DE60026974T2

DE60026974T2 - Neue polymerformulierungen, die perfluorierte verbindungen enthalten, zum konstruieren von zellen und geweben zur transplantation, welche den stoffwechsel und das überleben von zellen verbessern, sowie verfahren zu deren herstellung

Info

Publication number: DE60026974T2
Application number: DE60026974T
Authority: DE
Inventors: Christopher Hollywood FRAKER; Luca Miami Beach INVERARDI; Marcos Miami MARES-GUIA; Camillo Univers.of Miami.Diabetes R Miami RICORDI
Original assignee: Biomm Inc Miami; BIOMM Inc
Current assignee: Biomm Inc Miami; BIOMM Inc
Priority date: 1999-01-04
Filing date: 2000-01-04
Publication date: 2007-04-19
Anticipated expiration: 2020-01-05
Also published as: ATE321562T1; DE60026974D1; EP1146884B1; EP1146884A1; WO2000040252A1; BR0007296A; EP1146884A4; US6630154B1

Description

Verweis auf verwandte Anmeldungen
Diese Anmeldung beansprucht die Priorität der „Provisional Application" mit der Seriennummer 60/114,708, deren Anmeldetag der 4. Januar 1999 ist, mit dem Titel „Novel Polymer Formulations For the Engineering of Cells and Tissues for Transplantation That Improves Cell Metabolism and Survival, And Methods for Making Same". Verwiesen wird außerdem auf die US-Patentanmeldung mit der Seriennummer 08/417,652, deren Anmeldetag der 5. April 1995 ist, aus der das US-Patent Nr. 5,808,050, erteilt am 15. September 1998, hervorgegangen ist, und auf die ebenfalls anhängige US-Anmeldung mit der Seriennummer 08/877,682, deren Anmeldetag der 17. Juni 1997 ist, und auf WO 98/49202.
Bereich der Erfindung
Das größte Hindernis auf dem Gebiet der Zell- und Gewebeverkapselung/Immunisolierung ist historisch das Fehlen eines ausreichenden Sauerstoff- und Nährstofftransports über die Polymermembranen gewesen, die verwendet wurden, um Zellen und Gewebe zu verkapseln. Das Ergebnis dieses unzureichenden Gas- und Nährstoffaustauschs ist der Zelltod und eine verminderte Stoffwechselaktivität. Angesichts der Tatsache, dass die meisten dieser Verkapselungsvorrichtungen bei Hormonersatztherapien verwendet werden, wie etwa verkapselte Inselzellen, um Diabetes mellitus zu behandeln, steigert eine verminderte Stoffwechselaktivität den Bedarf an Gewebe, das benötigt wird, um das Hormondefizit therapeutisch zu behandeln, um ein Vielfaches, und bis zum heutigen Tage sind keine Vorrichtungen mit klinischer Anwendbarkeit entwickelt worden, um die vielen Millionen von Diabetikern weltweit zu behandeln. Die vorliegende Erfindung betrifft eine neue Vorrichtung, in der die Gewebedichte vergrößert werden könnte und der Gas- und Nährstoffaustausch verbessert werden könnte, wodurch das Gebiet der Immunisolierung einen deutlichen Vorteil erfährt.
Nach nahezu 30 Jahren umfangreicher Forschung auf den Gebiet des Verkapselns von Inselzellen stimmen die meisten derjenigen, die wesentliche Beiträge auf diesem spezialisierten Gebiet geliefert haben, vier wichtigen Lehrsätzen zu (siehe die unter den Nummern 1–19 aufgeführten Referenzen). Erstens, dass bei jeder geometrischen Art einer Immunisolierungsvorrichtung keine Dimension einen Wert von 1 mm übersteigen darf. Zweitens, dass keine Vorrichtung mit Zellen in einer Gewebedichte beladen werden kann, die mehr als 5 bis 10% (Vol./Vol.) beträgt. Drittens, dass ungeachtet der Matrixstruktur eine Diffusion von Metaboliten in derartige Vorrichtungen und von Insulin aus derartigen Vorrichtungen heraus häufig verzögert ist und durch einfache Diffusionsgradienten über die Entfernung zwischen den Zellen und der Peripherie der Kapsel beherrscht werden kann. Die Endergebnisse derartiger Einschränkungen sind zahlreich. Erstens, um einen klinischen Erfolg mit einer solchen Vorrichtungen zu erzielen, würde das Verhältnis von Polymer zu Gewebe, das in einen Diabetiker von durchschnittlichem Gewicht zu transplantieren wäre, die Intraperitonealhöhle eines Transplantatempfängers schnell füllen. Zweitens, wenn einer der oben umrissenen Lehrsätze modifiziert wird, wirkt sich das Ergebnis häufig katastrophal auf die verkapselten Inseln aus. Die Häufigkeit eines Transplantatversagens steigt dramatisch mit der subklinischen Leistungsfähigkeit in funktionellen Test, und der Beleg einer Zellnekrose in der gesamten Vorrichtung ist bei einer histologischen Untersuchung nach Explantation vorherrschend. Die Hauptursache für diese Ergebnisse wird häufig durch die hypoxische Umgebung von isolierten und ferner, immunisolierten Inselzellen bestätigt. Angesichts der gesteigerten metabolischen Anforderungen von Inselzellen im Vergleich zu anderen somatischen Zellen ist die Notwendigkeit zum Verbessern ihrer Sauerstoffversorgung nach Isolierung, Immunisolierung und Transplantation von höchster Wichtigkeit für die Möglichkeit, dass derartige Vorrichtungen eine klinische Relevanz aufweisen.
Colton und eine andere Gruppe unter Per-Ola Carlsson haben Mikroelektroden implantiert, um Sauerstoffpartialdrucke in Inseln zu messen, und zwar in ihrer natürlichen Umgebung, nach Isolierung und nach Transplantation in Polymervorrichtungen sowie frei unter die Nierenkapsel. Beide Gruppen kamen zu ähnlichen Ergebnissen (siehe die unter den Nummern 19 und 29 zitierten Referenzen). Die Sauerstoffpartialdrucke in den nativen Pankreasinseln sind die höchsten der Organe im Körper, wobei 37 bis 47 mmHg gemessen werden (man vergleiche diesen Wert mit dem Wert von 13 bis 21 mmHg bei Zellen in der Nierenrinde). Nach Isolierung fallen diese Werte auf 14 bis 19 mmHg ab. Nach Transplantation in normoglykämische Tiere unter die Nierenkapsel fallen die Werte leicht auf 9 bis 15 mmHg ab. Falls eine Transplantation in schwer hyperglykämische Tiere (über 350 mg/dl) erfolgt, fallen diese Werte auf 6 bis 9 mmHg ab. Wenn die Zellen immunisotiert werden und sich deshalb nicht einfach dafür hergeben, in ein vaskularisiertes Gebiet, wie etwa die Nierenkapsel transplantiert zu werden, fallen die Sauerstoffwerte sogar noch weiter ab. Tatsächlich können bei hyperglykämischen Tieren die Sauerstoffpartialdrucke von Inseln in Polymerkapseln auf so niedrige Werte wie 1 bis 2 mmHg abfallen. Diese nahezu anoxischen Bedingungen können zu einem raschen Zelltod führen, insbesondere je näher die Zellen am Kern der Polymervorrichtung liegen.
Die Erfindung betrifft weiterhin den Einschluss von perfluorierten Substanzen in die Biodritin-Polymerformulierungen, um eine verbessern Verfügbarkeit von Sauerstoff für die verkapselten Zellen oder Gewebe zu erzielen. Organische Perfluorverbindungen sind hervorragende Lösungsmittel für Sauerstoff, wobei sie eine mehrfach höhere Sauerstofflöslichkeit aufweisen als Wasser. Diese Verbindungen werden umfangreich als Blutersatz verwendet, und sie sind kürzlich zur Konservierung von Gewebe nach der Entfernung aus Tieren verwendet worden, ebenso wie um Inselisolierungen aus dem Pankreas zu verbessern.
Folglich betrifft die Erfindung insbesondere das Zugeben von perfluorierten Substanzen zu dem Biodritin-Heteropolysaccharid, Gele daraus und/oder eine Zusammensetzung, z.B. Lösungen mit einer einstellbaren Viskosität, die durch das Manipulieren der Konzentration von Biodritin-Heteropolysacchariden und/oder Ionenkonzentrationen, z.B. Calcium hergestellt wird; und/oder ein Gel oder Sol, welches das Biodritin-Heteropolysaccharid umfasst; die Synthese, Reinigung und Verwendung von Biodritin-Heteropolysaccharid als einem neuen Glykopolymer und/oder Heteropolysaccharid und/oder Gelen, Lösungen und/oder Solen, welche Biodritin-Heteropolysaccharid umfassen. Die Gele werden durch Zugeben eines anorganischen Ions, wie etwa Calciumionen, zu dem Biodritin-Heteropolysaccharid erhalten. Die Sole können durch Behandlung eines Gels mit einem geeigneten Mittel, wie etwa Natriumsalz, z.B. Zitronensäuresalzen oder Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) als Natriumsalz, erhalten werden. Die Gele können verschiedene Viskositäten aufweisen, indem die Menge an Biodritin-Heteropolysaccharid und/oder anorganischem Ion, z.B. Calciumion, variiert wird; und mit einer Menge an Calciumionen können unendliche Gele erhalten werden.
Die Erfindung betrifft weiterhin das Zugeben der perfluorierten Substanzen zu einer Zusammensetzung, die hier als „Biodritin-Polymernetzwerk" bezeichnet wird, und Verfahren und Formulierungen zum Herstellen eines Biodritin-Polymernetzwerks. Ein Biodritin-Polymernetzwerk kann mindestens ein Glykosaminoglykan, z.B. Chondroitinsulfat-4 und/oder -6 enthalten, und mindestens ein Alginsäuresalz, z.B. Natriumalginat, wobei mindestens das Glykosaminoglykan oder das Alginsäuresalz oder beide quervernetzt sind (siehe die US-Anmeldung mit der Seriennummer 08/877,682, deren Anmeldedatum der 17. Juni 1997 ist, und WO 98/49202 in Bezug auf „Biodritin" und „Biodritin-Polymernetzwerk"). Und die Verfahren und Formulierungen zum Herstellen eines Biodritin-Polymernetzwerks umfassen das Zumischen des Glykosaminoglykans und Alginsäuresalzes und das Zumischen von mindestens einem quervernetzten Mittel, z.B. einem anorganischen Ion. Beispielsweise wird ein Biodritin-Polymernetzwerk, von dem angenommen wird, ohne dass gewünscht ist, an irgendeine bestimmte Theorie gebunden zu sein, dass es sich um ein semi-interpenetrierendes Polymernetzwerk (semi-interpenetrating polymer network, s-IPN) handelt, durch Zugabe von anorganischen Ionen zu einer Lösung aus einem Glykosaminoglykan und einem Alginsäuresalz gebildet, z.B. indem Calciumionen zu einer Lösung aus Chondroitinsulfat-4 und/oder -6 und Natriumalginat gegeben werden (wobei das Natriumalginat quervernetzt ist und Taschen von Chondroitinsulfat-4 und/oder -6 und/oder nicht-quervernetztem Natriumalginat aufweist).
Selbstverständlich kann ein Biodritin-Polymernetzwerk, das mindestens ein Biodritin-Heteropolysaccharid enthält, durch kovalentes Binden des Glykosaminoglykans und des Alginsäuresalzes, die in einem Biodritin-Polymernetzwerk vorhanden sind, erhalten werden, beispielsweise, indem ein Biodritin-Polymernetzwerk einer Kopplungsreaktion unterworfen wird, an der ein Linkermolekül beteiligt ist; beispielsweise, indem ein Netzwerk durch Zugabe von anorganischen Ionen zu einer Lösung aus einem Glykosaminoglykan und einem Alginsäuresalz gebildet wird, z.B. indem Calciumionen zu einer Lösung aus Chondroitinsulfat-4 und/oder -6 und Natriumalginat gegeben werden, und indem das Netzwerk einer Kopplungsreaktion unterworfen wird, z.B. indem ein Netzwerk einer Kopplungsreaktion unterworfen wird, an der Divinylsulfon beteiligt ist.
Beim Herstellen eines Biodritin-Heteropolysaccharids oder eines Biodritin-Polymernetzwerks, welches ein Biodritin-Polymernetzwerk umfasst, wird in einer Lösung GAG, z.B. Chondroitinsulfat-4 und/oder -6, mit Alginat, z.B. Natriumalginat, durch kovalente Bindung mittels einer Reaktion mit einem Linkermolekül, wie etwa Divinylsulfon verknüpft; die Reaktion wird vorzugsweise in alkalischem Medium durchgeführt. Beim Ausführen der Erfindung kann man ein Verfahren einsetzen, um die Calcium-bindenden Stellen von Alginat, auch als „egg-box"-Stellen bekannt, zu schützen, so dass keine Reaktion an diesen Stellen während der Verknüpfungsreaktion der mit dem Linkermolekül, z.B. Divinylsulfon, und GAG, z.B. Chondroitinsulfat, stattfindet. Man kann auch ein Verfahren einsetzen, um die verbleibenden aktiven Vinylgruppen in dem Biodritin nach der Verknüpfung durch eine Reaktion mit einem Alkanolamin, wie etwa Ethanolamin, vorzugsweise bei alkalischem pH-Wert zu bewahren. Und man kann ein Verfahren einsetzen, um Biodritin nach der Synthesereaktion, die ein Entfernen von Calcium mit einem Molekül, das an Calcium bindet oder damit ein Konjugat bildet, z.B. EDTA, umfasst, zu reinigen, vorzugsweise gefolgt durch eine oder mehrere Präzipitation(en) mit einem Alkohol, wie etwa Ethanol.
Die Erfindung bezieht sich auch auf ein zusätzliches Verfahren, um ein Biodritin-Polymernetzwerk, das perfluorierte Substanzen umfasst, herzustellen, und auf ein dehydrothermales Quervernetzen einer Mischung des Polymers, welches ein Biodritin-Heteropolysaccharid bildet. Die dehydrothermale Reaktion kann aus einem trockenen Rückstand (Kuchen) bestehen, der GAG enthält, z.B. Chondroitisulfat, und Alginat, z.B. Natriumalginat. Der Kuchen kann durch Gefriertrocknen einer Lösung hergestellt werden, die Chondroitinsulfat und Natriumalginat in geeigneten Konzentrationen enthält. Die Calciumbindungsstellen von Alginat können vor der Dehydrothermalbehandlung durch Zugabe von Calciumionen, die an die „egg-box"-Stellen des Alginats binden sollen, geschützt werden. Das Calcium kann aus den „egg-box"-Komplexen durch Behandlung des Produkts der dehydrothermalen Reaktion mit einem Material entfernt werden, welches Calcium bindet oder mit diesem Komplexe oder Konjugate eingeht, z.B. Natrium-EDTA. Eine Reinigung kann wie oben diskutiert durchgeführt werden.
Zur Erleichterung der Bezugnahme können Biodritin-Polymernetzwerke und Biodritin-Heteropolysaccharide als „Biodritin" oder „Biodritin-Produkte" bezeichnet werden (siehe auch die US-Anmeldung mit der Serinenummer 08/877,682, deren Anmeldedatum der 17. Juni 1997 ist, und WO 89/49202).
Eine hauptsächliche Verwendung von Biodritin-Produkten mit den perfluorierten Substanzen und/oder Produkten, die davon abgeleitet sind, liegt in Anwendungen, bei denen es auf die Biokompatibilität mit Wirtsgeweben und/oder eine Immunisolierung ankommt, beispielsweise beim Verkapseln von Zellen, wie etwa eine Immunisolierung durch Mikroverkapslung von Langerhans'schen Inseln zur Steuerung eines Diabetes oder von anderen Zelltypen oder Ge weben. Ein Biodritin-Gel, das aus Biodritin-Heteropolysaccharid gebildet ist oder ein Biodritin-Polymernetzwerk umfasst (z.B. ein Gel, das mindestens ein Glykosaminoglykan, z.B. Chondroitin-4 und/oder -6, und mindestens ein Alginsäuresalz umfasst, wobei mindestens das Glykosaminoglykan und/oder das Alginsäuresalz quervernetzt sind und das Glykosaminoglykan und das Alginsäuresalz wahlweise (und vorzugsweise) kovalent gebunden sind, vorzugsweise durch eine Reaktion, an der ein Linkermolekül, wie etwa Divinylsulfon beteiligt ist, und das Quervernetzen nach dem kovalenten Binden durchgeführt werden kann oder davor; im Allgemeinen ein Biodritin-Produkt oder ein Produkt aus einer Reaktion mit Biodritin), kann verwendet werden, um Körnchen (Beads) oder Mikrokapseln zu bilden, welche Zellen oder Gewebe zur Implantation enthalten. Und folglich bezieht sich die Erfindung auf derartige Beads oder Mikrokapseln sowie auf Verfahren zum Herstellen und Verwenden derartiger Beads oder Mikrokapseln.
