DE60034594T2

DE60034594T2 - Diagnose von malignen neoplasmen

Info

Publication number: DE60034594T2
Application number: DE60034594T
Authority: DE
Inventors: Jack R. Waban WANDS; Suzanne M. East Greenwhich DE LA MONTE; Nedim Boston INCE; Rolf I. Boston CARLSON
Original assignee: Rhode Island Hospital
Current assignee: Rhode Island Hospital
Priority date: 1999-11-08
Filing date: 2000-11-08
Publication date: 2008-04-03
Anticipated expiration: 2020-11-09
Also published as: JP2003519365A; US7094556B2; US6812206B2; US6815415B2; US20030031670A1; US20100144837A1; US20020114810A1; EP1881327A2; AU1590101A; CA2390374A1; US6797696B2; AU783327B2; JP4375932B2; US20060211058A1; US20020122802A1; EP1259813A2; EP1881327A3; WO2001035102A2; US20020146421A1; US20100136581A1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft eine ex-vivo-Methode zum Diagnostizieren eines malignen Neoplasmas in einem Säuger. Die vorliegende Erfindung umfasst außerdem eine ex-vivo-Methode zum Prognostizieren solch eines malignen Neoplasmas.
Primär maligne Neoplasmen des Zentralen Nervensystems (ZNS), insbesondere Glioblastome, sind aufgrund ihrer aggressiven und ausgedehnten Infiltration des Gehirns und ihrer Resistenz gegen Antikrebsbehandlungen in hohem Maße fatal. Obschon ein Fortschritt im Entwirren der pathologischen Mechanismen, die den ZNS-Krebsarten als auch anderen Krebstypen zugrunde liegen, erzielt worden ist, sind Tumor-spezifische therapeutische Ansätze und Methoden für ihre Diagnose weitgehend schwer definierbar geblieben.
Lavaissiere, et al. (J. Clin. Invest., 1996; 98(6): 1313–1323) beschreiben, dass Aspartyl-(Asparaginyl)-beta-Hydroxylase (AAH) an der Zelloberfläche einer Anzahl hepatozellulärer Caranome und Cholangiocarciname exprimiert wird. Lavaissiere, et al. beschreiben die Sequenz der cDNA, die für humanes AAH und die abgeleitete Aminosäuresequenz kodiert, und die Produktion von monoklonalen Antikörpern zu dieser HAAH.
Gemäß eines Aspekts der vorliegenden Erfindung wird eine Methode zum Diagnostizieren eines malignen Neoplasmas in einem Säuger bereitgestellt, wie in nachstehendem Anspruch 1 beansprucht.
Zu in dieser Weise detektierten malignen Neoplasmen zählen solche, die von endodermalem Gewebe abgeleitet sind, z.B. Dickdarmkrebs, Brustkrebs, Bauchspeicheldrüsenkrebs, Leberkrebs und Krebs der Gallengänge. Neoplasmen des Zentralen Nervensystems (ZNS), wie etwa primär maligne ZNS-Neoplasmen sowohl eines neu ronalen als auch glialen Zellursprungs und metastatische ZNS-Neoplasmen werden ebenfalls detektiert. Körperflüssigkeiten, wie etwa eine vom ZNS stammende Körperflüssigkeit, Blut, Serum, Urin, Speichel, Auswurf, Lungeneffusion und Aszitesflüssigkeit, können mit einem HAAH-spezifischen Antikörper gemäß der Erfindung kontaktiert werden.
Das Assay-Format ist auch zur Generierung zeitlicher Daten, die zum Prognostizieren der malignen Erkrankung verwendet werden, nützlich.
Gemäß eines anderen Aspekts der vorliegenden Erfindung wird daher eine Methode zum Prognostizieren eines malignen Neoplasmas bereitgestellt, wie in unten stehendem Anspruch 2 beansprucht.
Der Antikörper bindet bevorzugt an eine Stelle in der carboxyterminalen katalytischen Domäne von HAAH. Alternativ bindet der Antikörper an ein Epitop, das an der Oberfläche der Zelle exponiert ist. Der Antikörper ist ein polyklonales Antiserum oder ein monoklonaler Antikörper. Die Erfindung umfasst die Verwendung nicht nur eines intakten monoklonalen Antikörpers, sondern auch eines immunologisch aktiven Antikörperfragments, z.B. eines Fab- oder (Fab)₂-Fragments; eines konstruierten einzelkettigen Fv-Moleküls, oder eines chimären Moleküls, z.B. eines Antikörpers, der die Bindungsspezifität eines Antikörpers, z.B. von murinem Ursprung, und die verbliebenen Abschnitte eines anderen Antikörpers, z.B. von humanem Ursprung, enthält. Vorzugsweise ist der Antikörper ein monoklonaler Antikörper, wie etwa FB50, 5C7, 5E9, 19B, 48A, 74A, 78A, 86A, HA238A, HA221, HA239, HA241, HA329 oder HA355. Antikörper, die an dieselben Epitope wie diese monoklonalen Antikörper binden, befinden sich ebenfalls im Rahmen der Erfindung.
Ein HAAH-spezifischer Intrakörper ist ein rekombinanter einzelkettiger HAAH-spezifischer Antikörper, der innerhalb einer Zielzelle, z.B. einer Tumorzelle, exprimiert wird. Solch ein Intrakörper bindet an endogene intrazelluläre HAAH und hemmt die enzymatische Aktivität von HAAH oder hindert die HAAH am Binden an einen intrazellulären Liganden. HAAH-spezifische Intrakörper hemmen die intrazelluläre Signaltransduktion und hemmen als Folge dessen das Wachstum von Tumoren, die HAAH überexprimieren.
Eine weitere Ausführungsform betrifft die in vitro-Verwendung eines Kits, wie in dem unabhängigen Anspruch 12 beansprucht.
Beschrieben wird auch ein Kit zum Diagnostizieren eines Tumors in einem Säuger, der einen HAAH-spezifischen Antiköper enthält. Der diagnostische Assay-Kit ist vorzugsweise in einem standardmäßigen Bindungsformat zweier Antikörper formuliert, bei welchem ein HAAH-spezifischer Antikörper die HAAH in einer Patientenprobe einfängt und ein anderer HAAH-spezifischer Antikörper zum Detektieren der eingefangenen HAAH verwendet wird. Zum Beispiel wird der Fang-Antikörper an einer festen Phase, z.B. einer Assay-Platte, einem Assay-Well, einer Nitrocellulosemembran, einem Kügelchen, einem Tauchstäbchen oder einer Komponente einer Elutionssäule, immobilisiert. Der zweite Antikörper, d.h. der Nachweis-Antikörper, ist typischerweise mit einer nachweisbaren Markierung, wie z.B. einem kolorimetrischen Agens oder Radioisotop, getagged.
HAAH ist ein Protein, das zu der Alpha-Ketoglutarat-abhängigen Dioxygenase-Familie der Prolyl- und Lysylhydroxylasen zählt, die eine Schlüsselrolle in der Kollagen-Biosynthese spielen. Dieses Molekül hydroxyliert Aspartinsäure oder Asparaginreste in EGF-ähnlichen Domänen verschiedener Proteine in der Gegenwart von Ferro-Salzen. Diese EGF-ähnlichen Domänen enthalten konservierte Motive, die sich wiederholende Sequenzen in Proteinen bilden, wie etwa Gerinnungsfaktoren, extrazelluläre Matrixproteine, LDL-Rezeptor, NOTCH-Homologa oder NOTCH-Liganden-Homologa.
Die Alpha-Ketoglutarat-abhängige Dioxygenase Aspartyl-(Asparaginyl)-beta-Hydroxylase (AAH) hydroxyliert spezifisch einen Aspartin- oder Asparaginrest in den EGF-ähnlichen Domänen verschiedener Proteine. Die 4,3 kb cDNA, die für die humane AspH (hAspH) kodiert, hybridisiert mit 2,6 kb und 4,3 kb-Transkripten in transformierten Zellen, und die abgeleitete Aminosäuresequenz des größeren Transkripts kodiert ein Protein von etwa 85 kDa. Sowohl die in vitro-Transkription und -Translation als auch die Western Blot-Analyse weisen ebenfalls ein 56 kDa-Protein nach, das aus der posttranslationalen Spaltung des katalytischen C-Terminus resultieren kann.
Eine physiologische Funktion von AAH ist die posttranslationale beta-Hydroxylierung von Aspartinsäure in Vitamin K-abhängigen Coagulationsproteinen. Die reichliche Expression von AAH in mehreren malignen Neoplasmen und die geringen Mengen an AAH in vielen normalen Zellen weisen jedoch auf eine Rolle dieses Enzyms für die Malignität hin. Das AAH-Gen wird auch in Cytotrophoblasten, doch nicht in Syncytiotrophoblasten der Plazenta, in hohem Maße exprimiert. Cytotrophoblasten sind invasive Zellen, die die Plazentaimplantation vermitteln. Die erhöhten Grade der AAH-Expression bei humanen Cholangiokarzinomen, hepatozellulären Karzinomen, Dickdarmkrebsen und Brustkarzinomen waren in erster Linie mit invasiven oder metastatischen Läsionen assoziiert. Darüber hinaus spiegelt eine Überexpression von AAH streng genommen nicht eine vermehrte DNA-Synthese und zelluläre Proliferation wider, da hohe Grade der AAH-Immunreaktivität bei 100 Prozent der Cholangiokarzinome beobachtet wurden, doch nicht bei menschlichen oder experimentellen krankhaften Prozessen in Verbindung mit der Regeneration oder nicht-neoplastischen Proliferation der Gallengänge. Die AAH-Überexpression und die begleitenden hohen Grade der Beta-Hydroxylase-Aktivität führen zu einem invasiven Wachstum von transformierten neoplastischen Zellen. Die Detektion eines Anstiegs der HAAH-Expression ist für eine frühe und zuverlässige Diagnose der Krebstypen nützlich, die nun als dieses Genprodukt überexprimierend charakterisiert worden sind.
Diagnose von malignen Tumoren
HAAH wird in vielen Tumoren eines endodermalen Ursprungs und in wenigstens 95 der ZNS-Tumoren im Vergleich zu normalen nicht-kanzerösen Zellen überexprimiert. Eine Zunahme des HAAH-Genprodukts in einer vom Patienten stammenden Körperflüssigkeit kann gemäß der vorliegenden Erfindung unter Anwendung standardmäßiger Methoden, z.B. durch Western Blot-Assays oder einen quantitativen Assay, wie etwa ELISA, detektiert werden. Zum Beispiel wird ein standardmäßiges kompetitives ELISA-Format unter Verwendung eines HAAH-spezifischen Antikörpers zur Quantifizierung der HAAH-Mengen in einem Patienten angewendet. Alternativ wird ein Sandwich-ELISA unter Verwendung eines ersten Antikörpers als dem Fang-Antikörper und eines zweiten HAAH-spezifischen Antikörpers als einem Nachweis-Antikörper verwendet.
Zu Methoden zum Nachweisen von HAAH zählen das Kontaktieren einer Komponente einer Körperflüssigkeit mit einem HAAH-spezifischen Antikörper, der an eine feste Matrix, z.B. Mikrotiterplatte, Kügelchen, Tauchstäbchen, gebunden ist. Zum Beispiel wird die feste Matrix in eine vom Patienten stammende Probe einer Körperflüssigkeit eingetaucht, gewaschen, und die feste Matrix mit einem Reagenz kontaktiert, um das Vorhandensein von an der festen Matrix vorhandenen Immunkomplexen zu detektieren.
Proteine in einer Testprobe werden an einer festen Matrix immobilisiert (z.B. daran gebunden). Die Methoden und Mittel zur kovalenten oder nicht-kovalenten Bindung von Proteinen an feste Matrizes sind im Fachgebiet bekannt. Die Beschaffenheit der festen Oberfläche kann in Abhängigkeit vom Assay-Format variieren. Für Assays, die in Mikrotiter-Wells durchgeführt werden, ist die feste Oberfläche die Wand des Mikrotiter-Wells oder -Bechers. Für Assays unter Verwendung von Kügelchen ist die feste Oberfläche die Außenseite des Kügelchens. Bei Assays unter Verwendung eines Tauchstäbchens (d.h. eines festen Körpers, der aus einem porösen oder fibrösen Material wie Gewebe oder Papier hergestellt ist) ist die Oberfläche die Oberfläche des Materials, aus dem das Tauchstäbchen hergestellt ist. Zu Beispielen nützlicher fester Träger zählen Nitrozellulose (z.B. in Membran- oder Mikrotiter-Well-Form), Polyvinylchlorid (z.B. in Platten oder Mikrotiter-Wells), Polystyrollatex (z.B. bei Kügelchen oder Mikrotiter-Platten), Polyvinylidinfluorid (bekannt als IMMULON^TM), diazotiertes Papier, Nylonmembranen, aktivierte Kügelchen und Protein A-Kügelchen. Der feste Träger, der den Antikörper enthält, wird typischerweise nach der Kontaktierung mit der Testprobe und vor der Detektierung der gebundenen Immunkomplexe gewaschen. Der Inkubation des Antikörpers mit der Testprobe folgt die Detektion der Immunkomplexe durch eine nachweisbare Markierung. Zum Beispiel ist die Markierung eine enzymatische, fluoreszierende, chemilumineszierende, radioaktive oder ein Farbstoff. Assays, die die Signale von dem Immunkomplex verstärken, sind ebenfalls im Fachgebiet bekannt, z.B. Assays, die Biotin und Avidin ausnützen.
Ein HAAH-Nachweisreagenz, z.B. ein Antikörper, wird in Form eines Kits verpackt, der ein oder mehrere HAAH-spezifische Antikörper, Kontrollformulierungen (positive und/oder negative) und/oder eine nachweisbare Markierung enthält. Der Assay kann in der Form eines standardmäßigen Sandwich-Assay-Formats mit zwei Antikörpern vorliegen, wie es im Fachgebiet bekannt ist.
Anti-HAAH-Antikörper können mittels der im Fachgebiet wohl bekannten Techniken erhalten werden. Solche Antikörper sind polyklonal oder monoklonal. Polyklonale Antikörper können unter Anwendung standardmäßiger Methoden erhalten werden, z.B. mittels der bei Ghose et. al., Methods in Enzymology, Bd. 93, 326–327, 1983, beschriebenen Methoden. Ein HAAH-Polypeptid, oder ein antigenes Fragment davon, wurde als das Immunogen verwendet, um die Produktion polyklonaler Antikörper in den Antiseren von Kaninchen, Ziegen, Schafen oder Nagern zu stimulieren. Zu antigenen Polypeptiden für die Produktion sowohl polyklonaler als auch monoklonaler Antikörper, die als Immunogene nützlich sind, zählen Polypeptide, die eine katalytische Domäne der HAAH enthalten. Zum Beispiel ist das immunogene Polypeptid das reife Volllängen-HAAH-Protein oder ein HAAH-Fragment, das die carboxyterminale katalytische Domäne enthält, z.B. ein HAAH-Polypeptid, das das His-Motiv der SEQ ID Nr. 1 enthält. Tabelle 1: Aminosäuresequenz von HAAH

