DE60036029T2

DE60036029T2 - Basismaterialien zur geweberegeneration, transplantatmaterialien und verfahren zur herstellung selbiger

Info

Publication number: DE60036029T2
Application number: DE60036029T
Authority: DE
Inventors: Nobuhiko Nomi-gun YUI; Tooru Ishikawa-gun OOYA; Masakazu Gamagori-shi KATO; Takeyuki Gamagori-shi Yamamoto
Original assignee: Japan Tissue Engineering Co Ltd
Current assignee: Japan Tissue Engineering Co Ltd
Priority date: 2000-07-03
Filing date: 2000-11-27
Publication date: 2008-04-30
Anticipated expiration: 2020-11-28
Also published as: WO2002002159A1; EP1316321B1; CN1208094C; KR20030020895A; AU2001215528A1; EP1316321A1; EP1316321A4; US20030124168A1; JP4753525B2; KR100714742B1; DE60036029D1; CN1454100A

Description

Technisches Gebiet
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Ausgangsmaterial zum Wiederaufbau von Gewebe und ein implantierbares Material, das in medizinischen Bereichen, wie beispielsweise orthopädischer Chirurgie, Zahnchirurgie und plastischer Chirurgie in großem Umfang verwendet werden kann, sowie ein Verfahren zum Herstellen des implantierbaren Materials.
Stand der Technik
In der letzten Zeit hat sich Tissue Engineering (Gewebezüchtung) zum Regenerieren und Wiederaufbauen humaner Gewebe für die Behandlung schnell entwickelt. Im Bereich des Tissue Engineering wurden seit den frühen 1980er Jahren ausgiebige Studien durchgeführt, um für die Behandlung orthopädischer Operationen und dergleichen Hautzellen, Chondrocyten und Neurone in abbaubaren und nicht-abbaubaren Materialen zu kultivieren.
Beim Tissue Engineering gibt es einige bekannte Behandlungstechniken. Bei einer Behandlungstechnik wird eine als Gerüst für den Wiederaufbau von Gewebe fungierende Matrix in den lebenden Körper implantiert und bewirkt eine Vermehrung der Zellen in vivo. Bei einer weiteren Behandlungstechnik werden Zellen auf der Matrix als Gerüst in vitro kultiviert und vermehrt und die kultivierten Zellen (Gewebe) werden allein oder mit der Matrix in den lebenden Körper implantiert.
Es gibt eine Vielfalt an bekannten, aus Gewebe stammenden Biomaterialien und synthetischen Materialien für die als Gerüst zum Wiederaufbau von Gewebe fungierende Matrix. Zum Beispiel ermöglichen die Matrices aus Kollagen oder Polyglykolsäure die dreidimensionale Kultur von Zellen und werden in vivo abgebaut und absorbiert.
Die Abbauprodukte dieser Matrices können jedoch Entzündungen hervorrufen. Zudem treten bei der Steuerung des Abbaus und der Zeit bis zum Verschwinden Schwierigkeiten auf; zum Beispiel kann die Matrix vor dem Wiederaufbau der Gewebe abgebaut werden oder die Matrix kann selbst lange nach dem Wiederaufbau der Gewebe nicht abgebaut werden.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist daher, die oben erörterten Probleme zu lösen und ein Ausgangsmaterial für den Wiederaufbau von Gewebe bereitzustellen, das den Wiederaufbau von Gewebe ermöglicht und physikalische Eigenschaften aufweist, die für den Wiederaufbau von Gewebe erforderlich sind, sowie die Eigenschaften, nach dem Wiederaufbau der Gewebe in vivo abbaubar zu sein und zu verschwinden. Aufgabe der Erfindung ist auch, ein implantierbares Material, das einen günstigen Wiederaufbau von Gewebe ermöglicht und nach dem Wiederaufbau der Gewebe die Eigenschaften besitzt, in vivo abbaubar zu sein und zu verschwinden, und ein Verfahren zum Herstellen eines solchen implantierbaren Materials bereitzustellen.
Offenbarung der Erfindung
Um die vorstehend genannten Probleme zu lösen, stellt die vorliegende Erfindung ein Ausgangsmaterial zum Wiederaufbau von Gewebe bereit, das hauptsächlich aus einem Polyrotaxan-Hydrogel besteht, wobei das Polyrotaxan biokompatible Gruppen mit jeweils einem sperrigen Substituenten aufweist, die durch hydrolysierbare in vivo Bindungen an eines von beiden Enden eines linearen Moleküls mit zahlreichen darauf aufgefädelten cyclischen Molekülen eingeführt werden und worin das Polyrotaxangel eine Netzwerkstruktur aufweist, die durch Vernetzung zwischen den cyclischen Molekülen, zwischen den biokompatiblen Gruppen oder zwischen den cylischen Molekülen und den biokompatiblen Gruppen in benachbarten Polyrotaxanmolekülen gebildet wird.
Die Anwendung des Ausgangsmaterials zum Wiederaufbau von Gewebe, das gemäß der vorliegenden Erfindung hauptsächlich aus Polyrotaxan-Hydrogel besteht, zum Kultivieren von Chondrocyten bewirkt eine Vermehrung der Zellen, während die intrinsischen Eigenschaften der Chondrocyten erhalten bleiben. Die Implantation des Ausgangsmaterials zum Wiederaufbau von Gewebe allein in vivo beeinträchtigt nicht die intrinsischen Eigenschaften oder die Vermehrung der Zellen, sondern stellt einen erfolgreichen Wiederaufbau von Gewebe sicher.
Das in der Erfindung verwendete Polyrotaxan-Hydrogel weist für den Wiederaufbau von Gewebe erforderliche physikalische Eigenschaften auf. Dies kann der hohen Kristallinität des Polyrotaxans und des Polyrotaxan-Hydrogels aufgrund ihrer supramolekularen Strukturen zugeschrieben werden, in denen verschiedene Moleküle, das heißt lineare Moleküle und cyclische Moleküle, mechanisch ineinander verzahnt sind (nicht-kovalente Bindung).
Das in der Erfindung verwendete Polyrotaxan-Hydrogel besitzt auch die Eigenschaften, nach dem Wiederaufbau der Gewebe in vivo abbaubar zu sein und zu verschwinden. Dies kann dessen hydrolysierbaren Bindungen zugeschrieben werden. Die Hydrolyse der hydrolysierbare Bindungen in vivo bewirkt, dass die sperrigen, biokompatiblen Gruppen (d.h. Stopper) von beiden Enden des linearen Moleküls entfernt werden. Das Entfernen der Stopper ermöglicht, dass die cyclischen Moleküle von dem linearen Molekül freigesetzt werden. Dies führt zu einem Abbau und dem Verschwinden des Polyrotaxan-Hydrogels.
Wie oben erörtert; ermöglicht das Ausgangsmaterial zum Wiederaufbau von Gewebe gemäß der vorliegenden Erfindung den Wiederaufbau von Gewebe und weist physikalische Eigenschaften auf, die für den Wiederaufbau von Gewebe erforderlich sind, sowie die Eigenschaften, nach dem Wiederaufbau der Gewebe in vivo abbaubar zu sein und zu verschwinden. Dieses Ausgangsmaterial ist daher für den Wiederaufbau von Geweben aus den Zellen geeignet.
In dem Ausgangsmaterial zum Wiederaufbau der vorliegenden Erfindung sind das lineare Molekül und das cyclische Molekül nicht besonders beschränkt, solange sie Biokompatibilität (die Eigenschaften, die für die lebenden Körper im Wesentlichen unschädlich sind) besitzen. Das lineare Molekül ist vorzugsweise eines oder mehrere, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Polyethylenglykol, Polypropylenglykol, Copolymeren von Polyethylenglykol und Polypropylenglykol und Polymethylvinylether. Die Auswahl des cyclischen Moleküls und des linearen Moleküls mit hervorragender Biokompatibilität ermöglicht, dass das synthetisierte Polyrotaxan oder Polyrotaxan-Hydrogel die hohe Biokompatibilität und die Eigenschaften, die für das implantierbare Material zum Wiederaufbau von Gewebe geeignet sind, zeigen kann. Das bevorzugte durchschnittliche Molekulargewicht des linearen Moleküls liegt in einem Bereich von 200 bis 50000 oder stärker bevorzugt von 400 bis 5000. Bevorzugte Beispiele für das cyclische Molekül sind α-, β- und γ-Cyclodextrine, obwohl auch andere Verbindungen mit analogen, cyclischen Strukturen ebenso verwendbar sind. Bespiele für solche Verbindungen schließen cyclische Polyether, cyclische Polyester, cyclische Polyetheramine und cyclische Polyamine ein. Eine günstige Kombination des linearen Moleküls und des cyclischen Moleküls ist α-Cyclodextrin und Polyethylenglykol.