Biodritin-Produkte und/oder Produkte daraus können auch „aufgestrichen", gesprüht oder auf das Obere von Wunden, z.B. chirurgische Wunden oder Nähte, aufgetragen werden, und sie können verwendet werden, um eine chirurgische Überwachungs- oder eine andere Ausrüstung zu beschichten, um eine lokale Reaktion, Verletzung oder Irritation zu vermeiden. Diejenigen, die auf dem Fachgebiet sachkundig sind, können dies ohne übermäßiges Experimentieren anwenden, wenn sie die hier dargestellte Offenbarung und die Fachkenntnis sowie typische Faktoren, wie etwa das Alter, das Geschlecht, das Gewicht und den Zustand des Patienten etc. oder die Art der Ausrüstung, die beschichtet werden soll, berücksichtigen. Biodritin-Produkte und/oder Produkte daraus dienen als ein Matrixmaterial zum Stützen von Zellen zum Kultivieren oder für andere Anwendungen, bei denen Zellen einen suspendierten oder nicht aggregierten Zustand beibehalten müssen. Demgemäß betrifft die Erfindung „Anstriche", Sprays und Matrices, welche Biodritin-Produkte und/oder Produkte daraus enthalten, sowie Verfahren zu deren Herstellung und Verwendung.
Das neue Heteropolysaccharid und Produkte daraus, ebenso wie das semi-interpenetrierende Polymernetzwerk, d.h. das Biodritin-Heteropolysaccharid, und Produkte daraus und das Biodritin-Polymernetzwerk nutzen die Biokompatibilität von Glykosaminoglykanen (GAGs), vorzugsweise einer spezifischen Gruppe von Glykosaminoglykanen, nämlich denjenigen Glykosaminoglykan, die keine definierten Zellbindungseigenschaften aufweisen, vorzugsweise Chondroitinsulfate-4 und/oder -6, hier als CIS bezeichnet; und die gewünschten Eigenschaften von Algenpolysacchariden und/oder Alginsäure, vorzugsweise in Form eines Salzes von Alginsäure, z.B. M+-Alginat, wobei M ein Kation, wie etwa eine Metallkation ist, welches als ein stöchiometrisches Gegenion dient, um die negativen Ladungen des Alginatanions, z.B. einem Metall aus der Gruppe I, wie etwa Natrium, Lithium oder anderen Kationen, z.B. organischen und Komplexkationen, z.B. Ammonium, auszugleichen. Vorzugsweise ist das Gegenion Natrium und das Salz der Alginsäure ist Natriumalginat, das in der Lage ist, unendliche Gelnetzwerke in Gegenwart von Calciumionen zu bilden.
Die Erfindung bezieht sich insbesondere auf einen Einschluss von Perfluorverbindungen in die Polymerformulierung, wie Emulsionen, die durch Ultraschallbehandlung (oder andere Verfahren) hergestellt werden, wie beansprucht und in den Beispielen offenbart, um ein Überleben der Zellen während des Verkapselns von Zellen oder Gewebe oder während der Immunisolierung zu therapeutischen Zwecken sicherzustellen.
Perfluorierte Kohlenwasserstoffderivate sind extrem dicht, chemisch inert, und sie sind wasserunlösliche Verbindungen, die in den frühen 40er Jahren des vergangenen Jahrhunderts als ein Teil des Manhattan-Projekts entwickelt wurden (siehe die Referenzen 22 und 23). Ausführlich untersucht über Jahre im Hinblick auf ihre chemischen Eigenschaften (siehe die Referenzen 24 bis 37), wurden sie in den 80er Jahren des vergangenen Jahrhunderts zur Verwendung als künstliche Blutbestandteile ausgewählt, da sie chemisch inert, sind und aufgrund dessen, dass sie nicht verstoffwechselt werden. Angesichts ihrer hohen Dichte und ihrer vollständigen Unlöslichkeit in Lösungen auf der Grundlage von Wasser war der einzige Weg zur Verwendung dieser Verbindungen als künstliches Blut, stabile Emulsionen unter Verwendung von hydrophoben Phospholipiden und unter Standardisierung der Perfluorkohlenstoff-Tröpfchengröße zwischen 0,2 bis 0,3 μm zu erzeugen. Die Forschung an diesen Emulsionen explodierte mit unvergleichlichem Fortschritt, und 1989 war Flusol DA^® die erste dieser Emulsionen, die von der FDA zu klinischen Anwendungen zur Verwendung bei der perkutanen transluminaren Angioplastie (Percutaneous Transluminary Angioplasty) zugelassen wurde. Bald folgten andere Unternehmensprodukte, wie etwa Oxygent^® von Alliance Pharmaceuticals. Die Emulsionen der ersten Generation, obwohl sie vorteilhaft waren, wiesen auch unerwünschte blutverdünnende Wirkungen auf. Trotz der enormen akademischen und unternehmerischen Forschung, die an den Perfluorkohlenstoffen durchgeführt wurde, wurde festgestellt, dass höhere Gew./Vol.-Konzentrationen in PFC-Emulsionen die Häufigkeit des Auftretens unerwünschter Wirkungen reduzierten und die Eigenschaften der Abgabe und Retention von Sauerstoff verbesserten. Die Emulsionen der zweiten Generation hatten eine bei wei tem größere Wirkung. In dem Prozess wurden die kritischen Eigenschaften von perfluorierten Kohlenwasserstoffen und Derivaten sorgfältig dokumentiert, wobei ein erstaunliches Fehlen einer Ungleichheit zwischen einer Forschungsgruppe und der nächsten zu beobachten war.
Die sauerstofftransportierenden Eigenschaften von perfluorierten Verbindungen entstammen den Fluoratomen und sind direkt proportional zu ihrer Anzahl innerhalb der Struktur. Auf ähnliche Weise ist der Sauerstoffgehalt einer vorgegebenen Emulsion direkt proportional zu dem pO₂ der Umgebung der Emulsion und dem prozentualen Gewicht der PFC im Gesamtvolumen der Emulsion. Darüber hinaus weisen Perfluorkohlenstoffe eine Kinetik der Sauerstoffaufnahme und -abgabe auf, die zweimal so schnell ist, wie die des normalen Sauerstoffabgabesystems des Körpers, dem Hämoglobin. Diese Eigenschaften werden durch die Abgabe von hohen Konzentrationen an Sauerstoff an Patienten, welche PFC-Emulsionen erhalten, verstärkt.
In einer Studie an Patienten, welche die PFC-Emulsionen IV erhielten, wurden vorteilhafte Steigerungen des pO₂ bei jeder möglichen Kombination von Gas und Emulsion beobachtet. Bei einer Emulsion mit geringem prozentualem Gewicht (20%, Gew./Vol.) und bei Raumtemperatur zeigten die Patienten eine mittlere Zunahme des pO₂ von 82 mmHg auf 101 mmHg. Durch dasselbe Zeichen wurden deutliche Zunahmen des Gewebe-pO₂ bei Tieren nach der Verabreichung von PFC-Emulsionen beobachtet. Der interessanteste Aspekt dieser Zunahmen ist der, dass sie über etliche Tage persistierten, und auch wenn sich die Werte für die Blut-PFC-Konzentrationen Null angenähert haben könnten.
Neben den Studien an PFC-Emulsionen zur intravenösen Verwendung als künstliches Blut haben zahlreiche Gruppen die Verbindungen in Studien verwendet, welche eine Reperfusionsverletzung bei geernteten Organen, die auf eine Hypoxie zurückzuführen ist, und den Erhalt einer physiologischen Sauerstoffversorgung von Gewebe während der Transplantationschirurgie betreffen (38–49). Kurzgefasst sind die Befunde dieser Gruppen derart, dass Fluorkohlenstoffemulsionen oder -verbindungen gewaltige Konservierungswirkungen auf geerntetes Gewebe ausüben. Drei derartige Studien, die besonders interessant sind, sind diejenigen von Kuroda et al. bezüglich des Zweischichtenverfahrens der Pankreaskonservierung (50), von Tanioka et al. bezüglich der Verwendung des Zweischichtenverfahrens, um die Inselisolierung nach langen Zeiten einer Ischämie zu verbessern (51), und die der Gruppe von Urushihara et al. bezüglich der Verwendung von PFCs und PFC-Emulsionen bei der Kältekonser vierung von Rattenpankreata (52). In der ersten Studie wurden Hundepankreata geerntet und verwendet. Diese Studie zeigte eindeutig, dass eine einfache Doppelschicht aus Perfluorkohlenstoff die so dicht und unlöslich ist, dass sie sich am Boden des Behälters vereinigt, mit einen anderen Konservierungsmittel die Funktion von kältekonservierten Pankreata wesentlich verbessert bis zu dem Punkt, an dem ein Transplantationserfolg erzielt wird, der mit dem vergleichbar ist, der mit Pankreatra erzielt wird, die ummittelbar nach dem Ernten transplantiert wurden.
Urushihara et al. fanden Ähnliches im Hinblick auf die Konservierung bei der Verwendung von Rattenpankreata. Bei dieser Studie allerdings war die Ausgestaltung derart, um die bereits überprüften Konservierungseigenschaften von PFCs mit denen von PFC-Emulsionen zu vergleichen. Bei Urushihara enthielt die experimentelle Ausgestaltung vier Gruppen. Die erste Gruppe bestand aus Pankreata, die mit einer FC-Emulsion perfundiert und dann in die Emulsion getaucht wurden, während sie mit einer Mischung aus 95% O₂/5% CO₂ begast wurden. Die zweite Gruppe unterschied sich von der ersten Gruppe nur insoweit, als 100% N₂ zur Begasung verwendet wurde. Die dritte Gruppe war aus Pankreata zusammengesetzt, die mit flüssigem PFC perfundiert wurden, weiter in PFC getaucht und dann begast wurden, wieder mit 95% O₂/5% CO₂. Die vierte und letzte Gruppe ist dieselbe wie die dritte Gruppe, abgesehen davon, dass 100% N₂ als Begasungsgas verwendet wurde. Die Funktion der Organe nach der Kultivierungszeit wurde dann durch (syngene) Transplantation des Transplantats unter den folgenden Kriterien für ein erfolgreiches Transplantat beurteilt: Falls das Transplantat die STZ-induzierte Hyperglykämie auf Werte von weniger als 200 ml/dl innerhalb von 24 Stunden reduzierte, und falls dieser Wert für mehr als zwei Wochen aufrecht erhalten wurde, dann wurde das Tranplantat als funktionsfähig angesehen. Urushihara fanden, dass es eine Konservierung in allen Gruppen über 24 Stunden gab, nach 48 Stunden jedoch alle Gruppen mit Ausnahme von Gruppe 3 einen Transplantationserfolg von 0% aufwiesen. Die Gruppe 3, d.h. flüssiger PFC mit 95% O₂/5% CO₂, war allen anderen Gruppen in Bezug auf die Konservierung in jeder Hinsicht überlegen. Von den Organen in der Gruppe, die 24 Stunden kultiviert wurde, waren 100% der transplantierten Transplantate funktionsfähig. Von denen in der Gruppe, die 48 Stunden kultiviert wurde, waren 80% der transplantierten Transplantate (4/5) funktionsfähig. Im Vergleich zu den Konservierungszeiten von 12 bis 16 Stunden, die durch Standardaufbewahrungslösungen für Organe, wie etwa einer UW-Lösung, gewährleistet wurde, zeigte PFC einen deutlichen Vorteil. Tatsächlich wendet eine Gruppe an der University of Washington ein Zweischichten-PFC-Verfahren zum Perfundieren von Pankreata nach der Ernte an und hat wesentliche Verbesserungen in Bezug auf die Konservierungszeit beobachtet.
Von besonderer Bedeutung für unser Studiengebiet ist, dass die Gruppe von Tanioka et al. das Zweischichtenverfahren auf das Ernten von Pankreasinselzellen anwendete. Deren Studie war in fünf Gruppen aufgeteilt: Die erste Gruppe von Hundepankreata wurde geerntet und drei Stunden unter Verwendung einer Doppelschicht aus UW-Lösung und PFC konserviert. Am Ende dieses Zeitraums wurden die Langerhans'schen Inseln aus den Pankreata unter Verwendung des Ricordi-Verfahrens zur Isolierung von menschlichen Inseln, das für die Anwendung auf Rattenpankreata modifiziert war, isoliert (53). Die zweite Gruppe setzte dasselbe Konservierungsverfahren ein wie die erste, jedoch für einen Zeitraum für 24 Stunden, wobei zu dieser Zeit die Inseln isoliert wurden. Die dritte und vierte Gruppe verwendeten nur eine UW-Lösung als Konservierungsmedium. Bei allen ersten vier Gruppen wurden 95% O₂/5% CO₂ in die Konservierungsbehälter eingeleitet. Die letzte Gruppe war gekennzeichnet durch sofortige Ernte und autologe Transplantation zur Kontrolle.
Nach den Konservierungszeiten und Inselisolierungen bei Tanioka wurden die Inseln gezählt (vorgereinigt an einem Ficoll-Gradienten und nachgereinigt) und durch Kannulierung einer Mesenterialvene in die Leber transplantiert. Wie in den vorhergehenden Studien an ganzem Pankreas wurde der Transplantaterfolg durch die Aufhebung der Hyperglykämie (Glukosewerte von weniger als 200 mg/dl) in den pankreasektomierten autologen Spendern beurteilt und durch die Aufrechterhaltung dieser Aufhebung über einen bedeutenden Zeitraum. In der Kontrollgruppe betrug der prozentuale Anteil der Wiedergewinnung von Inseln (Anzahl nach Reinigung/Anzahl vor Reinigung) 65,4% mit 5000 IEQs/g an wiedergewonnenem Pankreas. Die experimentellen Gruppen wiesen nach 3 Stunden Werte von 63,3% für die Doppelschicht-PFC-Gruppe (5600 IEQs/g Pankreas) und 59,3% für die UW-Gruppe (4700 IEQs/g Pankreas) auf. Die Werte bei einer 24-stündigen Kältekonservierung für die zwei Gruppen betrugen 56,4% bei der Doppelschicht-PFC-Gruppe (4000 IEQs/g Pankreas) und 39,3% bei der UW-Gruppe (1300 IEQs/g Pankreas). Allein von den Zellzahlen her war der Vorteil der Verwendung von PFCs bei der Konservierung vor der Isolierung offensichtlich. Ein weiterer Beweis für die Überlegenheit des Zweischichtenverfahrens bei Organen und sogar bei der Einzelzellkonservierung waren die Transplantaterfolgsraten. Die Kontrollgruppe wies eine Transplantaterfolgsrate von 89% (8/9) Transplantationen auf. Die dreistündige experimentelle Gruppe wies Raten von 83% (5/6, Doppelschicht-PFC-Gruppe) und 33% (2/6, UW-Gruppe) auf. Die experimentelle 24-Stunden-Gruppe wies Raten von 56% (5/9, Doppelschicht-PFC-Gruppe) und 0% (0/9, UW-Gruppe) auf. Dieser überwältigende Beweis legt nahe, dass nicht nur die Perfluorverbindungen als vorteilhaftes Konservierungsmedium bei der Ernte ganzer Organe wirken, sondern auch bei der Konservierung von isolierten Zellen, wie etwa den Langerhans'schen Inseln verwendet werden können.
Die Argumente für die Verwendung von Perfluoremulsionen und Perfluorverbindungen auf dem Gebiet der Zell- und Gewebekonservierung sind stichhaltig. Diese Befunde begründeten den Hintergrund für unsere Erfindung, die jetzt beschrieben wird.
Deshalb bezieht sich die Erfindung, sogar in einem noch breiteren Sinn, auf Folgendes:
Eine Zusammensetzung, die mindestens ein Glykosaminoglykan, mindestens ein Alginat und mindestens eine Perfluorkohlenstoffsubstanz, z.B. eine emulgierte Perfluorkohlenstoffsubstanz, umfasst, um die Sauerstoffverfügbarkeit für verkapselte und/oder immunisolierte Zellen und Gewebe zu steigern, wobei:
das mindestens eine Glykosaminoglykan und/oder das Alginat quervernetzt oder polymerisiert sind, z.B. ist das Alginat quervernetzt oder polymerisiert, beispielsweise durch Zugabe eines anorganischen Salzes, wie etwa einem Calciumsalz; oder
das mindestens eine Glykosaminoglykan und das Alginat kovalent gebunden sind, z.B. mittels einer Kopplungsreaktion, an der eine Linkermolekül, wie etwa DVS beteiligt ist; oder
das mindestens eine Glykosaminoglykan und/oder das Alginat quervernetzt oder polymerisiert sind, z.B. ist das Alginat quervernetzt oder polymerisiert, beispielsweise durch Zugabe eines anorganischen Salzes, wie etwa einem Calciumsalz, und das mindestens eine Glykosaminoglykan und das Alginat kovalent gebunden sind, z.B. mittels einer Kopplungsreaktion, an der ein Linkermolekül, wie etwa DVS beteiligt ist, und das kovalente Binden kann vor der Quervernetzung oder Polymerisierung durchgeführt worden sein oder umgekehrt;
eine emulgierte Perfluorkohlenstoffsubstanz, die zu Biodritin gegeben oder damit verwendet wird, um die Sauerstoffverfügbarkeit für verkapselte und/oder immunisolierte Zellen und Gewebe zu steigern;
Gele, welche die Zusammensetzung umfassen; Mischungen aus derartigen Gelen oder aus mindestens einem solchen Gel und mindestens einer solchen Zusammensetzung;
Verfahren zum Herstellen solcher Zusammensetzungen und Gele;
Verfahren zum Verwenden solcher Zusammensetzungen und Gele, einschließlich als „Anstriche", Sprays, Matrices, Beads, Mikrokapseln;
Produkte, welche die Zusammensetzung oder das Gel umfassen, z.B. „Anstriche", Sprays, Matrices, Beads, Mikrokapseln; und
die Perfluorkohlenstoffsubstanzen, einschließlich Perfluortributylamin (FC-43), Perfluordekalin, Perfluoroktylbromid oder bis-Perfluorbutylethen, ohne darauf beschränkt zu sein.
