DE68924991T2

DE68924991T2 - 2-Pyranon-Derivat und Verfahren zu dessen Herstellung.

Info

Publication number: DE68924991T2
Application number: DE68924991T
Authority: DE
Inventors: Norihide Amano; Sumio Asami; Hidekazu Hosono; Tohru Kodama; Takaaki Kusumi; Mitsuru Maeda
Original assignee: Suntory Ltd
Current assignee: Suntory Ltd
Priority date: 1988-02-13
Filing date: 1989-02-13
Publication date: 1996-07-11
Anticipated expiration: 2009-02-14
Also published as: EP0329361B1; AU2969489A; AU609940B2; EP0329361A2; CA1335365C; ES2080068T3; DE68924991D1; ATE131169T1; EP0329361A3

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft neue 2-Pyranon-Derivate, Verfahren zu ihrer Herstellung und diese enthaltende bakterienwachstumshemmende Zusammensetzungen. Insbesondere können die Derivate eine bakterienwachstumshemmende Aktivität bei einer sehr niedrigen Konzentration, insbesondere gegenüber pflanzenpathogener Pilze zeigen und sind deshalb als ein aktiver Bestandteil für eine landwirtschaftliche Biocid-Zusammensetzung nützlich.
Das gestellte Problem ist die Bereitstellung neuer Biocid-Verbindungen, die nicht die nachteiligen Nebeneffekte bei landwirtschaftlichen Pflanzen zeigen und die insbesondere für die Verhinderung und Kontrolle von Botrytis cinerea nützlich sein können, die parasitisch auf einem sehr breiten Bereich von Pflanzen (z.B. Gurke, Tomate, Aubergine, Erdbeere, Kopfsalat, Udo (Aralia cordata) und Zwiebel) bei niederen Temperaturen und hohen Feuchtigkeitsbedingungen sein können.
Unter Stellung dieses Problems wurde nun erfindungsgemäß ein Mikroorganismus aus der Natur isoliert, der Grauschimmel unterdrückende biologisch aktive Verbindungen erzeugt, und von dem gefunden wurde, daß er ein zum Stamm Streptomyces gehörender Actinomyces ist, der in einer Kulturbrühe Substanzen erzeugt, die einen wachstumshindernden Effekt auf Pilze, einschließlich Dermatophyten und pflanzenpathogene Pilze, bei einer sehr niederen Konzentration zeigt. Erfindungsgemäß wurde weiter die Substanz isoliert und gereinigt sowie deren Struktur bestimmt und bestätigt, daß die gereinigte Substanz Grauschimmel stark unterdrückt.
Demgemäß stellt die vorliegende Erfindung ein 2-Pyranon-Denvat der Formel (I) dar:
in der R ein Wasserstoffatom oder eine lineare oder verzweigte Alkylcarbonyloxy- oder Cycloalkylcarbonyloxy-Gruppe mit 3 bis 10 Kohlenstoffatomen ist, und deren Salze.
