivität von NRRL Nr. B-30145 gegen Botrytis cinerea
Turf-Braunflecken-Rhizoctonia sp.
Zwei ml Fermentationsprobe wurden zu jeder Zelle eines Topfs mit 6 Zellen von einen Monat alten Turf-Sämlingen (Bentgras) zugegeben. Ein Mycel-Plättchen von 4 mm einer 2 – 3 Tage alten Kultur von Rhizoctonia sp. wurde unter die Bodenoberfläche gebracht. Jede Behandlung wurde 6 mal repliziert. Die inokulierten Töpfe wurden in flache Kunststoffbehälter gebracht und mit einer Kunststoff-Kuppel abgedeckt. Die flachen Behälter wurden auf ein Licht-Gestell (16 h/Tag) gestellt und bei Raumtemperatur inkubiert. Die Schwere der Krankheit wurde nach 5 – 6 Tagen Inkubation untersucht und mit der wasser-behandelten Kontrolle verglichen. Die Ergebnisse zeigten an, dass NRRL Nr. B-30145 eine unterdrückende Aktivität gegen Rhizoctonia hat (Tabelle 6).
Tabelle 6: Die Wirksamkeit von NRRL Nr. B-30145 gegen von Rhizoctonia sp. verursachte Turfkrankheit
Erdnuß-Brennflecken und Fruchtfäule – Sclerotinia minor
Erdnußsämlinge im Stadium der ersten zwei Blätter wurden mit NRRL Nr. B-30145 behandelt, und nach dem Trocknen der behandelten Pflanzen wurde ein Mycel-Plättchen von 4 mm an die Basis jedes Stengels gelegt. Die inokulierten Pflanzen wurden zwei Tage lang in einer Taukammer inkubiert, bevor sie in einen mit einer Abdeck-Kuppel verschlossenen, flachen Kunststoff-Behälter gebracht wurden. Der flache Behälter wurde bei Raumtemperatur 10 Tage lang auf einem Licht-Gestell (16 h/Tag) inkubiert. Die Schwere der Krankheit wurde durch Vergleichen der behandelten mit der Wasser-Kontrolle bewertet. Die Ergebnisse (Tabelle 7) zeigten an, dass NRRL Nr. B-30145-Voll-Bouillon bei 1 mal etwas kontrollierende Aktivität gegen Sclerotinia minor hat.
Tabelle 7. Die Wirksamkeit von NRRL Nr. B-30145 auf Erdnuß-Sclerotinia-Fäule.
Beispiel 5
Von NRRL Nr. B-30145 erzeugter antimykotischer Metabolit.
Die Voll-Bouillon von NRRL Nr. B-30145 wurde in Ethylacetat-, Butanol- und wässerige Fraktionen aufgeteilt. Jede Fraktion wurde in einem Sporenkeimungsassay gegen Alternaria brassicicola getestet. Die Alternaria-Sporen wurden in Anwesenheit jeder Probe in Mikroskop-Objektträgern mit Vertiefung, die 40 μl Probe und 20 μl Pathogen-Sporen enthielten, gekeimt. Näherungsweise 16 Stunden später werden die Sporen unter einem Mikroskop betrachtet, um zu sehen, ob sie gekeimt haben. Keine Keimung (Wert von 0) verglichen mit der Wasser-Kontrolle (100% Keimung und Wachstum = Wert von 5) zeigt Aktivität der Probe, die getestet wird, an. Die Ergebnisse des Alternaria-Keimungsassays mit verschiedenen NRRL Nr. B-30145-Fraktionen sind unten gezeigt (Wert bei einer Bewertung von 0 – 5 wie oben).
Der Metabolit ist klar in der Butanol-löslichen Fraktion und ist in Ethylacetat nicht leicht extrahierbar. Andere Kennzeichen des Metaboliten wurden bestimmt. Es wurde gezeigt, dass das Molekül durch einen Molekulargewicht 10.000-Sperrfilter hindurchgeht, was anzeigt, dass der Metabolit kleiner als 10.000 Dalton ist. Die Aktivität ging bei Behandlung mit Base oder bei einstündigem Erhitzen auf 80° C nicht verloren. Die Aktivität ging bei Behandlung mit Säure verloren (der Wert gegen Alternaria stieg von 0 auf 5).
Die Fraktionierung des Butanol-Extrakts mit Flash-Chromotographie an Silicagel-gebundenem Octadecylsilan (ODS) unter Verwendung eines Acetonitril (ACN)/Wasser-Gradienten mit 0,01 % Trifluoressigsäure (TFA) ergab eine aktive Fraktion, die mit 50% Acetonitril/Wasser mit 0,01 % TFA eluierte. Die Fraktionen wurden in einem Alternaria-Keimungsassay auf Aktivität getestet (Bewertungsskala 0–5).