In dem Ausgangsmaterial zum Wiederaufbau von Gewebe der vorliegenden Erfindung kann die hydrolysierbare Bindung eine beliebige Bindung sein, die in vivo hydrolysiert wird. Ein bevorzugtes Beispiel ist eine Esterbindung, die auf nicht-enzymatische Weise in vivo schnell hydrolysiert wird.
In dem Ausgangsmaterial zum Wiederaufbau von Gewebe, das aus dem Polyrotaxangel besteht, ist die Vernetzung vorzugsweise eine beliebige Bindung von einer Urethanbindung, einer Amidbindung, einer Carbamidbindung, einer Etherbindung, einer Sulfidbindung und einer Schiffschen-Basen-Bindung. In dem Fall des Vernetzens der cyclischen Moleküle ist es bevorzugt, dass die Vernetzung gegenüber Wasser stabiler ist als die hydrolysierbare Bindung. Der schnellere Abbau der hydrolysierbaren Bindung bewirkt, dass die biokompatiblen Gruppen mit sperrigen Substituenten von beiden Enden des linearen Moleküls abgelöst werden. Die vernetzten cyclischen Moleküle werden dann auf einmal freigesetzt. Dies ergibt ein günstiges Abbaumuster.
In dem Ausgangsmaterial zum Wiederaufbau von Gewebe der vorliegenden Erfindung können die biokompatiblen Gruppen an beiden Enden des linearen Moleküls beliebige Gruppen sein, die eine hohe Affinität zu den lebenden Körpern besitzen (das heißt Gruppen, die den lebenden Körpern eine hohe Sicherheit bieten). Bevorzugte Beispiele sind Aminosäuren, Oligopeptide, Oligosaccharide und Zuckerderivate. Typische Beispiele für die Aminosäure schließen Alanin, Valin, Leucin, Isoleucin, Methionin, Prolin, Phenylalanin, Tryptophan, Asparaginsäure, Glutaminsäure, Glycin, Serin, Threonin, Tyrosin, Cystein, Lysin, Arginin und Histidin ein. Typische Beispiele für das Oligopeptid schließen solche ein, die durch Peptidbindung einer Vielzahl der aus den oben genannten Beispielen ausgewählten Aminosäuren gebildet wurden. Typische Beispiele für das Oligosaccharid schließen solche mit 1 bis 5 sich wiederholenden Einheiten ein, die aus Dextran, Hyaluronsäure, Chitin, Chitosan, Alginsäure, Chondroitinsulfat und Stärke als Polysaccharidbestandteil bestehen. Typische Beispiele für das Zuckerderivat schließen chemisch modifizierte Verbindungen, wie acetylierte oder isopropylierte Oligosaccharide, Polysaccharide und Monosaccharide ein. Besonders bevorzugt sind Aminosäuren mit Benzolringen, wie L-Phenylalanin, L-Tyrosin und L-Tryptophan.
In dem Ausgangsmaterial zum Wiederaufbau von Gewebe der vorliegenden Erfindung kann der sperrige Substituent der biokompatiblen Gruppe eine beliebige Gruppe sein, die einem Freisetzen der cyclischen Moleküle von dem linearen Molekül vorbeugt. Bevorzugte Beispiele sind Gruppen mit wenigstens einem Benzolring und Gruppen mit wenigstens einem tertiären Butyl. Beispiele für die Gruppe mit wenigstens einem Benzolring schließen eine Benzyloxycarbonyl (Z)-Gruppe, eine 9-Fluorenylmethyloxycarbonyl (Fmoc)-Gruppe und eine Benzylester (OBz)-Gruppe ein. Beispiele für die Gruppe mit wenigstens einem tertiären Butyl schließen eine tertiäre Butylcarbonyl (Boc)-Gruppe und eine Aminosäure-tertiäre Butylester (OBu)-Gruppe ein. Eine Benzyloxycarbonylgruppe ist besonders bevorzugt.
In dem Ausgangsmaterial zum Wiederaufbau von Gewebe der vorliegenden Erfindung ist besonders bevorzugt, dass das lineare Molekül Polyethylenglykol, das cyclische Molekül α-Cyclodextrin, die hydrolysierbare Bindung eine Esterbindung und die biokompatible Gruppe mit dem sperrigen Substituenten Benzyloxycarbonyl-L-phenylalanin ist. In der Struktur der auf das lineare Polyethylenglykol-Rückgrat aufgefädelten α-Cyclodextrinmoleküle beträgt das stöchiometrische Verhältnis von α-Cyclodextrin zu den sich wiederholenden Einheiten des Ethylenglykols 1 bis 2.
Das Ausgangsmaterial zum Wiederaufbau von Gewebe der vorliegenden Erfindung besteht aus dem Polyrotaxan-Hydrogel, wobei die Abbaurate des Polyrotaxan-Hydrogels durch Verändern der Gewichtsprozent des Polyrotaxans in dem Polyrotaxan-Hydrogel (das heißt das Gewichtsverhältnis des Polyrotaxans zu dem Polyrotaxan-Hydrogel) reguliert werden kann. Dies ist unsere neue Erkenntnis durch die Untersuchung. Basierend auf dieser Erkenntnis bestimmt eine bevorzugte Anordnung die Gewichtsprozent des Polyrotaxans in dem Polyrotaxan-Hydrogel. Die Vorgehensweise legt im Vorhinein eine für die Anwendung des Ausgangsmaterials zum Wiederaufbau von Gewebe geeignete Abbaurate fest und bestimmt die Gewichtsprozent des Polyrotaxans in dem Polyrotaxan-Hydrogel, um die festgelegte Abbaurate zu erreichen. Dies stellt das für die Anwendung geeignete Ausgangsmaterial zum Wiederaufbau von Gewebe bereit.
Wenn das Ausgangsmaterial zum Wiederaufbau von Gewebe der vorliegenden Erfindung aus dem Polyrotaxan-Hydrogel besteht, welche eine Vernetzung zwischen den cyclischen Molekülen (zwischen den biokompatiblen Gruppen oder zwischen dem cyclischen Molekül und der biokompatiblen Gruppe) in benachbarten Molekülen des Polyrotaxans über ein vernetzendes, lineares Molekül aufweist, kann die Abbaurate oder das Abbaumuster des Polyrotaxan-Hydrogels durch Ändern des durchschnittlichen Molekulargewichts des vernetzenden, linearen Moleküls reguliert werden. Dies ist ebenso unsere neue Erkenntnis durch die Untersuchung. Basierend auf dieser Erkenntnis bestimmt eine bevorzugte Anordnung das durchschnittliche Molekulargewicht des vernetzenden Moleküls. Die Vorgehensweise legt im Vorhinein eine für die Anwendung des Ausgangsmaterials zum Wiederaufbau von Gewebe geeignete Abbaurate oder ein Abbaumuster fest und bestimmt das durchschnittliche Molekulargewicht des vernetzenden, linearen Moleküls, um die festgelegte Abbaurate oder das festgelegte Abbaumuster zu erreichen. Dies stellt das für die Anwendung geeignete Ausgangsmaterial zum Wiederaufbau von Gewebe bereit.
Das Abbaumuster kann ein Muster eines stufenweisen Abbaus in vivo oder ein Muster des plötzlichen Abbaus in vivo nach Ablauf einer bestimmten Zeit ohne einen wesentlichen Abbau sein. Bevorzugte Beispiele für das vernetzende, lineare Molekül sind biokompatible Polymere, wie Polyethylenglykol, Polypropylenglykol und Copolymere von Polyethylenglykol und Polypropylenglykol. Das durchschnittliche Molekulargewicht liegt bevorzugt in einem Bereich von 0 bis 50000. Das Festlegen des Molekulargewichts der Vernetzung auf '0' bezeichnet eine direkte Verbindung ohne jegliches vernetzendes, lineares Molekül. Eine Vernetzung an beiden Enden des vernetzenden, linearen Moleküls ist erwünscht.
Das Ausgangsmaterial zum Wiederaufbau von Gewebe der vorliegenden Erfindung ist eines, das hauptsächlich aus einem Polyrotaxan-Hydrogel besteht und wünschenswerter Weise die unten stehenden Eigenschaft (a) und/oder (b) besitzt, wobei das Polyrotaxan-Hydrogel eine Netzwerkstruktur aufweist, die durch Vernetzen der cyclischen Moleküle in benachbarten Molekülen eines Polyrotaxans über ein vernetzendes, lineares Molekül gebildet wird, worin das Polyrotaxan biokompatible Gruppen mit jeweils einem sperrigen Substituenten aufweist und über eine hydrolytische Bindung an eines von beiden Enden eines linearen Moleküls mit zahlreichen darauf aufgefädelten cyclischen Molekülen eingeführt wird:

a) worin eine Zeit für die vollständige Hydrolyse des Po(lyrotaxan-Hydrogels unabhängig von dessen Wassergehalt ist, jedoch mit jeweils einer Abnahme des Polyrotaxangehalts im Polyrotaxan-Hydrogel, dem Anstieg im Molverhältnis des vernetzenden, linearen Moleküls zu dem cyclischen Molekül und einer Abnahme des durchschnittlichen Molekulargewichts des vernetzenden, linearen Moleküls verlängert wird.
(b) wobei ein Abbaumuster, das als Graph mit t/t_∞ als Abszisse und M_t/M₀ als Ordinate dargestellt ist, unabhängig von dem Gehalt des Polyrotaxans in dem yrotaxan-HydrogePoll ist, aber vom Molekulargewicht des vernetzenden, linearen Moleküls abhängt, wobei t_∞ die Zeit bis zur vollständigen Hydrolyse des Polyrotaxan-Hydrogels bezeichnet, t die abgelaufene Zeit bezeichnet, M₀ das Anfangsgewicht des Polyrotaxan-Hydrogels im durch Wasser gequollenen Zustand bezeichnet und M_t ein Gewicht des Polyrotaxan-Hydrogels zum Zeitpunkt t bezeichnet.

Wenn das Polyrotaxan-Hydrogel die Eigenschaft (a) aufweist, legt die Vorgehensweise im Vorhinein eine für eine Anwendung des Ausgangsmaterials zum Wiederaufbau von Gewebe geeignete Abbaurate fest und bestimmt die Prozent (den Gehalt) des Polyrotaxans in dem Polyrotaxan-Hydrogel, das Molverhältnis des vernetzenden, linearen Moleküls zu dem cyclischen Molekül oder das durchschnittliche Molekulargewicht des vernetzenden, linearen Moleküls, um die festgelegte Abbaurate zu erreichen. Dies stellt das für die Anwendung geeignete Ausgangsmaterial zum Wiederaufbau von Gewebe bereit.
Wenn das Polyrotaxan-Hydrogel die Eigenschaft (b) aufweist, legt die Vorgehensweise andererseits im Vorhinein ein für eine Anwendung des Ausgangsmaterials zum Wiederaufbau von Gewebe geeignetes Abbaumuster fest und bestimmt das durchschnittliche Molekulargewicht des vernetzenden, linearen Moleküls zum Erreichen des festgelegten Abbaumusters. Dies stellt das für die Anwendung geeignete Ausgangsmaterial zum Wiederaufbau von Gewebe bereit. Das durchschnittliche Molekulargewicht des vernetzenden, linearen Moleküls legt in einem Bereich von 4000 bis 10000, um das Muster des plötzlichen Abbaus in vivo nach Ablauf einer bestimmten Zeit ohne wesentlichen Abbau zu erreichen.
Typische Beispiele für das Ausgangsmaterial zum Wiederaufbau von Gewebe mit der Eigenschaft (a) und/oder (b) sind, dass das cyclische Molekül α-Cyclodextrin, das lineare Molekül Polyethylenglykol, die hydrolytische Bindung eine Esterbindung, das vernetzende, lineare Molekül Polyethylenglykol-bisamin ist und das Polyrotaxan- Hydrogel eine Netzwerkstruktur aufweist, die durch Vernetzen von OH-Gruppen der α-Cyclodextrine, die in benachbarten Molekülen des Polyrotaxans über Urethanbindungen von NH₂-Gruppen an beiden Enden des Polyethylenglykol-bisamins eingeschlossen sind, gebildet wird.
Das Ausgangsmaterial zum Wiederaufbau von Gewebe der vorliegenden Erfindung kann in beliebigen, geeigneten Formen, die eine Kultur oder ein Einbetten von Zellen ermöglichen, angewendet werden. Zum Beispiel können Zellen auf einer Schicht des Ausgangsmaterials, auf einem Gel des Ausgangsmaterials, in einer Lösung oder in einer Suspension desselben ausgesät werden. Aufgrund seiner Eigenschaften, Zellen leicht zu halten und zu kultivieren ist eine poröse Struktur des Polyrotaxans oder des Polyrotaxan-Hydrogels erwünscht. Die Poren der porösen Struktur sind nicht besonders beschränkt, sollten jedoch eine geeignete Größe und Dichte aufweisen, um die Zellen darin zu halten. Wenn das Ausgangsmaterial zum Wiederaufbau von Gewebe nicht mit Zellen kombiniert wird, sondern allein in vivo implantiert wird, besteht keine Einschränkung für die Form desselben. Die poröse Struktur wird jedoch bevorzugt, da sie die gewünschte Umgebung für eine Vermehrung der Zellen aus den um das implantierte Stück herum liegenden Geweben bereitstellt. Die Poren der porösen Struktur sind nicht besonders beschränkt, sollten jedoch eine geeignete Größe und Dichte aufweisen, um ein Eindringen der Zellen aus den um das implantierte Stück herum liegenden Geweben und eine Vaskularisierung zu ermöglichen. Zum Erzeugen der porösen Struktur ist jede beliebige Technik anwendbar: zum Beispiel die Gelbildung in Anwesenheit von Natriumchlorid oder das Lyophilisieren des Wasser enthaltenden Hydrogels.
Bei dem Ausgangsmaterial zum Wiederaufbau von Gewebe der vorliegenden Erfindung kann die Oberfläche mit einer die Zelladhäsion fördernden Substanz beschichtet sein. Die die Zelladhäsion fördernde Substanz ist jede beliebige Substanz mit der Eigenschaft, die Adhäsion von Zellen zu fördern. Typische Beispiele sind Collagen und Gelatine. Das Beschichtungsverfahren ist nicht besonders beschränkt, kann jedoch jede beliebige, herkömmliche Vorgehensweise sein. In einem einfachen Ver fahren wird eine poröse Struktur hergestellt, die poröse Struktur in der die Zelladhäsion fördernde Substanz eingeweicht und die eingeweichte poröse Struktur gefriergetrocknet.
Das Ausgangsmaterial zum Wiederaufbau von Gewebe kann zur Kultur oder zum Einbetten von beliebigen Zellen verwendet werden. Zum Beispiel wird das Ausgangsmaterial zur Kultur von Mesenchymzellen, Leberzellen und Neuronen angewendet. Die Mesenchymzellen schließen Chondrocyten, Fibroblasten, Osteoblasten, Myoblasten, Lipocyten, Endothelzellen, Epithelzellen und deren Vorläufer-Zellen ein. Das Ausgangsmaterial zum Wiederaufbau von Gewebe der vorliegenden Erfindung wird in effektiver Weise für die Kultur von Chondrocyten angewendet.
Um den Wiederaufbau von Geweben mit dem Ausgangsmaterial zum Wiederaufbau von Gewebe der vorliegenden Erfindung zu erreichen, kann in dem Verfahren das Polyrotaxan oder das Polyrotaxan-Hydrogel allein angewendet, die Zellen einfach in das Ausgangsmaterial zum Wiederaufbau von Gewebe eingebettet oder die Zellen einfach in dem Ausgangsmaterial zum Wiederaufbau von Gewebe vermehrt werden.
Zum Fixieren der Zellen sind verschiedene Techniken anwendbar. Bei einer verfügbaren Vorgehensweise zum Fixieren wird eine hohe Konzentration einer Zellsuspension zu dem Polyrotaxan-Hydrogel zugegeben und bewirkt, dass die Zellen unter Aufquellen des Gels in die Gelporen eingebettet werden. Eine weitere verfügbare Vorgehensweise zum Fixieren ist eine Rotationskultur. Bei einer noch weiteren verfügbaren Vorgehensweise zum Fixieren werden Zellen ausgesät und dann der Druck auf einen bestimmten Wert, der die Zellen nicht maßgeblich beeinflusst, verringert.
Ein implantierbares Material, das das Ausgangsmaterial zum Wiederaufbau von Gewebe der vorliegenden Erfindung mit darin kultivierten oder darin eingebetteten Zellen einschließt, ermöglicht den Wiederaufbau von Geweben. Zum Herstellen des implantierbaren Materials ist jedes beliebige Verfahren anwendbar. Eine bevorzugte Vorgehensweise stellt eine geeignete Größe und Form des Ausgangsmaterials zum Wieder aufbau von Gewebe gemäß der Anmeldung bereit und bewirkt anschließend das Kultivieren der Zellen auf oder das Einbetten der Zellen in dem Ausgangsmaterial zum Wiederaufbau von Gewebe, um das implantierbare Material zu erhalten. Wenn zum Beispiel das implantierbare Material zum Wiederaufbau eines Knorpels des Ohrs angewendet wird, wird bei der Vorgehensweise das Ausgangsmaterial zum Wiederaufbau von Gewebe entsprechend dem Zielort an dem Ohr geformt und verarbeitet, eine Zellsuspension in das verarbeitete Ausgangsmaterial zum Wiederaufbau von Gewebe injiziert und die Zellen für eine vorgegebene Zeitspanne zum Erhalt des implantierbaren Materials kultiviert. Das so erhaltene, implantierbare Material wird in den Zielort des Ohrs eingebettet. Bei einer weiteren verfügbaren Vorgehensweise werden zunächst Zellen auf dem Ausgangsmaterial zum Wiederaufbau von Gewebe kultiviert oder Zellen in dasselbe eingebettet, um ein implantierbares Material zu erhalten und das implantierbare Material wird zu einer geeigneten Größe und Form entsprechend dem Zielort zu dem Zeitpunkt der wirklichen Anwendung oder zu dem Zeitpunkt der Übertragung geformt und verarbeitet.
In dem implantierbaren Material, bei dem die Chondrocyten auf dem Ausgangsmaterial zum Wiederaufbau von Gewebe, das aus dem Polyrotaxan oder dem Polyrotaxan-Hydrogel besteht, kultiviert werden, werden die kultivierten Zellen vermehrt und erzeugen intensiv ein Knorpelsubstrat, während die intrinsischen Eigenschaften der Chondrocyten beibehalten werden. Das Knorpelgewebe wird hauptsächlich mit den Chondrocyten und dem von den Chondrocyten erzeugten Substrat repariert. Der hohe Gehalt der Chondrocyten und des Knorpelsubstrats bedeutet, dass das implantierbare Material ein großes Vermögen zum Wiederaufbauen von Gewebe besitzt. Die Vorteile der Kultur sind, dass die zum Reparieren der Gewebe erforderlichen Zellen vermehrt werden und dass die Produkte der Zellen (das Substrat und der Wachstumsfaktor) auf dem implantierbaren Material getragen werden. Selbst wenn die Zellen aus irgendeinem Grund zerstört werden, bleiben das Substrat und der Wachstumsfaktor, die von den Zellen produziert wurden, in dem implantierbaren Material übrig, so dass sie effektiv den Wiederaufbau von Geweben bewirken. In dem Fall, in dem die Chondrocyten einfach auf dem Ausgangsmaterial zum Wiederaufbau ausgesät werden, das heißt, wenn die Chondrocyten einfach ohne Vermehrung in das Ausgangsmaterial eingebettet werden, behalten die eingebetteten Zellen ihre intrinsischen Eigenschaften und beginnen den Wiederaufbau der Gewebe unmittelbar nach der Implantation zu bewirken. Diese Anordnung stellt damit auch ein wirksames, implantierbares Material bereit.