Eine Biodritin-Heteropolysaccharidlösung wird in Gelmikrokapseln überführt, indem die Lösung in eine Calciumchloridlösung getropft wird. Eine Biodritin-Heteropolysaccharidlösung wird zu einer Platte von jeder gewünschten Form gebildet, indem die Biodritin-Heteropolysaccharid- und Calciumchloridlösung miteinander in Kontakt gebracht werden und dadurch das Biodritin zu der gewünschten Form geliert wird, derart, dass die Form des Gels variiert werden kann, wie gewünscht. Die Gelmikrokapseln oder die Gelplatte können Langerhans'sche Pankreasinseln enthalten.
Das Biodritin kann auch zur eine „Spaghetti"-artigen Struktur gebildet werden, hergestellt durch Extrusion einer Biodritin-Heteropolysaccharidlösung über eine Schnur, z.B. durch eine zylindrische Katheterröhre, die im Inneren eine Baumwollschnur oder eine chirurgische Schnur enthält. Die Biodritin-Lösung wird zusammen mit der Schnur in eine Lösung extrudiert, die Calciumionen enthält, wobei sich sofort ein Gel bildet, welches die Schnur enthält. Das Gel wird dann in einer Calciumionenlösung reifen gelassen. Man kann eine äußere Schutzschicht über den Biodritin-Spaghetti bilden, z.B. aus Polylysin/Biodritin, um der Vorrichtung eine begrenzte Permeabilität zu verleihen. Die Strukturierung der Spaghetti-Vorrichtung erfolgt durch die Schnur im Inneren und erstreckt sich weiter nach außen hin zu dem umgebenden Gelzylinder, z.B. durch die seitlichen Ausläufer der Schnur oder durch sol che, die auf der Oberfläche der Schnur herbeigeführt werden, indem sie aufgekratzt wird, z.B. mit einer Messerklinge.
Ein Biodritin-Spaghettistrang kann zur Implantation von Zellen oder Geweben, die darin enthalten sind, z.B. an den seitlichen Ausläufern, verwendet werden; oder es können mehr als ein Biodritin-Spaghettistrang verwendet werden, indem diese an jedem Ende miteinander verschnürt werden. Die Stränge können weiterhin mit einem biokompatiblen Material eingefügt werden, derart, dass die Biodritin-Spaghettistränge vor mechanischer Belastung nach Implantation geschützt sind. Und diese Strangvorrichtungen können als ein Mittel zum Implantieren von Zellen oder Geweben in Mensch und Tier zur Prävention oder Behandlung einer Erkrankung verwendet werden, wie dies der Fall ist bei Implantaten aus Langerhans'schen Inseln zur Behandlung von Diabetes.
Derjenige, der auf dem Fachgebiet sachkundig ist, kann eine Zusammensetzung, die Zellen, wie etwa Inselzellen enthält, ohne übermäßiges Experimentieren implantieren, wenn typische Faktoren, wie etwa das Alter, das Geschlecht, der Zustand etc. des Patienten und die Rate, mit der ein gewünschtes Expressionsprodukt der Zellen, z.B. Insulin, sezerniert wird, berücksichtigt werden (siehe auch USSN 08/417,652, deren Anmeldedatum der 5. April 1995 ist, jetzt US-Patent Nr. 5,808,050, erteilt am 15. September 1998).
Folglich bezieht sich die Erfindung auf diese Produkte und Verfahren zu ihrer Herstellung und Verwendung zum Verkapseln von Zellen und Geweben in einer Langzeitkultur, zum Transport und/oder zur Transplantation bei einer medizinischen Behandlung.
Analoge Verfahren können verwendet werden, um Produkte aus Biodritin-Polymernetzwerken herzustellen; und dementsprechend bezieht sich die Erfindung auf diese Produkte und Verfahren zu deren Herstellung und Verwendung.
Was Glykosaminoglykane, wie etwa Heparinsulfat, Heparin und Hyaluronsäure betrifft, diese sind für die Erfindung nicht bevorzugt, da sie definierte Zellbindungseigenschaften aufweisen können. Was Material mit definierten Zellbindungseigenschaften betrifft, welche dieses ungeeignet zur Verwendung bei der vorliegenden Erfindung macht, bindet Hyaluronsäure spezifisch an CD44, auch als „Lymphozyten-Homing-Rezeptor" (Hermes-Antigen) oder „Haupt-Hyaluronsäurerezeptor von Säugetierzellen" (Aruffo et al., 1990) bekannt. CD44 wird auf den Oberflächen der meisten Säugetierzellen, von hämatopoetischen Nagetier- und Primatenzellarten, fibroplastoiden Zellen, Nerven- und Muskelzellen exprimiert (Rosenmann und St. John, 1993). Hyaluronsäure bindet auch an Versican, einen großen Proteoglykan, das durch Fibroblasten sezerniert wird und das die Zelladhäsion durch Wechselwirkungen mit Bestandteilen der extrazellulären Matrix und mit Zelloberflächen-Glykoproteinen fördert (Zimmermann, 1993).
Weiterhin wird bei der Verwendung von Materialien mit unerwünschten definierten Zellbindungseigenschaften ebenfalls nicht bevorzugt, dass Heparin mit Alginat in der Zusammensetzung verknüpft ist, aufgrund seiner gut bekannten Hemmung des Blutgerinnungsmechanismus. Aufgrund seiner Beteiligung an Zell-Zell-Adhäsionsmechanismen wird Heparansulfat ebenfalls nicht bevorzugt. Heparansulfat wird mit einem membrangebundenen Proteoglykan in Zusammenhang gebracht, das an NCAM (neural cell adhesion molecule, neurales Zelladhäsionsmolekül) bindet, wodurch die homophile Zelladhäsion gefördert wird (Cole et al., 1986). Die Heparansufat-bindende Domäne von Fibronektin ist für die Bindung von Neuronen, Lymphozyten und anderen Zellarten an Fibronektin im Verlauf der Zell-Zell-Adhäsion verantwortlich (Liao et al., 1988). Weiterhin stellen Heperansulfatproteoglykane, die auf Zelloberflächen und in der extrazellulären Matrix gefunden werden, Bindungsstellen für einen Fibroblastenwachstumsfaktor dar (nämlich für den basic fibroblast growth factor, bFGF) (Moscatelli et al., 1988).
Nachdem folglich die Grundlage geschaffen wurde, dass CIS das am meisten wünschenswerte Glykosaminoglykan ist, um für die Zwecke der vorliegenden Erfindung verwendet zu werden, ergeben sich die erfindungsgemäßen Heteropolysaccharide aus stabilen kovalenten chemischen Bindungen zwischen den Strukturen des mindestens einen Alginsäuresalzes, z.B. Natriumalginat, und des mindestens einen Glykosaminoglykans, z.B. CIS, beispielsweise durch eine Kopplungsreaktion mit Divinylsulfon (DVS). Diese Reaktanten können ein neues neo-Heteropolysaccharidkonjugat mit zur Verwendung in der Zell- und Gewebebiologie gewünschten Eigenschaften herstellen, wann immer die Biokompatibilität und/oder Immunisolierung kritische Punkte sind. Ebenso kann ein semi-interpenetrierendes Polymernetzwerk durch Mischen von CIS und Alginat in gewünschten Konzentrationen und durch Bilden eines Gels und durch Zugabe von Calciumionen hergestellt werden, das Eigenschaften und Vorteile aufweist, die denen der erfindungsgemäßen Heteropolysaccharide ähnlich sind.
Folglich kann sich die Erfindung auf mindestens zwei Verfahren beziehen.
Erstens, die vorliegende Erfindung macht ein Verfahren zum Herstellen eines Heteropolysaccharids verfügbar, das ein kovalentes Binden von mindestens einem Glykosaminoglykan, z.B. CIS, und mindestens einem Alginsäuresalz, z.B. Natriumalginat, umfasst, vorzugsweise eine Kopplungsreaktion mit einem Linkermolekül z.B. DVS, und einer emulgierten Perfluorkohlenstoffsubstanz, einschließlich Perfluortributylamin (FC-43), Perfluordekalin, Perfluoroctylbromid oder bis-Perfluorbutylethen, ohne darauf beschränkt zu sein, derart, dass die Calciumbindungsstellen in dem Alginat während der Kopplungsreaktion bewahrt und/oder konserviert werden. Diese Stellen machen die Flexibilität bei der Verwendung des Heteropolysaccharids als einem Sol oder einem Gel von gewünschter Stärke oder als eine Zusammensetzung mit einer einstellbaren Viskosität verfügbar; und die vorliegende Erfindung bezieht sich auf Produkte aus dem Heteropolysaccharid und auf ein Verfahren zu deren Herstellung und Verwendung, z.B. indem ein Kontakt mit Ionen, wie etwa Calciumionen hergestellt wird, um ein Gel, beispielsweise ein unendliches Gel herzustellen.
Das zweite Verfahren bildet ein physikalisches Gel, z.B. in der Art eines semi-interpenetrierenden Polymernetzwerks, indem ein polymerisierendes oder quervernetzendes Mittel, z.B. Calciumionen, zu einer Lösung gegeben wird, die sowohl mindestens ein Alginat, mindestens ein Glykosaminoglykan, z.B. Chondroitinsulfat-4 und/oder -6, als auch eine emulgierte Perfluorkohlenstoffsubstanz, einschließlich Perfluortributylamin (FV-43), Perfluordekalin, Perfluoroctylbromid oder bis-Perfluorbutylethen, enthält, ohne darauf beschränkt zu sein. Dieses Gel kann eine Zusammensetzung sein, die variiert werden kann, um speziellen Anforderungen zu genügen. Das erfindungsgemäße s-IPN-Gel ist stabil und wird durch Komplexbildung von Calciumionen mit Polyguluronsäure-Blöcken von Alginat gebildet, um die „egg-box"-Strukturen zu bilden, die das Gel stabilisieren.
Ebenfalls im Rahmen der gerade ausgeführten Gesetzmäßigkeiten kann eine andere Formulierung durch eine geeignete Kombination der oben beschriebenen Formulierungen hergestellt werden, bei der eine vorgegebene Menge an dem kovalent gebundenen Heteropolysaccharindkonjugat in eine Lösung mit Alginat und CIS eingemischt wird und zu dieser Lösung Calciumionen gegeben werden, um das Gel zu bilden.
Auf ähnliche Weise kann eine andere Formulierung hergestellt werden, indem ein erfindungsgemäßes Gel einer Verknüpfungsreaktion unterworfen wird, damit Glykosaminoglykan- und Alginateinheiten kovalent aneinander binden, z.B. indem das Gel einer Kopplungsreaktion unterworfen wird, an der ein Linkermolekül, wie etwa DVS beteiligt ist.
Die Erfindung bezieht sich weiterhin auf Verwendungen von Gelen und Zusammensetzungen, die zu Gelen geformt werden können, insbesondere biokompatiblen Gelen, wie etwa in „Anstrichen", Sprays, Matrices, Beads, Mikrokapseln und derartigem, einschließlich neuen Verwendungen, wie etwa „Spaghetti"-artigem Material, das einen Strang, z.B. ein Nahtmaterial oder einen Faden umfasst, wobei ein gewünschtes Material damit verbunden ist, z.B. Zellen, die mit dem „Rückgrat" verbunden sind, und ein erfindungsgemäßes Gel, welches das „Rückgrat" umgibt, beispielsweise auf eine zylindrische Weise.
Hintergrund der Erfindung
Zellen und Gewebe können durch drei grundlegende Techniken immobilisiert und immunisoliert werden: isoliert in extravaskulären Kammern, jedoch im Weg des Blutstroms, in sphärische Dispersionen oder Mikrokapseln, und innerhalb von Makrokapseln. Unter Verwendung dieser Techniken ist eine große Vielfalt an Zellen und Geweben aus verschiedenen Tieren immunisoliert und in Tiere zur Entwicklung therapeutischer Systeme implantiert worden (Übersichtsartikel von Christenson et al., 1993). Tatsächlich sind zukünftige Anwendungen auf eine Therapie mit immunisolierten Zellen für Erkrankungen oder Zustände augenfällig, wie etwa Diabetes, Hämophilie, Leberversagen, Morbus Alzheimer, Parkinson und Huntington, affektive Störungen, Leberversagen und Fertilitätsprobleme (Christenson et al., 1993). Eine vollständige Übersicht über die Fragen, die mit dem Verkapseln und der Immunisolierung verbunden sind, wird in einem kürzlich erschienenen Band dargestellt, der durch Goosen (1993) herausgegeben wurde.
Im Fall von Diabetes mellitus ist nach Alternativen zu den täglichen Insulininjektionen gesucht worden, um einen Diabetes vom Typ I oder einen insulinabhängigen Diabetes mellitus (insulin-dependent diabetes mellitus, IDDM) zu kontrollieren. Dies schloss Pankreastransplantate, Pumpen zur Abgabe von Insulin unter einem Steuerungsprogramm und zuletzt eine Transplantation von Langerhans'schen Inseln ein. Eine Übersicht über Implantate mit anhaltender Freisetzung zur Abgabe von Insulin ist publiziert worden (Wang, 1991).
Etliche Forscher haben verschiedene Ansätze vorgeschlagen, um Inselgewebe vor einem Angriff durch den Wirt nach Transplantation zu schützen; diese schließen das Verkapseln von Inseln in verschiedene Materialien ein, so dass Insulin sezerniert werden kann, die Beta-Zellen in dem Inselgewebe jedoch von dem Wirt immunologisch isoliert sind. Es ist vorgeschlagen worden, Polysaccharide zu Membranen zu formen, wie im Fall von Agarose durch Howell et al. (1982) oder im Fall von Alginat durch Tze und Tai (1982). Verwendete Materialien schließen synthetische Polysäuren und Polybasen, Gelatine und Polyaminosäuren (Young et al., 1989) ebenso ein, wie verschiedene Polysaccharide: chemisch modifiziertes Dextran, um polyionisch gebundene Kapseln zu bilden (Lim und Hall, 1988, Internationale Patentanmeldung unter dem PCT WO 88/00327), Einschließen in Alginat, gefolgt durch Stabilisierung mit Polylysin und Alginat (Chang und Wong, 1992, US 5,084,350 ), ebenso wie eine Kombination aus Chitosan und Carboxymethylzellulose, um Kapseln von kontrollierter Permeabilität zu bilden (Shioya und Hirano, 1990, US 5,089,272 ).
Zusätzlich haben kürzliche Arbeiten, welche die Regeneration von Haut in Kultur betrafen, auf die wichtige Rolle von GAGs in dem Verfahren hingewiesen, in Studien, bei denen Mischungen aus Kollagen und GAG als Träger verwendet wurden (Murphy et al., 1990; Yannas et al., 1990). Dazu passt, dass Keratinozyten und Fibroblasten, die an einem Nylonnetz wachsen gelassen wurden, eine hautartige Matrix mit Proteoglykanen produzierten (Slovakia et al., 1993).
Die Bedeutung der Bestandteile der extrazellulären Matrix für die normale Entwicklung des Systems Haut verleiht einer Grundlage der vorliegenden Erfindung Unterstützung, z.B., dass Fremdmoleküle, kombiniert oder strukturiert mit spezifizierten GAGs, z.B. vorzugsweise CIS im Fall dieser Erfindung, ideale Schutzmaterialien zur Transplantation oder Implantation von Zellen oder Geweben menschlichen oder tierischen Ursprungs mit dem Zweck, eine Krankheit zu behandeln oder zu kontrollieren, bilden.
Allerdings versagte der Stand der Technik bisher darin, die besonderen Heteropolysaccharid-Polylmernetzwerke, die zusätzlich eine emulgierte Perfluorkohlenstoffsubstanz enthalten, welche in der Lage ist, die Sauerstoffverfügbarkeit bei verkapselten und/oder immunisolierten Zellen und Geweben zu steigern, wodurch die Lebensfähigkeit der verkapselten Zellen und Gewebe zum Transport und/oder zur Transplantation verlängert wird, sowie Produkte daraus und Verfahren und Verwendungen der Erfindung zu lehren oder nahezulegen.
Weiterhin zeigen wesentliche Bestandteile der extrazellulären Matrix in Konnektivgeweben, von Zellmembranen und der Endothelauskleidung sowie die allgegenwärtige Präsenz von GAGs deren Bedeutung bei der Matrixbildung und Ausdehnung und bei Zell-Matrix- und Zell-Zell-Interaktionen. Obwohl GAGs in einem Organismus meistens in Verbindung mit Proteinen, wie Proteoglykanen vorkommen, ist gezeigt worden, dass nur der Proteinanteil immunogen ist; das Glykosaminoglykan, z.B. der CIS-Bestandteil, ist selbst nicht immunogen (Hirschmann und Dziewiatkowski, 1966; Loewi und Muir, 1965).
Allerdings sind die Verwendung eines GAG mit einem Alginatsalz, beispielsweise GAG-Alginatbiomolekülen, z.B. durch eine Kopplungsreaktion mit einem Linkermolekül, um ein Heteropolysaccharidkonjugat und Produkte daraus zu bilden, und Verfahren und Verwendungen der Erfindung bislang nicht gelehrt oder nahegelegt worden. Darüber hinaus ist die Bildung eines Polymernetzwerkes, z.B. eines semi-interpenetrierenden Polymernetzwerkes auf der Grundlage der beiden Bestandteil Alginat und GAG, z.B. CIS, hergestellt in Gelform durch Zugabe von Ionen, wie etwa anorganischen Ionen, z.B. Calciumionen, im Stand der Technik weder gelehrt noch nahegelegt worden. Auch ist ein Polymernetzwerk, welches ein Heteropolysaccharid umfasst, hervorgegangen aus der Kopplung von GAG-Alginat, das in einem GAG-Alginatpolymernetzwerk vorhanden ist, bisher auch nicht gelehrt oder nahegelegt worden.