DSFEHEVWQD ASSFRLIFIV DVWHPELTPQ QRRSLPAI (SEQ ID Nr. 2; GENBANK Zugriffs-Nr. S83325; His-Motiv ist unterstrichen, konservierte Sequenzen innerhalb der katalytischen Domäne sind durch Fettdruck angezeigt)

Antikörper, die an dieselben Epitope wie die hierin beschriebenen Antikörper binden, werden unter Anwendung standardmäßiger Methoden, z.B. kompetitiver Bindungsassays, identifiziert, wie im Fachgebiet bekannt.
Monoklonale Antikörper können mittels standardmäßiger Techniken erhalten werden. Zehn μg des gereinigten rekombinanten HAAH-Polypeptids wurden intraperitoneal in komplettem Freund-Adjuvans an Mäuse verabreicht, gefolgt von einer einzelnen intravenösen (in die Schwanzvene) Auffrischung 3–5 Monate nach der Erstimpfung. Antikörper-produzierende Hybridome wurden unter Anwendung standardmäßiger Methoden erzeugt. Um jene Hybridome zu identifizieren, die Antikörper produzieren, die in hohem Maße für ein HAAH-Polypeptid spezifisch waren, wurden die Hybridome unter Verwendung desselben Polypeptid-Immunogens, das zur Immunisierung verwendet wurde, gescreent. Jene Antikörper, die als eine HAAH-Bindungsaktivität aufweisend identifiziert wurden, wurden ebenfalls auf ihre Fähigkeit zur Hemmung der katalytischen Aktivität der HAAH unter Verwendung der unten beschriebenen enzymatischen Assays gescreent. Vorzugsweise weist der Antikörper eine Bindungsaffinität von mindestens etwa 10⁸ Liter/Mol auf, und bevorzugter eine Affinität von mindestens etwa 10⁹ Liter/Mol.
Monoklonale Antikörper können mittels im Fachgebiet bekannter Methoden humanisiert werden, z.B. können MAbs mit einer gewünschten Bindungsspezifität kommerziell humanisiert werden (Scotgene, Schottland; Oxford Molecular, Palo Alto, CA).
HAAH-spezifische Intrakörper werden wie folgt produziert: Auf die Identifizierung eines Hybridoms hin, das einen geeigneten monoklonalen Antikörper produziert, wird die DNA, die für den Antikörper kodiert, kloniert. Die DNA, die für einen einzelkettigen HAAH-spezifischen Antikörper kodiert, in der variable Domäne der schweren und der leichten Kette durch ein flexibles Linkerpeptid getrennt sind, wird in einen Expressionsvektor unter Anwendung bekannter Methoden kloniert (z.B. Marasco et. al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:7889–7893 und Marasco et. al., 1997, Gene Therapy 4:11–15). Solche Konstrukte werden in Zellen, z.B. unter Anwendung standardmäßiger Gentransfer-Techniken, für die intrazelluläre Produktion der Antikörper eingeführt. Intrazelluläre Antikörper, d.h. Intrakörper, werden zur Hemmung der Signaltransduktion durch HAAH verwendet. Intrakörper, die an eine carboxyterminale katalytische Domäne der HAAH binden, hemmen die Fähigkeit der HAAH, EGF-ähnliche Zielsequenzen zu hydroxylieren.
Methoden zur Knüpfung von HAAH-spezifischen Antikörpern (oder Fragmenten davon), die an Zelloberflächen-exponierte Epitope von HAAH binden, an die Oberfläche einer Tumorzelle werden an bekannte cytotoxische Agenzien, z.B. Ricin- oder Diphtherietoxin, unter Anwendung bekannter Methoden gebunden.
Es folgt eine Beschreibung einer lediglich beispielhaften Natur unter Bezugnahme auf die begleitenden Zeichnungen der Materialien und Methodologien, die bei der vorliegenden Erfindung angewendet werden können.
In den Zeichnungen ist:
1 ein Balkendiagramm, das die durch transiente Transfektion von NIH-3T3-Zellen mit verschiedenen Aspartyl-(Asparaginyl)-beta-Hydroxylase (AAH) cDNAs induzierte Koloniebildung zeigt. Die Koloniebildung wurde durch transiente Transfekti an mit 10 μg DNA induziert. Im Gegensatz dazu weist das mutierte murine AAH-Konstrukt ohne enzymatische Aktivität keine transformierende Aktivität auf. Die Daten sind angegeben als mittlere Anzahl der transformierten Foci ± SEM.
2 ein Balkendiagramm, das die Ergebnisse einer densitometrischen Analyse eines Western Blot-Assays von Proteinen zeigt, die durch verschiedene mit muriner AAH stabil transfizierte Zellklone produziert sind. In Klonen 7 und 18 lag eine mäßige Zunahme der HAAH-Genexpression vor, wohingegen die Überexpression in einem geringeren Grad in Klon 16 vorlag.
3A–B Balkendiagramme, die die Koloniebildung in Weichagar zeigen, die mit HAAH stabil transfizierte Klone entwickeln, im Vergleich zur enzymatischen Aktivität von HAAH. 3A zeigt eine Messung der enzymatischen Aktivität der murinen AAH in Klonen 7, 16 und 18, und 3B zeigt die durch Klone 7, 16 und 18 entstandene Koloniebildung. Die Daten sind angegeben als mittlere Anzahl der Kolonien 10 Tage nach der Ausplattierung ± SEM. Alle drei Klone mit mäßigen Zunahmen der enzymatischen Aktivität von HAAH, die mit der Proteinexpression korrelierte, zeigten ein Anker-unabhängiges Wachstum.
4 ein Balkendiagramm, das die Tumorbildung in Nacktmäusen zeigt, die mit transfizierten Klonen, die murine AAH überexprimieren, injiziert waren. Das Tumorwachstum wurde nach 30 Tagen ausgewertet. Das mittlere Tumorgewicht wurde in Mäusen beobachtet, die mit Klonen 7, 16 und 18 injiziert waren, im Vergleich zu einem Mock-DNA-transfizierten Klon. Alle Tiere, die mit Klonen injiziert waren, die HAAH überexprimieren, entwickelten Tumoren.
5A–D Balkendiagramme, die eine erhöhte AAH-Expression in PNET2- (5A, 5C) und SH-Sy5y- (56) -Zellen zeigen, die mit Retinoesäure (5A, 56) oder Phorbolestermyristat (PMA; 5C) behandelt waren, um einen Neuritenauswuchs zu induzieren, wie er während der Tumorzellinvasion erfolgt. Die Zellen wurden mit 10 μm Retinoesäure oder 100 nM PMA für 0, 1, 2, 3, 4 oder 7 Tage behandelt. Die Zelllysate wurden mittels Western Blot-Analyse unter Verwendung eines HAAH-spezifischen monoklonalen Antikörpers zum Nachweis des 85 kDa AAH-Proteins analysiert. Die Grade der Immunreaktivität wurden mittels Volumendensitometrie (willkürliche Einheiten) gemessen. Die Diagramme zeigen den Mittelwert ± SD der aus drei separaten Experimenten erhaltenen Ergebnisse an. In 5D wurden PNET2-Zellen für 24 Stunden mit sublethalen Konzentrationen an H₂O₂ behandelt, um die Neuritenretraktion zu induzieren. Eine Lebensfähigkeit von größer als 90% der Zellen wurde durch TrypanBlau-Farbstoffausschluss nachgewiesen. Ähnliche Ergebnisse wurden für SH-Sy5y-Zellen erhalten.
6 ein Balkendiagramm, das die Auswirkungen der AAH-Überexpression auf die Grade der Antiapoptose (Bcl-2), den Zellzyklus-Mitoseinhibitor (p16 und p21/Waf1) und die Proliferations- (proliferierendes Zellkernantigen; PCNA) -Moleküle zeigt. Neuronale PNET2-Zellen wurden mit der humanen Volllängen-cDNA stabil transfiziert, die AAH (pHAAH) oder Leervektor (pcDNA) kodiert. Die AAH-Genexpression erfolgte unter der Kontrolle eines CMV-Promoters. Die Western Blot-Analyse wurde mit Zelllysaten vorgenommen, die aus Kulturen präpariert waren, die zu 70 bis 80 Prozent konfluent waren. Die Proteinbeladung war in jeder Bahn äquivalent. Replikat-Blots wurden mit den verschiedenen Antikörpern sondiert. Die Balkendiagramme zeigen die mittlere SD der in drei Experimenten gemessenen Proteinexpressionshöhen. Alle Differenzen sind anhand der Student-t-Testanalyse statistisch signifikant (P < 0,01– P < 0,001).
7 ein Diagramm, das die Komponenten des IRS-1-Signaltransduktionswegs zeigt.
Beispiel 1: Eine erhöhte Expression von HAAH ist mit einer malignen Transformation assoziiert
HAAH ist ein hochgradig konserviertes Enzym, das EGF-ähnliche Domänen in Transformations-assoziierten Proteinen hydroxyliert. Das HAAH-Gen ist bei vielen Krebstypen, einschließlich humaner hepatozellulärer Karzinome und Cholangiokarzinome, überexprimiert. Die HAAH-Genexpression wurde als nicht nachweisbar während der Gallengangsproliferation sowohl bei einem menschlichen Erkrankungs- als auch bei Rattenmodellen, verglichen zu einem Cholangiokarzinom befunden. Die Überexpression von HAAH in NIH-3T3-Zellen war mit der Bildung eines malignen Phänotyps assoziiert, und die enzymatische Aktivität wurde als für die zelluläre Transformation erforderlich befunden. Die nachstehend beschriebenen Daten zeigen, dass die Überexpression von HAAH an die zelluläre Transformation von Gallenwegsepithelzellen geknüpft ist.
Um Moleküle zu identifizieren, die in transformierten malignen Zellen eines humanen hepatozytischen Ursprungs spezifisch überexprimiert sind, wurde die FOCUS hepatozelluläre Karzinom-(HCC)-Zelllinie als ein Immunogen verwendet, um monoklonale Antikörper (mAb) zu generieren, die mit dem malignen Phänotyp assoziierte Proteine spezifisch oder präferenziell erkennen. Eine Lambda GT11 cDNA-Expressionsbibliothek, die von HepG2 HCC-Zellen abgeleitet war, wurde gescreent, und von einem HAAH-spezifischen mAb, der gegen die FOCUS-Zelllinie produziert war, wurde festgestellt, dass er ein Epitop auf einem Protein, das durch eine HAAH cDNA kodiert war, erkennt. Es wurde festgestellt, dass das HAAH-Enzym in mehreren unterschiedlichen humanen transformierten Zelllinien und Tumorgeweben im Vergleich zu daran angrenzenden humanen Gewebe-Gegenstücken heraufreguliert war. Das überexprimierte HAAH-Enzym in verschiedenen humanen malignen Geweben wurde als katalytisch aktiv befunden.
Die HAAH-Genexpression wurde in proliferierenden Gallengängen und in NIH 3T3-Zellen untersucht. Ihre Rolle in der Generierung des malignen Phänotyps wurde anhand der Bildung transformierter Foci, des Wachstums in Weichagar als einem Index des Anker-unabhängigen Wachstums und der Tumorbildung in Nacktmäusen gemessen. Die Rolle der enzymatischen Aktivität bei der Induktion des transformierten Phänotyps wurde unter Verwendung eines cDNA-Konstrukts mit einer Mutation in der katalytischen Stelle, die die Hydroxylase-Aktivität beseitigte, gemessen. Die Ergebnisse zeigen, dass ein Anstieg in der Expression des HAAH-Gens mit einer malignen Transformation der Gallengänge assoziiert ist.
Die folgenden Materialien und Methoden wurden zur Generierung der nachstehend beschriebenen Daten verwendet.
Antikörper
Der FB50 monoklonale Antikörper wurde durch zelluläre Immunisierung von Balb/C-Mäusen mit FOCUS HCC Zellen generiert. Ein monoklonaler Anti-Dengue-Virus-Antikörper wurde als eine nicht-relevante Kontrolle verwendet. Der HBOH2 monoklonale Antikörper wurde gegen ein rekombinantes 52 kDa HAAH-Polypeptid generiert und erkennt die katalytische Domäne der Beta-Hydroxylase von Maus- und humanen Proteinen. Polyklonale Anti-HAAH-Antikörper kreuzreagieren mit Ratten-Hydroxylase-Protein. Der Kontroll-Antikörper Anti-Erk-1 wurde von Santa Cruz Biotechnology, Inc., CA, bezogen. Schaf-Anti-Maus- und Affe-Anti-Kaninchen-Antiseren, die mit Meerrettichperoxidase markiert waren, wurden erhalten von Amersham, Arlington Heights, IL.