Kurzbeschreibung der Figuren
1 zeigt ein Verfahren zum Synthetisieren eines biologisch abbaubaren Polyrotaxans;
2 zeigt ein Verfahren zum Synthetisieren eines biologisch abbaubaren Polyrotaxan-Hydrogels;
3 ist ein Graph, der das nicht-enzymatische, hydrolytische Verhalten der Polyrotaxan-Hydrogele PRHG-5, 6 zeigt;
4 ist ein Graph, der die Abbaumuster der Polyrotaxan-Hydrogele PRHG-5, 6 zeigt;
5 ist ein Graph, der das nicht-enzymatische, hydrolytische Verhalten der Polyrotaxan-Hydrogele PRHG-7 bis einschließlich 9 zeigt;
6 ist ein Graph, der die Abbaumuster der Polyrotaxan-Hydrogele PRHG-7 bis einschließlich 9 zeigt;
7 sind Graphen, die das Abbauverhalten der Polyrotaxan-Hydrogele mit Veränderungen des Polyrotaxangehalts unter der Bedingung eines festgesetzten Molekulargewichts des PEG-Eisamins zeigen;
8 ist ein Graph, der die Beziehung zwischen dem Polyrotaxangehalt und der Zeit für den vollständigen Abbau zeigt;
9 ist ein Graph, der die Beziehung zwischen dem Polyrotaxangehalt und dem Wassergehalt zeigt;
10 ist ein Graph, der die Zeit für den vollständigen Abbau zeigt, die gegen das PEG/α-CD-Verhältnis abgebildet ist;
11 sind Graphen, die die Abbaumuster mit t/t_∞ als Abszisse und M_t/M₀ als Ordinate zeigen;
12 zeigt die Änderungen in einer Kultur von Kaninchen-Chondrocyten auf den Polyrotaxan-Hydrogelen PRHG-1, 2 über die Zeit.
Beste Ausführungsformen der Erfindung
Unten werden bevorzugte Beispiele der Erfindung erörtert, obwohl die Erfindung keineswegs auf diese Beispiele beschränkt ist.
(1) Synthese von biologisch abbaubarem Polyrotaxan (siehe 1)
(1-1) Synthese von PEG mit Aminogruppen an beiden Enden
Polyethylenglykol (PEG) (33 g, 10 mmol) mit einem Molekulargewicht von 3300 und Bernsteinsäureanhydrid (20 g, 200 mmol) wurden in Toluol (220 ml) gelöst. Die resultierende Lösung war bei 150 °C 5 Stunden unter Rückfluss. Nach Beendigung der Reaktion wurde die Lösung in einen Überschuss Diethylether gegossen, filtriert und unter reduziertem Druck getrocknet. Ein auf diese Weise erhaltenes Rohprodukt wurde in Dichlormethan gelöst. Nach Entfernen einer unlöslichen Substanz mittels Zentrifugieren wurde die Lösung in einen Überschuss Diethylether gegossen, filtriert und unter reduziertem Druck getrocknet. Dies ergab PEG mit Carboxylgruppen an dessen beiden Enden (Verbindung A) als weißes Pulver.
Die Verbindung A (20 g, 5,7 mmol) und N-Hydroxysuccinimid (HOSu) (17,1 g, 148,2 mmol) wurden in einer gemischten Lösung aus 1,4-Dioxan und Dichlormethan (350 ml, Volumenverhältnis 1:1) gelöst. Nach Abkühlen der Lösung mit Eis wurde Dicyclohexylcarbodiimid (DCC) (23,5 g, 114 mmol) zu der Lösung gegeben. Die resultierende Lösung wurde unter Kühlen mit Eis 1 Stunde gerührt und über Nacht bei Raumtemperatur weiter gerührt. Nachdem Dicyclourethan als Nebenprodukt herausgefiltert worden war wurde das Filtrat eingeengt, in einen Überschuss Diethylether gegossen, filtriert und unter reduziertem Druck getrocknet. Dies ergab PEG mit aktivierten Carboxylgruppen (Verbindung B) als weißes Pulver.
Eine Dichlormethanlösung (75 ml) der Verbindung B (10 g, 2,7 mmol) wurde tropfenweise zu einer Dichlormethanlösung (75 ml) von Ethylendiamin (0,4 ml, 6 mmol) gegeben. Nach Beenden der tropfenweisen Zugabe wurde die Lösungsmischung 1 Stunde bei Raumtemperatur gerührt. Nach Beendigung der Reaktion wurde die Lösung in einen Überschuss Diethylether gegossen, filtriert und unter reduziertem Druck getrocknet. Dies ergab PEG mit Aminogruppen an beiden Enden (Verbindung C), als weißes Pulver.
(1-2) Herstellen von Pseudopolyrotaxan
Eine wässrige Lösung (20 ml) der Verbindung C (4 g, 1,12 mmol) wurde tropfenweise bei Raumtemperatur zu einer gesättigten wässrigen Lösung (311 ml) α-Cyclodextrin (α-CD) (48 g, 49,2 mmol) zugegeben. Die resultierende Lösung wurde 1 Stunde unter Bestrahlung mit Ultraschallwellen gerührt und 24 Stunden lang bei Raumtemperatur weiter gerührt. Mittels Zentrifugieren wurde ein weißer Niederschlag rückgewonnen und bei 50 °C unter reduziertem Druck getrocknet. Dies ergab ein weißes Pulver von Pseudopolyrotaxan.
Das Polyrotaxan weist eine große Anzahl an cyclischen Molekülen (zum Beispiel Cyclodextrin), die auf einem linearen Molekül (zum Beispiel PEG) aufgefädelt sind und sperrige Stopper-Substituenten an beiden Enden des linearen Moleküls auf.
Das Pseudopolyrotaxan weist keine sperrigen Stopper-Substituenten an beiden Enden des Polyrotaxans auf.
(1-3) Herstellen der terminalen Stopper-Komponenten
Für das Einführen von Benzyloxycarbonyl-L-phenylalanin (Z-L-Phe: Z bezeichnet eine Benzyloxycarbonylgruppe) als sperrige Substituenten zum Vorbeugen einer Desorption von α-CD wurde die Carboxylgruppe von Z-L-Phe aktiviert.
Z-L-Phe (100 g, 334 mmol) wurde in 1,4-Dioxan (800 ml) gelöst. Unter Kühlen mit Eis wurde HOSu (38,42 g, 334 mmol) zu der Lösung gegeben. Nach 1 Stunde wurde langsam eine 1,4-Dioxanlösung (200 ml) von DCC (75,7 g, 367 mmol) zu der Lösung gegeben. Die resultierende Lösung wurde 1 Stunde unter Kühlen mit Eis gerührt und über Nacht bei Raumtemperatur weiter gerührt. Nachdem Dicyclourethan als Nebenprodukt herausgefiltert worden war, wurde das Filtrat eingeengt, in einen Überschuss Diethylether gegossen, filtriert und unter reduziertem Druck getrocknet. Dies ergab ein Rohprodukt. Das Rohprodukt wurde bei Raumtemperatur in Dichlormethan bis zu einem, seiner Sättigungskonzentration am nächsten kommenden Grad, gelöst. Nach Zugabe einer geeigneten Menge Waschbenzin wurde die Lösung zum Umkristallisieren kühl gehalten. Nach Filtrieren und Trocknen unter reduziertem Druck wurden weiße Nadelkristalle, ein Succinimidester von Z-L-Phe (Z-L-Phe-OSu) erhalten.
(1-4) Herstellen des biologisch abbaubaren Polyrotaxans
Z-L-Phe-OSu (80 g, 200 mmol) wurde in Dimethylsulfoxid (DMSO) (60 ml) gelöst und das Pseudopolyrotaxan (45 g, 2 mmol) wurde zu der Lösung gegeben. Zu dieser heterogenen Lösung wurde bei Raumtemperatur unter Rühren für 96 Stunden bis zum homogenen Zustand nach und nach DMSO gegeben. Nach Beendigung der Reaktion wurde die Reaktionslösung in einen Überschuss Diethylether gegossen. Dies ergab ein Rohprodukt. Zum Entfernen der Verunreinigungen (einschließlich nicht umgesetztem Z-L-Phe-OSu, α-CD und Verbindung C) wurde das Rohprodukt nach einander mit Aceton und Dimethylformamid (DMF) gewaschen. Nach Filtration und Trocknen unter reduziertem Druck wurde ein biologisch abbaubares Polyrotaxan als weißes Pulver erhalten. Das Ergebnis der Synthese wurde mittels ¹H-NMR überprüft.
(2) Herstellung von Polyrotaxan-Hydrogelen (siehe 2)
Das biologisch abbaubare Polyrotaxan (1 g, 2,91 × 10^-5 mol, [OH] = 16,2 mmol) wurde unter Stickstoffatmosphäre in DMSO (10 ml) gelöst. Nach Zugabe von N,N'-Carbonyldimidazol (CDI) (8,13 mmol) wurde die Lösung 3 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Nach Beendigung der Reaktion wurde die Lösung in einen Überschuss Diethylether gegossen, filtriert und unter reduziertem Druck getrocknet. Dies ergab ein weißes Pulver von mit CDI aktiviertem Polyrotaxan (CDI-PR).
Eine DMSO-Lösung von CDI-PR, PEG-Eisamin (PEG-BA, Molekulargewicht: 600) und Natriumchlorid wurde entsprechend den in der unten angegebenen Tabelle 1 gezeigten Zusammensetzungen miteinander gemischt. Nach Rühren und Entlüften wurden die Mischungen bei 35 °C 24 Stunden einer Gelbildung mit Teflon-Abstandshaltern (Durchmesser: 13 mm, Tiefe: 2 mm) unterzogen. Die resultierenden Gele wurde zuerst mit DMSO und nachfolgend mit Wasser gewaschen, bis keine Gewichtsänderungen mehr auftraten. Dies ergab die Polyrotaxan-Hydrogele (PRHG-1 bis einschließlich PRHG-4).
Jedes dieser Polyrotaxan-Hydrogele PRHG-1 bis einschließlich PRHG-4 weist eine dreidimensionale Netzwerkstruktur auf, in der die cyclischen Moleküle (α-Cyclodextrin), die in den benachbarten Molekülen des Polyrotaxans eingeschlossen sind, durch eine vernetzende Bindung (Urethanbindung) über PEG verbunden sind. Die Hydrogele PRHG-1 bis einschließlich PRHG-3, die in Anwesenheit von Natriumchlorid geliert worden waren, waren poröse Körper (mit Hilfe eines Elektronenmikroskops überprüft), während das Hydrogel PRHG-4, das in Abwesenheit von Natriumchlorid geliert worden war, eine nicht-poröse Struktur besaß. [Tabelle 1]

