DE60026576T2

DE60026576T2 - VERFAHREN ZUM AUFFINDEN EINES HEILMITTELS FÜR KREBS MIT HILFE VON INTERAKTIONSDOMÄNEN VON p53 UND MORTALIN

Info

Publication number: DE60026576T2
Application number: DE60026576T
Authority: DE
Inventors: Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Renu Niihari-gun WADHWA
Original assignee: Chugai Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Chugai Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 1999-12-16
Filing date: 2000-12-15
Publication date: 2007-01-18
Anticipated expiration: 2020-12-16
Also published as: AU1891801A; ATE319996T1; EP1243923A1; US20030087263A1; DE60026576D1; EP1243923B1; EP1243923A4; WO2001044807A1

Description

Technischer Bereich
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf Verfahren des Screenens nach Heilmitteln unter Verwendung von Interaktionsregionen von p53 und Mortalin.
Hintergrund-Wissenschaft
p53 ist als eines der Schlüssel-Tumorsuppressorgene fest etabliert (Levine, A. J. (1997) Cell, 88, 323–331; Metz, T. et al. (1995) Cell, 82, 29–36). Funktionelle Inaktivierung von p53 ist ein sehr häufiges Charakteristikum von Tumoren (Harvey, D. M. und Levine, A. J. (1991) Genes Dev., 5, 2375–2385; Hainaut, P. et al. (1997) Nucleic Acids Res., 25, 151–157; Hollstein, M. et al. (1998) Mutat. Res., 405, 145–154; Moll, U. M. und Schramm, L. M. (1998) Critical Reviews In Oral Biol. Med., 9, 23–37), und die Mechanismen, durch die dies erfolgt, schließen die folgenden drei Hauptkategorien ein: (i) Mutationen von p53, die seine DNA-Bindung oder transkriptionellen Aktivierungsfunktionen aufheben; (ii) abnormale Expression von p53-interagierenden Proteinen z.B. mdm2, was zu beschleunigtem Abbau des Wildtyp-p53 oder der Stabilität des mutierten p53 führt; und (iii) nucleärer Ausschluss von Wildtyp-p53 (Bosari, S. et al. (1995) Am. J. Pathol., 147, 790–798; Iwaya, K. et al. (1995) Lab Invest., 72, 707–714; Ostermeyer, A. G. et al. (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93, 15190–15194; Kubbutat, M. H. et al. (1999) Cell Growth Differ., 10, 87–92; Stommel, J. M. et al. (1999) EMBO J., 18, 1660–1672; Unger, T. et al. (1999) EMBO J., 18, 1805–1814).
Während die ersten zwei Kategorien in den letzten zehn Jahren intensiv untersucht worden sind, bleibt die dritte schlecht verstanden. Die funktionellen Domänen von p53 schließen eine Transaktivierungsdomäne am Aminoende, eine sequenzspezifische DNA-Bindungsdomäne, eine Oligomerisierungs-/Tetramerisierungsdomäne am Carboxyende und eine regulatorische Domäne ein (Harris, C. C. (1996) J. Natl. Cancer Inst., 88, 1442–1455). Sich ansammelnde Hinweise deuten darauf hin, dass die Aktivität von p53 in großem Rahmen abhängig ist von seiner Konformation (Levine, A. J. (1997) Cell, 88, 323–331; Thomas, M. et al. (1999) Mol. Cell. Biol., 19, 1092–1100). Es ist gezeigt worden, dass die intrazelluläre Lokalisation von p53 durch nucleäre Lokalisierungssignale; einzelne Aminosäurereste wie Leu³⁰⁵, Arg³⁰⁶ und Ser³¹⁵ (Liang, S. H. und Clarke, M. F. (1999) Oncogene, 18, 2163–2166); nucleäre Export- oder Importsignale (Middeler, G. et al. (1997) Oncogene, 14, 1407–1417; Stommel, J. M. et al. (1999) EMBO J., 18, 1660–1672); und Interaktionen von p53 mit anderen Proteinen einschließlich mdm2 und Mitgliedern der hsp70-Familie (Hansen, S. et al. (1996) J. Biol. Chem., 271, 30922–30928; Selkirk, J. K. et al. (1996) Electrophoresis, 17, 1764–1771; Adler, V. et al. (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94, 1686–1691; Levine, A. J. (1997) Cell, 88, 323–331; Kamijo, T. et al. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95, 8292–8297; Zhang, Y. et al. (1998) Cell, 92, 725–734; Tao, W. und Levine, A. J. (1999) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 96, 3077–3080) bestimmt wird.