Konstrukte
Das murine Volllängen-AAH-Konstrukt (pNH376) und das ortsgerichtete Mutationskonstrukt (pNH376-H660) mit beseitigter katalytischer Aktivität wurden in den eukaryotischen Expressionsvektor pcDNA3 (Invitrogen Corp., San Diego, CA) kloniert. Die humane Volllängen-AAH wurde in den prokaryotischen Expressionsvektor pBC-SK+ (Stratagene, La Jolla, CA) kloniert. Die humane Volllängen-AAH (GENBANK Zugriffs-Nr. S83325) wurde in die EcoRI-Stelle des pcDNA3-Vektors subkloniert.
Tiermodell der Gallengangsproliferation
Ratten wurden in 9 separate Gruppen von jeweils 3 Tieren aufgeteilt, mit Ausnahme der Gruppe 9, die 5 Ratten enthielt. Gruppe 1 war die nicht-chirurgische Kontrollgruppe, und Gruppe 2 war die Sham-operierte chirurgische Kontrolle. Die verbliebenen Gruppen wurden einer Ligation des Ductus choledochus unterzogen, um die intrahepatische Gallengangsproliferation zu induzieren, und wurden nach 6, 12, 24, 48 Stunden und 4, 8, und 16 Tagen ausgewertet, wie in Tabelle 3 gezeigt. Die Tiere wurden mit CO₂ asphyxiert, und Leberproben wurden aus den linken lateralen und medialen Lappen entnommen, in 2% Paraformaldehyd fixiert und in Paraffin eingebettet. Die Leberproben (5 μm) wurden geschnitten und mit Hematoxylen und Eosin angefärbt, um die intrahepatische Gallengangsproliferation auszuwerten. Die Immunhistochemie wurde mit polyklonalen Anti-HAAH-Antikörpern, die mit dem Rattenprotein kreuzreagieren, vorgenommen, um die Höhen der Proteinexpression zu bestimmen.
Gallengangsproliferation in Verbindung mit primär sklerosierender Cholangitis (PSC)
Leberbiopsie-Proben wurden von 7 Individuen mit PSC und assoziierter Gallengangsproliferation genommen. Diese Individuen wurden gemäß standardmäßiger gastroenterohepatologischer Protokolle ausgewertet. Die Patienten waren 22–46 Jahre alt und bestanden in 4 Männern und drei Frauen. Vier wiesen eine assoziierte entzündliche Darmerkrankung auf (3 ulzerative Kolitis und 1 Crohn-Kolitis). Alle Patienten wurden einer radiologischen Auswertung unterzogen, einschließlich einer abdominalen Ultrasonographie und einer endoskopischen retrograden Cholangiopankreatikographie, um die Diagnose einer extrahepatischen Gallengangsobstruktion auszuschließen. Gewebesektionen wurden aus in Paraffin eingebetteten Blöcken präpariert und wurden durch Hämatoxylin- und Eosin-Anfärbung auf die Gallengangsproliferation ausgewertet. Die Expression von HAAH wurde mittels Immunhistochemie unter Verwendung eines HAAH-spezifischen monoklonalen Antikörpers, wie FB50, bestimmt.
Immunhistochemie
Lebergewebesektionen (5 μm) wurden in Xylol entparaffinisiert und in Alkoholstufen rehydriert. Die endogene Peroxidase-Aktivität wurde durch eine 30-minütige Behandlung mit 0,6% H₂O₂ in 60% Methanol gelöscht. Endogenes Biotin wurde durch Inkubation mit Avidin-Biotin-Blockierlösungen (Vector Laboratories, Burlingame, CA) maskiert. Der FB50 mAb (für PSC-Proben) und polyklonale Anti-HAAH-Hydroxylase-Antikörper (für Rattenleber-Proben) wurden den Scheiben in einer befeuchteten Kammer bei 4°C über Nacht zugegeben. Die immunhistochemische Anfärbung wurde unter Anwendung einer standardmäßigen Methode mit Avidin-Biotin-Meerrettichperoxidase-Komplex (ABC) unter Verwendung von Vectastain Kits mit Diaminobenzidin (DAB) als dem Chromogen gemäß den Anweisungen des Herstellers (Vector Laborstories, Inc., Burlingame, CA) vorgenommen. Die Gewebesektionen wurden mit Hämatoxylin gegengefärbt, gefolgt von einer Dehydrierung in Ethanol. Die Sektionen wurden durch Lichtmikroskopie auf die Gallengangsproliferation und HAAH-Proteinexpression untersucht. Paraffin-Sektionen von Cholangiokarzinom und Plazenta wurden als positive Kontrollen verwendet, und Hepatosteatose-Proben wurden als negative Kontrollen verwendet. Um die Antikörper-Bindungsspezifität zu kontrollieren, wurden angrenzende Sektionen in der Abwesenheit eines primären Antikörpers oder unter Verwendung eines nicht-relevanten Antikörpers gegen Dengue-Virus immungefärbt. Als einer positiven Kontrolle für die Gewebeimmunreaktivität wurden angrenzende Sektionen aller Proben mit monoklonalem Antikörper gegen Glyceraldehyd-3-phosphatdehydrogenase immungefärbt.
Western Blot-Analyse
Zelllysate wurden in einem standardisierten Radioimmunpräzipitationsassay- (RIPA) -Puffer, der Protease-Inhibitoren enthielt, präpariert. Die Gesamtmenge an Protein in den Lysaten wurde mittels eines kolorimetrischen Bio-Rad-Assays (Bio Rad, Hercules, CA), gefolgt von einer 10% Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamidgelelektrophorese (SDS-PAGE), bestimmt, auf PVDF-Membranen übertragen und einer Western Blot-Analyse unter Verwendung von FB50, HBOH2, Anti-Erk-1 (verwendet als eine interne Kontrolle für die Proteinbeladung) als primären, Schaf-Anti-Maus- und Affe-Anti-Kaninchen-Antiseren, markiert mit Meerrettichperoxidase, als sekundären Antikörpern unterzogen. Die Antikörperbindung wurde mit Reagentien mit erhöhter Chemilumineszenz (SuperSignal, Pierce Chemical Company, Rockford, IL) und Filmautoradiographie nachgewiesen. Die Grade der Immunreaktivität wurden mittels Volumendensitometrie unter Verwendung einer NIH Image-Software gemessen.
Assay der enzymatischen Aktivität
Die Aktivität der AAH wurde in Zelllysaten unter Verwendung der ersten EGF-ähnlichen Domäne von Rinderprotein S als Substrat, wobei ¹⁴C-markiertes Alpha-Ketogluterat die Domäne hydroxyliert, die ¹⁴C enthaltendes CO₂ freisetzt, gemäß standardmäßiger Methoden gemessen, wie z.B. solchen, die beschrieben sind bei Jia et al., 1992, J. Biol. Chem. 267:14322–14327; Wang et al., 1991, J. Biol. Chem. 266:14004–14010; oder Gronke et al., 1990, J. Biol. Chem. 265:8558–8565. Die Inkubationen wurden bei 37°C für 30 min in einem Endvolumen von 50 μl, enthaltend 48 μg Rohzellextrakt-Protein und 75 μm EGF-Substrat, durchgeführt.
Zelltransfektions-Studien
Die NIH-3T3-Zellen wurden in Dulbecco's modifiziertem Eagle-Medium (DMEM; Mediatech, Washington, DC), ergänzt mit 10% hitzeinaktiviertem fötalem Kälberserum (FCS; Sigma Chemical Co., St. Louis, MO), 1 % L-Glutamin, 1 % nicht-essenziellen Aminosäuren und 1 % Penicillin-Streptomycin (GIBCO BRL, Life Technologies, Inc., Grand Island, NY), kultiviert. Subkonfluente NIH-3T3-Zellen (3 × 10⁵ Zellen/60 mm-Schale) wurden mit 10 μg eines der folgenden Plasmide transfiziert: 1) nicht-rekombinantem pcDNA3-Vektor (Invitrogen Corp., San Diego, CA) als einer negativen Kontrolle; 2) pNH376-H660, der murinen AAH cDNA, die in der katalytischen Domäne mutiert und in den pcDNA3-Vektor, gesteuert durch einen CMV-Promotor, kloniert war; 3) pNH376, der murinen Wildtyp-AAH cDNA, kloniert in den pcDNA3-Vektor; 4) pCDHH, der humanen Wildtyp-AAH cDNA, kloniert in den pcDNA3-Vektor; oder 5) pLNCX-UP1, eine cDNA, die das v-Src-Onkogen kodiert (positive Kontrolle). Die Zellen wurden unter Verwendung des Kalziumphosphat-Transfektionskits gemäß den Anleitungen des Herstellers transfiziert (5 Prime – 3 Prime, Inc., Boulder, CO). Ein Vergleich der zellulären Transfektionsleistung wurde mit den verschiedenen Konstrukten ausgewertet. Für diese Verfahrensweise wurden konfluente Platten, die 48 Stunden nach der Transfektion erhalten waren, aufgeteilt und in 12 separate 6 cm-Schalen wieder ausgesät, wobei 6 von diesen zum Wachstum in der Gegenwart von 400 μg/ml G-418 (GIBCO BRL, Life Technologies, Inc., Grand Island, NY) enthaltendem Medium gebracht wurden. Die Anzahl der G-418-resistenten Foci wurde 14 Tage nach der Transfektion bestimmt und zur Korrektur jeglicher Variabilität in der Transfektionsleistung verwendet.
Transformations-Assay
Die NIH-3T3-Zellen wurden mit den verschiedenen Konstrukten transfiziert und durften nach 48 Stunden zur Konfluenz gelangen, wie oben beschrieben. Jede 6 cm-Schale wurde aufgeteilt und in 12 verschiedene 6 cm-Schalen ausgesät. Während 6 von diesen zum Wachstum in der Gegenwart von G-418 zum Nachweis der Transfektionsleistung gebracht wurden, wurden die anderen 6 in komplettem Medium ohne G-418 und bei einem Austausch des Mediums an jedem 4ten Tag gezüchtet. Die Anzahl der transformierten Foci wurde in diesen Platten ohne G-418 gezählt und als transformierte Foci pro μg transfizierter DNA ausgedrückt.
Anker-unabhängiger Zellwachstums-Assay
Eine Limiting Dilution-Technik (0,15 Zellen/Well einer flachbödigen 96-Well-Platte) wurde an Transfektanten vorgenommen, die in G-418 gezüchtet waren, um Zellklone mit unterschiedlichen Graden der HAAH-Aktivität zu isolieren, wie mittels Western Blot-Analyse und enzymatischem Assay der Hydroxylase-Aktivität gemessen. Klonierte Zelllinien (1,0 × 10⁴ Zellen) wurden in komplettem Medium, das 0,4 % niederschmelzende Agarose enthielt (SeaPlaque GTG Agarose; FMC Bioproducts, Rockland, Maine), suspendiert und über ein Bodenagar-Gemisch ausgelegt, bestehend aus komplettem Medium mit 0,53 % niederschmelzender Agarose. Jeder Klon wurde im Triplikat untersucht. Die Klone wurden unter diesen Bedingungen ausgesät, und 10 Tage später wurde die Größe (positives Wachstum > 0,1 mm im Durchmesser) und die Anzahl der Foci bestimmt.
Tumorigenität bei Nacktmäusen
Dieselben Klone, wie im Anker-unabhängigen Wachstums-Assay ausgewertet, wurden in Nacktmäuse injiziert und auf die Tumorbildung beobachtet. Die Tumorigenität wurde unter Verwendung von 10 Tieren in jeder der 4 Gruppen ausgewertet (Charles River Labs., Wilmington, MA). Gruppe 1 erhielt 1 × 10⁷ Zellen, die mit Mock-DNA stabil transfiziert waren, Gruppe 2–4 erhielt 1 × 10⁷ Zellen der Klone, die mit pNH376 stabil transfiziert waren und verschiedene Mengen an murinem HAAH-Protein expri mierten. Die Nacktmäuse wurden unter Pathogen-freien Bedingungen in einer standardmäßigen Tierbehausung gehalten. 30 Tage nach der Tumorzell-Inokulation wurden die Tiere unter Verwendung von Isofluoran (Acrrane, Anaquest, NJ) -enthaltenden Kammern geopfert, und die Tumoren wurden vorsichtig entfernt und das Gewicht bestimmt.
Tiermodell der Gallengangsproliferation