Gemäß einer zweiten Ausführungsform der Erfindung wird ein Verfahren zur Herstellung des vorstehend definierten 2- Pyranon-Derivates (I) bereitgestellt, enthaltend die Schritte der Kultivierung eines zur Erzeugung des Derivates fähigen Mikroorganismus des Stammes Streptomyces platensis SAM-0654 (FERM BP-1668), um das Derivat zu erzeugen, und Wiedergewinnen der gebildeten Verbindung aus dem Kulturprodukt.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform der Erfindung wird eine Biocid-Zusammensetzung enthaltend eine als Biocid wirkende wirksame Menge des vorstehend genannten 2-Pyranon-Derivates bereitgestellt. Darüber hinaus stellt die vorliegende Erfindung den genannten Stamm des Mikroorganismus bereit, der zur Erzeugung der vorstehend genannten 2-Pyranon-Derivate fähig ist.
Die US-A-4 578 383, die der EP-A-87 021 entspricht, und die EP-A-128 651 beschreiben eine Verbindung mit einer Grundstruktur der vorstehenden Formel (I), die jedoch ein Wasserstoffatom oder eine Hydroxylgruppe in der 5-Stellung des Pyranonringes zeigt, eher als die Ethylgruppe in der Formel (I), und mit einem 1-Propenyl oder 3-Hydroxy-1-propenyl in einer am weitesten von dem Pyranonring entfernten Position hat, eher als ein Cyclohexylring wie in Formel (I). Aus diesem Grund sind diese Verbindungen signifikant verschieden in der Struktur von den vorliegenden Verbindungen, die eine Ethylgruppe in der 5-Stellung des Pyranonringes und eine Cyclohexylringstruktur in der von der Pyranonstruktur am weitest entfernten Position zeigen. Darüber hinaus ist den vorstehenden Veröffentlichungen nicht zu entnehmen, daß ein zu Streptomyces gehörender Mikroorganismus diese Verbindungen produzieren könnte.
Die US-A-4 575 500 offenbart eine Verbindung mit einer zu der Formel (I) ähnlichen Struktur, mit Ausnahme einer Cyclohexanon-Struktur anstelle des Pyranonringes gemäß vorliegender Erfindung.
Figur 1 zeigt ein Elutionsprofil, gemäß dem Komponenten in einem konzentriertem Überstand aus einer Kulturbrühe durch Hochdruckflüssigkeitschromatographie getrennt wurden.
Bevorzugte Merkmale der Erfindung und spezifische Beispiele von Ausführungsformen werden nun beschrieben.
In der vorstehend genannten Formel (I) ist die Alkylcarbonyloxygruppe vorzugsweise Butyryloxy, Isobutyryloxy, Isovaleryloxy, 2-Methylbutyryloxy, Cyclohexylcarbonyloxy, 4-Methylhexanoyloxy, 6-Methylheptanoyloxy oder Octanoyloxy.
Der Erzeuger-Mikroorganismus kann ein jeder zum Stamm Streptomyces gehörende und zur Erzeugung der vorliegenden 2-Pyranon- Derivate fähige Mikroorganismus sein.
Ein solcher Mikroorganismus kann durch Isolieren von zu Streptomyces gehörenden Mikroorganismen aus mikrobiellen Quellen, wie Erdreich, durch ein herkömmliches Verfahren zur Isolierung von Actinomyces und Auswählen eines Mikroorganismus, der eine Substanz mit bakterienhemmender Aktivität gegen Botrvtis cinerea erzeugt, erhalten werden. Ein die Erfindung verkörpernder Erzeugerstamm, Streptomyces platensis SAM-0654 wurde beim Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology am 22. Januar 1988 als FERM BP-1668 hinterlegt.
Der Stamm SAM-0654 hat die folgenden taxonomischen Eigenschaften:

1. Morphologie

Das Luftmycel zeigt einfache Verzweigungen und an der Spitze desselben wird eine Spiralsporenkette enthaltend 10 bis 50 oder mehr Sporen gebildet. Die Spore ist semisphärisch (halbmondförmig), hat eine Länge von 0,6 bis 1,0 µm und eine Breite von 0,3 bis 0,4 µm und zeigt eine glatte Oberfläche.

2. Kultureipenschaften in verschiedenen Medie

Das Aussehen bzw. Erscheinungsbild einer Kultur in verschiedenen Medien ist in Tabelle 1 gezeigt. Die Beobachtungen wurden nach Kultivierung bei 28ºC während 21 Tagen durchgeführt. Tabelle 1 Kulturmedium Wachstum Luftmycel vegetatives Mycel lösliches Pigment andere äußere Erscheinungsformen Hefeextrakt-Malzextrakt-Agar (ISP-2) Hafermehl-Agar (ISP-3) Anorganische Salze-Stärke-Agar (ISP-4) Glycerin-Asparagin-Agar (ISP-5) 1/10 V-8-Agar Hefeextrakt-Stärke-Agar 1/10 Kartoffel-Karotten-Agar Calciummalat-Agar (+ Glycerin) gut reichlich moderat kaum weiß bis hell gelblich bis grau braun orange tiefgrün hellgelb hygroskopisch keine Sporenbildung