^*) Beobachtete Werte in Bezug auf die nicht-porösen Körper.

(3) Eigenschaften von Polyrotaxan-Hydrogelen
Mit der Untersuchung wurde der Wassergehalt, das Kompressionsmodul der Elastizität als Index für die dynamische Festigkeit und die Vernetzungsdichte in dem gequollenen Zustand der Polyrotaxan-Hydrogele gemessen (siehe Tabelle 1). Die Werte in der Tabelle 1 sind die unter Bezug auf die nicht-porösen Körper beobachteten Werte. Die poröse Struktur weist ein zu dem Kompressionsmodul der Elastizität der nicht-porösen Struktur äquivalentes oder um eine Größenordnung kleineres Kompressionsmodul der Elastizität und eine zu der Vernetzungsdichte der nicht-porösen Struktur äquivalente Vernetzungsdichte auf.
Mit dem Test wurde ein Gewicht (W_nass) des Polyrotaxan-Hydrogels im Gleichgewichtszustand der Quellung bei Raumtemperatur und ein Gewicht (W_trocken) des getrockneten Polyrotaxan-Hydrogels nach dem Trocknen des Gels unter reduziertem Druck bei 50 °C gemessen und der Wassergehalt wurde gemäß der unten angegebenen Gleichung 1 berechnet: [Gleichung 1]
Das Kompressionsmodul der Elastizität wurde bei Raumtemperatur mit einer Vorrichtung zum Messen der durch Wärmespannung induzierten Belastung gemessen. Aus dem beobachteten Kompressionsmodul der Elastizität wurde die Vernetzungsdichte gemäß der unten angegebenen Gleichung 2 berechnet. Bei der Messung wurden die Polyrotaxan-Hydrogele im Gleichgewichtszustand der Quellung, die mit Hilfe eines Korkbohrers auf einen zu einer Probe im Wesentlichen identischen Querschnitt ausgestanzt worden waren, verwendet. Ec = 3RT × ve/V [Gleichung 2]worin

Ec: das Kompressionsmodul der Elastizität bezeichnet,
ve/V: die Vernetzungsdichte bezeichnet,
R: die Gaskonstante bezeichnet,
T: die absolute Temperatur bezeichnet und
V: das Volumen des Gels in dem gequollenen Zustand bezeichnet.