Nach der Ligation des Ductus choledochus war eine intrahepatische Gallengangsproliferation nach 48 Stunden evident. 8 und 16 Tage nach der Ligation des Ductus choledochus erhaltene Gewebeproben offenbarten eine extensive Gallengangsproliferation, wie in Tabelle 3 gezeigt. Tabelle 3: Gallengangsproliferation und HAAH-Expression zu unterschiedlichen Intervallen nach der Ligation des Ductus choledochus

Gruppe	Chirurgisches Verfahren	Mikroskopie^*	Immunhistochemie
1	Keine Chirurgie	normal	negativ
2	Sham-Chirurgie	normal	negativ
3	6 Stunden nach Ligation	normal	negativ
4	12 Stunden nach Ligation	normal	negativ
5	24 Stunden nach Ligation	normal	negativ
6	48 Stunden nach Ligation	minimale Gallengangsproliferation	negativ
7	4 Tage nach Ligatian	mäßige Gallengangsproliferation	negativ
8	8 Tage nach Ligatian	extensive Gallengangsproliferation	negativ
9	16 Tage nach Ligation	extensive Gallengangsproliferation	negativ

* Die Untersuchung wurde unter unter Lichtmikroskopie nach einer Hämatoxylin- und Eosin-Anfärbung vorgenommen.