Physiologische Eigenschaften

(1) Wachstumstemperaturbereich 20ºC bis 37ºC
(2) Gelatineverflüssigung negativ
(3) Stärkehydrolyse positiv
(4) Magermilchkoagulation (37ºC) negativ
(5) Magermilchpeptonisierung (37ºC) negativ
(6) Herstellung von Melanoidpigmenten
Trypton-Hefeextrakt-Agarmedium negativ
Tyrosin-Agarmedium negativ
Pepton-Hefeextrakt-Agarmedium negativ
(7) Nitratreduktion negativ
(8) Verwendung von Kohlenstoffquellen
L-Arabinose - L-Rhamnose -
D-xylose ± Raffinose +
D-Glucose ++ D-Mannitol ++
D-Fructose + Lactose -
Saccharose ++ Salicin -
Inositol ++ Cellulose -

4. Chemotaxonomische Eigenschaften

(1) 2,6-Diaminopimelinsäure
Totalzellhydrolysate der in SAM 0654 enthaltenen L,L-2,6- Diaminopimelinsäure
(2) Chinonsystem
Der Stamm SAM 0654 hat Melachinon-9(H6) und Melachinon- 9(H8) als Hauptchinone.
Aus den vorstehend erwähnten taxonomischen Eigenschaften wird angenommen, daß der vorliegende Stamm SAM-0654 ein zum Stamm Streptomyces gehöriger Actinomyces ist. Der Vergleich des vorliegenden Stammes mit den bekannten Arten des Stammes Streptomyces auf der Basis der vorstehend genannten taxonomischen Eigenschaften zeigte, daß der vorliegende Stamm sehr ähnlich zu Streptomyces platensis (International Journal of Systematic Bacteriology, Vol. 18, Seite 360, 1968) ist.
Demgemäß wurde der vorliegende Stamm SAM-0654 mit einem typisierten Stamm von Streptomyces platensis, nämlich Streptomyces platensis JCM 4662 verglichen und eine Zusammenfassung dieser Ergebnisse ist in Tabelle 2 angegeben. Tabelle 2 Streptomyces platensis JCM 4662 Sporenkette spiralförmig Oberfläche und Form der Sporen glatt, subsphärisch (halbmondförmig) Kultureigenschaften Hefeextrakt-Malzextrakt-Agar (ISP-2) Hafermehl-Agar (ISP-3) Anorganisches Salz-Stärke-Agar (ISP-4) Glycerin-Asparagin-Agar (ISP-5) Luftmycel vegetatives Mycel lösliche Pugmente andere Erscheinungsform weiß bis grau braun gelb hygroskopisch gelblich braun hellgelb braun hell gelblich grau rötlich braun hellbraun Tabelle 2 (Fortsetzung) Streptomyces platensis JCM 4662 Produktion von Melanoidpimenten Gelatineverflüssigung Stärkehydrolyse Magermilchkoagulation und-peptonisierung Verwendung einer Kohlenstoffquelle negativ positiv Glucose, Fructose, Saccharose, Inositol, Raffinose, Mannitol
Wie aus der Tabelle 2 zu sehen ist, sind die Eigenschaften des SAM-0654 sehr ähnlich denen von Streptomyces platensis und der einzige Unterschied ist der Farbton des vegetativen Mycels und der löslichen Pigmente. In dem typisierten Stamm von Streptomyces platensis, Streptomyces platensis JCM 4662, ist der Farbton des vegetativen Mycels und der löslichen Pigmente rötlich. Im Gegensatz dazu ist der Stamm SAM-0654 gelblich&sub5; Nichtsdestoweniger werden diese Unterschiede als nicht ausreichend angesehen, um den Stamm SAM-0654 von Streptomyces platensis zu unterscheiden und der Stamm SAM-0654 wurde als Streptpomyces platensis SAM 0654 identifiziert.
Für die Produktion der vorliegenden Erfindung wird ein Erzeugerstamm vorzugsweise in einem Flüssigmedium unter aeroben Bedingungen durch Schütteln oder durch Belüftung und Agitation kultiviert, obwohl ein Festmedium verwendet werden kann. Jegliches Medium, in welchem ein Erzeugermikroorganismus wachsen und die erfindungsgemäße Verbindung erzeugen kann, kann verwendet werden, solange das Medium eine Kohlenstoffquelle wie Glucose, Lactose, Glycerin, Stärke, Saccharose, Dextrin, Melasse und/oder organische Säuren und eine Stickstoffquelle wie ein hydrolysiertes Proteinprodukt wie Pepton oder Casaminosäure, Fleischextrakt, Hefeextrakt, entfettetes Sojabohnenpellet, Maislaugenflüssigkeit, Aminosäuren, Ammoniumsalze, Nitrate, oder andere organische oder anorganische stickstoffhaltige Substanzen enthält. Anorganische Salze wie verschiedene Phosphate, wie Magnesiumsulfat und/oder Natriumchlorid, können einem Medium zugesetzt werden. Darüber hinaus können Vitamine und nucleinsäureverwandte Verbindungen zur Beschleunigung des Wachstums des Stammes zugesetzt werden. In einigen Fällen kann die Zugabe eines Antischäumungsmittels wie Silicon, Propylenglycolderivate und Sojabohnenöl das Akkumulations- bzw. Anreicherungsniveau der vorliegenden Verbindung erhöhen.