(4) Analyse des nicht-enzymatischen, hydrolytischen Verhaltens von Polyrotaxan-Hydrogelen
(4-1) Diskussion des Anteils an Polyrotaxan im Polyrotaxan-Hydrogel
Der Prozess der Gelbildung (2) der Mischung, die die DMSO-Lösung von CDI-PR, die DMSO-Lösung von PEG-BA und Natriumchlorid enthält, wurde zum Herstellen eines Polyrotaxan-Hydrogels (PRHG-5), in dem das Verhältnis zwischen dem Gewicht des Polyrotaxans (aus der DMSO-Lösung von CDI-PR umgewandelt) und dem Gewicht von PEG-BA 70 zu 30 betrugt, und eines Polyrotaxan-Hydrogels (PRHG-6), bei dem das Gewichtsverhältnis 60 zu 40 betrug, durchgeführt.
Die Polyrotaxan-Hydrogele PRHG-5 und PRHG-6 im Gleichgewichtszustand der Quellung wurden entsprechend in eine 0,1 M Phosphatpufferlösung (PBS) (pH = 8,0) eingeweicht und bei 37 °C geschüttelt. Die Änderungen des Gewichts eines jeden Hydrogels wurden gemessen, während in vorgegebenen Zeitintervallen Wasser weggewischt wurde. Die Gewichtsänderungen wurden zum Beurteilen des nicht-enzymatischen, hydrolytischen Verhaltens des Hydrogels verwendet. Die Ergebnisse der Messung sind in 3 gezeigt.
In dem Abbaumuster des Polyrotaxan-Hydrogels steigt das Gewicht des Polyrotaxan-Hydrogels zunächst an und nimmt dann auf Null ab. Während des Gewichtsanstiegs nimmt die Anzahl der Vernetzungsstellen in dem Polyrotaxangel unter Erweitern der Größe jedes Gitters in der dreidimensionalen Netzstruktur ab, während die dreidimensionale Struktur des Polyrotaxan-Hydrogels beibehalten wird. Dies erleichtert das Speichern von Wasser und erhöht den Wasseranteil. Wenn die Anzahl an Vernetzungsstellen unter Zerstören der dreidimensionalen Struktur des Polyrotaxan-Hydrogels weiter abnimmt, verringert jedoch der Abbau des Polyrotaxan-Hydrogels das Gewicht auf Null. Die Zeitspanne zwischen dem Zeitpunkt, wenn die Messung der Gewichtsänderung beginnt, und dem Zeitpunkt, wenn das Gewicht Null erreicht, hängt mit der Abbaurate zusammen.
Wie in 3 gezeigt, weist das Hydrogel PRHG-5 eine höhere Abbaugeschwindigkeit als diejenige des Hydrogels PRHG-6 auf. Und zwar führt der höhere Gewichtsanteil des Polyrotaxans in dem Polyrotaxan-Hydrogel zu einer höheren Abbaugeschwindigkeit des Polyrotaxan-Hydrogels.
Zur weiteren Diskussion wurde das Abbaumuster des Polyrotaxan-Hydrogels mit einem Gewicht M₀ des Polyrotaxan-Hydrogels in dem durch Wasser gequollenen Zustand vor Versuchsbeginn und einer Zeit t_∞ für den vollständigen Abbau des Polyrotaxan-Hydrogels (im Folgenden als die vollständige Abbauzeit bezeichnet) standardisiert. Das Ergebnis der Standardisierung ist in dem Graphen der 4 gezeigt, in dem t/t_∞, was eine Division einer seit dem Einweichen des Polyrotaxan-Hydrogels in Wasser abgelaufenen Zeit t durch die Zeit t_∞ ist, gegen M_t/M₀ aufgetragen ist, was eine Division eines Gewichts M_t des Polyrotaxan-Hydrogels zum Zeitpunkt t durch das Gewichts M₀ ist. Einer der entscheidenden Punkte in dem Abbaumuster ist der Wert für t/t_∞, bei dem der Abbau des Polyrotaxan-Hydrogels beginnt (bei dem M_t/M₀ einen Peak erreicht). Der kleinere Wert für t/t_∞ zu Beginn des Abbaus bedeutet eine längere erforderliche Zeitspanne für den vollständigen Abbau ab dem Beginn des Abbaus. Umgekehrt bedeutet der größere Werte für t/t_∞ zu Beginn des Abbaus eine kürzere erforderliche Zeitspanne für den vollständigen Abbau ab dem Beginn des Abbaus.
Wie in 4 gezeigt, weisen beide Hydrogele PRHG-5 und PRHG-6 im Wesentlichen identische Werte (ungefähr 0,5) für t/t_∞ zu Beginn des Abbaus auf. Dies beweist entsprechend, dass das Abbaumuster des Polyrotaxan-Hydrogels nicht von dem Prozentsatz des Polyrotaxans in dem Polyrotaxan-Hydrogel abhängt.
(4-2) Diskussion des Molekulargewichts des vernetzenden Anteils im Polyrotaxan-Hydrogel
Der Prozess der Gelbildung (2) der Mischung, die die DMSO-Lösung von CDI-PR, die DMSO-Lösung von PEG-BA und Natriumchlorid enthält, wurde zum Herstellen eines Polyrotaxan-Hydrogels (PRHG-7), in dem das verwendete PEG-BA ein Mole kulargewicht von 600 besaß, eines Polyrotaxan-Hydrogels (PRHG-8), in dem das verwendete PEG-BA ein Molekulargewicht von 2000 besaß, und eines Polyrotaxan-Hydrogels (PRHG-9), in dem das verwendete PEG-BA ein Molekulargewicht von 4000 besaß, durchgeführt, während das Mischungsverhältnis von PEG-BA zu dem Gehalt an α-CD in CDI-PR auf gleich 1,0 eingestellt wurde.
Die Polyrotaxan-Hydrogele PRHG-7, PRHG-8 und PRHG-9 im Gleichgewichtszustand der Quellung wurden jeweils in eine 0,1 M Phosphatpufferlösung (PBS) (pH = 7,4) eingeweicht und bei 37 °C geschüttelt. Die Änderung des Gewichts eines jeden Hydrogels wurde gemessen, wobei in vorgegebenen Zeitintervallen Wasser weggewischt wurde. Die Gewichtsänderungen wurde zum Beurteilen des nicht-enzymatischen, hydrolytischen Verhaltens des Hydrogels verwendet. Die Ergebnisse der Messung sind in 5 gezeigt.
Das Ergebnis aus 5 zeigt, dass das kleinere Molekulargewicht des vernetzenden Anteils in dem Polyrotaxan-Hydrogel zu einer höheren Abbaurate des Polyrotaxan-Hydrogels führt. Das bedeutet, dass die Abbaurate des Polyrotaxan-Hydrogels durch Verändern des Molekulargewichts des vernetzenden Anteils in dem Polyrotaxan-Hydrogel reguliert wird.
Zur weiteren Diskussion wurde das Abbaumuster des Polyrotaxan-Hydrogels, wie der Graph der 4, in dem Graphen der 6 standardisiert. Wie in 6 gezeigt ist, betrug der Wert für t/t_∞ zu Beginn des Abbaus ungefähr 0,50 für das Hydrogel PRHG-7, ungefähr 0,85 für das Hydrogel PRHG-8 und ungefähr 0,90 für das Hydrogel PRHG-9. Dies zeigt, dass das größere Molekulargewicht des vernetzenden Anteils in dem Polyrotaxan-Hydrogel zu einem höheren Wert für t/t_∞ zu Beginn des Abbaus in dem Abbaumuster der Polyrotaxan-Hydrogels führt.
(4-3) Schlussfolgerungen
Wie aus den obigen Ergebnisse deutlich hervorgeht, wird die Abbaurate des Polyrotaxan-Hydrogels durch Verändern der Gewichtsprozent des Polyrotaxans in dem Polyrotaxan-Hydrogel oder durch Verändern des Molekulargewichts des vernetzenden Anteils in dem Polyrotaxan-Hydrogel reguliert. In dem Fall, in dem das Polyrotaxan-Hydrogel als Ausgangsmaterial zum Wiederaufbau von Gewebe verwendet wird, legt das Verfahren die Abbaurate des für eine Anwendung des Ausgangsmaterials zum Wiederaufbau von Gewebe geeigneten Polyrotaxangels fest und bestimmt die Gewichtsprozent des Polyrotaxans in dem Polyrotaxan-Hydrogel oder das Molekulargewicht des vernetzenden Anteils in dem Polyrotaxan, um die festgelegte Abbaurate zu erreichen.
Das Abbaumuster des Polyrotaxan-Hydrogels (t/t_∞, zu Beginn des Abbaus) ist durch Verändern des Molekulargewichts des vernetzenden Anteils in dem Polyrotaxan-Hydrogel steuerbar. In dem Fall, in dem das Polyrotaxan-Hydrogel als Ausgangsmaterial zum Wiederaufbau von Gewebe verwendet wird, legt die Vorgehensweise ein für eine Anwendung des Ausgangsmaterials zum Wiederaufbau von Gewebe geeignetes Abbaumuster fest und bestimmt das Molekulargewicht des vernetzenden Anteils in dem Polyrotaxan-Hydrogel, um das festgelegte Abbaumuster zu erreichen.
(5) Analyse des nicht-enzymatischen, hydrolytischen Verhaltens der Polyrotaxan-Hydrogele – Teil 2