Die immunhistochemische Anfärbung versagte darin, das Vorhandensein von HAAH in proliferierenden Gallengängen zu irgendeinem Zeitpunkt nachzuweisen. Die Analyse der HAAH-Expression in Gallengängen, die von Sham-operierten Kontrollen stammten, war ebenfalls negativ, wohingegen alle Proben eine positive Immunreaktivität mit Kontroll-Antikörpern zu Glyceraldehyd-3-phosphatdehydrogenase zeigten. Somit war die Gallengangsproliferation nicht mit einer erhöhten HAAH-Expression in diesem standardmäßigen Tiermodellsystem verbunden.
HAAH-Expression in PSC
Die Leberbiopsie-Proben von Patienten mit PSC zeigten eine Gallengangsproliferation, begleitet von einer periduktalen Fibrose und einem mononukleären entzündlichen Zellinfiltrat ohne Nachweis einer Dysplasie. Angrenzende Sektionen, die mit einem HAAH-spezifischen monoklonalen Antikörper immungefärbt waren, zeigten keine detektierbare HAAH-Immunreaktivität in proliferierenden Gallengängen. Im Gegensatz dazu zeigten Sektionen des Cholangiokarzinoms, die gleichzeitig unter Verwendung desselben Antikörpers und der Detektionsreagentien immungefärbt wurden, intensive Höhen der HAAH-Immunreaktivität in nahezu allen Tumorzellen, wohingegen angrenzende Sektionen des Cholangiokarzinoms eine negative immunfärbende Reaktion mit monoklonalem Antikörper zu Dengue-Virus zeigten. Diese Befunde weisen darauf hin, dass die HAAH-Expression mit einer malignen Transformation und nicht einer nicht-kanzerösen zellulären Proliferation der intrahepatischen Gallengänge assoziiert war.
HAAH-assoziierte Transformation von NIH-3T3-Zellen
Das Transformationsvermögen der murinen und humanen AAH-Gene, als auch des murinen AAH-Mutantenkonstrukt ohne enzymatische Aktivität wurden zu Mock-DNA (negative Kontrolle) und v-Src-transfizierten NIH-3T3-Zellen (positive Kontrolle) verglichen. Das Transformationsvermögen von muriner AAH wurde als das 2-3-fache dessen der Vektor-DNA-Kontrolle befunden, wie in 1 gezeigt. Das Transformationsvermögen des humanen Gens war größer als das bei der murinen AAH beobachtete (diesbezüglich 32 ± 1,5 gegenüber 13 ± 2,6 transformierten Foci). Die mit muri ner und humaner AAH transfizierten Zellen bildeten große Foci, die jenen der v-Src-transfizierten Fibroblasten ähnelten, verglichen zu den gelegentlich viel kleineren Foci, die bei mit Vektor-DNA transfizierten Zellen beobachtet werden, welche die Kontaktinhibition von Fibroblasten-Zelllinien aufwiesen. Unter Verwendung des mutierten pNH376-H660-Konstrukts ohne enzymatische Aktivität vorgenommene Parallelexperimente zeigten keine transformierende Aktivität. Dieser Befund zeigt, dass die enzymatische Aktivität von HAAH für die transformierende Aktivität, die das HAAH-Gen aufweist, erforderlich ist.
Anker-unabhängiger Zellwachstums-Assay
Nach der transienten Transfektion mit dem murinen AAH-Konstrukt wurden mehrere verschiedene transformierte Foci für diluierende Klonierungsexperimente isoliert, um stabil transfizierte Zellklone mit unterschiedlichen Höhen der AAH-Genexpression zu etablieren. Neun verschiedene klonierte Zelllinien wurden für die weitere Untersuchung ausgewählt. Die Expressionshöhe des HAAH-Proteins wurde durch Western Blot-Analyse bestimmt. Klone 7 und 18 zeigten eine mäßige Zunahme der HAAH-Proteinexpression, bildeten jedoch große Kolonien in Weichagar (2). Die Proteinbeladung war in allen Bahnen äquivalent, wie durch ein Immunblotting derselben Membranen mit einem monoklonalen Anti-Erk-1-Antikörper gezeigt. Die erhöhte Proteinexpression war mit einer verstärkten enzymatischen Aktivität verbunden, wie in 3 gezeigt. Die Fähigkeit dieser Klone, ein Anker-unabhängiges Zellwachstum in Weichagar zu zeigen, ist in 3 dargestellt. Alle 3 Klone mit einer erhöhten HAAH-Genexpression zeigten ein Anker-unabhängiges Zellwachstum, verglichen zu dem mit Mock-DNA transfizierten Klon.
Tumorbildung in Nacktmäusen
Die 3 Klone mit erhöhter HAAH-Genexpression wurden auf die Fähigkeit zur Bildung von Tumoren in Nacktmäusen ausgewertet. Die Tumorgröße in der Maus, die Klon 18 erhalten hatte, wurde zu einem mit Mock-DANN transfizierten Klon verglichen. Klone 7, 16 und 18 waren bei diesem Assay hochgradig transformiert und erzeugten große Tumoren mit einem mittleren Gewicht von 2,5, 0,9 bzw. 1,5 Gramm (4).
Diese Daten zeigen, dass die Überexpression von HAAH zur Induktion und Beibehaltung des malignen Phänotyps in vivo beiträgt.
Hoher HAAH-Expressionsgrad ist für Malignität indikativ
Um zu bestimmen, ob die HAAH-Expression viel mehr mit einer Malignität als einem erhöhten Zellumsatz verbunden war, wurden zwei Modelle der Gallengangsproliferation untersucht. In dem Tiermodell induzierte die Ligation des Ductus choledochus eine extensive intrahepatische Gallengangsproliferation, doch gab es keinen Nachweis einer HAAH-Genexpression unter diesen experimentellen Bedingungen, wie in Tabelle 3 gezeigt. In ähnlicher Weise wurde die HAAH-Genexpression in einem humanen Krankheitsmodell in Verbindung mit der Gallengangsproliferation ausgewertet, da PSC eine autoimmune Lebererkrankung in Verbindung mit der Zerstörung als auch der Proliferation der intra- und extrahepatischen Gallengänge ist. PSC ist eine prämaligne Erkrankung, und ein signifikanter Anteil der betroffenen Individuen wird schließlich ein Cholangiokarzinom entwickeln. Es gab jedoch keinen Nachweis einer erhöhten HAAH-Genexpression in der Gegenwart einer extensiven Gallengangsproliferation.
Nachdem festgestellt war, dass die HAAH-Proteinmengen bei Cholangiokarzinom erhöht waren, nicht aber bei normalen oder proliferierenden Gallengängen, wurde die Rolle der HAAH in der Generierung eines malignen Phänotyps untersucht. Das HAAH-Gen wurde in NIH-3T3-Zellen transfiziert, und zelluläre Veränderungen, z.B. eine erhöhte Bildung von transformierten Foci, Koloniewachstum in Weichagar und Tumorbildung in Nacktmäusen in Verbindung mit einer malignen Transformation, wurden ausgewertet. Die murinen und humanen Volllängen-AAH-Gene wurden in Expressionskonstrukte kloniert und transient in NIH-3T3-Zellen transfiziert. Eine erhöhte Anzahl an transformierten Foci wurde in Zellen nachgewiesen, die sowohl mit dem murinen als auch humanen AAH-Gen transfiziert waren, verglichen zu den mit Mock-DNA transfizierten Kontrollen. Die erhöhte Anzahl der transformierten Foci war nach der Kontrolle der Transfektionsleistung nicht ebenso hoch, verglichen zu den mit v-Src-Gen transfizierten Zellen, die als eine positive Kontrolle verwendet wurden. Die enzymatische Aktivität des HAAH-Gens war für einen malignen Phänotyp erfor derlich, da ein Mutantenkonstrukt, bei welchem die katalytische Stelle beseitigt war, keine transformierenden Eigenschaften aufwies. Mehrere stabile Transfektanten und klonierte NIH-3T3-Zelllinien mit einer mäßigen Zunahme der HAAH-Proteinmengen und enzymatischen Aktivität wurden etabliert. Solche Zelllinien wurden in Weichagar platziert, um das Anker-unabhängige Zellwachstum als einer anderen Eigenschaft des malignen Phänotyps zu untersuchen. Alle Zelllinien wuchsen in Weichagar, verglichen zu der mit Mock-DNA transfizierten Kontrolle, und es lag eine positive Korrelation zwischen der zellulären Höhe der HAAH-Genexpression und der Anzahl und Größe der gebildeten Kolonien vor. Drei dieser klonierten Zelllinien bildeten Tumoren in Nacktmäusen. Alle drei Zelllinien mit einer erhöhten HAAH-Expression waren onkogen, wie durch die Entwicklung großer Tumoren als einem anderen wohl bekannten Charakteristikum des transformierten Phänotyps gezeigt.
Um zu bestimmen, ob zelluläre Veränderungen, die durch die Überexpression von HAAH induziert waren, zu der enzymatischen Funktion in Bezug standen, wurde eine ortsgerichtete Mutation in das Gen eingeführt, welche die Ferrosalz-Bindungsstelle von Histidin zu Lysin an der 660sten Position der Maus-HAAH austauschte und dabei die Hydroxylase-Aktivität der murinen HAAH beseitigte. Eine entsprechende Mutation bei HAAH wird als einer dominant-negativen Mutante zur Hemmung der HAAH-Hydroxylase-Aktivität verwendet. Das pNH376-H660-Konstrukt wies keine transformierende Aktivität auf, was zeigt, dass zelluläre Veränderungen des malignen Phänotyps, wie durch Überexpression induziert, von der enzymatischen Aktivität des Proteins abhängen.
Notch-Rezeptoren und deren Liganden weisen mehrere EGF-ähnliche Domänen in der N-terminalen Region auf, welche die mutmaßliche Konsensussequenz für die Beta-Hydroxylierung enthalten. Notch-Liganden stellen wichtige Elemente des Notch-Signaltransduktionsweges dar, und die Wechselwirkung des Notch mit seinen Liganden erfolgt mittels der EGF-ähnlichen Domänen beider Moleküle. Punktmutationen, die Aspartinsäure oder Asparaginreste in EGF-ähnlichen Domänen beeinflussen, die die Ziele für die Beta-Hydroxylierung durch HAAH darstellen, reduzieren die Kalziumbindung und Protein-Protein-Interaktionen, die an der Aktivierung der stromabwärts gerichteten Signaltransduktionswege beteiligt sind. Die Überexpression von HAAH und die Notch-Protein-Hydroxylierung durch HAAH tragen zu Malignität bei. Das Tumorwachstum wird durch eine Verminderung der Notch-Protein-Hydroxylierung durch HAAH gehemmt.