Beim Kultivieren wird vorzugsweise eine Vorkultur in einem kleinen Maßstab hergestellt und die Vorkultur wird in ein Produktionskulturmedium eingebracht, obwohl ein direktes Einbringen zu einem Produktionskulturmedium zugelassen werden kann. Die Kulturbedingungen wie Kulturtemperatur, pH-Wert des Kulturmediums und die Kulturdauer werden so gewählt oder gesteuert, daß die Bedingungen eine maximale Produktion der erf indungsgemäßen Verbindungen ermöglichen. Gewöhnlicherweise wird das Kultivieren bei 25ºC bis 35ºC, einem pH-Wert von 5,5 bis 7,2 unter aeroben Bedingungen während zwei oder drei Tagen durchgeführt.
Während des Kultivierens werden die erfindungsgemäßen Verbindungen in einer Kulturbrühe extrazellulär akkumuliert bzw. angereichert. Aus diesem Grund wird gemäß einer bevorzugten Ausführungsform zum Wiedergewinnen der Produkte eine Kulturbrühe filtriert oder zentrifugiert, um ein die Produkte enthaltendes Filtrat oder Überstand zu erhalten, und die gewünschten Produkte werden aus dem Filtrat oder Überstand zurückgewonnen. Alternativ kann das Produkt direkt aus einer Kulturbrühe gewonnen werden. Der Gewinnungsprozess wird von einem Scheibenverfahren unter Verwendung von Asperillus oryzae oder Botrytis cinerea als Testorganismus oder einem in dem Beispiel beschriebenen Gurkensämling-Assay gefolgt.
Die gewünschte Verbindung wird aus der Kulturbrühe durch verschiedene, gemäß der Natur der gewünschten Verbindung ausgewählte Verfahren isoliert und gereinigt. Nämlich durch Extraktion unter Verwendung eines organischen Lösungsmittels wie 1- Butanol, welches nicht mischbar mit Wasser ist und die gewünschte Verbindung löst, Lösung in einem hochpolaren Lösungsmittel wie Methanol oder Ethanol, Entfernung von Verunreinigungen durch Behandlung mit Hexan oder dergleichen, Gelfiltration über Sephadex, Ionenaustauschchromatographie auf einem Ionenaustauscherharz, Sephadexionenaustauscher oder dergleichen, oder Adsorptionschromatographie an aktivem Kohlenstoff, Siliciumdioxidgel oder Amberlite XAD-1 oder -2, oder eine Kombination davon, können zum Isolieren und Reinigen der gewünschten Verbindung verwendet werden. Ein insbesondere be vorzugtes Adsorbenz, Diaion HP-20 (Mitsubishi Chemical Industry Ltd.), Sepabeads FP-DA13 (Mitsubishi Chemical Industry.), YMC-C&sub1;&sub8; (Yamamura Chemical Laboratories Co. Ltd.) und eine Kombination davon werden erwähnt. Da eine Kulturbrühe aus dem Erzeugerstamm mehr als zehn Analoge enthält, kann die Trennung und Reinigung jeder aktiven Komponente am wirksamsten durch Hochdruckflüssigkeitschromatographie ausgeführt werden.
Figur 1 zeigt ein Komponenten-Trennchromatogramm bei einer Absorption bei 232 nm, das unter Verwendung einer YMC-C&sub1;&sub8;- Säule (50 mm Innendurchmesser und 300 mm Länge, Yamamura Chemical Laboratories Co. Ltd.) und einer Gradientenelution mit 0,1% Ameisensäure enthaltenden 40- bis 60%-igem Acetonitril bei einer Flußrate von 32 ml/Minute erhalten wurde. Jeder Peak wurde fraktioniert, die Komponente gereinigt und von jeder Komponente gefunden, daß sie die nachfolgende Struktur (I) aufweist:
Unter Bezugnahme auf die vorstehend erwähnte allgemeine Formel und Figur 1 stellt:
Peak A in Fig. 1 eine erfindungsgemäße Verbindung (I-a) dar, in der R in der Formel (I) ein Wasserstoffatom ist;
Peak B eine Mischung von Verbindungen (I-b), in der R n- Butyryloxy, und einer Verbindung (I-c), in der R Isobutyryloxy ist, dar;
Peak C eine Mischung einer Verbindung (I-d), in der R Isovaleryloxy, und einer Verbindung (I-e), in der R 2-Methylbutyryloxy ist, dar;
Peak E eine Verbindung (I-f) dar, in der R Cyclohexylcarbonyloxy ist;