Das CDI-PR (4,2 × 10^–5 mol, N-Acylcarbonatgruppe: 10,7 mmol) wurde in DMSO (5 ml) gelöst. Verschiedene geschmolzene PEG-Bisamine wurden zu der Lösung gegeben. Tabelle 2 zeigt eine Liste der Synthesebedingungen. Jede Reaktionsmischung wurde entlüftet, zu Teflon-Abstandshaltern injiziert und für 24 Stunden bei 35 °C gehalten. Das resultierende Produkt wurde mit DMSO gewaschen und zur vollständigen Hydratation für 2 Tage bei Raumtemperatur in Wasser eingeweicht. Dies ergab Polyrotaxan-Hydrogele. [Tabelle 2]

Code^*1)	Molekulargewicht des PEG-Bisamins	Gehalt an Polyrotaxan (Gew.-%)	PEG/a-CD^*2)	Prozentanteil des Gehalts (%)
E4/RX47	4000	47	0,34	77,6
E4/RX35	4000	35	0,54	79,6
E4/X29	4000	29	0,71	80,9
E4/X26	4000	26	0,84	81,6
E4/RX21	4000	21	1,11	82,2
E2//RX81	2000	81	0,14	84,8
E2/RX63	2000	63	0,35	83,9
E2/RX52	2000	52	0,54	85,4
E2/RX44	2000	44	0,76	85,4
E2/RX37	2000	37	0,94	85,9
E0,6/RX85	600	85	0,36	60,5
E0,6/RX79	600	79	0,53	57,6
E0,6/RX73	600	73	0,74	57,8
E0,6/RX67	600	67	0,98	60,5

^*1)Die Ziffer nach 'E' bezeichnet 1/1000 des durchschnittlichen Molekulargewichts des PEG-Bisamins. Die Ziffer nach 'RX' bezeichnet den Gehalt (Gew.-%) des Polyrotaxans.
^*2)PEG/α-CD bezeichnet das berechnete Molverhältnis von PEG-Eisamin zu α-CD in dem Polyrotaxan-Hydrogel.

Das hydrolytische Verhalten wurde auf folgende Weise untersucht. Jedes der so erhaltenen, quellenden Polyrotaxan-Hydrogele wurde in 1 cm × 1 cm große Scheiben (Dicke < 1 mm) geschnitten. Die Scheiben wurden bei 37 °C in einem 0,1 M Phosphatpuffer (pH 7,4), der 0,02 % Natriumazid enthielt, eingeweicht und mit Hilfe eines Schüttlers mit 130 Upm geschüttelt. Der Abbau des Polyrotaxan-Hydrogels wurde durch 15 Messen des Gewichts des verbleibenden Polyrotaxan-Hydrogels beurteilt. Das Experiment wurde dreimal wiederholt. Die Ergebnisse des Experiments sind in den Graphen der 7 bis einschließlich 9 gezeigt.
Die Graphen der 7 zeigen Abbauverhalten der Polyrotaxan-Hydrogele mit Veränderungen in den Polyrotaxangehalten unter der Bedingung eines festgesetzten Molekulargewichts des PEG-Bisamins. Die 7(a) bis einschließlich 7(c) zeigen entsprechend die Ergebnisse für die PEG-Bisamine mit den Molekulargewichten von 4000, 2000 und 600. Der Graph der 8 zeigt die Beziehung zwischen dem Gehalt des Polyrotaxans und der Zeit für den vollständigen Abbau. Wie aus den Graphen der 7 und deutlich hervorgeht, führt die Abnahme des Gehalts des Polyrotaxans unter der Bedingung eines festgesetzten Molekulargewichts des PEG-Eisamins zu einer längeren Zeit für den vollständigen Abbau. Und zwar führt der höhere Gewichtsanteil des Polyrotaxans in dem Polyrotaxan-Hydrogel zu einer höheren Abbaurate des Polyrotaxan-Hydrogels.
Der Graph in 9 zeigt die Beziehung zwischen dem Gehalt des Polyrotaxans und dem Wassergehalt. Wie aus dem Graphen der 9 deutlich hervorgeht, ist der Wassergehalt in dem Polyrotaxan-Hydrogel unter der Bedingung eines festgesetzten Molekulargewichts des PEG-Eisamins ungeachtet des Gehalts des Polyrotaxans praktisch konstant. Dieses Ergebnis zeigt, dass der Wassergehalt nicht der Faktor zum Verändern der Zeit für den vollständigen Abbau ist.
10 ist ein Graph, der die gegen das PEG/α-CD-Verhältnis abgebildete Zeit für den vollständigen Abbau zeigt. Das PEG/α-CD-Verhältnis gibt hier das Molverhältnis von PEG-Eisamin zu α-CD in dem Polyrotaxan-Hydrogel wieder. Wie aus dem Graphen der 10 deutlich hervorgeht, führt das größere PEG/α-CD-Verhältnis zu einer längeren Zeit für den vollständigen Abbau unter der Bedingung eines festgesetzten Molekulargewichts des PEG-Bisamins. Und zwar führt das kleinere PEG/α-CD-Verhältnis zu der höheren Abbaurate des Polyrotaxan-Hydrogels. Wie in Tabelle 2 gezeigt, wurde das PEG/α-CD-Verhältnis auf einen Wert von nicht mehr als '2' eingestellt. Wenn das PEG/α-CD-Verhältnis den Wert '2' übersteigt, wird das Polyrotaxan-Hydrogel unter physiologischen Bedingungen oder in einer 0,1 M wässrigen Lösung von Natriumhydroxid nicht abgebaut. Das PEG/α-CD-Verhältnis wurde entsprechend auf einen Wert von nicht mehr als '2' eingestellt.
Wie in 4 zeigen die Graphen der 11 Abbaumuster mit t/t_∞ als Abszisse und M_t/M₀ als Ordinate. Wie aus den Graphen der 11 deutlich hervorgeht, hängen die Abbaumuster nicht von dem Gehalt des Polyrotaxans in dem Polyrotaxan-Hydrogel ab, weisen jedoch unter der Bedingung eines festgesetzten Molekulargewichts des PEG-Bisamins änliche Profile auf. Die Zeitverzögerung bis zum Beginn des Abbaus des Polyrotaxan-Hydrogels wird mit einem Anstieg des Molekulargewichts des PEG-Eisamins verlängert. Diese Ergebnisse zeigen, dass das größere Molekulargewicht des PEG-Eisamins in einer längeren Zeitverzögerung bis zum Beginn des Abbaus resultiert und ein Muster des frühen Abbaus ergibt.
(6) Kultur von Chondrocyten
Die in Tabelle 1 gezeigten Polyrotaxan-Hydrogele PRHG-1 und PRHG-3 wurden autoklaviert und bei 121 °C 20 Minuten lang sterilisiert. Jedes der sterilisierten Polyrotaxan-Hydrogele wurde in eine Kulturplatte mit 96 Vertiefungen eingebracht. Kaninchen-Chondrocyten, die cryokonserviert (in einem gefrorenen Zustand gehalten) und aufgetaut worden waren, wurden mit einer Konzentration von 2 × 10⁵ Zellen/100 μl pro Vertiefung ausgesät und bei 37 °C in einem 5 % CO₂-Inkubator ruhig stehen gelassen. Dies bewirkte eine Fixierung der Zellen an jedem Polyrotaxan-Hydrogel (Dauer der Fixierung: 2 Stunden oder 24 Stunden).
Jedes Polyrotaxan-Hydrogel, an das Chondrocyten fixiert waren, wurde in eine Kulturplatte mit 24 Vertiefungen überführt. Dulbeccos modifiziertes Eagle-Medium (DMEM), das 10 % v/v fötales Rinderserum (FBS) und 50 μg/ml Ascorbinsäure enthielt (im Folgenden einfach als das Medium bezeichnet) wurde zu der Kulturplatte gegeben. Das Medium wurde alle 7 Tage ausgetauscht. Die gesamte Kulturdauer betrug 6 Wochen. Die Kultur wurde mit 10 % Formalin fixiert, mit Alcian Blau (pH 1,0) eingefärbt und nach Entfärben, Dehydratation und der Penetration versiegelt. Färben mit Alcian Blau ist eine der Techniken zum Färben von sauren Mucopolysacchariden und ist zum Färben des Knorpelgewebes anwendbar.
In dem Fall, in dem die Dauer der Fixierung 2 Stunden betrug, begannen runde Zellen unmittelbar nach Kulturbeginn mit der Vermehrung in einer Kolonie und die Kolonie wuchs über die der Dauer der Kultur an. Das Wachstum der Kolonie wurde am Kulturtag 14, am Kulturtag 28 und am Kulturtag 42 beobachtet (siehe 12). Die Kolonie erzeugte während ihres Wachstums ein etwas lichtundurchlässiges Substrat. Dies ergab getrübte Bilder unter dem Mikroskop. Nach der 4-wöchigen Kultur wurden deutliche Alcian Blau positive Bilder über die gesamte Zellkolonie beobachtet. Und zwar bewirkte die Anwendung des Polyrotaxan-Hydrogels bei der Kultur, dass sich die Chondrocyten vermehrten und das Substrat (saure Mucopolysaccharide) erzeugten, während sie die intrinsische runde Form beibehielten. Die dreidimensionalen Kulturen der Chondrocyten auf dem Ausgangsmaterial zum Wiederaufbau von Gewebe, das aus den Polyrotaxan-Hydrogelen (PRHG-1 und RHG-3) bestand, können daher als implantierbare Materialien verwendet werden. In dem Fall, in dem die Dauer der Fixierung 24 Stunden betrug, wurden ähnliche Ergebnisse erhalten.
Die Kolonie der Chondrocyten wurde in die Kulturplatte gegossen und hefteten sich unter Verlängerung der Zellen oder durch den Abbau des Polyrotaxan-Hydrogels an dem Boden der Kulturplatte an. Dann wurden Fibroblasten ähnliche Zellen auf der adhäsiven Kolonie auswachsen gelassen. Diese ausgewachsenen Zellen behielten nicht die intrinsische runde Form der Chondrocyten bei und waren bei einer Alcian Blau-Färbung negativ. Diese Ergebnisse können die Dedifferenzierung belegen, da eine Monolayer-Kultur der Kolonie der Chondrocyten, die in dem Polyrotaxan-Hydrogel gehalten wurde, bewirkte, dass die kultivierten Zellen die intrinsischen Eigenschaften der Chondrocyten verloren.
Gewerbliche Anwendbarkeit
Die vorliegende Erfindung stellt ein Ausgangsmaterial zum Wiederaufbau von Gewebe und ein implantierbares Material, das weitgehend in medizinischen Bereichen, wie orthopädischer Chirurgie, Zahnchirurgie und plastischer Chirurgie verwendet werden kann, bereit.