Die hierin vorgestellten Daten liefern den Nachweis, dass eine hochgradige HAAH-Expression an eine maligne Transformation geknüpft ist. Ein Anstieg der Expression der HAAH-cDNA in NIH-3T3-Zellen induzierte einen transformierten Phänotyp, wie durch erhöhte Anzahlen der transformierten Foci, des Anker-unabhängigen Wachstums und der Tumorigenese in Nacktmäusen manifestiert. Außerdem wurde festgestellt, dass intaktes HAAH-Enzym für die HAAH-assoziierte Transformation erforderlich ist. Dementsprechend verleiht die Hemmung von lediglich 20 % der endogenen enzymatischen Aktivität oder Expression von HAAH einen therapeutischen Nutzen. Zum Beispiel wird ein klinischer Nutzen durch eine Hemmung von 50 %–70 % der Expression oder Aktivität von HAAH nach Verabreichung einer HAAH-inhibitorischen Verbindung, verglichen zu der Menge, die mit einer unbehandelten Krebszelle oder einer normalen nicht-kanzerösen Zelle verbunden ist, erzielt.
HAAH wird auf der Ebene der Transkription reguliert. Lediglich mäßige Zunahmen der HAAH-Expression und Enzymaktivität waren für die zelluläre Transformation erforderlich. Diese Ergebnisse zeigen, dass eine erhöhte HAAH-Genexpression und Enzymaktivität zur Generierung oder Beibehaltung des transformierten Phänotyps beitragen und dass eine Verminderung der Transkription des HAAH-Gens oder eine Verminderung der enzymatischen Aktivität des HAAH-Genprodukts zu einer Verminderung der Malignität führen. Dementsprechend wird die HAAH-Transkription durch Verabreichen von Verbindungen gehemmt, die die Bindung von Fos und/oder Jun (Elemente, die die HAAH-Transkription regulieren) an HAAH-Promotorsequenzen vermindern.
Da HAAH mit der malignen Transformation des Gallenwegsepithels heraufreguliert wird und die HAAH-Immunreaktivität auf Tumorzell-Oberflächenmembranen detektierbar ist, ist HAAH auch ein Molekül, auf das ein zytotoxisches Agens zielgerichtet werden kann, z.B. durch Koppeln des zytotoxischen Agens an eine Verbindung, die an auf der Oberfläche einer Tumorzelle exprimierte HAAH bindet. Ein Assay der HAAH-Proteinmengen in biologischen Flüssigkeiten, wie etwa Galle, stellt einen diagnostischen Marker für humanes Cholangiokarzinom dar.
Beispiel 2: Expression von AAH und Wachstum und Invasivität maligner ZNS-Neoplasmen
AAH wird in Karzinomen und trophoblastischen Zellen reichlich exprimiert, nicht aber in den meisten normalen Zellen, einschließlich jener von ZNS-Ursprung. Hohe Grade der AAH-Expression wurden in 15 von 16 Glioblastomen, 8 von 9 anaplastischen Oligodendrogliomen und 12 von 12 primitiven neuroektodermalen Tumoren (PNETs) beobachtet. Hohe Grade der AAH-Immunreaktivität wurden primär an den infiltrierenden Rändern und nicht in den zentralen Abschnitten der Tumoren lokalisiert. Eine immunhistochemische Färbung mit Doppelmarkierung wies eine reziprokale Beziehung zwischen AAH und Tenascin, einem Substrat für die enzymatische Aktivität von AAH, nach. Neuronale PNET2-Zelllinien, die mit Phorbolestermyristat oder Retinoesäure behandelt waren, um die Neuritenverlängerung und das invasive Wachstum zu stimulieren, zeigten hohe Grade der AAH-Expression, wohingegen eine H₂O₂-induzierte Neuritenretraktion zur Herabregulierung von AAH führte. Neuronale PNET2-Zellen, die die humane AAH cDNA stabil überexpremierten, zeigten erhöhte Mengen an PCNA und Bcl-2 und reduzierte Mengen an p21/Wafl und p16, was vermuten lässt, dass die AAH-Überexpression zu einer gesteigerten pathologischen Zellproliferation, Zellzyklus-Progression und Resistenz gegen Apoptose führt. Außerdem zeigen die verminderten Mengen an p16, wie bei AAH-Transfektanten beobachtet, an, dass die AAH-Überexpression ein verstärktes invasives Wachstum der neoplastischen Zellen verleiht, da die Deletion oder Herabregulierung des p16-Gens mit einem aggressiveren und invasiveren in vivo-Wachstum der Glioblastome korreliert. Eine erhöhte AAH-Immunreaktivität wurde an den infiltrierenden Rändern von primär malignen ZNS-Neoplasmen nachgewiesen, was weiterhin auf eine Rolle der HAAH in der Tumorinvasivität hinweist.
Die folgenden Materialien und Methoden wurden zur Generierung der unten beschriebenen Daten verwendet.
Analyse der AAH-Immunreaktivität in humanen primär malignen ZNS-Neoplasmen:
Die AAH-Immunreaktivität wurde in chirurgischen Resektionsproben von Glioblastom (N=16), anaplastischem Oligodendrogliom (N=9) und primitivem neuroektodermalem Tumor (PNET; supratentoriale Neuroblastome (N=3) und Medulloblastomen (N=9) untersucht. Die histopathologischen Sektionen wurden unter Anlegung standardmäßiger Kriterien nochmals überprüft, um die Diagnosen zu bestätigen. Paraffin-Sektionen von Blöcken, die repräsentative Proben von lebensfähigem festem Tumor, oder eines Tumors mit angrenzendem intaktem Gewebe, enthielten, wurden untersucht. Sektionen von normalen adulten Postmortem-Gehirnen (N=4) wurden als negative Kontrollen einbezogen. Die AAH-Immunreaktivität wurde unter Verwendung eines HAAH-spezifischen monoklonalen Antikörpers nachgewiesen. Die Immunreaktivität wurde mittels der Avidin-Biotin-Meerrettichperoxidase-Komplex-Methode (Vector ABC Elite Kit; Vector Laborstories, Burlingame, CA) unter Verwendung von 3,3'-Diaminobenzidin (DAB) als dem Chromogen (24) und Hämatoxylin als einer Gegenfärbung sichtbar gemacht.
Tenascin und Laminin sind geeignete Substrate für AAH aufgrund des Vorhandenseins der EGF-ähnlichen Wiederholungen innerhalb der Moleküle. Immunfärbungsstudien mit Doppelmarkierung wurden zur gemeinsamen Lokalisierung von AAH mit Tenascin oder Laminin vorgenommen. Die AAH-Immunreaktivität wurde mittels der ABC-Methode mit DAB als dem Chromogen nachgewiesen, und die Tenascin- oder Laminin-Immunreaktivität wurde mittels der Avidin-Biotin-alkalische Phosphatase-Komplex-Methode (Vector Laborstories, Burlingame, CA) mit BCIP/NBT als dem Substrat nachgewiesen. Als positiven und negativen Kontrollen wurden angrenzende Sektionen mit monoklonalem Antkörper zu saurem Gliafibrillen-Protein (GFAP) und Hepatitis B-Oberflächenantigen immungefärbt. Alle Proben wurden unter Verwendung derselben Antikörper-Verdünnungen und Immundetektions-Reagenzien chargenweise immungefärbt.
Zelllinien und Kulturbedingungen
Es wurden Studien durchgeführt, um zu bestimmen, ob die AAH-Expression mit einer Neuriten-(Filopodia)-Verlängerung (Sprießen) moduliert war, wie es bei invasivem Wachstum von malignen Neoplasmen auftritt. Von humaner PNET2 ZNS abgeleitete und SH-Sy5y-Neuroblastomzellen wurden kultiviert und für 0, 1, 2, 3, 5 oder 7 Tage mit 100 nM Phorbol-12-ester-13-acetat oder 10 μM Retinoesäure stimuliert, um das Sprießen zu induzieren. Um außerdem die Auswirkungen der Neuritenretraktion auf die AAH-Expression zu untersuchen, wurden subkonfluente Kulturen für 24 Stunden mit geringen Konzentrationen (10–40 μM) an H₂O₂ behandelt. Für beide Untersuchungen wurde die AAH-Expression mittels Western Blot-Analyse unter Verwendung eines HAAH-spezifischen Antikörpers ausgewertet.
Generierung von mit PNET2 AAH transfizierten Klonen
Die humane Volllängen-AAH cDNA (SEQ ID Nr. 3) wurde in den pcDNA3.1-Säugerexpressionsvektor ligiert, in welchem die Genexpression unter der Kontrolle eines CMV-Promotors (Invitrogen Corp., San Diego, CA) war. PNET2-Zellen wurden entweder mit pHAAH oder pcDNA3 (negative Kontrolle) unter Verwendung des Cellfectin-Reagenz (Gibco BRL, Grand Island, NY) transfiziert. Neomycin-resistente Klone wurden selektioniert, um zu untersuchen, ob die konstitutiven Grade der AAH-Proteinexpression um das zumindest Zweifache relativ zu der Kontrolle (pcDNA3) erhöht waren, wie mittels Western Blot-Analyse nachgewiesen. Um zu bestimmen, wie die AAH-Oberexpression die Expression der Gene, die den transformierten Phänotyp modulieren, veränderte, wurden die Mengen an proliferierendem Zellkernantigen (PCNA), p53, p21/Wafl, Bcl-2 und p16 in den Zelllysaten gemessen, die aus subkonfluenten Kulturen von mit AAH (N=5) und pcDNA3 (N=5) stabil transfizierten Klonen präpariert waren. PCNA wurde als ein Marker der Zellproliferation verwendet. Die P53-, p21/Wafl- und Bcl-2-Mengen wurden untersucht, um zu bestimmen, ob Zellen, die AAH überexprimierten, eher zu einer Zellzyklus-Progression neigten und resistenter gegen Apoptose waren. Die Mengen an p16 wurden ausgewertet, um zu bestimmen, ob die AAH-Überexpression eine Rolle in der Tumorinvasivität spielt. Tabelle 2: HAAH cDNA-Sequenz