Peak F eine Verbindung (I-g) dar, in der R 4-Methylhexanoyloxy ist;
Peak H eine Verbindung (I-h) dar, in der R 6-Methylheptanoyloxy ist: und
Peak 1 eine Mischung einer Hauptverbindung (I-i), in der R Octanoyloxy ist, und einer Verbindung (I-j), in der R C&sub8;H&sub1;&sub5;COO&supmin; ist, dar.
Zusätzlich zu den vorstehend erwähnten Verbindungen wurde gefunden, daß auf der Basis von NMR-Spektren und Massenspektren wenige Verbindungen vorlagen, in denen R z.B. Propionyloxy, Valeryloxy oder 4-Methylvaleryloxy ist.
Die erfindungsgemäßen Verbindungen können in der Form der Salze, wie Hydrochlond, Phosphat, Nitrat vorliegen.
Die vorstehend die Erfindung verkörpernden Verbindungen unterdrücken den Grauschimmel bei niederer Konzentration.
Wenn die erfindungsgemäße Verbindung als ein bakterienwachstumhemmendes Mittel verwendet wird, kann es mit einem Träger vermischt werden, und, falls nötig, mit anderen Additiven, um eine als landwirtschaftliches bakterienwachstumshemmendes Mittel verwendete herkömmliche Formulierung zu bilden. Diese kann fest, e.g. ein feinverteiltes Pulver oder Körnchenmaterial, oder flüssig, e.g. eine Lösung, Emulsion, Suspension, Konzentrat, Aufschlämmung oder dergleichen sein. Geeignete flüssige Träger beinhalten Wasser, Alkohle wie Ethanol, Ethylenglycol, Ketone wie Aceton, Ether wie Dioxan, Cellosolve, aliphatische Kohlenwasserstoffe wie Kerosin, aromatische Kohlenwasserstoffe wie Benzol, Toluol, organische Basen wie Pyridin, halogenierte Kohlenwasserstoffe wie Chloroform, Tetrachlorkohlenstoff; Ester wie Ethylacetat, Fettsäureglycerinester, Nitrile wie Acetonitril, Dimethylformamid und Dimethylsulfoxid.
Geeignete feste Träger beinhalten Pulver von pflanzlichem Ursprung wie Stärke, Weizenmehl und Mineralpulver wie Kaolin, Bentonit, Calciumphosphat, Tone, Talke, Siliciumdioxide. Diese können allein oder in Kombination verwendet werden.
Darüber hinaus werden als Emulgiermittel, Fixiermittel, Durchdringungsmittel oder Dispergiermittel, Seife, Sulfatester höherer Alkohole, Alkylsulfonsäure, Alkylarylsulfonsäure, tertiäre Ammoniumsalze, Oxyalkylamine, Fettsäureester, Polyalkylenoxide und Anhydrosorbit verwendet. Gewöhnlicherweise werden diese Additive in einer Menge von 0,2 bis 10 Gew.-% bezogen auf die Formulierung verwendet. Darüber hinaus können andere bakterienwachstumshemmende Mittel wie Insektizide, Nematozide, Herbizide, Pflanzenwachstumsregulatoren, Pflanzennährstoffe, Düngemittel und/oder Erdmodifiziermittel in die Formulierung eingeschlossen werden.
Bakterienwachstumshemmende Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung können durch herkömmliche Verfahren aus dem 2-Pyranon-Derivat (I), Trägerstoffen, Additiven und dergleichen hergestellt werden.
Die vorliegende Verbindung (I) ist vorzugsweise in einer Menge von 0,5 bis 50 Gew.-% in einer Feststofformulierung und in einer Menge von 5 bis 90 Gew.-% in einer Flüssigformulierung enthalten. Die Flüssigformulierungen werden vorzugsweise durch eine geeignete Menge Wasser, z.B. 50- bis 5000-fach, vor der Anwendung verdünnt.
Die Menge der verwendeten vorliegenden Verbindung (I) und das Verhältnis zu anderen Komponenten in der Zusammensetzung hängt vom Stadium des Wachstums der Pflanzen, auf die die Zusammensetzung aufgebracht wird, der Wachstumsbedingung der Pflanze, der Natur des Pathogens, der Pathologiebedingung, dem Verfahren der Anwendung und dergleichen ab und ist üblicherweise 10 bis 300 g der vorliegenden Verbindung (I) pro 10 Ar. Eine Konzentration der Verbindung (I) in einer zur Verwendung geeigneten Flüssigzusammensetzung ist gewöhnlicherweise 10 bis 1000 ppm. Das Verfahren der Anwendung der Zusammensetzung ist nicht besonders beschränkt und es kann z.B. durch Sprühen, Stäuben oder Irrigation oder in Form einer Saatbeschichtung aufgebracht werden, solange sie sicher und effektiv auf die Zielpflanze aufgebracht wird.