Im Fall eines Diabetes wird das Ausmaß des Interesses an der Entdeckung der besten Möglichkeit, Inseln bei der Transplantation zu verwenden, durch zwei kürzlich publizierte Papiere gezeigt, wobei eines von der Lagerung und Konservierung von Inseln (Jindal und Gray, 1994) und das andere von der Wirkung von Prednison auf die Funktion des Insel-Autotransplantats (Rodrigues Rilo et al., 1994) handelt.
Das US-Patent Nr. 4,409,331, erteilt an Lim, bezieht sich auf die Verkapselung von Inseln in Polymermaterial, das aus Alginat und Polylysin bebildet wird; Lim und Sun (1980) diskutierten die Mikroverkapselung von Inseln, um ein biologisch künstliches Pankreas zu bilden. Es wurden Chitosan-Mikrosphären entwickelt, die an GAG-Rezeptoren auf Zelloberflächen binden (Gallo et al., US 5,129,877 ). Kollagen-GAG-Mikrokapseln wurden als Arzneimittelabga besysteme vorgeschlagen, um antimikrobielle Mittel abzugeben (Rase et al., US 5,169,631 ). Polyakrylate wurden auch als Verkapselungsmaterialien entwickelt und sind mit Alginat kopolimerisiert worden, wie durch Stevenson and Sefton (1993) diskutiert wurde. Allerdings wurde die Verwendung von GAG, das eine emulgierte Perfluorkohlenstoffsubstanz mit einem Alginatsalz aufweist, GAG-Alginatbiomoleküle, z.B. in physikalischer Mischung oder gebunden durch eine Kopplungsreaktion mit einem Linkermolekül, um ein Heteropolysaccharid oder ein physikalisches Netzwerk zu bilden, z.B. s-IPN, ein Gel oder Produkte daraus und Verfahren und Verwendungen der Erfindung, weder gelehrt noch nahegelegt.
Es wird allerdings darauf hingewiesen, dass kein Stand der Technik bisher GAG, welches eine perfluorierte Substanz, die als das Hauptbiokompatibilitätsmittel zwischen einer fremden chemischen Struktur oder Vorrichtung und einem Wirtsorganismus wirkt, insbesondere in einer Zusammensetzung mit einem Alginat, aufweist.
Die Synthese und die Eigenschaften von Glykokonjugaten sind in einem von Lee and Lee (1994) herausgegebenen Buch zusammenfassend besprochen worden. Die neue Klasse von Strukturen, die jetzt hier gerade beschrieben wird, gehört zu einer Gruppe von Glykopolymeren, die dadurch gebildet werden, dass zwei verschiedene natürliche Heteropolysaccharide durch Reaktion mit einem unnatürlichen Ether, z.B. Divinylsulfon, miteinander verbunden werden. Diese neue Klasse würde in die Liste von neo-Glykokonjugaten aufgenommen werden, die durch Magnusson et al. (1994) unter der Überschrift „glycopolymers with gel forming properties" zusammengestellt wurde.
Andererseits gehört das physikalische Gel, das durch Zugeben von Calciumionen zu Lösungen, welche verschiedene Konzentrationen an GAG, z.B. CIS, und Alginat enthalten, zu der Gruppe von Polymeren, die als semi-interpenetrierende Polymernetzwerke bekannt sind, wie kürzlich durch LaPorte (1997) diskutiert. In diese Kategorie wird eine Art von Polymer verstrickt und eingeschlossen durch ein zweites Polymer, das quervernetzt ist, um die Struktur zu stabilisieren.
Die Tatsache allerdings, dass Zusammensetzungen der Erfindung charakterisiert werden können als „Glykopolylmere mit gelbildenden Eigenschaften" oder als ein „Polymernetzwerk", z.B. "ein semi-interpenetrierendes Polymernetzwerk", bedeutet nicht, dass die Erfindung bisher gelehrt oder nahegelegt worden ist.
Kurzfassung und Gegenstand der Erfindung
Folglich macht die vorliegende Erfindung ein neues Heteropolysaccharidkonjugat oder einen davon abgeleiteten Komplex, Gele und/oder Sole, die davon abgeleitet sind, verfügbar sowie die Synthese, Reinigung oder Verwendung eines neuen Glykopolymers und/oder Heteropolysaccharids und/oder von Gelen mit einer perfluorierten Substanz, Lösungen und/oder Solen, hier als Biodritin-Zusammensetzung bezeichnet. Das erfindungsgemäße Heteropolysaccharid wird vorzugsweise aus einer kovalenten Bindung zwischen mindestens einem Glykosaminoglykan, welches Chondroitinsulfat-4 und/oder -6 umfasst, und mindestens einem Alginsäuresalz gebildet, z.B. derart, dass ein Gel und/oder Sol gebildet wird, und z.B. einer perfluorierten Substanz, welche als eine emulgierte Perfluorkohlenstoffsubstanz Perfluortributylamin (FC-43), Perfluordekalin, Perfluoroctylbromid oder bis-Perfluorbutylethen umfasst, in Gegenwart eines geeigneten Gegenions, z.B. Calcium.
Eine zusätzliche Formulierung der Erfindung kombiniert die beiden Polysaccharide Alginat und GAG, z.B. CIS, in wässrigen Lösungen, die variable Konzentrationen von jedem Bestandteil aufweisen, durch die Bildung eines Gels von der Art eines semi-interpenetrierenden Polymernetzwerks durch Zugabe eines quervernetzenden oder polymerisierende Mittels, z.B. Calciumionen. Eine dritte Formulierung kombiniert die beiden Konzepte in derselben Zubereitung in einem geeigneten Verhältnis, das durch denjenigen, der auf dem Fachgebiet sachkundig ist, ohne übermäßiges Experimentieren anhand dieser Offenbarung und der Kenntnis des Stands der Technik begründet werden kann.
Deshalb macht die Erfindung Folgendes verfügbar:
Eine Zusammensetzung, die mindestens ein Glykosaminoglykan, nämlich Chondroitinsulfat-4 oder -6, eine emulgierte Perfluorkohlenstoffsubstanz, wie oben definiert, und mindestens ein Alginat, z.B. Natriumalginat umfasst, wobei:
das mindestens eine Glykosaminoglykan und/oder das Alginat quervernetzt oder polymerisiert sind, z.B. ist das Alginat quervernetzt oder polymerisiert, beispielsweise durch Zugabe eines anorganischen Salzes, wie etwa einem Calciumsalz; und
das mindestens eine Glykosaminoglykan und das Alginat kovalent gebunden sind, z.B. mittels einer Kopplungsreaktion, an der ein Linkermolekül, wie etwa DVS beteiligt ist; oder
das mindestens eine Glykosaminoglykan und/oder das Alginat quervernetzt oder polymerisiert sind, z.B. ist das Alginat quervernetzt oder polymerisiert, beispielsweise durch Zugabe eines anorganischen Salzes, wie etwa Calciumsalz, und das mindestens eine Glykosaminoglykan und das Alginat sind kovalent gebunden, z.B. mittels einer Kopplungsreaktion, an der ein Linkermolekül, wie etwa DVS beteiligt ist, und das kovalente Binden kann vor dem Quervernetzen oder Polymerisieren durchgeführt worden sein oder umgekehrt; und
eine perfluorierte Substanz in der Biodritin-Polymerformulierung, wobei die perfluorierte Substanz eine emulgierte Perfluorkohlenstoffsubstanz ist, die aus Perfluortributylamin (FC-43), Perfluordekalin, Perfluoroctylbromid oder bis-Perfluorbutylethen besteht,
Gele, welche die Zusammensetzung umfassen; Mischungen aus solchen Gelen oder aus mindestens einem solchen Gel und mindestens einer solchen Zusammensetzung; und
Verfahren zum Herstellen solcher Zusammensetzungen und Gele; und
Verfahren zur Verwendung solcher Zusammensetzungen und Gele, einschließlich als „Anstriche", Sprays, Matrices, Beads, Mikrokapseln; und
Produkte, welche die Zusammensetzung oder das Gel, z.B. „Anstriche", Sprays, Matrices, Beads und Mikrokapseln, umfassen.
Die erfindungsgemäße Zusammensetzung kann erhalten werden, indem 0,5% bis 5,0%, z.B. 1% bis 3% (Gew.-% oder Vol.-%) Alginat, z.B. Natriumalginat, und ungefähr 1%, z.B. 1,5% oder 2% bis zu 20% bis 30%, z.B. 25% (Gew.-% oder Vol.-%) GAG, z.B. CIS, zugemischt werden. Dies bedeutet, dass im Allgemeinen das Verhältnis von Alginat zu GAG beim Bilden der erfindungsgemäßen Zusammensetzungen 0,5:30 betragen kann, jedoch vorzugsweise drei (3) bis vier (4) mal mehr GAG vorhanden ist als Alginat (bezogen auf Gewicht oder Volumen), d.h. ein bevorzugtes Verhältnis von Alginat zu GAG beim Bilden von erfindungsgemäßen Zusammensetzungen beträgt 1:3 bis 1:4. Die Alginate treten in verschiedenen Viskositäten auf, z.B. hohe Viskosität, mittlere Viskosität. Alginate mit mittlerer Viskosität sind bevor zugt, da Alginate mit hoher Viskosität zu härteren Beads führen können. Weiterhin kann die Menge an Alginat, die beim Bilden einer erfindungsgemäßen Zusammensetzung eingesetzt wird, durch die Viskosität des Alginats begrenzt werden; wobei ein Alginat mit mittlerer Viskosität, 5 Gew.-% oder Vol.-% Alginat ziemlich viskös ist. Weiterhin kann derjenige, der auf dem Fachgebiet sachkundig ist, leicht würdigen, dass das Volumen und die Viskosität oder die Härte von Zusammensetzungen, Gelen und Produkten daraus, z.B. Beads etc., ohne übermäßiges Experimentieren durch Variieren der Menge an GAG, z.B. CIS, und Alginat, z.B. Natriumalginat, variiert werden kann. Wenn beispielsweise eine weichere Zusammensetzung, ein Gel oder Produkt, das mehr Volumen aufweist, gewünscht ist, wird mehr GAG eingesetzt, d.h. die Menge an GAG, bezogen auf das Gewicht oder Volumen, wird gesteigert; und wenn physikalische Widerstandsfähigkeit, Härte und ähnliche Eigenschaften erwünscht sind, wird mehr Alginat eingesetzt, d.h. die Menge an Alginat, bezogen auf das Gewicht oder Volumen, wird gesteigert.
Wenn ein Linkermolekül beim Bilden einer erfindungsgemäßen Verbindung verwendet wird, kann es in einer Menge verwendet werden, die zu der Menge an Alginat oder zu der Menge an vorhandenem GAG in einem Verhältnis steht, z.B. eine Menge von 50% bis zur Gleichheit, bezogen auf das Gewicht, Volumen oder stöchiometrisch auf die Menge an vorhandenem Alginat oder auf die Menge an vorhandenem GAG, oder 2- oder 3-mal soviel wie das Gewicht, Volumen oder die stöchiometrischen Menge an vorhandenen Alginat oder GAG. Wenn ein anorganisches Ion als quervernetzendes oder polymerisierende Mittel beim Bilden einer Zusammensetzung dieser Erfindung verwendet wird, ist das anorganische Ion vorzugsweise ein Calciumion, z.B. Calciumchlorid, das in einer Menge verwendet werden kann, die zu der Menge an vorhandenem Alginat in einem Verhältnis steht, z.B. in einer Menge von ungefähr 0,05% bis 2%, bezogen auf das Gewicht oder Volumen, z.B. ungefähr 1,0%, bezogen auf das Gewicht oder Volumen.
Die Gele können im Wesentlichen kovalent oder teilweise kovalent oder teilweise interpenetrierend sein. Aufgrund einer Analyse der erfindungsgemäßen Gele, z.B. einer HPLC-Analyse, die Banden zeigt, die mit Alginat, CIS und einer kovalenten Struktur korrespondieren, wird angenommen, dass Gele der Erfindung interpenetrierende Netzwerke bilden. Allerdings beabsichtigen die Anmelder nicht notwendigerweise, an irgendeine bestimmte Theorie gebunden zu sein.
Biodritin, das eine emulgierte Perfluorkohlenstoffsubstanz enthält, kann auf chirurgische Wunden oder Nähte aufgetragen werden, um vor Anhaftungen zu schützen; sie kann auch als ein Matrixmaterial zum Unterstützen von Zellen zum Kultivieren oder für andere Anwendungen dienen, insbesondere bei solchen, bei denen eine hohe Vitalität der Zellen erhalten bleiben muss und die in einem nicht-aggregierten Zustand suspendiert werden müssen.
Ein Gegenstand der Erfindung ist es, eine Zusammensetzung verfügbar zu machen, die in der Lage ist, Zellen zum Kultivieren, zum Transport und/oder zur Transplantation verfügbar zu machen, wobei die Zellen langfristig in vitro und mit einer hohen Vitalitäts- und geringen Mortalitätsrate gehalten werden können, indem eine Zusammensetzung zur Verfügung steht, die in der Lage ist, die Sauerstoffdiffusion zu verstärken.
In dieser Offenbarung können die Begriffe „umfassen", „umfassend" und dergleichen, die ihnen im US-Patentgesetz zugeschriebenen Bedeutungen haben und können „einschließen", „einschließend" und dergleichen bedeuten.
Diese und andere Ausführungen werden jetzt beschrieben und/oder werden aus der folgenden genauen Beschreibung offensichtlich werden.
Kurze Beschreibung der Figuren
1 zeigt einen Vergleich von menschlichen Inseln, die aus Polymerplatten ohne oder in Gegenwart von FC-43 nach 14-tägiger Kultur in vitro erhalten wurden. Genauer gesagt zeigt 1 ein histologisches Muster von Inseln, verkapselt in Platten von 3 × 10 × 20 mm, die in vitro kultiviert wurden. 40000 menschliche Inseläquivalente (human islet equivalents, IEQs) wurden in jeder Platte verkapselt und 14 Tage bei 37°C in CMRL-Medium mit 10% fötalem Kälberserum kultiviert. Die Kontrollen erhielten kein FC-43, während die Testansätze 10% (Vol./Vol.) FC-43 erhielten.
2 zeigt eine menschliche Insel, die 77 Tage nach Transplantation in eine Nacktmaus mit einer Polymerformulierung mit FC-43 explantiert wurde. Genauer gesagt zeigt sie ein histologisches Muster von menschlichen Inseln in Mikrokapseln aus Biodritin. 3500 menschliche IEQs wurden in Mikrokapseln verkapselt und intraperitoneal in Nacktmäuse transplantiert. Nach 77 Tagen einer Euglykämie bei den Tieren wurden die Mikrokapseln zur Untersuchung explantiert. FC-43 wie in 1.
3 zeigt Inseln aus einer NOD-Maus (14 Tage nach Implantation). Genauer gesagt zeigt sie ein histologisches Muster von Ratteninseln, die in Mikrokapseln verkapselt und in nicht-fettleibige, diabetische (non-obese, diabetic, NOD) Mäuse implantiert wurden. 1500 Ratten-IEQs wurden in Mikrokapseln in Biodritin verkapselt und intraperitoneal in die NOD-Mäuse implantiert. Die Explantation fand am Tag 14 statt. FC-43 wie in 1.
Beschreibung der Erfindung
Ohne dass gewünscht ist, das Vorhergesagte notwendigerweise zu begrenzen, soll das Folgende die Erfindung im Hinblick auf bestimmte bevorzugte Ausführungen diskutieren. Es ist jetzt gefunden worden, dass die chemische Polymerisierung eines Algenpolysaccharids, nämlich Alginsäure in Form von Natriumalginat, mit einer spezifischen Gruppe von tierischen Heteropolysacchariden, z.B. Chondroitinsulfat-4 und -6, CIS, zu neuen Materialien, z.B. Biodritin, führt, die als neo-Heteropolysaccharidkonjugate klassifiziert werden können, die neue Eigenschaften in Bezug auf die Elternmoleküle aufweisen, während die meisten der chemischen Eigenschaften der beiden Elternmoleküle bewahrt bleiben. Die allgemeinen Eigenschaften dieser neuen Klasse von Verbindungen schließen ein Biodritin oder alle Biodritine ein, und vorzugsweise sind alle Biodritine Polyanionen, die sowohl Carboxylsäure als auch Sulfatgruppen tragen (Alginat enthält Carboxylsäuren, während Chondroitinsulfat sowohl Carboxylsäuren als auch Sulfate enthält); Biodritine bilden unendliche Gele, wenn sie mit Calciumionen behandelt werden, eine Eigenschaft, die durch die Alginatgruppe verliehen wird. Biodritine lösen sich leicht in Wasser. Zusätzlich kann die Viskosität der Lösungen reguliert werden, indem die Konzentration an Biodritin eingestellt wird, ebenso wie die Konzentration an Calcium.