(SEQ ID Nr. 3; GENBANK Zugriffs-Nr. S83325; Codon, das das Anfangs-Methionin kodiert, ist unterstrichen).

Western Blot-Analyse
In 10 cm²-Schalen gezüchtete Zellen wurden lysiert und in einem RIPA-Puffer, der Protease- und Phosphatase-Inhibitoren enthielt, für einen standardmäßigen Radioimmunpräzipitations-Assay homogenisiert. Die nach Zentrifugieren der Proben bei 12.000 × g für 10 Minuten zur Entfernung der unlöslichen Trümmer entnommenen Überstände wurden für die Western Blot-Analyse verwendet. Die Proteinkonzentration wurde unter Verwendung des BCA-Assays (Pierce Chemical Co, Rockford, IL) gemessen. Proben, die 60 μg Protein enthielten, wurden elektrophoretisch in Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamidgelen (SDS-PAGE) behandelt und einer Western Blot-Analyse unterzogen. Replikat-Blots wurden mit den individuellen Antikörpern sondiert. Die Immunreaktivität wurde mit Meerrettichperoxidase-konjugiertem IgG (Pierce Chemical Co, Rockford, IL) und Reagenzien mit verstärkter Chemilumineszenz detektiert. Um die Höhen der Proteinexpression zu quantifizieren, wurden nicht-gesättigte Autoradiographien einer Volumendensitometrie unter Verwendung von NIH Image Software, Version 1.6, unterzogen. Die statistischen Vergleiche zwischen mit pHAAH und pcDNA 3transfizierten Zellen wurden unter Verwendung von Student-t-Tests vorgenommen.
Antikörper
HAAH-spezifischer monoklonaler Antikörper, der gegen hepatozelluläre FOCUS-Karzinomzellen generiert war, wurde zum Nachweis der AAH-Immunreaktivität verwendet. Monoklonale Antikörper zu Tenascin und saurem Gliafibrillen-Protein, und polyklonale Kaninchen-Antikörper zu Laminin wurden bezogen von Sigma Co. (St. Louis, MO). Polyklonale Kaninchen-Antikörper zu humanem p16 wurden bezogen von Santa Cruz Biotechnology Inc. (Santa Cruz, CA). Der negative monoklonale 5C3 Kontroll-Antikörper zu Hepatitis B-Oberflächenantigen wurde unter Verwendung von rekombinantem Protein generiert und als eine negative Kontrolle verwendet.
AAH-Immunreaktivität in primär malignen Gehirntumoren
Die AAH-Immunreaktivität wurde in 15 von 16 Glioblastomen, 8 von 9 anaplastischen Oligodendrogliomen und allen 12 PNETs detektiert. Die AAH-Immunreaktivität wurde im Zytoplasma, Zellkern und den Zellfortsätzen lokalisiert. Die Gewebeverteilung der AAH-Immunreaktivität war anhand der intensiven Markierung, die an den Grenzflächen zwischen Tumor und intaktem Gehirn lokalisiert war, und den auffallend geringeren Graden der Immunreaktivität innerhalb der zentralen Abschnitte der Tumoren bemerkbar. Hohe Grade der AAH-Immunreaktivität wurden auch in neoplastischen Zellen beobachtet, die in den subpial liegenden Zonen, Leptomeninges, perivaskulären Virchow-Robin-Räumen und in einzelnen oder kleinen Clustern der neoplastischen Zellen, die das Parenchym infiltriert hatten, verteilt sind. Im Gegensatz dazu war keine AAH-Immunreaktivität im normalen Gehirn detektierbar. Die Verteilung der AAH-Immunreaktivität schien nicht streng mit der DNA-Synthese zu korrelieren, da die Dichte der Kerne in der Mitose (1–5 %) in den zentralen und peripheren Abschnitten der Tumoren ähnlich war.
Beziehung zwischen AAH- und Tenascin-Immunreaktivität in Glioblastomen
Tenascin ist ein extrazelluläre Matrix-assoziiertes Antigen, das in malignen Gliomen exprimiert wird. Tenascin enthält EGF-ähnliche Domänen innerhalb des Moleküls, ein Substrat für die HAAH-Hydroxylierung. Um AAH in Bezug zu der Tenascin-Immunreaktivität in malignen Gehirntumoren zu lokalisieren, wurde eine doppelmarkierende immunhistochemische Färbung vorgenommen, wobei AAH unter Verwendung eines braunen Chromogens (DAB), und von Tenascin, einem blauen Chromogen (BCIP/NBT), detektiert wurde. Angrenzende Sektionen wurden entsprechend doppelmarkiert, um AAH mit Laminin, einer anderen EGF-Domäne, die ein im ZNS exprimiertes extrazelluläres Matrix-Molekül enthielt, gemeinsam zu lokalisieren. Intensive Grade der Tenascin-Immunreaktivität wurden im perivaskulären Bindegewebe und in Verbindung mit der glomeruloiden Proliferation von Endothelzellen beobachtet. Die Doppelmarkierungstudien wiesen eine reziprokale Beziehung zwischen der AAH- und der Tenascin-Immunreaktivität nach, so dass hohe Mengen an AAH mit geringem oder nicht nachweisbarem Tenascin assoziiert waren, und geringe Mengen an AAH mit einer reichlichen Tenascin-Immunreaktivität assoziiert waren. Obschon Laminine ebenfalls geeignete Substrate für die AAH-Enzymaktivität aufgrund der EGF-Wiederholungen innerhalb der Moleküle sind, ergaben die Doppelmarkierungs-Studien lediglich geringe Grade der Laminin-Immunreaktivität in den gesamten Tumoren und an den Grenzflächen zwischen dem Tumor- und dem intakten Gewebe.
Analyse der AAH-Expression in mit PMA oder RA behandelten neuronalen Zelllinien
Das Sprießen von Neuriten/die Verlängerung von Filopodia markiert das invasive Wachstum neoplastischer neuronaler Zellen. PMA aktiviert die Proteinkinase C-Signaltransduktionswege, die am Sprießen von Neuriten beteiligt sind. Retinoesäure bindet an ihren eigenen Rezeptor und der Ligand-Rezeptor-Komplex transloziert an den Nukleus, wo er an spezifische Konsensussequenzen bindet, die in den Promotor/Enhancer-Regionen der am Neuritenwachstum beteiligten Zielgene vorhanden sind. Sowohl PNET2 als auch SH-Sy5y-Zellen können durch Behandlung mit PMA (60–120 nM) oder Retinoesäure (5–10 μM) zum Sprießen veranlasst werden. 5A–D stellen Daten von repräsentativen Western Blot-Autoradiographien dar; die Balkendiagramme entsprechen dem Mittelwert ± SD der aus drei Experimenten erhaltenen Ergebnisse. Die Western Blot-Analyse mit dem FB50-Antikörper detektierte Dublettbanden entsprechend einem Protein mit einer Molekülmasse von etwa 85 kDa. Unbehandelte PNET2-Zellen zeigten relativ geringe Grade der AAH-Immunreaktivität (5A), wohingegen unbehandelte SH-Sy5y-Zellen eine ohne weiteres detektierte AAH-Expression aufwiesen (5B). Unbehandelte PNET2-Zellen zeigten eine polygonale Morphologie mit groben, kurzen, radialen Zellfortsätzen, wohingegen SH-Sy5y-Zellen leicht länglich waren und spontan fein zulaufende Fortsätze ausrecken. Beide Zelllinien zeigten zeitabhängige Zunahmen der Grade der AAH-Immunreaktivität entweder auf RA- (5A und 5B) oder auf PMA- (5C) -Stimulation hin und eine Neuritenverlängerung. Bei PNET2-Zellen nahmen die Mengen an AAH-Protein um das zumindest Zweifache 24 Stunden nach Exposition an RA oder PMA zu, und hohe Mengen an AAH wurden während der gesamten 7 Tage der Studie aufrechterhalten. In SH-Sy5y-Zellen erfolgten die RA- oder PMA- stimulierten Zunahmen der AAH-Expression gradueller und waren nach 7 Tagen der Behandlung am höchsten (5B).
Um die Wirkung der AAH-Expression auf die Neuritenretraktion zu untersuchen, wurden PNET2- und SH-Sy5y-Zellen mit geringen Konzentrationen (8–40 μM) an H₂O₂ behandelt. Nach 24 Stunden der Exposition an bis zu 40 μM H₂O₂ zeigten sie, obschon die meisten Zellen lebensfähig blieben (TrypanBlau-Farbstoffausschluss), eine Neuritenretraktion und Abrundung. Die Western Blot-Analyse unter Verwendung des FB50-Antikörpers zeigte H₂O₂-dosisabhängige Reduktionen in den Mengen an AAH-Protein (5D).
Wirkungen der AAH-Überexpression in PNET2-Zellen
Um die Rolle der AAH-Überexpression in Bezug auf den malignen Phänotyp direkt zu beurteilen, wurden PNET2-Zellen mit der humanen Vollängen-cDNA bei einer Genexpression unter der Kontrolle eines CMV-Promotors (pHAAH) stabil transfiziert. Neomycin-resistente Klone, die wenigstens zweifach höhere Grade der AAH-Immunreaktivität relativ zu Neomycin-resistenten pcDNA3-(Mock)-Klonen aufwiesen, wurden untersucht. Da das aggressive Verhalten maligner Neoplasmen mit einer erhöhten DNA-Synthese, Zellzyklus-Progression, Resistenz gegen Apoptose und invasivem Wachstum verbunden ist, wurden die Veränderungen im Phänotyp, die mit einer konstitutiven Überexpression von AAH assoziiert waren, in Bezug auf PCNA, p21/Wafl, p53, Bcl-2 und p16 charakterisiert. PCNA wurde als ein Index der DNA-Synthese und Zellproliferation verwendet. P21/Wafl ist ein Zellzyklus-Inhibitor. Die Expression des p53-Tumorsuppressor-Gens nimmt vor der Apoptose zu, wohingegen Bcl-2 die Apoptose hemmt und das Überleben der neuronalen Zellen fördert. p16 ist ein Onkosuppressor-Gen, das oftmals beim Infiltrieren maligner Neoplasmen entweder herabreguliert wird oder mutiert.
Fünf pHAAH- und 5 pcDNA3-Klone wurden untersucht. Erhöhte Mengen der AAH-Expression in den pHAAH-transfizierten Klonen wurden mittels Western- (6) und Northern Blot-Analyse bestätigt. Die Western Blot-Analyse unter Verwendung von Zelllysaten von Kulturen, die zu 70 bis 80 Prozent konfluent waren, zeigten, dass konstitutiv erhöhte Mengen der AAH-Expression (etwa 85 kDa; P < 0,05) in pHAAH-transfizierten Zellen mit signifikant erhöhten Mengen an PCNA (etwa 35 kDa; P < 0,01) und Bcl-2 (etwa 25 kDa; P < 0,05) und reduzierten Mengen an p21/Wafl (etwa 21 kDa; P < 0,001) und p16 (etwa 16 kDa; P < 0,001) (6) verbunden waren. Die stabilen pHAAH-Transfektanten zeigten jedoch ebenfalls höhere Mengen an Wildtyp-p53 (etwa 53–55 kDa). Obschon die AAH-Expression (85 kDa-Protein) in den stabilen Transfektanten um lediglich 75 bis 100 Prozent erhöht war, waren die Mengen an p16 und p21/Wafl scharf vermindert und nahm PCNA um nahezu das Zweifache (6) zu.
Eine erhöhte AAH-Expression ist für das Wachstum und die Invasivität maligner ZNS-Neoplasmen indikativ
Die hierin beschriebenen Daten zeigen, dass die AAH-Überexpression ein diagnostisches Werkzeug darstellt, mittels dessen primär maligne ZNS-Neoplasmen sowohl eines neuronalen als auch Gliazell-Ursprungs identifiziert werden können. Untersuchungen mit immunhistochemischer Färbung zeigten, dass die AAH-Überexpression hauptsächlich an den Grenzflächen zwischen dem festen Tumor und dem normalen Gewebe, und in infiltrierenden neoplastischen Zellen, die in den subpial gelegenen Zonen, Leptomeninges, perivaskulären Räumen und dem Parenchym verteilt waren, detektierbar war. In vitro-Experimente zeigten, dass die AAH-Genexpression mit Neuriten-(Filopodium)-Verlängerung und Invasivität moduliert war und mit Neuritenretraktion herabreguliert wurde. Außerdem zeigten PNET2-Zellen, die mit der AAH cDNA stabil transfiziert waren, eine erhöhte PCNA- und bcl-2-, und reduzierte Wafl/p-21- und p16-Expression. Daher trägt eine AAH-Überexpression zu dem transformierten Phänotyp der ZNS-Zellen bei, indem die Expression anderer Gene moduliert wird, die die zelluläre Proliferation und Zellzyklus-Progression fördern, die Apoptose hemmen und die Tumorzell-Invasivität verstärken.
Die Daten wiesen leicht detektierbare AAH mRNA-Transkripte (4,3 kB und 2,6 kB) und Proteine (85 kDa und 50–56 kDa) in PNET2- und SH-SySy-Zellen nach, doch nicht in normalem Gehirn. Entsprechend wurden hohe Grade einer AAH-Immunreaktivität in 35 der 37 untersuchten primär malignen ZNS-abstammenden Neoplasmen beobachtet, wohingegen die 4 normalen Kontrollgehirne keine detektierbare AAH-Immunreaktivität zeigten. Das Vorhandensein einer hochgradigen AAH-Immunreaktivität an den Infiltrationsrändern und generell nicht in den zentralen Abschnitten der Tumoren zeigt, dass die AAH-Überexpression an dem invasiven Wachstum von ZNS-Neoplasmen beteiligt ist. Die Verabreichung von Verbindungen, die die AAH-Expression oder enzymatische Aktivität vermindern, hemmt die Proliferation von ZNS-Tumoren, die AAH überexpremieren, als auch von Metastasen der ZNS-Tumoren an anderen Gewebetypen.
Das AAH-Enzym hydroxyliert die EGF-Domänen einer Reihe von Proteinen. Tenascin, ein extrazelluläres Matrixmolekül, das in malignen Gliomen reichlich exprimiert wird, enthält EGF-ähnliche Domänen. Da Tenascin die Tumorzell-Invasion fördert, stellt seine reichliche Expression in Glioblastomen einen autokrinen Mechanismus für ein erhöhtes Tumorzellwachstum in Anbetracht der häufigen Überexpression von EGF- oder EGF-ähnlichen Rezeptoren in malignen Gliazell-Neoplasmen dar. Die Analyse der funktionellen Domänen der Tenascine weist darauf hin, dass die mitogenen Wirkungen dieser Familie von Molekülen weitgehend durch die Fibronectin-Domänen vermittelt werden und dass die EGF-ähnlichen Domänen das Wachstum, die Zellfortsatz-Verlängerung und die Matrixinvasion hemmen. Daher stellt die Hydroxylierung der EGF-ähnlichen Domänen durch AAH einen wichtigen regulatorischen Faktor in der Tumorzell-Invasivität dar.
Doppelmarkierende immunhistochemische Färbungsstudien wiesen eine reziprokale Beziehung zwischen AAH und der Tenascin-Immunreaktivität nach, so dass hohe Grade einer an den Umgrenzungen der Tumoren vorhandenen AAH-Immunreaktivität mit geringen Mengen an Tenascin assoziiert waren, und geringe Mengen an AAH oftmals mit hohen Mengen an Tenascin assoziiert waren. Diese Beobachtungen zeigten, dass die AAH-Hydroxylierung der EGF-ähnlichen Domänen von Tenascin die Immunreaktivität des Tenascin-Proteins verändert und dadurch das invasive Wachstum maligner ZNS-Neoplasmen in angrenzende normale Gewebe und perivaskuläre Räume hinein erleichtert.
Die AAH-Immunreaktivität wurde in PNET2- und SH-Sy5y-neuronalen Zellen, die zu einer Neuritenverlängerung mit PMA oder Retinoesäure, oder Neuritenretraktion durch Exposition an geringe Dosen an H₂O₂ gebracht waren, untersucht. Die AAH-Expression wurde durch die PMA- oder Retinoesäure-induzierte Neuriten-(Filopodium)-Verlängerung scharf erhöht und durch die H₂O₂-induzierte Neuritenretraktion und Zellabrundung gehemmt. Die Neuriten- oder Filopodium-Verlängerung und Anlagerung an extrazelluläre Matrix ist für die Tumorzell-Invasion in das ZNS erforderlich. Die EGF-ähnlichen Domänen von Tenascin hemmen das Neuriten- und Gliazellwachstum in die Matrix hinein während der Entwicklung.
Um die Rolle der AAH-Überexpression in Bezug auf den transformierten Phänotyp direkt zu untersuchen, wurden Gene, die mit DNA-Synthese, Zellzyklus-Progression, Apoptose und Tumorinvasivität moduliert waren, in neuronalen Zellklonen untersucht, die die humane AAH cDNA stabil überexprimierten. Die Befunde einer erhöhten PCNA- und reduzierten Wafl/p21-Immunreaktivität zeigten, dass die AAH-Überexpression die zelluläre Proliferation und Zellzyklus-Progression verstärkt. Außerdem zeigte der Befund einer erhöhten Bcl-2-Expression, dass die AAH-Überexpression zu dem transformierten Phänotyp durch Erhöhung der zellulären Resistenz gegen Apoptose beiträgt. Der scheinbar widersprüchliche Befund der höheren Mengen an p53 in den Zellen, die AAH überexprimierten, lässt sich durch die Beobachtung erklären, dass hohe Mengen an Wildtyp-p53 in unreifen neuronalen Zellen mit Neuritenwachstum (Invasivität) und nicht mit einer Apoptose assoziiert waren. Die Mengen an p16 waren reduziert (im Vergleich zu normalen Zellen) oder nahezu nicht nachweisbar in Zellen, die AAH konstitutiv überexprimierten; eine Deletionsmutation des p16-Gens ist mit invasivem Wachstum und einer schnelleren Progression der malignen Neoplasmen, einschließlich jener eines ZNS-Ursprungs, korreliert worden. Diese Daten zeigen, dass die p16-Expression durch AAH moduliert wird.
Beispiel 3: Erhöhte HAAH-Produktion und IRS-vermittelte Signaltransduktion
Der IRS-1-vermittelte Signaltransduktionsweg ist bei 95 % der humanen HCC-Tumoren verglichen zu dem angrenzenden unbeteiligten Lebergewebe aktiviert. HAAH ist ein stromabwärts gelegenes Effektorgen, das in diesen Signaltransdukti onsweg involviert ist. Die Heraufregulierung des HAAH-Gens ist mit der Überexpression von IRS-1 in HCC-Tumoren eng verbunden, wie durch eine immunhistochemische Färbung und Western Blot-Analyse gezeigt. Eine hohe Menge des HAAH-Proteins wird in HCC und Cholangiokarzinom im Vergleich zu normalen Hepatozyten und Gallengängen exprimiert. Diese beiden Tumoren zeigen auch eine hochgradige Expression von IRS-1 anhand von immunhistochemischer Färbung. Mit einer C-terminal verkürzten dominant-negativen Mutante von IRS-1, die die Insulin- und IGF-1-stimulierte Signaltransduktion blockiert, stabil transfizierte FOCUS HCC-Zellklone waren mit einer auffallenden Verminderung der HAAH-Genexpression in der Leber verbunden. Im Gegensatz dazu zeigen transgene Mäuse, die IRS-1 überexprimieren, eine Zunahme der HAAH-Genexpression anhand der Western Blot-Analyse. Die Insulinstimulierung von FOCUS HCC-Zellen (20 und 40 U) in serumfreiem Medium und nach 16 Stunden der Serum-Aushungerung zeigte eine Heraufregulierung der HAAH-Genexpression. Diese Daten weisen darauf hin, dass die HAAH-Genexpression ein stromabwärts gelegener Effektor des IRS-1-Signaltransduktionsweges ist.
Beispiel 4: Wirkungen der HAAH-Expressionshöhen auf die Charakteristika des malignen Phänotyps