Claims

Ausgangsmaterial zum Wiederaufbau von Gewebe, das hauptsächlich aus einem Polyrotaxan-Hydrogel besteht, wobei das Polyrotaxan biokompatible Gruppen mit jeweils einem sperrigen Substituenten aufweist, die durch hydrolysierbare in vivo Bindungen an eines von beiden Enden eines linearen Moleküls mit zahlreichen darauf aufgefädelten cyclischen Molekülen eingeführt werden und worin das Polyrotaxan-Hydrogel eine Netzwerkstruktur aufweist, die durch Vernetzung zwischen den cyclischen Molekülen, zwischen den biokompatiblen Gruppen oder zwischen den cyclischen Molekülen und den biokompatiblen Gruppen in benachbarten Polyrotaxanmolekülen gebildet wird.
Ausgangsmaterial zum Wiederaufbau von Gewebe nach Anspruch 1, worin das lineare Molekül ein beliebiges von Polyethylenglycol, Polypropylenglykol, Copolymeren von Polyethylenglycol und Polypropylenglykol, und Polymethylvinylether ist, und das cyclische Molekül ein beliebiges von α-, β-, und γ-Cyclodextrinen ist.
Ausgangsmaterial zum Wiederaufbau von Gewebe nach einem der Ansprüche 1 und 2, worin die hydrolysierbaren in vivo Bindungen Esterbindungen sind.
Ausgangsmaterial zum Wiederaufbau von Gewebe nach Anspruch 3, worin die Vernetzung eine beliebige Bindung von Urethanbindungen, Amidbindungen, Carbamidbindungen, Etherbindungen, Sulfidbindungen, und Schiffscher-Basen-Bindungen sind.
Ausgangsmaterial zum Wiederaufbau von Gewebe nach einem der Ansprüche 1 bis 4, worin der sperrige Substituent jeweils aus einer Gruppe ist, die wenigstens einen Benzolring aufweist oder einer Gruppe, die wenigstens ein tertiäres Butyl aufweist.
Ausgangsmaterial zum Wiederaufbau von Gewebe nach einem der Ansprüche 1 bis 5, worin die biokompatiblen Gruppen beliebige von Aminosäuren, Oligopeptiden, Oligosacchariden und Zuckerderivaten sind.
Ausgangsmaterial zum Wiederaufbau von Gewebe nach einem der Ansprüche 1 bis 6, worin das lineare Molekül Polyethylenglycol ist, die cyclischen Moleküle α-Cyclodextrine sind, die hydrolysierbaren Bindungen Esterbindungen sind, die biokompatiblen Gruppen mit den sperrigen Substituenten Benzyloxycarbonyl-L-phenylalanine sind.
Ausgangsmaterial zum Wiederaufbau von Gewebe nach einem der Ansprüche 1 bis 7, worin das Polyrotaxan-Hydrogel eine poröse Struktur aufweist.
Ausgangsmaterial zum Wiederaufbau von Gewebe nach einem der Ansprüche 1 bis 8, worin das Polyrotaxan-Hydrogel die Vernetzung zwischen den cyclischen Molekülen aufweist, zwischen den biokompatiblen Gruppen, oder über Vernetzung linearer Moleküle zwischen den cyclischen Molekülen und den biokompatiblen Gruppen, und wobei das Polyrotaxan-Hydrogel die Eigenschaft (a) aufweist: (a) worin die Zeit (t_∞) für die vollständige Hydrolyse des Polyrotaxan-Hydrogels unabhängig von dessen Wassergehalt ist, jedoch mit jeweils der Abnahme des Polyrotaxangehalts im Polyrotaxan-Hydrogel, dem Anstieg im Molverhältnis der vernetzenden linearen Moleküle zu den cyclischen Molekülen und einer Abnahme des durchschnittlichen Molekulargewichts der vernetzenden linearen Moleküle verlängert wird.
Ausgangsmaterial zum Wiederaufbau von Gewebe nach einem der Ansprüche 1 bis 8, worin das Polyrotaxan-Hydrogel die Vernetzung zwischen den cyclischen Molekülen aufweist, zwischen den biokompatiblen Gruppen, oder über Vernetzung linearer Moleküle zwischen den cyclischen Molekülen und den biokompatiblen Gruppen, und wobei das Polyrotaxan-Hydrogel die Eigenschaft (b) aufweist: (b) wobei das Abbaumuster, das als Graph mit t/t_∞ als Abszisse und M_t/M₀ als Ordinate dargestellt ist, wobei t_∞ die Zeit bis zur vollständigen Hydrolyse des Polyrotaxan-Hydrogels ist, t die Zeit des Einweichens des Polyrotaxan-Hydrogels in Wasser ist, M₀ das Anfangsgewicht des Polyrotaxan-Hydrogels im durch Wasser gequollenen Zustand ist, und M_t das Gewicht des Polyrotaxan-Hydrogels zum Zeitpunkt t ist, unabhängig vom Polyrotaxangehalt im Polyrotaxan-Hydrogel ist, aber vom Molekulargewicht der vernetzenden linearen Moleküle abhängt.
Ausgangsmaterial zum Wiederaufbau von Gewebe nach einem der Ansprüche 9 und 10, worin die cyclischen Moleküle α-Cyclodextrine sind, das lineare Molekül Polyethylenglykol ist, die hydrolysierbaren in vivo Bindungen Esterbindungen sind, die vernetzenden linearen Moleküle Polyethylenglycol-bis-amine sind, und worin das Polyrotaxan-Hydrogel eine Netzwerkstruktur aufweist in der OH-Gruppen der α-Cyclodextrine, die in benachbarten Polyrotaxanmolekülen enthalten sind, über Urethanbindungen von NH₂-Gruppen an beiden Enden der Polyethylenglycol-bis-amine vernetzt werden.
Ausgangsmaterial zum Wiederaufbau von Gewebe nach einem der Ansprüche 1 bis 11, für die Verwendung zur Kultur von Mesenchymzellen, Leberzellen und Neuronen.
Implantierbares Material, dass Zellen umfasst, die in einem Ausgangsmaterial zum Wiederaufbau von Gewebe nach einem der Ansprüche 1 bis 12 kultiviert oder eingebettet sind.
Verfahren zum Herstellen eines implantierbaren Materials, wobei das Verfahren ein implantierbares Material bereitstellt, indem Zellen, die in einem Ausgangsmaterial zum Wiederaufbau von Gewebe nach einem der Ansprüche 1 bis 12 kultiviert oder eingebettet sind, hergestellt werden.