Biodritine können auch durch Polymerisation von CIS und Alginat in gemischten Lösungen hergestellt werden, indem Calciumionen zugesetzt werden, woraus die Bildung von stabilen Gelen aus einem semi-interpenetrierenden Polymernetzwerk resultiert, bei dem der CIS-Bestandteil in dem Gelnetzwerk, das durch Calciumalginat gebildet wird, eingeschlossen ist.
Durch Zugeben von Calcium in ausreichender Konzentration bilden die Biodritine stabile Gele, da das Syntheseverfahren der Erfindung entworfen wurde, um mit extremer Vorsicht Calciumbindungsstellen in dem Alginatbestandteil zu bewahren. Die Gegenwart des Chondroitinsulfat-Bestandteils verleiht andererseits den Biodritinen eine stärkere negative Ladung an Sulfaten und eine Ähnlichkeit mit extrazellulären Matrix, was sie vollständig biokompatibel macht, unter anderem für Anwendungen bei der Transplantation von Zellen und Geweben.
Die Materialien, die sich von Biodritin ableiten, können ihre Permeabilitätssperrschicht durch ionische Komplexierung mit positiv geladenen Polymeren, wie etwa Poly-L-Lysin oder Poly-L-Ornithin, die eine dünne äußere Kapsel des Gels bildet, gesteuert haben. Die Porengröße dieser Kapsel kann wie gewünscht eingestellt werden, indem die Konzentration und das Molekulargewicht des positiv geladenen Polymers während der Kapselbildung geändert wird.
Bei der Synthese der Zusammensetzungen der Erfindung weist Biodritin vorzugsweise einen GAG-Gehalt im Bereich von 2–200 Gew.-% der Alginatzusammensetzung auf, was von den jeweiligen Reaktionsbedingungen abhängt. Die Endzusammensetzung kann eingestellt werden, indem Biodritin, das mit Biodritin, das aus dem Gelieren von Alginat und CIS gebildet wurde, quervernetzt wird, und einer emulgierten Perfluorkohlenstoffsubstanz in derselben Lösung kombiniert wird. Innerhalb dieses Bereichs weisen die Verbindungen die gewünschten Eigenschaften zur Verwendung als Transplantationsmaterialien auf, und wenn sie eine emulgierte Perfluorkohlenstoffsubstanz aufweisen, wird die Sauerstoffversorgung der Zellen und Gewebe, die in der Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung verkapselt sind, dramatisch ansteigen, wodurch die lange Lebensdauer und die Vitalität der verkapselten Zellen und/oder Gewebe für den Transport und/oder die Transplantation verlängert wird. Unlösliche Materialien können auch hergestellt werden, indem die Polymerisierungsbedingungen gesteuert werden. Diese können Anwendung finden als Füllstoffe bei der Gewebereparatur oder als Oberflächen, um ein Zellwachstum in Kultur zu ermöglichen.
Die Oberfläche von Biodritin-Beads, die einer wässrigen Lösung ausgesetzt sind, tragen die Funktionalitäten von Carboxylaten, Sulfaten, Hydroxygruppen von sowohl Alginat als auch Chondroitinsulfat (GAG), ebenso wie glykosidische Bindungen und die Sulfongruppe der quervernetzenden Gruppe; die negativ geladenen Sulfat- und Carboxylatgruppen sind in der Lage, starke Ion-Ion-Komplexe mit Polykationen, wie etwa Polylysin oder Polyornithin zu bilden, wodurch den Beads eine zusätzliche Außenstruktur und ein Schutz verliehen wird, der bei Alginatkapseln beobachtet wurde. Diese Komplexe, gebildet auf der äußeren Oberfläche der Mikrokapseln, tragen auch dazu bei, die Porengrößen zu definieren.
Die viskösen Lösungen, die erhalten werden, indem Biodritin in Wasser oder Salzlösung oder einem anderen gewünschten wässrigen Medium gelöst werden, sind einfach zu handhaben, insbesondere, wenn die Konzentration unter 4% (Gew./Vol.) gehalten wird, und unter der Vorraussetzung, dass sie nicht Calciumionen ausgesetzt werden. Derartige Lösungen können zu unendlichen Gelen durch Komplexierung mit Calciumionen umgewandelt werden, indem sie z.B. aus Spritzen oder Kapillaren in Lösungen aus Calciumchlorid getropft werden, kann man Mikrobeads der gewünschten sphärischen Größe erhalten. Die weitere Behandlung mit positiv geladenen Molekülen, wie etwa Polylysin, führt zu einer dünnen Außenkapsel, die wieder durch das Aufschichten von Biodritin auf ihre Oberseite aus einer Verdünnungslösung geschützt wird.
Eine Biodritin-Lösung kann extrudiert werden, z.B. aus einem dünnen Schlauch, direkt in eine Calciumchloridlösung, wobei ein Gel in Form eines Stabs oder Zylinders von einheitlichem Durchmesser erhalten wird. Zellen oder Gewebe können innerhalb dieser Zylinder zu Zwecken einer Kultivierung oder Transplantation gehalten werden.
Das Biodritin-Gel kann auch in Form gebracht werden, z.B. als eine Platte von gewünschter Größe und Form, in der Zellen oder Gewebe eingeschlossen werden können, zu Zwecken einer Kultivierung oder Implantation.
Eine andere Verwendung von Biodritin ist der Schutz frischer Nähte: Ein Biodritin-Sol kann „aufgemalt" oder mit einer sterilen Bürste aufgetragen oder um das Nahtgebiet aufgesprüht werden, gefolgt durch Aufsprühen mit einer entsprechenden Calciumchloridlösung. Es bildet sich sofort ein weiches schützendes Gel um das Nahtgebiet herum, wodurch es vor dem Eindringen von Zellen geschützt wird, indem die Zelladhäsion unterbunden wird. Das Biodritin-Gel selbst kann auf eine Naht aufgesprüht, aufgemalt oder aufgetragen werden, um sie vor Anhaftungen zu schützen. Derjenige, der auf dem Fachgebiet sachkundig ist, kann die geeignete Viskosität des Gels und die Menge davon, die zum Sprayen, Anstreichen oder Auftragen eingesetzt wird, ohne übermäßiges Experimentieren aufgrund der Fachkenntnis, der hier verfügbar gemachten Offenbarung und aufgrund typischer Faktoren, wie etwa der Wunde oder der Naht, und dem Zustand des Patienten bestimmen.
Die chemische Kopplung der beiden Biodritin-Hauptbestandteile, vorzugsweise Natriumalginat und Chondroitinsulfat-4 und/oder -6, wird durch Reaktion mit einem Linkermolekül, z.B. Divinylsulfon, abgekürzt DVS, durchgeführt. Ein Linkermolekül ist ein kleines Molekül, das für einen nukleophilen Angriff sehr empfänglich ist (siehe USSN 08/417,652, jetzt US-Patent Nr. 5,808,050, hier im Wege der Bezugnahme aufgenommen im Hinblick auf andere Arten von Linkermolekülen und Kopplungsreaktionen). Die Reaktion wird bei alkalischem pH-Wert durchgeführt unter Bedingungen, die erlauben, dass die Calciumbindungstellen im Alginat vor einer Reaktion geschützt werden. Das Endprodukt der Quervernetzungsreaktionen wird dann löslich gemacht und kann von den Reagenzien durch Reinigung durch wiederholte Alkoholpräzipitation getrennt werden.
Die Konzentration der Linkermoleküle, z.B. DVS, die in der Reaktion verwendet wird, kann die Endlöslichkeit des Glykopolymerkomplexes definieren; jenseits eines bestimmten Bereichs werden unlösliche Materialien gebildet.
Eine Alternative zu der chemischen Kopplung von CIS und Alginat ist die Herstellung von Biodritin durch Bildung eines physikalischen Gels aus einer Lösung, die beide Polymere in gewünschten Konzentrationen enthält. Dieses Gel bildet sich, wenn Calciumionen zugesetzt werden, und das daraus hervorgehende Gel ist von der Art eines semi-interpenetrierenden Polymernetzwerks s-IPN. Bei dieser Art eines polymeren Gels wird die quervernetzte Struktur von nur einem Bestandteil, z.B. Alginat, durch die Bildung der „egg-box"-Strukturen abgeleitet, die aus der Bindung von Calciumionen an Polyguluronsäureblöcken in dem Alginat resultieren. Das sich ergebende Gelnetzwerk schließt die CIS-Ketten, die mit dem Alginat verflochten sind, ein und hält sie fest, derart, dass die CIS-Moleküle als Bestandteile der Gelstruktur erhalten bleiben, was der Gelstruktur die Eigenschaften von CIS verleiht.
Ein Element der Erfindung ist die Eigenschaft des Endprodukts, nämlich Biodritin, Gele mit Calciumionen zu bilden und für die verkapselten Zellen und/oder Gewebe eine ausreichende Sauerstoffversorgung verfügbar zu machen. Dies wird erreicht, indem die Calcium-Bindungstellen in dem Alginat, sogenannte „egg-box"-Stellen, vor dem Reagieren mit dem quervernetzenden Reagenz während der Synthese der chemisch gekoppelten Variante von Biodritin geschützt werden. Dies wird erreicht, indem die entsprechende Menge an Calciumionen der Alginatlösung vor der Kopplungsreaktion auf eine solche Weise zugesetzt wer den, dass die Calcium-„egg-box"-Komplexe vorgebildet werden, während eine starkes Gelieren vermieden wird, und die Kopolymerisationsreaktion der Lösung nicht unterbunden wird.
In einer frühen Phase der Reinigungsschritte des Endprodukts werden die schützenden Calciumionen aus den „egg-box"-Komplexen entfernt, was die Ablösung der Partikel erlaubt, um eine visköse Lösung zu bilden, die dann wie gewünscht behandelt werden kann.
Perfluorierte Kohlenwasserstoffderivate sind extrem dichte, chemisch inerte und wasserunlösliche Verbindungen, die in den frühen 40er Jahren des vergangenen Jahrhunderts als Teil des Manhattan-Projekts entwickelt wurden. Über Jahre ausführlich beforscht im Hinblick auf ihre chemischen Eigenschaften, wurden sie in den 80er Jahren des vergangenen Jahrhunderts aufgrund ihrer Eigenschaft, chemisch inert zu sein, und weil sie nicht verstoffwechselt werden, zur Verwendung als künstliche Blutbestandteile ausgewählt. Angesichts ihrer hohen Dichte und ihrer vollständigen Unlöslichkeit in Lösungen auf der Grundlage von Wasser war das einzige Mittel, diese Verbindungen als künstliches Blut zu verwenden, stabile Emulsionen zu erzeugen, indem hydrophobe Phospholipide verwendet wurden und die Perfluorkohlenstofftröpfchengröße zwischen 0,2 bis 0,3 μm standardisiert wurde. Die Forschung an diesen Emulsionen explodierte mit unvergleichbarem Erfolg, und 1989 war Flusol DA^® die erste derartige Emulsion, die von der FDA zu klinischen Anwendungen für die Verwendung bei der perkutanen transluminaren Angioplastie zugelassen wurde. Bald darauf folgten andere Unternehmensprodukte, wie etwa Oxygent^® von Alliance Pharmaceuticals. Die Emulsionen der ersten Generation, obwohl vorteilhaft, wiesen auch unerwünschte blutverdünnende Wirkungen auf. Trotz der enormen akademischen und unternehmerischen Forschung an Perfluorkohlenstoffen wurde festgestellt, dass höhere Gew.-/Vol.-Konzentrationen in PFC-Emulsionen das Auftreten von unerwünschten Wirkungen reduzierte und die Eigenschaften im Hinblick auf die Abgabe und Retention von Sauerstoff verbesserten. Diese zweite Generation von Emulsionen hatte eine bei Weitem größere Auswirkung. Bei dem Verfahren wurden die kritischen Eigenschaften von perfluorierten Kohlenwasserstoffen und Derivaten sorgfältig dokumentiert, wobei sich ein erstaunliches Fehlen einer Ungleichheit von einer Forschungsgruppe zu der nächsten zeigte.
Die sauerstofftragenden Eigenschaften von perfluorierten Verbindungen stammen aus Fluoratomen und sind direkt proportional zu ihrer Menge in deren Struktur. Auf ähnliche Weise ist der Sauerstoffgehalt einer bestimmten Emulsion direkt proportional zu dem pO₂ der Umge bung der Emulsion und dem prozentualen Gewicht des PFC in dem Gesamtvolumen der Emulsion. Darüber hinaus weist Perfluorkohlenstoff eine Kinetik einer Sauerstoffaufnahme und -abgabe auf, die zweimal so schnell ist, wie die des normalen Sauerstoffabgabesystems des Körpers, nämlich Hämoglobin. Diese Eigenschaften werden weiter verstärkt durch die Abgabe von hohen Konzentrationen an Sauerstoff an Patienten, die PFC-Emulsionen erhalten.
Genauer gesagt, angesichts einer Sauerstoffdiffusionskinetik, die zu Hämoglobin bei normalen pO₂-Werten passt und Hämoglobin bei kritischen hypoxischen pO₂-Werten übersteigt, und angesichts der Eigenschaft der Perfluorverbindungen, inert und biokompatibel zu sein, sind die potentiellen Vorteile der Substanzen enorm, insbesondere auf dem Gebiet der Verkapselung und Konstruktion von Zellen und Geweben.
Diese Substanzen, wie etwa Perfluortributylamin, sind kommerziell verfügbar; die FDA ließ Mischungen aus Perfluorverbindungen zu, die als feine Emulsionen (mit Mizellengrößen < 0,2 μm) hergestellt sind, was zur Verwendung in Blutgefäßen notwendig ist. Allerdings ist bis zum heutigen Tage keine dieser Substanzen modifiziert worden, um dazu verwendet zu werden, die Diffusion und Verfügbarkeit von Sauerstoff bei Immunisolierungs- oder Gewebetransplantationsvorrichtungen zu verstärken, was der Gegenstand unserer Erfindung ist.
Unter Verwendung eines neuen Heteropolysaccharids, zusammengesetzt aus Chondroitin A (CIS) und Natriumalginat in verschiedenen Mischungskonzentrationen mit oder ohne Quervernetzung, ist ein anwendbares Polymer zu Zwecken der Immunisolierung entwickelt worden (Mares-Guia und Ricordi, Patentanmeldung 1997, Referenznummer 1). Demgemäß lehrt und beansprucht die vorliegende Erfindung ein Verfahren zu Einschließen von Perfluorkohlenstoffderivaten in die Polymermatrix, um die Sauerstoffverfügbarkeit für und den Sauerstofftransport zu den verkapselten Zellen oder Geweben zu verbessern. Das Polymer wird dann zu gelartigen Vorrichtungen jeder geometrischen Gestaltung gebildet, wobei eine Grenzflächenkoazervation verwendet wird, ein Verfahren, bei dem die Polymermatrix in 1,5% (Gew./Vol.) Calciumchloridlösung extrudiert wird und die positiv geladenen Calciumionen durch ionische Bindungen Brücken zwischen den negativ geladenen Carboxylatgruppen, die in den Anteilen der Polymermatrix, die Natriumalginat sind, vorhanden sind, bilden. Der Rest der Matrix wird in dem gelierten Kern der Vorrichtung eingeschlossen, einschließlich der die Sauerstoffdiffusion verstärkenden Emulsion.
Die Fähigkeit der erfindungsgemäßen Zusammensetzungen, leicht und schnell von einer Lösung zum Gel und vom Gel zu einer Lösung durch Manipulation der Calciumionenkonzentration überzugehen, ist eine weitere bedeutende Eigenschaft der Erfindung, da sie zu zusätzlichen Anwendungen dieses Materials außerhalb des Gebiets der Transplantation führt.
Bei einer anderen Ausführung der vorliegenden Erfindung wird die chemische Kombination von Alginat, z.B. Natriumalginat, und GAG, z.B. Chondroitinsulfat-4 und/oder -6, durch eine dehydrothermale Reaktion bei Temperaturen von ungefähr 100°C hergestellt. In diesem Fall wird kein DVS verwendet und die Esterbindungen werden zwischen den alkoholischen Hydroxygruppen und den Säuregruppen in Alginat und Chondroitinsulfat gebildet. Auch unter Verwendung von DHT wird ein Schutz der „egg-box"-Stellen erhalten, und dies ist zur Bewahrung der Geliereigenschaften von Biodritin nützlich.
Es wird darauf hingewiesen, dass angesichts der Reinigungsschritte nach der Reaktion kommerziell verfügbare Reaktanten bei allen hier beschriebenen Test verwendet worden sind ohne vorläufige Reinigung und ohne negative Auswirkungen auf die Eigenschaften des Endprodukts Biodritin.
Die Erfindung soll weiter anhand der folgenden nicht einschränkenden Beispiele beschrieben werden, die auch eine Veranschaulichung der Erfindung sind und nicht als eine Beschränkung dieser Erfindung betrachtet werden sollen, wobei viele offensichtliche Variationen davon möglich sind, ohne ihren Erfindungsgedanken zu verlassen.
BEISPIELE
Beispiel 1 – Herstellung der Reaktantenlösungen
Chondroitinsulfat: Das verwendete kommerzielle CIS enthält 70% 4-Sulfat und 30% 6-Sulfat; es wurden 2,5 g in 25 ml 0,1 M Natriumcarbonatlösung gelöst, um eine Endkonzentration von 100 mg/ml zu ergeben. Bei anderen Formulierungen werden höhere Konzentrationen an CIS verwendet, um Endkonzentrationen von 150, 200 oder 250 mg/ml zu ergeben.