Die Überexpression von IRS-1 in NIH 3T3-Zellen induziert die Transformation. Das murine Volllängen-HAAH-Konstrukt wurde in den eukaryotischen pcDNA3-Expressionsvektor kloniert. Ein zweites murines Konstrukt kodierte HAAH mit beseitigter katalytischer Aktivität aufgrund einer ortsgerichteten Mutation. Die humane Volllängen-HAAH-cDNA wurde in den pcDNA3-Expressionsvektor kloniert, und außerdem ein Plasmid, das v-src kodiert, welches als eine positive Kontrolle für die Transformationsaktivität verwendet wurde. Standardmäßige Methoden wurden für die Transfektion von NIH 3T3-Zellen, als Kontrolle für die Transfektionsleistung, Assays der enzymatischen Aktivität von HAAH, die Transformation durch Analyse der Focibildung, Anker-unabhängige Zellwachstums-Assays und Analyse der Tumorigenität in Nacktmäusen angewendet. Die Daten zeigten, dass die HAAH-Überexpression mit der Generierung eines malignen Phänotyps assoziiert ist. Tabelle 4: Überexpression von enzymatisch aktiver HAAH weist auf Malignität hin

cDNA	# der Foci ± SD^b	NIH 3Z3-Klon	# der Kolonien^e
pcDNA3 (Mock)	6,0 ± 3,3	pcDNA (Mock)	0,4 ± 0,5
murine HAAH	14,0 ± 2,9	Klon 18^d	6,2 ± 2,9
mutierte murine HAAH^a	1,6 ± 1,0	Klon 16^d	4,7 ± 6,5
humane HAAH	32,0 ± 5,4
v-scr	98,0 ± 7,1

a. enzymatisch inaktive HAAH
b. P < 0,01 im Vergleich zu Mock- und mutierter muriner HAAH
c. P < 0,001 im Vergleich zu Mock
d. Klon 18 ist eine stabil klonierte NIH 3T3-Zelllinie, die humane HAAH um das etwa Zweifache überexprimiert.
e. Klon 16 ist eine stabil klonierte NIH 3T3-Zelllinie, die humane HAAH um etwa 50 % überexprimiert.

Diese Daten zeigen, dass die Überexpression von HAAH mit der Bildung von transformierten Foci assoziiert ist. Die enyzmatische Aktivität ist für das Erfolgen der zellulären Transformation erforderlich. Klonierte NIH 3T3-Zelllinien mit einer erhöhten humanen HAAH-Genexpression wuchsen als feste Tumoren in Nacktmäusen. HAAH ist ein stromabwärts gelegenes Effektorgen des IRS-1-Signaltransduktionsweges.

Claims

Ex vivo-Methode zum Diagnostizieren eines malignen Neoplasmas in einem Säuger, welche Methode das Kontaktieren einer Körperflüssigkeit von dem Säuger mit einem Antikörper oder Fragment davon, welcher an ein Aspartyl-(Asparaginyl)-beta-Hydroxylase-(AAH)-Polypeptid unter Bedingungen bindet, die ausreichend sind, um einen Antigen-Antikörper-Komplex zu bilden, und Nachweisen der Antigen-Antikörper-Komplexes umfasst.
Ex vivo-Methode zum Prognostizieren eines malignen Neoplasmas eines Säugers, wobei die Methode die Methode nach Anspruch 1 umfasst und wobei die Methode zeitliche Daten generiert, die zum Prognostizieren der malignen Erkrankung verwendet werden.
Methode nach Anspruch 1 oder 2, wobei der Patient ein Mensch ist.
Methode nach Anspruch 1, 2 oder 3, wobei das Neoplasma von endodermalen Gewebe stammt.
Methode nach Anspruch 1, 2 oder 3, wobei das Neoplasma ausgewählt ist aus Dickdarmkrebs, Brustkrebs, Bauchspeicheldrüsenkrebs, Leberkrebs und Krebs der Gallengänge.
Methode nach Anspruch 1, 2 oder 3, wobei das Neoplasma ein Krebs des Zentralen Nervensystems (ZNS) ist.
Methode nach Anspruch 1, 2 oder 3, wobei die Körperflüssigkeit ausgewählt ist aus einer ZNS-abgeleiteten Körperflüssigkeit, Blut, Serum, Urin, Speichel, Auswurf, Lungeneffusion und Aszitesflüssigkeit.
Methode nach jedem der vorangehenden Ansprüche, wobei der Antigen-Antikörper-Komplex mittels einer Markierung nachgewiesen wird, ausgewählt aus einer enzymatischen Markierung, einer fluoreszierenden Markierung, einer chemilumineszierenden Markierung, einer radioaktiven Markierung und einer Farbstoff-Markierung.
Methode nach jedem der vorangehenden Ansprüche, wobei das Neoplasma ausgewählt ist aus einem hepatozellulärem Karzinom, einem Cholangiokarzinom, einem Glioblastom und einem Neuroblastom.
Methode nach jedem der vorangehenden Ansprüche, wobei der Antikörper an ein Epitop innerhalb einer katalytischen Stelle von AAH bindet.
Methode nach Anspruch 9, wobei der Antikörper ein einzelkettiges Fv-Molekül ist.
In vitro-Verwendung eines Kits, welches einen nachweisbar markierten Antikörper umfasst, der an eine AAH bindet, wobei die Verwendung zur Unterstützung des Diagnostizierens eines in der Körperflüssigkeit eines Säugers detektierbaren Neoplasmas dient.