Beispiele:

Die vorliegende Erfindung wird anhand der nachfolgenden nichtbeschränkenden Beispiele näher erläutert.

Beispiel 1

Herstellung der Verbindungen

Zuerst werden 30 1 eines 90 g Glucose, 300 g Pepton, 600 g Maisstärke, 60 g Hefeextrakt, 90 g trockene Hefezellen und 30 g Dikaliumphosphat (pH 7,0) enthaltenden Mediums mit einer reinen Kultur von Streptopmyces platensis SAM-0654 (FERM BP- 1668) beimpft und das Kultivieren wurde in einem kleinen Fermenter bei 28ºC mit Belüftung bei 30 l/Minute und Rühren bei 400 rpm während 40 Stunden durchgeführt.
Die so erhaltene Kulturbrühe wurde zentrifugiert, um 27 l Überstand zu erhalten, welcher anschließend durch eine mit Diaion HP-20 (Mitsubishi Chemical Industry Ltd.) gepackte Säule (14 cm x 33 cm) geleitet wurde, um das Produkt zu adsorbieren. Die Säule wurde mit 30 l Wasser und 36 l 50%-igem Methanol gewaschen und mit 18 l Methanol eluiert, um ein Eluat mit Anti-Aspergillus- (oder Botrytis)-Aktivität zu erhalten. Das Eluat wurde unter verringerten Druck konzentriert, zentrifugiert, um Verunreinigungen zu eliminieren, und 400 ml des Konzentrats wurden auf eine mit Sepabeads FP-DA13 (Mitsubishi Chemical Industry Ltd.) gepackte Säule (5,6 cm x 33 cm) aufgebracht, welche mit Methanol gewaschen worden ist, und die Säule wurde mit Ethanol eluiert. Da eine bakterienwachstumshemmende Aktivität bei einem Elutionsvolumen von 3000 ml bis 6600 ml gefunden wurde, wurde diese Fraktion unter verringertem Druck konzentriert, Wasser dem Konzentrat zugesetzt und die Mischung lyophilisiert, um 800 mg einer Trockenpräparation zu erhalten. Anschließend wurden 100 mg der Trockenpräparation in Methanol gelöst und die Lösung auf eine Hochdruckflüssigkeitschromatographiesäule (YMC C&sub1;&sub8;-Säule, mit einem Innendurchmesser von 50 mm und einer Länge von 300 mm; Yamamura Chemical Laboratories Co&sub4; Ltd.) aufgebracht. Die Elution wurde mit 40% Acetonitril in 0,1% Ameisensäure während 8 Minuten, einem linearen Gradienten von 40% bis 60% Acetonitril in 0,1% Ameisensäure während 60 Minuten und 60% Acetonitril in 0,1% Ameisensäure während 10 Minuten bei einer Flußrate von 32 ml/Minute durchgeführt, während die Adsorption bei 232 nm überwacht wurde, und 25,6 ml-(0,8 Minuten)-Fraktionen wurden erhalten. Dieses Verfahren wurde achtmal wiederholt. Das Chromatogramm ist in Figur 1 gezeigt.
Die Fraktionsnummern 31 bis 33 enthalten einen 13 mg der vorstehend erwähnten Verbindung I-a enthaltenden Peak A,
die Fraktionsnummern 35 bis 37 enthalten einen 50 mg einer Mischung der Verbindung I-b und der Verbindung I-c (1:2) enthaltenden Peak B,
die Fraktionsnummern 44 bis 47 enthalten einen 120 mg einer Mischung der Verbindung I-d und der Verbindung I-e (3:2) enthaltenden Peak C,
die Fraktionsnummern 60 bis 63 enthalten einen 119 mg der Verbindung I-f enthaltenden Peak E,
die Fraktionsnummern 67 bis 69 enthalten einen 35 mg der Verbindung I-g enthaltenden Peak F und
die Fraktionsnummern 81 bis 87 enthalten 84 mg einer Mischung der Verbindung I-h, der Verbindung I-i und der Verbindung I-j (3:2:1) enthaltende Peaks H und I.
Nachfolgend wurden die die Verbindungen I-a und I-c aufweisende Mischung, die die Verbindungen I-d und I-e aufweisende Mischung und die die Verbindungen I-h, I-i und I-j aufweisende Mischung getrennt der Hochdruckflüssigkeitschromatographie unter denselben Bedingungen wie vorstehend beschrieben unterworfen und als Ergebnis davon wurden jeweils die Verbindungen I-b und I-c, die Verbindungen I-d und I-e und die Verbindungen I-h und I-i und I-j isoliert.
Die auf diese Weise erhaltenen Verbindungen I-a bis I-j waren weiße Pulver, zeigten eine maximale UV-Absorption bei 232 nm in Methanol, hatten eine positive Ninhydrin-Reaktion, Ryndon- Smith-Reaktion, Iod-Reaktion, Anisaldehydsschwefelsäure-Reaktion, Phosphomolybdänsäure-Perchlorsäure-Reaktion und eine negative BTB- und p-Anisidin-Reaktion. Da die Verbindung I-j nur in einer geringen Menge erhalten wurde, wurde die genaue Struktur derselben nicht bestimmt. Die Strukturen und physikalisch chemischen Eigenschaften der Verbindungen I-a bis I-i sind in der Tabelle 3 gezeigt. Tabelle 3 Verbindung Molekularformel Rf-Wert* IR-Spektrum NMR-Spektrum Tabelle 3 (Fortsetzung) Verbindung Molekularformel Rf-Wert* IR-Spektrum NMR-Spektrum Tabelle 3 (Fortsetzung) Verbindung Molekularformel Rf-Wert* IR-Spektrum NMR-Spektrum Tabelle 3 (Fortsetzung) Verbindung Molekularformel Rf-Wert* IR-Spektrum NMR-Spektrum Tabelle 3 (Fortsetzung) Verbindung Molekularformel Rf-Wert* IR-Spektrum NMR-Spektrum
* Siliciumdioxidgel-Dünnschichtchromatographie (Merck MPTLC Silica F254); Entwicklungs = Chloroform/Methanol/Wasser 6:4:1; bestimmt durch Bioautographie unter Verwendung von Aspergillus oryzae, Anisaldehydschwefelsäure-Reaktion und Ninhydrin-Reaktion