Fraktion Wert

ODS 10% ACN 4

ODS 20% ACN 5

ODS 50% ACN 0,5

ODS 100% ACN 5

Wasser-Kontrolle 5
Weitere Reinigung durch ODS-HPLC ergab zwei aktive Komponenten (Fraktionen 6 und 7) aus einer isokratischen Eluierung mit 31 % Acetonitril in Wasser mit 0,02% TFA).

Fraktion Wert

HPLC Fr.1 5

HPLC Fr.2 5

HPLC Fr.3–5 4

HPLC Fr.6 3

HPLC Fr.7 2

HPLC Fr.8 5

HPLC Fr.9 5

Wasser-Kontrolle 5
Das HPLC-Chromatogramm der aktiven Fraktion aus der Flash-Chromatographie mit 50% Acetonitril/Wasser mit 0,01 % TFA, und die HPLC-Chromatogramme der aktiven Fraktionen 6 und 7, einschließlich UV-Spektren der aktiven Grundbestandteile, sind in den 1 und 2 gezeigt.
NRRL Nr. B-30145 stimmte bei 16S-RNA-Sequenzierung am genauesten mit Streptomyces mashuensis überein. Anders als die antibakteriellen Metaboliten, die typischerweise mit S. mashuensis in Verbindung stehen, war die fungizide Aktivität von NRRL Nr. B-30145 mit Butanol extrahierbar. Es ist bekannt, dass S. mashuensis Streptomycin erzeugt, das eine wasserlösliche antibakterielle Verbindung ist. Ein anderes von S. mashuensis erzeugtes Antibiotikum, Monazomycin (Akasaki et al. 1963), zeigt keine Schulter bei 215–220 nm, wie es die fungizid aktiven Fraktionen von NRRL Nr. B-30145 tun.
Antimykotische Verbindungen wurden auch in der nahe verwandten und möglicherweise synonymen Spezies Streptomyces griseocarneum (American Type Culture Collection) gefunden. Diese beinhalten Porfiromycin (Claridge et al., 1986), eine purpurfarbene Verbindung, deren entsprechendes UV-Spektrum in der aktiven Fraktion von NRRL Nr. B-30145 nicht zu sehen ist, und das Heptaenes-trichomycin (Komori und Morimoto, 1989) und Griseocarnin (Campos et al., 1974), deren entsprechende UV-Spektren ebenfalls in der aktiven Fraktion nicht vorhanden sind. Die fungizid aktive Verbindung ist auch nicht Neutramycin, das mit Ethylacetat extrahierbar ist (Mitscher und Kunstmann, 1969).
Beispiel 6
Zusätzliche Verfahren zur weiteren Reinigung des antimykotischen Metaboliten von NRRL Nr. B-30145
Verfahren A
Die gefriergetrocknete Voll-Bouillonkultur wurde erneut in Wasser (2,0 L) suspendiert und auf eine in Wasser äquilibrierte Säule, die ein nicht-ionisches polymeres Harz enthielt (Supelco Sepabead SP-207; 26 × 3,0 cm), aufgebracht. Die Säule wurde mit Wasser (200 ml) gewaschen und dann mit einem Gradienten von wässerigem Methanol wie folgt: (1) 20:80 Methanol/Wasser (200 ml), (2) 40:60 Methanol/Wasser (200 ml), (3) 60:40 Methanol/Wasser (200 ml), 80/20 Methanol/Wasser (200 ml), und (5) Methanol (200 ml).
Bioassay-Ergebnisse (Keimungsassay mit Monilinia fructicola und/oder Alternaria brassicicola) zeigten an, dass alle Fraktionen aktiv waren. Jede Fraktion wurde einzeln fraktioniert mit HPLC an Silicagel-gebundenem Octadecylsilan (ODS) unter Verwendung von Acetonitril/Methanol/Wasser (TOSOHASS ODS-80TS; 10 μm, 21,5 × 30 cm. Lösungsmittel-System: Lösungsmittel A: Acetonitril/Methanol/Wasser 25:5:65, Lösungsmittel B: Acetonitril/Methanol/Wasser 65:5:30. Gradient: Beginn bei 0 min mit Lösungsmittel A und Halten für 25 min. Dann Steigern von Lösungsmittel B auf 35% über 50 min. Fluß = 6,0 ml/min). Alle Fraktionen ergaben näherungsweise dasselbe HPLC-Profil, wobei die Aktivität an zwei Bereichen lokalisiert war: Peak A (t~55–63 min) und Peak B (t~65–70 min).