Natriumalginat (5,0 g) wurde in 55 ml Wasser suspendiert, auf 40°C erhitzt, wonach weitere 30 ml Wasser in 10 ml-Portionen zugesetzt wurden, um die Lösung zu erleichtern und die Viskosität der fertigen Lösung zu vermindern. Die Menge an verwendetem Natriumalginat entsprach 28,3 mMolen der Einheit des Disaccharidrests von Alginat (F. Wt. = 176,2).
Das bei der verwendeten Verkapslung gemäß der vorliegenden Erfindung verwendete Polymer ist als Biodritin bekannt; eine verwendete Mischung, um die Polymerlösung herzustellen, ist 70% Natriumalginat, gemischt mit 30% CIS mit oder ohne chemisches Quervernetzen (siehe die US-Patentanmeldung mit der Seriennummer 08/877,682 und WO 98/49202). Allgemein wird eine Pulvermischung von 20 g hergestellt und gereinigt (14 g Alginat, 6 g Chondroitinsufat A). Die Mischung wird zweimal sterilisiert, wobei zunächst eine zweifache ethanolische Extraktion, gefolgt durch Trocknen und steriles Mahlen, und dann ein Einweichen in Chloroform-Ethanol verwendet wird. Die Mischung wird unter einer Sterilhaube luftgetrocknet und dann in sterile konische 25 ml-Röhrchen überführt. Die Polymerlösung wird hergestellt, indem das Pulver unter der Sterilhaube gewogen wird, wobei 1,25 g zu 25 ml einer Mischlösung aus sterilem Kulturmedium und steriler Perfluorverbindung zugegeben werden soll. Die Menge reicht aus, um eine Lösung von 4% bis 9% (Gew./Vol.) herzustellen, was sich als der vernünftigste strukturelle Konzentrationsbereich bei Tests zu Chelatierung von Calcium mit 50 mM Natriumzitratlösungen ergeben hat. Für eine Polymerlösung von 25 ml werden die folgenden Zutaten verwendet:

1. 1,0 g bis 2,0 g steriles 70/30 Biodritin-Pulver;
2. Steriles CMRL-Kulturvollmedium, supplementiert mit 10% fötalem Kälberserum, L-Glutamin und einer antibiotischen/antimykotischen Lösung, qsp 22,5 ml;
3. 2,5 ml steriles FC-43 (Perfluortributylamin) (von Sigma Chemical Company), ungefähr 5% bis 25% des Gesamtvolumens, vorteilhafterweise 5% bis 20% des Gesamtvolumens, wie etwa 10% des Gesamtvolumens.

Die Mischung wird dann unter einer Sterilhaube bei 40 Watt für eine angemessene Zeitdauer mit Ultraschall behandelt, bis eine homogene Emulsion erzielt worden ist. Das Polymer ist dann zur Verwendung fertig. Ein Kontrollpolymer wird auf die gleiche Weise hergestellt ohne die Zugabe des FC-43, wobei folglich 25 ml des CMRL-Vollmediums zu der entsprechenden Menge an Biodritin gegeben werden. Unter Verwendung dieses Aufbaus und dieser Konzentrationen wurde eine Reihe von Experimenten durchgeführt, um die Fähigkeit des Polymers als eine Immunsperre zu wirken, und die Fähigkeit der Fluorkohlenstoffverbindung, die Einschränkungen der Verkapselung als Ergebnis einer Hypoxie und einem Fehlen von Nährstoffen zu verbessern oder zu beseitigen, zu testen.
Beispiel 2 – Teilschutz von Calciumbindungsstellen
Die Gesamtblockierung der Calciumstellen in der Alginatlösung würde 6,5 ml einer 4,5 M CaCl₂-Lösung erfordern, was vom Gebrauch her unpraktisch ist. Eine 4,5 M Calciumchlorid-Stammlösung wurde 1:5 verdünnt, und es wurden Portionen der Natriumalginatlösung von 200 μl in Intervallen zugesetzt. Während der Zugaben und danach wurde die Lösung heftig gemischt mit Hilfe eine Kraftmixers, um die Bildung von Gelklumpen vollständig zu vermeiden. Acht derartige Zugaben, plus eine, wurden in einem Gesamtvolumen von 1800 μl durchgeführt, was einer Menge von 1,5 mMol an zugesetzten Calciumionen entsprach.
Es können auch Biodritin-Zubereitungen hergestellt werden, bei denen die Calciumbindungsstellen in geringerem Ausmaß geschützt sind, und zwar 25% bis 75% der obigen Angaben. Dies führt auch zu löslichen Materialien, vorausgesetzt, dass die Kopplung mit DVS nicht übermäßig ist.
Bei Anwendungen, bei denen das s-IPN-Gel hergestellt wird, ist ein Schutz der Calciumbindungsstellen nicht notwendig, da keine chemische Reaktion mit dem Alginantbestandteil von Biodritin vor dem gelbildenden Schritt auftritt.
Beispiel 3 – DVS-Kopplungsreaktion
Während das Alginatgel mit geschützten Calciumbindungsstellen kontinuierlich heftig gemischt wurde, wurden 25 ml der CIS-Lösung zugesetzt, wobei zu diesem Zeitpunkt die Viskosität der Lösung abnahm. Die Lösung wurde durch heftiges Mischen rasch homogenisiert, und das Kopplungsreagenz DVS wurde in 10 Portionen von jeweils 0,3 ml unter kontinuierlichem Mischen in Intervallen von 2–3 Minuten zugesetzt.
Nachdem die Zugabe von DVS abgeschlossen war, wurde die Mischung zwei Stunden in einem Wasserbad bei 40°C inkubiert. Am Ende dieses Intervalls hatte die Reaktionsmischung eine leicht violette Farbe; sie wurde aus dem Wasserbad genommen und über Nacht bei Raumtemperatur stehen gelassen.
Während der Reaktionsschritte war ein fortwährendes Mischen erforderlich, das leicht mit Hilfe eines elektrischen Mixers mit Klingen oder Paddeln erzielt werden kann.
Beispiel 4 – Verarbeitung und erste Reinigung
Nachdem die Reaktion abgeschlossen war, ähnelte die Mischung einer „Mousse". Zu jeder Portion dieses Materials von 100 ml wurden 15 ml 1 M NaCl und Portionen von 5 × 1 ml einer 0,63 M EDTA-Lösung zugegeben, um Calciumionen von den „egg-box"-Stellen zu entfernen. Das Mischen wurde fortgeführt, um das Lösen zu erleichtern. Schließlich wurde eine sehr visköse und bräunliche Lösung erhalten.
Die Lösung wurde in einem Eiswasserbad gekühlt, wonach Portionen von 100 ml eiskaltem Ethanol dreimal langsam unter starkem Mischen mit einem Spatel zugesetzt wurden, um das Produkt auszufällen. Ein weißes, fadenartiges Präzipitat wurde reichlich produziert; die Mischung wurde eine Stunde in einem Eiswasserbad stehen gelassen, wonach sie bei 4°C bei 6000 Upm für mindestens 20 Minuten in 250 ml-Kunststoffflaschen zentrifugiert wurde.
Beispiel 5 – Blockieren der verbleibenden aktiven Vinylgruppen
Nachdem der Überstand verworfen worden war, wurde die Zentrifugenflasche umgedreht, um überschüssige Flüssigkeit ablaufen zu lassen, das Präzipitat wurde aufgenommen und zwischen Filterpapier gepresst, wobei Handschuhe verwendet wurden. Es wurde dann in 50 ml 1 M Ethanolamin bei pH 9,4 suspendiert, dem auch 1 ml 0,63 M EDTA zugesetzt wurde. Sobald das Lösen einsetzte, wurden weitere 50 ml Ethanolaminlösung in 2 gleichen Portionen zugesetzt; kleine Klumpen wurden mit einem Spatel zerbrochen. Die Lösung wurde dann gerührt, während sie auf ungefähr 40°C erhitzt wurde, wenn eine vollständige Lösung auftrat. Der Behälter wurde mit Parafilm verschlossen und über Nacht bei Raumtemperatur stehen gelassen oder alternativ in einem Wasserbad bei 40°C für vier Stunden aufbewahrt. Es ergab sich eine goldgelbe transparente Lösung, die in ein 2 l-Becherglas zur weiteren Behandlung überführt wurde.
Beispiel 6 – Weitere Reinigung
Die Lösung aus dem vorangegangenen Schritt wurde in einem Eiswasserbad gekühlt, und nach 30 Minuten wurden Portionen von dreimal 100 ml eiskaltem Ethanol unter kräftigem Mischen mit einem Spatel zugegeben. Es bildete sich ein weißes faseriges Präzipitat, das leicht mit der Schwerkraft sedimentierte. Diese Suspension wurde eine Stunde in einem Eiswasserbad aufbewahrt, wonach sie bei 6000 Upm 20 Minuten bei 4°C wie zuvor zentrifugiert wurde. Der klare Überstand wurde verworfen und das Präzipitat wie in Beispiel 4 oben gesammelt und zwischen Filterpapier getrocknet.
Das Präzipitat wurde wieder in Portionen von 2 × 50 ml Wasser für eine dritte Ethanol-Präzipitation gelöst. Die Lösung wurde in ein 2 l-Becherglas überführt und auf Eiswasserbadtemperatur gekühlt. Nach langsamer Zugabe von Portionen von 3 × 100 ml eiskaltem Ethanol bildete sich ein weißes faseriges Präzipitat, und die Mischung wurde eine Stunde im Eiswasserbad stehen gelassen.
Das Präzipitat wurde nach einer Zentrifugation, die genauso wie in diesem Beispiel beschrieben ausgeführt wurde, gesammelt; überschüssige Flüssigkeit wurde ablaufen gelassen, es wurde zwischen Filterpapier gepresst und mit Hilfe eines Spatels in 100 ml Wasser gelöst. Die fertige Lösung war klar, sehr viskös. Sie wurde in Petrischalen gegossen, gefroren und gefriergetrocknet.
Das trockene Material, das nach Gefriertrocknung erhalten wurde, war weiß und wog im Durchschnitt 5,9 g bei dieser Beschickungsgröße. Es wurde als strahlende faserige Blätter gewonnen, die in Flocken zerbrachen. Das fertige Material ist in Wasser oder 0,15 M NaCl-Lösung vollständig löslich. Lösungen in beiden Lösungsmitteln bis zu Konzentrationen von 10–30 mg/ml bilden Gelsphären, wenn sie in eine 1%ige Calciumchloridlösung getropft werden.
Beispiel 7 – Dehydrodermale Zubereitung von Biodritin
Natriumalginat und CIS-Lösungen wurden wie in Beispiel 1 hergestellt mit der wichtigen Modifikation, dass das Lösungsmittel für beide nun Wasser war.
Die „egg-box"-Stellen wurden mit Calciumionen wie in Beispiel 2 kombiniert. Die CIS-Lösung wurde dann dem Alginat zugesetzt; die CIS-Lösung kann auch vor der Zugabe von Calciumionen zugesetzt werden. Ein kräftiger Mixer wurde verwendet, um alle Klumpen, die sich während der Schritte der Calciumchloridzugabe gebildet haben könnten, zu zerbrechen. Die sehr visköse Endmischung wurde in Petrischalen überführt, gefroren und gefriergetrocknet.
Der harte trockene Kuchen in den Petrischalen wurde dann einer Dehydrothermalbehandlung unterzogen, wie folgt: Die Petrischalen, welche die Kuchen enthielten, wurden unter einer elektrischen Haube bei 102 bis 106°C platziert und dort 24 Stunden stehen gelassen. Nach dieser Zeit, welche eine Reaktion ermöglichte, wurden die Kuchen stehen gelassen, um auf Raumtemperatur zu kühlen, und weiterverarbeitet.
An diesem Punkt wird ein Kuchen vom im Durchschnitt 6,7 g erhalten; er wird zu Pulver reduziert und in rund 75 ml Wasser suspendiert, wozu 5 bis 6 ml 0,63 M EDTA zugesetzt werden, um Calcium von den „egg-box"-Stellen zu entfernen. 10 ml 1 M NaCl werden 100 ml dieser Mischung zugesetzt, um 0,1 M NaCl herzustellen, und die Mischung wird behutsam erhitzt. Große Brocken, die sich mit einem Spatel nicht lösen würden, werden entfernt, und die Mischung wird zentrifugiert, um unlösliche Bestandteile zu entfernen.
Der klare Überstand wird durch Ethanolpräzipitation gereinigt, wie in Beispiel 6 beschrieben; insgesamt werden drei Rück-Präzipitationen durchgeführt, die erste nach Zugabe von 2 ml EDTA, um eine vollständige Entfernung von Calcium sicherzustellen. Nach der dritten Präzipitation wird der Kuchen in rund 75 ml Wasser suspendiert, und es wird behutsam erwärmt, um das Lösen zu erleichtern. Die erhaltene klare Lösung wird in Petrischalen überführt, gefroren und gefriergetrocknet. Eine typische Ausbeute aus einer derartigen Beschickung beträgt 5,6 g Endprodukt.
Das sich ergebende Pulver ist leicht wasserlöslich bei Konzentrationen von 10 bis 40 mg/ml Wasser oder 0,1 M NaCl; die Viskosität ist ein wenig geringer als die von äquivalenten Konzentrationen von Biodritin, das durch chemisch Kopolymerisation mit DVS hergestellt wurde, jedoch werden Mikrokapseln gebildet, wenn die Lösung in Calciumchlorid getropft wird.
Beispiel 8 – Herstellung von Biodritin-Poly-L-Lysin-Mikrokapseln
Stammlösungen von Biodritin-Heteropolysaccarid wurden in Konzentrationen von 10, 15, 20 mg/ml (DVS-polymerisiertes Biodritin) oder 30 mg/ml (DHT-Biodritin) in 0,15 M NaCl bei Raumtemperatur hergestellt. Die Lösung ist schnell und einfach. Die Biodritin-Heteropolysaccharidlösung wurde aus einer Spritze in eine 1,1%ige CaCl₂-Lösung unter leichtem Schütteln aus einer Höhe von ungefähr 15 cm getropft, wodurch sich Beads bildeten. Die Beads wurden über verschiedene Zeitintervalle von 5 bis 40 Minuten in der Calciumchloridlösung reifen gelassen und wurden dann verarbeitet, wie durch Sun et al. (1984) beschrieben.

i- Kurz, die Beads wurden schrittweise in 0,1% CHES (Cyclohexylethansulfonsäure) und 1,1% Calciumchlorid gewaschen; sie wurden dann 6 Minuten mit einer 0,5%igen Poly-L-Lysin-Lösung behandelt, um eine Kapsel aus Biodritin-Poly-Lysin-Komplexen auf der Oberfläche der Beads zu bilden.
ii- Die Beads wurden dann mit 0,1% CHES, 1,1% Calciumchlorid und 0,15 M NaCl in dieser Reihenfolge gewaschen; jedes Waschen dauerte 2 Minuten.
iii- Eine äußere Beschichtung aus Biodritin wird jetzt durch Inkubation der Kapseln mit einer 0,03%igen Biodritin-Heteropolysaccharidlösung für 4 Minuten aufgetragen, wonach die Kapseln ausführlich in 0,15 M NaCl gewaschen werden. Sie werden in 0,15 M NaCl bis zur Verwendung gelagert.

Bei diesem Beispiel wurden keine Zellen verkapselt; die Mikrokapseln enthielten nur Biodritin-Calciumgel und die äußeren Beschichtungen. Reine Mikrokapseln werden verwendet, um ihre Biokompatibilität in Tierversuchen zu untersuchen.
Der äußere Durchmesser der wie in diesem Beispiel hergestellten Mikrokapseln betrug 4–5 mm; unter Verwendung von Vorrichtungen, bei denen ein koaxialer Luftstrom um die Spitze der Spritzennadel strömt, können sehr viel kleinere Mikrokapseln hergestellt werden, wie denjenigen, die in diesem Bereich versiert sind, bekannt ist.
Beispiel 9 – Herstellung von Biodritin als einem physikalischen s-IPN-Gel
Bei diesem Beispiel wurden Lösungen hergestellt, welche die folgenden Konzentrationen von Bestandteilen aufwiesen: Das Lösungsmittel war 0,15 M Natriumchlorid; die Alginatkonzentration war auf 3,0% festgesetzt, und die verwendeten CIS-Konzentrationen betrugen 1,5%, 3% bzw. 6%, was CIS/Alginat-Gewichtsverhältnisse von 0,5:1, 1:1 und 2:1 ergab. Das semi-interpenetrierende Polymernetzwerk wurde in Form von Beads hergestellt, indem jede dieser Lösungen in eine Lösung aus Calciumchlorid bei 1,1% getropft wurde, wie oben beschrieben.
Die Beads wurden aus einer Spritzennadel mit einem Maß von 20 (20 Gauge) bei einer Rate von 1 ml/min (peristaltische Pumpe) gebildet; diese Nadel wurde in eine größere eingeführt, die mit einer Luftpumpe verbunden war, so dass Luft um die Tropfnadel geblasen werden konnte, um Mikrobeads zu bilden, indem die ausfließende Flüssigkeitssäule, die in eine Calciumchloridlösung tropfte, zu fraktionieren. Eine typische Zubereitung bestand aus sich bildenden Beads von 3 ml von jeder Lösung, die in 30 ml 0,15 M NaCl in einem kleinen Becherglas aufgefangen wurden. Unmittelbar danach wurden die Beads in ein 50 ml-Zentrifugenröhrchen übergeführt, wo sie mit der Calciumlösung 10 Minuten lang sanft gemischt wurden. Bei diesem Schritt können die Zeiträume von wenigen Minuten bis zu sehr viel längeren, wie beispielsweise 40 Minuten variieren, was von dem Ausmaß des Gelierens abhängt, das gewünscht ist.