Test auf Anti-Pilzwirkung

Die erkrankungsunterdrückende Aktivität der vorliegenden Verbindungen I-a, I-c (und I-b), I-d (und I-e), I-f, I-g, I-h und I-i gegen den Grauschimmel wurde gemäß dem nachfolgenden Verfahren getest. Eine Lösung der vorliegenden Verbindung mit einer vorherbestimmten Konzentration wurde mit einem Absorptionsbaumwollblock auf dem Kotyledon eines Gurkensämlings sieben Tage nach der Aussaat aufgebracht. Einen Tag nach der Beschichtung wurde eine Agarscheibe mit einem Durchmesser von 5 mm, die Botrytis cinerea enthielt, auf das beschichtete Kotyledon gelegt, die Pflanze bei 20ºC während drei Tagen inkubiert und die krankheitsunterdrückende Aktivität der getesteten Verbindung beobachtet. Die Ergebnisse sind in der Tabelle 4 gezeigt. In Tabelle 4 ist Botrytis cinerea RR-4 ein Stamm, der gegen bakterienwachstumshemmende Mittel (multiresistenter Stamm) resistent ist, der aus einem erkrankten Sämling der Aubergine isoliert worden ist, und Botrytis cinerea S-9 ein auf bakterienwachstumshemmende Mittel sensitiver Stamm, der aus einem erkrankten Blütenblatt der Orangenblüte isoliert worden ist. Das Ausmaß der krankheitsunterdrückenden Wirkung ist durch Symbole + (keine Lesion), ± (gebildete Lesion mit einem Durchmesser von weniger als 10 mm) und - (gebildete Lesion mit einem Durchmesser von nicht weniger als 10 mm) ausgedrückt. Tabelle 4 Krankheitsunterdrückende Wirkung auf Botrytis cinerea Testverbindung Konzentration (ppm) Botrytis cinerea Procymidon Keine Behandlung

Claims

1. Eine Verbindung, die

(i) eine 2-Pyranonverbindung der Formel

in der R ein Wasserstoffatom oder eine lineare oder verzweigte Alkylcarbonyloxy- oder Cycloalkylcarbonyloxygruppe mit 3 bis 10 Kohlenstoffatomen ist, oder

(ii) deren Salz ist.

2. Verbindung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß R Butyryloxy, Isobutyryloxy, Isovaleryloxy, 2-Methylbutyryloxy, Cyclohexylcarbonyloxy, 4-Methylhexanoyloxy, 6-Methylheptanoyloxy oder Octanoyloxy ist.

3. Verfahren zum Herstellen einer Verbindung nach Anspruch 1 oder Anspruch 2 durch Kultivieren eines Mikroorganismus des Stammes Streptomyces platensis SAM-0654 (FERM BP-1668), um die Verbindung zu erzeugen, und Wiedergewinnen der erzeugten Verbindung aus der Kultur.

4. Fungizidzusammensetzung enthaltend eine wirksame Menge einer Verbindung nach Anspruch 1 oder Anspruch 2.

5. Zusammensetzung nach Anspruch 4 mit einem Träger, der

ein Festpulver- oder granulärer Träger ist und in dem die Verbindung von 0,5 bis 50 Gew.-% der Zusammensetzung darstellt, oder

ein flüssiger Träger ist, in welchem die Verbindung von 5 bis 90 Gew.-% der Zusammensetzung darstellt, die für die Verdünnung auf 10 bis 1000 ppm der Verbindung ist.

6. Mikroorganismus Streptomyces platensis SAM-0654 (FERM BP- 1668).

7. Verfahren zum Behandeln von Pflanzen zum Zerstören des pathogenen Pilzes Botrytis cinerea durch Aufbringen einer Verbindung nach Anspruch 1 oder Anspruch 2 auf die Pflanzen.

8. Verfahren nach Anspruch 7,

die Verbindung von 10 bis 300 g pro 10 Ar aufgebracht wird.