Peak B wurde weiter fraktioniert an einer anderen Umkehrphasen-HPLC-Säule (Phenomenex Luna Phenyl-Hexyl; 5 μm, 250 × 10 mm. Lösungsmittel-System: Lösungsmittel A: Acetonitril/Methanol/Wasser 25:5:65, Lösungsmittel B: Acetonitril/Methanol/Wasser 65:5:30. Gradient: Beginn bei 0 min mit Lösungsmittel A und Halten für 15 min. Dann Steigern von Lösungsmittel B auf 25% über 25 min. Fluß = 2,0 ml/min). Ein Hauptbestandteil wurde isoliert; die ana lytische HPLC-Analyse zeigte jedoch eine stark UV-absorbierende Verunreinigung an, die mit dem aktiven Metaboliten gemeinsam eluierte. Daher wurde ein alternatives Reinigungsverfahren eingesetzt (Verfahren B).
Verfahren B
Alternativ wird die homogenisierte, zellfreie Voll-Bouillonkultur durch nichtionisches polymeres Harz (Supelco Diaion HP-20) passiert, mit Wasser und dann mit Methanol gewaschen. Das Methanol-Eluat wird durch Umkehrphasen-HPLC (HP Zorbax Eclipse XDB-C8; 5 μm, 150 × 4,6 mm. Lösungsmittel-System: Lösungsmittel A: Acetonitril/Methanol/Wasser 25:5:65, Lösungsmittel B: Acetonitril/Methanol/Wasser 65:5:30. Gradient: Beginn bei 0 min mit Lösungsmittel A und Steigerung von Lösungsmittel B auf 3% in 20 min. Fluß = 0,8 ml/min) weiter gereinigt, um dieselben aktiven Peaks zu liefern, die bei Verfahren A beobachtet wurden (Peaks A und B), und durch analytische HPLC unter Verwendung von UV- und MS-Nachweis bestätigt. Eine HPLC-Kurve ist in 3 gezeigt.
Kennzeichen der aktiven Metaboliten von NRRL Nr. B-30145
Die aus dem Verfahren A erhaltene unreine Fraktion lieferte etwas Anfangsinformation über die Natur des aktiven Metaboliten. LC-MS gab ein Molekulargewicht [M+H⁺]=892,6 an, und das UV-Spektrum zeigt eine Schulter bei 215-220 nm. 1D- und 2D-NMR legt mindestens zwei Propargylalkohol-Segmente (C=C-CH(OH)], mehrere sauerstoffhaltige Methinkohlenstoffe (X-CH-Y) und eine mögliche Zuckereinheit nahe. ¹H und ¹³C NMR sind in den 4 bzw. 5 gezeigt.
Obwohl das Verfahren B keine ausreichenden Mengen zur NMR-Analyse lieferte, ergab dieses Verfahren sauberere Peaks in ausreichenden Mengen zur Analyse durch HPLC (Octyl gebunden an Silicagel) unter Verwendung von UV- und MS-Nachweisverfahren. Es wurden zwei Hauptpeaks (Peak A und B) er halten, die mit denselben Verbindungen übereinstimmten, die unter Verwendung von Verfahren A als die aktiven Metaboliten identifiziert wurden (siehe 3). Die UV-Spektren aller Verbindungen zeigten eine Schulter bei 215–220 nm. LC MS von Peak A zeigte die Anwesenheit von mindestens drei (3) Verbindungen mit den folgenden Molekulargewichten an [M+H⁺]=866,5, 882,5 und 898,4 (siehe 6). Gleichermaßen zeigte Peak B mindestens drei (3) Verbindungen mit Molekulargewichten [M+H⁺]=892,5, 908,5 und 924,5 (siehe 7).
LITERATURVERZEICHNIS