Nach diesem Zeitraum werden die Beads bei niedriger Geschwindigkeit (1000 Upm, 3 Minuten) abzentrifugiert, in ein 15 ml-Zentrifugenröhrchen übertragen und mit 0,15 M NaCl gewaschen. Es wurde eine Abfolge von Waschschritten wie in Beispiel 8 beschrieben angewendet. Es kann eine Polylysinkapsel auf die Beads aufgetragen werden, genau so wie oben beschrieben. Biodritin-Beads vom s-IPN-Typ wurden auf ihre Stabilität ohne die Polylysinkapsel untersucht, indem sie 140 Stunden bei Raumtemperatur in 0,15 M inkubiert wurden. Eine Analyse des Austretens von CIS und Alginat, durchgeführt durch Ultraviolett-Spektrophotometrie bei 204 und 215 nm, zeigt, dass bei den Beads, die 6% CIS enthielten, nur 6% des Gesamtalginats in den Beads innerhalb der ersten 50 Stunden austraten, während 4% Alginat aus den Beads mit 3% CIS und ca. 1% aus Beads mit 1,5% CIS austraten, was ungefähr das gleiche Ausmaß an Austreten ist, wie bei Kontroll-Beads mit Alginat beobachtet wurde. Das Austreten von CIS andererseits war in allen Fällen minimal, nämlich weniger als 1%. Nach diesem Zeitraum wurden die Beads weiterhin durch tägliche Wechsel von 0,15 NaCl gewaschen. Die austretenden Mengen nahmen ab und erreichten Null für alle Beads bis zum dritten Wechsel, d.h. nach 72 Stunden. Dieser Werte zeigen, dass durch s-IPN gebildete Beads stabil sind und ihre Zusammensetzung nach dem Gelieren behalten. Die in diesem Beispiel gebildeten Beads weisen einen mittleren Durchmesser von 550 μm auf.
Beispiel 10 – s-IPN-Gel, gebildet aus einer Mischung aus DVS-CIS-quervernetztem Biodritin und zugegebenem CIS
Eine Biodritin-Lösung von 2% (Gew./Vol.) wurde in 0,15 M NaCl hergestellt. Die verwendete Biodritin-Pulverzubereitung wies einen Gehalt an DVS-quervernetztem CIS von ca. 2 Gew.-% auf, der durch Zugabe von CIS auf 15% anstieg. Die fertige Lösung wies folglich eine Zusammensetzung von 2,0% Alginat und 0,3% CIS, bezogen auf Gew./Vol., auf. Die Beads wurden hergestellt, indem diese Lösung in eine 1,1%ige Calciumchloridlösung getropft wurde, gefolgt durch 40 Minuten Inkubation in derselben Lösung. Eine zusätzliche Behandlung schloss die Bildung einer Poly-L-Lysinkapsel ein, die weiter mit Biodritin beschichtet war, und einen Waschschritt, wie in Beispiel 8 beschrieben. Die auf diese Weise hergestellten Beads und Kapseln wiesen Eigenschaften auf, die mit denen von Beads mit ähnlicher Zusammensetzung, die aus Alginat und CIS wie in Beispiel 9 hergestellt wurden, identisch waren. Sie können ganz genauso behandelt werden, wie die in den nächsten Beispielen beschriebenen Beads.
Beispiel 11 – Sterilisierung von Mikrokapseln
Zusätzlich zu der Möglichkeit, die Biodritin-Heteropolysaccharidlösung, ebenso wie andere Lösungen, die in der Kapselzubereitung durch Membranfiltration vor dem Gelierungsschritt verwendet wurden, zu sterilisieren, können auch Biodritin-Mikrokapseln durch Behandlung mit 70% Isopropanol in 0,15 M NaCl sterilisiert werden. Folglich wurden Biodritin-Mikrokapseln schrittweise durch eine Lösung aus Isopropanol/0,15 M NaCl mit ansteigenden Isopropanolkonzentrationen behandelt, wie folgt: 25%, 50% und 70%, alle Werte beziehen sich auf Vol.-%. Die ersten beiden Behandlungen wurden jeweils 30 Minuten lang angewendet, um eine langsame Dehydration der Kapseln durch ansteigende Konzentration von Isopropanol zu ermöglichen. Wenn sie 70% Isopropanol unterzogen wurden, wurden die Mikrokapseln für bis zu 4 Tage bei Raumtemperatur stehen gelassen.
Unter diesen Bedingungen schrumpften sie auf ungefähr die Hälfte des ursprünglichen Durchmessers, wobei sie Falten auf der Oberfläche zeigten. Wenn sie 4 Tage später durch absteigende Konzentrationen an Isopropanol in der umgekehrten Reihenfolge wie oben bis zu einer Konzentration von 0,15 M NaCl rehydratisiert wurden, gewannen sie die ursprüngliche Kugelform zurück ohne Deformationen der Gestalt, Brüche oder Ablösungen der äußeren Schicht. Die Untersuchung der Oberfläche wurde mit Hilfe einer Lupe mit verschiedenen Vergrößerungsstufen durchgeführt.
Im Unterschied dazu schrumpften Mikrokapseln, die nur mit Alginat hergestellt worden waren, die auf die gleiche Weise und in parallelen Experimenten behandelt wurden, auf ein Drittel des ursprünglichen Volumens und gewannen ihre anfängliche Kugelform nicht zurück. Die meisten wurden zu Umdrehungselipsoiden mit intakten Oberflächen, die Falten aufwiesen, die mit der Zeit nicht verschwanden.
Mikrokapseln, die wie in den Beispielen 8 und 9 behandelt wurden, wurden ebenfalls in Mäuse implantiert, um ihre Biokompatibilität zu testen.
Beispiel 12 – Unversehrtheit der äußeren Mikrokapselmembran Biodritin/Polylysin/Biodritin)
Die Bewahrung der äußeren Membran nach Sterilisation und Rehydration wurde getestet, indem ein erheblicher Teil des Gels im Inneren der Mikrokapseln durch Behandlung mit 0,050 M Natriumzitrat gelöst wurde.
Die Mikrokapseln wurden mit Natriumzitrat bei Raumtemperatur über verschiedene Zeiträume inkubiert, während sie unter einer Lupe mit hoher Vergrößerung beobachtet wurden. In Abhängigkeit von der Kapselgröße änderte sich der Zeitverlauf der Ereignisse, für eine Gruppe von größeren Mikrokapseln wurden jedoch die folgenden Ergebnisse erhalten: Nach rund 10 Minuten war der zentrale Kern von einer schmalen, sehr transparenten Zone umgeben, wobei letztere durch die Außenmembran begrenzt wurde.
Nach 30 Minuten Beobachtungszeit erreichte die Löslichkeit des Biodritin-Gels durch die Entfernung von Calcium mittels Zitrat ungefähr 50% des Kapseldurchmessers, wobei die äußere Membran intakt war. Ein Mischen der Mikrokapselsuspension durch Drehung des Kolbens ermöglicht es, die wellenwerfende Bewegung der intakten Außenmembran zu beobachten, was auch zeigt, dass sie permeabel ist, was einer Flüssigkeit erlaubt, sich ein und aus zu bewegen.
Aufgrund des Fehlens der Unterstützung der darunterliegenden Gelstruktur, gelöst durch die Wirkung von Zitrat, kann die Membran durch starkes Ansaugen mit einer Pipette aufgebrochen werden.
Beispiel 13 – Mikrokapselfärbung mit Alcianblau
Alcianblau ist ein gutbekanntes Färbemittel für Chondroitinsulfat (Turnbull, 1993); wir haben festgestellt, dass es auch Alginat färbt, wenn auch mit geringerer Intensität. Die Mikrokapseln wurden in 0,5% Alcianblau in 2% Essigsäure 20 Minuten gefärbt; ein Entfärben fand in 2% Essigsäure während sich wiederholender Waschungen statt. Wie erwartet, ergaben Biodritin-Mikrokapseln ein tieferes Blau als Alginatkapseln. Wenn Biodritin-Mikrokapseln, hergestellt wie in Beispiel 8, in zwei Hälften geschnitten und gefärbt werden, färbt sich das Innere der Kapseln intensiver als das Äußere, was anzeigt, dass die Außenmembran eine Wirkung auf die Diffusion des Färbemittels in das Kapselinnere ausübt.
Beispiel 14 – Herstellung von strukturierten „Spaghetti"-artigen Zylindern aus Biodritin zur Zell- und Gewebeimplantation
Eine neue Verwendung der Biodritin-Erfindung ist die Herstellung von strukturierten Spaghetti-artigen Zylindern, die Zellen oder Gewebe zur Implantation enthalten, was selbst eine hier zum erstem Mal zu beschreibende Erfindung ist, sogenannte Biodritin-Spaghetti. Diese Biodritin-Spaghetti werden als „strukturiert" bezeichnet, da der dünne Gelzylinder, der den Namen Spaghetti erhalten hat, eine innere Struktur aufweist, die aus einem Strang aus einer Baumwollschnur oder alternativ einer Schnur aus chirurgischem Nahtmaterial gebildet ist. Die Baumwollschnur weist eine Vielzahl von sehr feinen seitlichen Ausläufern auf, wie kurze Äste bei einem langen Stängel, die von der Oberfläche der Schnur hervorspringen und in das Gel eingebettet sind. Das chirurgische Nahtmaterial weist derartige Äste nicht auf, sie können jedoch durch Aufkratzen der Oberfläche der Schnur mit einer Messerklinge geschaffen werden, bevor es sterilisiert wird. Diese seitlichen Ausläufer vom zentralen Kern der Schnur ma chen eine zusätzliche Fläche zur Adhäsion zwischen der Gelmatrix und dem zentralen Kern verfügbar, was die Struktur auf eine ähnliche Weise wie die Eisendrähte in Beton verstärkt.
Strukturierte Biodritin-Spaghetti werden wie folgt hergestellt:

1. Eine sterilisierte Baumwollnähfadenschnur mit einer Größe von 50 oder dünner wird in einen sterilen Polyethylenkatheter von 10 bis 20 cm und mit dem gewünschten Durchmesser – gewöhnlich Größe 60, jedoch kann auch Größe 90 mit dünneren Schnüren verwendet werden – bis zu dem Punkt eingeführt, an dem die Schnur die Nadel erreicht, die selbst mit einer Spritze verbunden ist. Eine Schnur aus chirurgischem Nahtmaterial kann anstelle der Baumwollschnur mit gleichwertigen Ergebnissen verwendet werden. Die Schnur sollte sich über das freie Ende des Katheterschlauchs 4 bis 5 cm hinaus erstrecken, so dass sie im späteren Verlauf des Verfahrens gehandhabt, verankert oder zurückgehalten werden kann (siehe 2A).
2. Ein Biodritin-Heteropolysaccharidlösung von gewünschter Konzentration, beispielsweise zwischen 0,5 und 3,0%, in dem erforderlichen Lösungsmittel (Salzlösung, Kulturmedium oder Hank-Medium), und welche die gewünschte Zell- oder Gewebezubereitung enthält, wird in den Katheterschlauch durch Spritzenansaugung durch den Katheter eingeführt, wobei die Schnur an ihrem Platz bleibt. Nachdem eine vorgegebene Länge des Katheters mit der Lösung gefüllt ist, werden die Katheterspitze und die Verlängerung der Schnur kurz mit Lösungsmittel gespült, und die Anordnung ist zur Bildung der Spaghetti bereit.
3. Strukturierte Spaghetti werden gebildet wie folgt: Der Katheter, der mit Biodritin-Heteropolysaccharidlösung, welche die Zellen enthält, gefüllt und mit der Spritze verbunden ist, wird rasch in eine Calciumchloridlösung in einer großen Petrischale oder einem flachem Tablett platziert, und der Spritzenstempel wird gedrückt, so dass der Katheter sich kontinuierlich in der Calciumchloridlösung vorwärts bewegt. Wenn die Biodritin-Heteropolysaccharidlösung den Katheter verlässt, tritt sie in unmittelbaren Kontakt mit Calciumionen und bildet sofort ein zylindrisches Gel um die Baumwollschnur oder die Schnur aus chirurgischem Nahtmaterial. Wenn die gesamte Biodritin-Heteropolysaccharidlösung in dem Katheter ausgestoßen ist, wird man mit einem zylindrischen Gel, das um die Schnur herum gebildet ist, zurückgelassen, dessen Ausdehnung durch die Menge an Biodritin-Heteropolysaccharidlösung bestimmt wird, die sich ursprünglich in dem Katheter befunden hat. An jedem Ende des Biodritin-Gels gibt es ein kontinuierliches Stück Schnur, das jetzt verwendet wird, um den Gelzylinder während der weiteren Verarbeitung zu halten.
4. Die Biodritin-Spaghetti werden jetzt in der Calciumchloridlösung für eine vorgegebene Zeitdauer liegen gelassen, um das Gel zu stärken; diese Zeitdauer variiert je nach Art des gewünschten Gels und beträgt einen Wert im Bereich von 5–40 Minuten. Nach der Inkubation mit Calciumionen werden die Biodritin-Spaghetti genauso wie unter Beispiel 8 beschrieben behandelt, um eine Biodritin-Poly-L-Lysin-Membran zu bilden, welche die Spaghettioberfläche bedeckt. Diese Außenmembran aus Biodritin/Polylysin/Biodritin hilft, das Gel zu unterstützen und steuert die Permeabilität nach der Molekülgröße.
5. Wenn Langerhans'sche Inselzellen oder andere Zellen oder Gewebe in den Biodritin-Spaghetti suspendiert werden, verteilen sie sich selbst in dem doppelzylindrischen Raum, der in den Grenzen der Oberfläche der Baumwollschnur oder der Schnur aus chirurgischem Nahtmaterial auf der Innenseite und der Biodritin/Polylysin/Biodritin-Membran auf der Außenseite enthalten ist, wie in 2A gezeigt. Die Anzahl an Inseln, die pro zylindrischer Volumeneinheit enthalten ist, kann durch die Inselsuspension gesteuert werden, die ursprünglich in der Biodritin-Lösung hergestellt wurde. Die biokompatible Biodritin-Gelstruktur, welche die Masse der Spaghetti bildet, stützt die Inseln weg voneinander und verhindert, dass sie zusammenklumpen, wodurch eine zentrale Nekrose in Inselaggregaten vermieden wird.
6. Die Biodritin-Spaghetti mit den Schnurverlängerungen an jedem Ende können einzeln implantiert werden, oder sie können vor einer Implantation an den Schnurenden miteinander verschnürt werden, wie in 2B gezeigt. Auf diese Weise kann eine sehr viel größere Masse an Zellen in einen ziemlich begrenzten Raum implantiert werden, jedoch unter Bedingungen, welche die einzelnen Spaghetti bewahren.
7. Eine weitere Ausführung der vorliegenden Erfindung ist, dass eine Gruppe von Biodritin-Spaghettisträngen mit Zellen, zusammengebunden wie in 3B gezeigt, in einem porösen, stützenden und biokompatiblen Außenzylinder platziert werden, der aus Venen oder Arterien eines Tiers oder aus dem Empfänger selbst präpariert wurde. Einmal angebracht in einem derartigen biokompatiblen Behälter, um eine Art von Kartusche mit lebendem Gewebe zu bilden, können die Biodritin-Spaghettistränge in einen Patienten implantiert werden. Eine mögliche und interessante Alternative, die mit dieser Erfindung vorgeschlagen wird, ist durch die Nabelnarbe derart, dass schließlich Ersatzkartuschen unter Verwendung einer ziemlich einfachen chirurgischen Technik ausgetauscht werden können.
8. Unter den oben beschriebenen Herstellungsbedingungen würden Biodritin-Spaghetti mit einer Gellänge, die 10 cm entspricht, die folgenden ungefähren Dimensionen aufweisen (4): A) Gellänge – 100 mm; B) Gesamtinnendurchmesser – 0,76 mm; C) Durchmesser der Baumwollschnur – 0,20 mm; D) Dicke des Biodritin-Gelzylinders (B bis C) – 0,50 mm; Volumen des Biodritin-Gels – 42,2 mm³ oder 4,22 mm³ pro linearer Zentimeterlänge.

Beispiel 15 – Implantate von Biodritin-Mikrokapseln in Tiere: Biokompatibilität
Biodritin-Mikrokapseln mit einem Durchmesser von 4–5 mm wurden Mäusen intraperitoneal implantiert, zwei Kapseln pro Maus, zwei Mäuse pro Gruppe, was chirurgischen Standardverfahren und genehmigten Protokollen folgte.
Nach Zeiträumen von einer Woche, einem Monat und drei Monaten nach Implantation wurden die Kapseln aus den Tieren entfernt. Es zeigte sich, dass die implantierten Kapseln nach einer Woche in der Peritonealhöhle frei und sauber waren und keine Anhaftung aufwiesen; es konnte keine entzündliche Reaktion in oder um die Stelle herum, wo sie gefunden wurden, beobachtet werden.