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Claims

Isolierter Streptomyces sp.-Stamm, der ausgewählt ist aus einem Streptomyces sp.-Stamm mit allen Identifizierungskennzeichen des Stammes, der bei NRRL mit der Zugangsnummer B-30145 hinterlegt wurde; und Mutanten des bei NRRL mit der Zugangsnummer B-30145 hinterlegten Stammes, wobei die Mutanten alle Identifizierungskennzeichen von NRRL Nr. B-30145 haben.
Von dem Streptomyces sp.-Stamm nach Anspruch 1 erzeugter Metabolit, wobei der Metabolit Aktivität gegen pflanzenpathogene Pilze zeigt.
Metabolit nach Anspruch 2, wobei der Metabolit hitzestabil, basenstabil und säurelabil ist.
Metabolit nach Anspruch 2, wobei der Metabolit hitze- und basenstabil ist, säurelabil ist und ein Molekulargewicht von weniger als etwa 10.000 Dalton hat.
Metabolit nach Anspruch 2, wobei der Metabolit ein Molekulargewicht (M+H⁺] zwischen etwa 925 und etwa 865 hat.
Metabolit nach Anspruch 5, wobei das Molekulargewicht ausgewählt ist aus der Gruppe, die aus 866,5, 882,5, 898,4, 892,5, 908,5 und 924,5 besteht.
Metabolit nach Anspruch 2, wobei der Metabolit UV-Absorption zwischen etwa 215 nm und 220 nm zeigt.
Metabolit nach einem der Ansprüche 2 bis 7, wobei der Metabolit eine oder mehrere chemische Baueinheiten aufweist, die ausgewählt sind aus der aus ei nem sauerstoffhaltigen Methinkohlenstoff und einer Zuckereinheit bestehenden Gruppe.
Zusammensetzung aufweisend einen isolierten Stamm, wie er in Anspruch 1 beschrieben ist, und einen Träger.
Zusammensetzung aufweisend einen Metaboliten, wie er in einem der Ansprüche 2 bis 8 beschrieben ist, und einen Träger.
Zusammensetzung aufweisend eine Voll-Bouillonkultur des isolierten Stammes, wie er in Anspruch 1 beschrieben ist.
Zusammensetzung aufweisend einen von der Voll-Bouillonkultur, wie sie in Anspruch 11 beschrieben ist, abgetrennten Überstand.
Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 9 bis 12, außerdem aufweisend mindestens ein chemisches oder biologisches Pestizid.
Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 9 bis 13, wobei die Zusammensetzung formuliert ist als eine Formulierung, die ausgewählt ist aus der aus einem benetzbaren Pulver, einer Granulatformulierung, einer wässerigen Suspension, einem emulgierbaren Konzentrat und einer mikroverkapselten Formulierung bestehenden Gruppe.
Verfahren zum Schützen oder Behandeln einer Pflanze, einer Frucht oder einer Wurzel vor einer Pilzinfektion bzw. gegen eine Pilzinfektion, wobei das Verfahren das Aufbringen einer wirksamen Menge eines Streptomyces sp.-Stammes, wie er in Anspruch 1 beschrieben ist, eines Metaboliten, wie er in einem der Ansprüche 2 – 8 beschrieben ist, oder einer Zusammensetzung, wie sie in einem der Ansprüche 9 – 14 beschrieben ist, auf die Pflanze, die Frucht oder die Wurzel aufweist.
Verfahren nach Anspruch 15, wobei die Pilzinfektion verursacht wird durch einen Pilz, der ausgewählt ist aus der aus Alternaria solani, Botrytis cinerea, Rhizoctonia sp., Sclerotinia sp. und Phytophthora sp. bestehenden Gruppe.