Ähnliche Ergebnisse wurden für die Mikrokapseln erhalten, die für einen Monat oder drei Monate intraperitonal in Mäusen blieben. Die Kapseln zeigten eine saubere, blendende Oberfläche, frei von jeglichen Anhaftungen. Ebenso wie bei den einwöchigen Experimenten wurde keine entzündliche Reaktion bemerkt. 4 in USSN 08/877,682 zeigt eine Kapsel, die aus einer Maus drei Monate nach intraperitonealer Implantation entfernt wurde. Eine histologische Untersuchung der Präparationen unterstützte diese Schlussfolgerung vollständig: Es wurden keine Zellen an der Oberfläche der Beads nach intraperitonealer Implantation für 8 Tage, 1 Monat und 3 Monate gefunden.
Folglich wurde die Biokompatibilität dieses neuen Materials begründet, wie es aufgrund des ubiquitären Vorkommens von Chondroitinsulfat im Tierreich und aufgrund des für Chondroitinsulfat gezeigten inhärenten Fehlens einer Immunogenität erwartet wurde.
Beispiel 16 – Chirurgischer Anstrich oder Spray mit Biodritin zum Schutz von chirurgischen Nähten.
Bei einer anderen Ausführung der vorliegenden Erfindung wird eine Biodritin-Heteropolysaccharidlösung in einer Konzentration von 0,8 bis 1,5% (Gew./Vol.) in Salzlösung auf und um eine chirurgische Naht gestrichen; unmittelbar danach wird eine 1%ige (Gew./Vol.) Calciumchloridlösung kurz als als ein Nebel über die angestrichene Fläche gesprüht. Es bildet sich unverzüglich ein Biodritin-Gel über der angestrichenen Fläche, das vor einwandernden Zellen oder vor einem Anhaften an benachbartem Gewebe schützt. Dies ist mit wichtigen Anwendungen in der Abdominalchirurgie verbunden, wenn sich unerwünschte Anhaftungen nach chirurgischen Verfahren bilden können. Als eine alternative Art der Anwendung kann die Biodritin-Heteropolysaccharidlösung über und um die chirurgische Naht herum gesprüht werden, gefolgt vom Aufsprühen der Calciumchloridlösung, um das Biodritin-Gel zu bilden.
Eine dritte Art und Weise der Anwendung von Biodritin ist, die Biodritin-Heteropolysaccharidlösung mit einem unlöslichem Calciumsalz, wie etwa Tricalciumzitrat zu mischen, wodurch eine einheitliche Suspension des Calciumsalzes gebildet wird, und dieses unmittelbar vor der Anwendung mit einer wässrigen Lösung aus dem δ-Lakton von Glukonsäure zu mischen, das langsam zu Glukonsäure hydrolysiert, was die Calciumionen von dem Zitrat löst, wodurch das Biodritin-Gel in situ gebildet wird. Diese Formulierung wird „internes Gelieren" genannt und ist durch Johansen und Fink (1988) eingesetzt worden, um Bakterienzellen zu verkapseln. Um diese Formulierung herzustellen, werden die folgenden Verhältnisse empfohlen: Zu jeweils 8 ml Biodritin-Heteropolysaccharidlösung (beispielsweise 2,5%) gibt man 1 ml Tricalciumzitratlösung (11,4 mg/ml) und schließlich 1 ml Glukonolakton (10 mg/ml). Nach Zugabe des Glukonolaktons findet das Inlösunggehen von Calcium innerhalb von Minuten statt, wenn das Gel beginnt, sich zu bilden. Dies ist die bevorzugte Ausführung dieser Anwendung.
Zusätzliche Beispiele werden auch dargestellt, wobei die perfluorierten Substanzen in die Biodritin-Polymerformulierung aufgenommen werden. Genauer gesagt werden die Experimente in drei Grundvoraussetzungen zerlegt: Erstens, die Fähigkeit von FC-43 oder von jedem Perfluorkohlenwasserstoffderivat, eine erhöhte Gewebedichte in Verkapselungsvorrichtungen zu ermöglichen. Zweitens, die Wirkung, dass FC-43 oder jedes Perfluorkohlenwasser stoffderivat, das in die Polymermatrix eingeschlossen ist, auf den Gesamtzustand von verkapselten Zellen und Geweben ausübt. Drittens, die Fähigkeit, einen Diabetes in Versuchtieren unter Verwendung sowohl von Kontroll- als auch perfluorierten Verkapselungsvorrichtungen aufzuheben.
Beispiel 17 – Die Fähigkeit von FC-43 und jedem Perfluorkohlenwasserstoffderivat, die Gewebedichte in Verkapselungsvorrichtungen zu erhöhen.
Das erste Experiment behandelt die ersten beiden Vorraussetzungen. Achtzigtausend (80000) menschliche Insel-Äquivalente (IEQ) wurden in zwei Gruppen von 40000 menschlichen Insel-Äquivalenten aufgeteilt. Jede Gruppe wurde in einer Polymerplatte verkapselt, wobei die erste eine Kontrolllösung von 3% Biodritin, die zweite eine 3%ige Biodritin-Lösung, supplementiert mit 2% FC-43, war. Die Polymermischungen wurden auf folgende Weise hergestellt: 0,75 g steriles 70/30 Biodritin-Pulver (siehe Beispiel 1) wurden zu entweder 25 ml sterilem CMRL-Kulturkomplettmedium für die Kontrollen oder zu 24,5 ml sterilem CMRL-Komplettmedium mit 0,5 ml sterilem FC-43 gegeben, das dann mit Ultraschall behandelt wurde. Die Polymerplatten wurden gebildet, indem die Insel/Polymer-Mischung in ein Dialysenröhrchen extrudiert wurde, dessen eines Ende abgeklemmt war, wobei das andere Ende abgeklemmt wurde, und dann die gesamte Röhre in 1,5% Calciumchloridlösung, hergestellt in destilliertem Wasser, eingetaucht wurde. Das Röhrchen war an Dimensionen von ungefähr 10 mm Weite × 3 mm Höhe × 20 mm Länge angepasst. Dies bedeutet einen 5- bis 7-fachen Anstieg über die heutzutage zulässige Vorrichtungsdicke. Auf der Grundlage der Anzahl an Inseln, die in der Platte verkapselt sind, wurde die Gewebedichte mit 20 bis 25% berechnet, was auch größer ist als die zuvor etablierten Standards. Die Platten wurden in Kulturkolben mit 50 ml CMRL-Komplettmedium, das alle zwei Tage gewechselt wurde, 2 Wochen lang bei 37°C belassen. Auf ähnliche Weise wurde ein Kontroll-Kolben mit nicht-verkapselten Kontrollinseln ebenfalls unter denselben Kulturbedingungen aufbewahrt.
Bis zum Tag 5 waren alle Kontroll-Inseln tot, wobei nur die zellulären Reste in dem Kolben verblieben. Eine Färbung wurde mit Dithizon versucht, einem Lebendfärbemittel für Inseln, welches die Insel-Zink-Granula in funktionsfähigen Inseln in eine hellrote Farbe verwandeln, ohne positive Ergebnisse. Proben aus der Kontroll-Polymerplatte und den experimentellen perfluorierten Platten am Tag 7 und 14 wurden gesammelt und analysiert. Zu diesem Zeitpunkt war das Experiment beendet. Die Ergebnisse waren ermutigend. Die Kontroll- Polymerplatten zeigten die übliche zentrale Nekrose in den verkapselten Inseln, obwohl einige Zellen an der Peripherie der Polymerplatten eine annehmbare Zellmorphologie zeigten. Im Kern der Platte allerdings, in dem Bereich, wo eine Hypoxie und Anoxie die größten Werte erreichte, gab es keine lebenden Zellen, lediglich Löcher im Polymer, wo sich die Zellen einst befunden haben. Eine Färbung mit Hämatoxylin und Eosin ergab einige lebensfähige Zellen an der Peripherie, und eine Antikörperfärbung auf Insulin zeigte eine schwache Färbung in einigen dieser peripheren Inseln. Dies war zu beiden Zeitpunkten, Tag 7 und Tag 14, im Wesentlichen gleich.
Die experimentellen Platten mit FC-43 zeigten erstaunliche Befunde. Die Inseln in der Platte waren sowohl am Tag 7 als auch am Tag 14 praktisch frei von zentraler Nekrose, morphologisch waren sie gesund und strukturell einwandfrei, und in dem Kern der Platte, derjenigen Region der Polymermatrix mit dem größten Sauerstoffdefizit, gab es Inseln, die sich mit Hämatoxylin und Eosin gut färbten (1). Ebenso war die Antikörperfärbung auf Insulin schwächer. Die Hypothese, dass die Verwendung des Polymers zusammen mit dem Perfluorkohlenstoffderivat die Grenzen der Beladung mit Gewebe verbessern könnte, während die Integrität der Insel erhalten bleibt, wurde bestätigt. Im vorliegenden Fall wurden Werte für eine Gewebedichte von ungefähr 20% (Vol./Vol.) erreicht, ein Wert, der unter Bedingungen, die verwendet wurden, bis diese Erfindung erprobt wurde, unmöglich zu erreichen war. Unsere Erfindung, die darin besteht, dass eine Kombination aus unserem Polymer, nämlich Biodritin, und einem Derivat einer Perfluorverbindung in der passenden Mischung verwendet werden kann, um jeden Zell- oder Gewebetyp mit vorteilhaften Ergebnissen in Bezug auf die Lebensfähigkeit in jeder Vorrichtungsgeometrie zu verkapseln, wird deshalb für Langerhans'sche Inseln in vielflächigen Gelen gezeigt.
Beispiel 18 – Die Wirkung von FC-43 oder jedem, in die Polymermatrix eingeschlossenen Perfluorkohlenstoffderivat auf den Gesamtzustand von verkapselten Zellen und Geweben
Dieses Experiment umfasste die Transplantation von Biodritin-Mikrokapseln von 500 bis 600 μm Durchschnitt, die Inselzellen enthielten. Die Kapseln wurden aus 4% Biodritin 70/30 (siehe Beispiel 1) mit und ohne 10% (Vol./Vol.) FC-43 hergestellt. Die Kapseln wurden durch einen Luftstrahlnadeltropfengenerator hergestellt. Die Polymer/Insel-Matrix wird durch eine peristaltische Pumpe durch einen PEG-Schlauch in einen Tropfengenerator gezogen. Es wird Raumluft auf eine Seite des Generators unter Verwendung einer Luftpumpe gepumpt.
Die Polymertröpfchen bilden sich an der Spitze der Nadel, sie werden durch die Luft in ein Becherglas, das 100 ml 1,5%ige Calciumchloridlösung enthält, extrudiert. Die Beads setzen sich im Calciumchlorid 10 Minuten lang ab, dann werden sie zweimal mit 0,1 M NaCl für 2 Minuten gewaschen. Als nächstes werden sie zweimal in 0,15 M NaCl für 2 Minuten gewaschen und vor der Transplantation in einen Kulturkolben mit 50 ml CMRL-Komplettmedium über Nacht platziert. Am nächsten Tag werden sie zu gleichen Bead-Volumina in Abhängigkeit von der Anzahl von Tieren, die Transplantatempfänger sind, aliquotiert. Statistisch haben wir gefunden, dass es einen Mittelwert von 5 bis 6 Inselpartikeln pro Kapsel gibt, so dass bei Kenntnis des Volumens der Kapseln wir die Anzahl an Kapseln ableiten können und folglich die Anzahl an Inselpartikeln, die implantiert wurden.
Wir haben 8 diabetische athymische Nacktmäuse (der Diabetes induziert durch Streptozotocin) transplantiert. Die ersten beiden wurden mit jeweils 3500 menschlichen Inseläquivalenten transplantiert, und die nächste Gruppe aus 6 Tieren wurde mit jeweils 700 Ratteninseläquivalenten transplantiert. In jeder Gruppe erhielt die Hälfte der Tiere Beads mit 10% (Vol./Vol.) FC-43 und die anderen erhielten Kontroll-Kapseln ohne FC-43. Alle 8 Tiere blieben normoglykämisch, 2 für 77 Tage, d.h. bis zu dem Zeitpunkt, zu dem das Experiment planmäßig zu beenden war. Alle Tiere erlangten ein Körpergewicht mit dem normalen Wert von 22 bis 23 g zurück, litten nicht an Polyurie und erschienen optisch gesund. Der eine Unterschied, der zwischen den Kapseln, die FC-43 enthalten, und solchen ohne gesehen werden kann, ist, dass die perfluorierte Verbindungen enthaltenden Kapseln eine sehr viel engere glykämische Kontrolle beibehielten als solche ohne das FC-43. 2 zeigt die histologische Ansicht einer Kapsel, die FC-43 enthält, und Inseln, die nach 77 Tagen entfernt wurden. Man beachte, dass es mindestens 6 gut strukturierte Inseln auf dem Objektträger gibt, dass sie sich normal färben, sogar jene, die näher am Zentrum der Vorrichtung liegen, und dass es keine Zellanhaftungen an der Mikrokapsel gibt.
Beispiel 19 – Die Fähigkeit, einen Diabetes bei Versuchtieren unter Verwendung von sowohl Kontroll- als auch perfluorierten Verkapselungsvorrichtungen aufzuheben
Unsere nächste Serie von Experimenten war ein Modell eines Autoimmundiabetes an nicht-fettleibigen diabetischen Mäusen (NOD-Mäuse). Eine der Entdeckungen auf dem Weg der Forschung gemäß der folgenden Erfindung war, dass die Perfluorkohlenwasserstoffderivate auch eine merkliche lokalisierte immunsuppressive Wirkung auf Makrophagen, PMNs ausübten und teilweise als freie Radikalfänger wirkten.
Die Inseln wurden in Biodritin mit 10% (Vol./Vol.) FC-43 mikroverkapselt und in NOD-Tiere implantiert. Kontroll-Mikrokapseln enthielten Biodritin ohne FC-43 und Inseln. Eine Kontrolle des Diabetes erfolgte am 2. Tag nach Implantation. Am Tag 14 nach Implantation wurden die Tiere getötet, und es wurde eine histologische Untersuchung der Mikrokapseln durchgeführt. Die Inseln in den Kapseln mit FC-43 wiesen eine wesentlich besser organisierte Struktur auf, im Wesentlichen ohne Gebiete einer Nekrose, während diejenigen, die aus Kontrollkapseln ohne FC-43 wieder gewonnen wurden, die gut bekannten Merkmale einer zentralen und zonalen Nekrose zeigten, was durch Gebiete gezeigt wurde, in denen Zellen innerhalb der Inselstrukturen fehlen. 3 veranschaulicht diese Befunde und hebt noch einmal die Verbesserung des Überlebens und der Funktion von Inseln hervor, wenn sie in Polymermedium, das eine perfluorierte Verbindung enthält, eingekapselt werden.
Die Verwendungen der Polymermatrix, verstärkt mit Fluorverbindungen, sind zahlreich. Eine Paste, Kapseln, flache Blätter, Spaghetti-artige oder vielflächige Vorrichtungen, die Gewebe und eine perfluorierte Verbindung im Bereich von 10% (Vol./Vol.) enthalten, werden ein Überleben von Zellen und eine Funktion verleihen, die über die Zelldichten, die in Abwesenheit der Perfluorverbindung verwendet werden, reichen und darüber hinaus gehen. (Man kann die Lehren der Beispiele 2 bis 16 in Kombination mit den Beispielen 1 und 17 bis 19 verwenden, um Biodritin plus eine perfluorierte Verbindung in jeder gewünschten Form oder Fassung zu verwenden.)
Nachdem auf diese Weise die bevorzugten Ausführungen der vorliegenden Erfindung im Einzelnen beschrieben worden sind, soll verstanden werden, dass die Erfindung, die durch die beigefügten Ansprüche definiert ist, nicht durch bestimmte Einzelheiten eingeschränkt werden soll, die in der oben dargestellten Beschreibung dargelegt sind, da viele offensichtliche Variationen davon möglich sind, ohne den Erfindungsgedanken oder den Umfang der vorliegenden Erfindung zu verlassen.
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Claims

Zusammensetzung, umfassend mindestens ein Glycosaminoglycan, mindestens eine perfluorierte Verbindung und mindestens ein Alginat, wobei: das mindestens eine Glycosaminoglycan und/oder das Alginat kreuzvernetzt oder polymerisiert sind, und mindestens ein Glycosaminoglycan und das Alginat kovalent gebunden sind, wobei das Glycosaminoglycan ein Chondroitinsulfat-4 oder -6 umfasst, die perfluorierte Verbindung Perfluortributylamin (FC-43), Perfluordecalin, Perfluoroctylbromid oder bis-Perfluorbutylethen umfasst, und die Zusammensetzung Zellen oder Gewebe enthält.
Zusammensetzung wie beansprucht in Anspruch 1, wobei die perfluorierte Substanz ein emulgierter Perfluorkohlenwasserstoff ist.
Verfahren zur Herstellung einer Zusammensetzung wie beansprucht in Anspruch 1, umfassend Mischen der perfluorierten Verbindung mit dem Glycosaminoglycan und Alginat, wobei vor oder während oder nach dem Mischen das mindestens eine Glycosaminoglycan und/oder das Alginat kreuzvernetzt oder polymerisiert werden; oder das mindestens eine Glycosaminoglycan und das Alginat kovalent gebunden werden; oder das mindestens eine Glycosaminoglycan und das Alginat kreuzvernetzt oder polymerisiert werden und das mindestens eine Glycosaminoglycan und das Alginat kovalent gebunden werden, und weiterhin Zellen oder Gewebe zu dem Gemisch hinzugefügt werden.
Verwendung einer Zusammensetzung wie beansprucht in Anspruch 1 oder Anspruch 2 zur Immunoisolierung.