Manche mutierte p53-Proteine sind in stabiler physikalischer Assoziierung mit molekularen Chaperonen einschließlich hsp70, hsp90, Cyclophilin 40 und p23-Typen gefunden worden, die die Konformation des Proteins stabilisieren (Hinds, P. W. et al. (1987) Mol. Cell. Biol., 7, 2863–2869; Hainaut, P. und Milner, J. (1992) EMBO J., 11, 3513–3520; Lane, D. P. et al. (1993) Philos. Trans. R. So. Lond. B Biol. Sci., 339, 369–372; Merrick, B. A. et al. (1996) Biochim. Biophys. Acta, 13, 57–68; Whitesell, L. et al. (1998) Mol. Cell. Biol., 18, 1517–1524). Andere mutierte Proteine wie p53-273H und 281G binden jedoch nicht an hsc70, und daher ist es nicht klar, ob die Komplexbildung zwischen mutiertem p53 und hsc70 notwendig ist für die transformierende Funktion von mutiertem p53 (Hinds et al., 1990). Darüber hinaus ist vorgeschlagen worden, dass hsc70 zelluläre Transformierung durch Sequestrierung von Wildtyp-p53-Protein ermöglichen kann (Hinds, P. W. et al. (1990) Cell Growth Differ., 1, 571–580). Vor kurzem hat der hier genannte Erfinder gezeigt, dass mot-2, ein Mitglied der hsp70-Familie, mit Wildtyp-p53 interagiert (Wadhwa, R. et al. (1998) J. Biol. Chem., 273, 29586–29591).
Die Mortaline mot-1 und mot-2 wurden von normalen beziehungsweise unsterblichen Mauszellen cloniert (Wadhwa, R. et al. (1993) J. Biol. Chem., 268, 6615–6621; Wadhwa, R. et al. (1993) J. Biol. Chem., 268, 22239–22242). Mortalin ist auch unabhängig als PBP-74, mtHSP70 und Grp75 identifiziert worden; und ihm sind Rollen in Antigen-Prozessierung, in vivo-Nierentoxizität und Radioresistenz in Untersuchungen durch andere Gruppen zugeordnet worden (Kaul, S. C. et al. (1998) Ind. J. Exp. Biol., 36, 345–352). Gemeinsame Lokalisation von mot-2 und Wildtyp-p53 ist in vielen transformierten Zellen beobachtet worden. Mot-1, das sich von mot-2 nur durch zwei Aminosäuren am Carboxy-Terminus unterscheidet, hat pancytoplasmatische zelluläre Verteilung in normalen Zellen hat (Bhattachargya et al. JBC (1995), Bd. 270, S. 1705–1710), die kein Überlappen mit p53 gemäß Immunfärbungs-Test zeigen. Für mot-2, aber nicht mot-1 wurde gefunden, dass es Wildtyp-p53 inaktiviert (Wadhwa, R. et al. (1998) J. Biol. Chem., 273, 29586–29591).
Offenbarung der Erfindung
Das Ziel der vorliegenden Erfindung ist, Regionen zu identifizieren, die zu der Interaktion zwischen p53 und Mortalin beitragen, um dadurch Verfahren zum Screenen auf Arzneistoffe, insbesondere Krebsheilmittel, durch Ausnutzen dieser Regionen zu liefern.
Als ein Ergebnis der Durchführung von in vitro-Bindungstests von p53 und Mortalin, um die obigen Probleme zu lösen, entdeckte der Erfinder der vorliegenden Erfindung, dass die Mortalin-Proteine mot-1 und mot-2 eine gleiche p53-Bindungsfähigkeit haben und dass die Region der Aminosäurereste 253–283 des Mortalin-Proteins involviert ist in die Bindung zwischen Mortalin und p53. Zusätzlich wurde gemäß dem Ergebnis eines in vivo-Tests unter Verwendung eines auf p53 ansprechenden Reportergens gezeigt, dass das mot-2-Protein alleine p53-abhängige Transkriptionsaktivierung bemerkenswert inhibiert. Auf der Basis der Ergebnisse von Analysen unter Verwendung von verschiedenen mutierten Mortalin-Proteinen wurde nahe gelegt, dass die Interaktion zwischen dem mot-1-Protein und p53-Protein in Zellen durch eine sekundäre Struktur eingeschränkt ist, die einzigartig für mot-1 oder auf die Anwesenheit eines dritten Proteins zurückzuführen ist, das spezifisch mit mot-1 interagiert. Gemäß den Ergebnissen des in vitro-Bindungstests wurde die Region des p53-Proteins, das mit Mortalin interagiert, auf die C-terminalen Aminosäurereste 312–352 des p53-Proteins kartiert. Eine Domäne, die in cytoplasmatische Sequestrierung des p53-Proteins involviert ist, ist in dieser Region eingeschlossen, wobei von dieser Domäne angenommen wird, dass sie zur Hemmung der Migration des p53-Proteins in den Kern beiträgt, wie in Brustkrebs, Neuroblastom und Colonkrebs berichtet wird. Die obigen Ergebnisse illustrieren einen neuen Mechanismus, durch den Krebszellen das p53-Protein, das Produkt eines wichtigen Krebs-verhindernden Gens, inaktivieren. Durch Bestimmen der Interaktion zwischen dem p53-Protein und Mortalin-Protein so wie den Regionen innerhalb von jedem Protein, die in diese Interaktion involviert sind, wird insbesondere ein neues Verfahren des Screenens nach Krebsheilmitteln geliefert.
Die vorliegende Erfindung betrifft Verfahren zum Screenen nach Krebsheilmitteln unter Verwendung der interagierenden Regionen von p53 und Mortalin, und spezieller liefert die vorliegende Erfindung:

(1) ein Verfahren zum Screenen auf Kandidatenverbindungen von Krebsheilmitteln umfassend die Schritte von:
(a) Inkontaktbringen eines Peptids, umfassend die Aminosäurereste 253 bis 282 einer Aminosäuresequenz des menschlichen mot-1-Proteins, mit einem Peptid, umfassend die Aminosäurereste 312 bis 352 einer Aminosäuresequenz des menschlichen p53 in der Anwesenheit einer Testprobe;
(b) Nachweisen der Bindung zwischen den Peptiden; und
(c) Auswählen der Verbindung, die die Bindung zwischen den Peptiden im Vergleich zur Bindung, die in der Abwesenheit der Testprobe auftritt, schwächt;
(2) ein Verfahren zum Screenen auf Kandidatenverbindungen von Krebsheilmitteln, umfassend die Schritte von:
(a) Inkontaktbringen einer Testprobe mit einer Zelle, die mit den folgenden Vektoren transformiert wurde:
(i) einem Vektor, enthaltend eine DNA, die ein Peptid, umfassend die Aminosäurereste 253 bis 282 einer Aminosäuresequenz des menschlichen mot-1-Proteins, codiert;
(ii) einem Vektor, enthaltend eine DNA, die ein Peptid, umfassend die Aminosäurereste 312 bis 352 einer Aminosäuresequenz des menschlichen p53, codiert, wobei das Peptid den auf menschliches p53 ansprechenden Promotor aktiviert; und
(iii) einem Vektor, enthaltend den auf menschliches p53 ansprechenden Promotor und ein Reportergen, das stromabwärts davon funktionell gebunden ist;
(b) Nachweisen der Aktivität des Reportergens in der Zelle; und
(c) Auswählen der Verbindung, die die Reporterexpression im Vergleich zu jener, die in der Abwesenheit der Testprobe auftritt, verstärkt;
(3) einen Kit zum Screenen auf Kandidatenverbindungen von Krebsheilmitteln, umfassend:
(a) ein Peptid, umfassend die Aminosäurereste 253 bis 282 einer Aminosäuresequenz des menschlichen mot-1-Proteins; und
(b) ein Peptid, umfassend die Aminosäurereste 312 bis 352 einer Aminosäuresequenz des menschlichen p53;
(4) einen Kit zum Screenen auf Kandidatenverbindungen von Krebsheilmitteln, umfassend:
(a) einen Vektor, enthaltend eine DNA, die ein Peptid, umfassend die Aminosäurereste 253 bis 282 einer Aminosäuresequenz des menschlichen mot-1-Proteins, codiert;
(b) einen Vektor, enthaltend eine DNA, die ein Peptid, umfassend die Aminosäurereste 312 bis 352 einer Aminosäuresequenz des menschlichen p53, codiert, wobei das Peptid den auf menschliches p53 ansprechenden Promotor aktiviert; und
(c) einen Vektor, enthaltend den auf menschliches p53 ansprechenden Promotor und ein Reportergen, das stromabwärts davon funktionell gebunden ist;
(5) eine Verbindung, die durch das Verfahren von (1) oder (2) isoliert wurde;
(6) ein Arzneimittel, umfassend die Verbindung von (5) als einen aktiven Bestandteil; und
(7) das Arzneimittel von (6), wobei die Zusammensetzung ein Krebsheilmittel ist.

Die vorliegende Erfindung liefert Verfahren zum Screenen auf Kandidatenverbindungen von Krebsheilmitteln durch Ausnutzen der interagierenden Regionen von p53 und Mortalin-Protein. Das Screenen der vorliegenden Erfindung hat verschiedene Vorteile gegenüber einem Screenen, das Voll-Längen-Proteine ausnutzt. Zum Beispiel ist die Herstellung leichter und wirtschaftlicher, da Peptide für das Screenen verwendet werden, die kürzer als Voll-Längen-Proteine sind. Zusätzlich können stärkere Aktivitäten während des Screenens nachgewiesen werden als nachgewiesen werden, wenn die Voll-Längen-Proteine verwendet werden, was darüber hinaus effizienteres Screenen ermöglicht. Darüber hinaus wird die Entwicklung von Arzneistoffen mit hoher Spezifität auf Grund der Verwendung von interagierenden Regionen erwartet.
Eine Ausführungsform des Verfahrens zum Screenen der vorliegenden Erfindung verwendet die Bindung der interagierenden Regionen von p53 und Mortalin-Protein als einen Index. Genauer umfasst das Verfahren: (a) Inkontaktbringen eines Peptids, umfassend die Aminosäurereste 253 bis 282 der Aminosäuresequenz des menschlichen Mortalin-Proteins mit einem Peptid, umfassend die Aminosäurereste 312 bis 352 der Aminosäuresequenz des menschlichen p53 in der Anwesenheit einer Testprobe; (b) Nachweisen der Bindung zwischen diesen Peptiden; und (c) Auswählen der Verbindung, die die Bindung zwischen diesen Peptiden im Vergleich zu jener, die in der Abwesenheit der Testprobe auftritt, schwächt.
Es gibt keine besondere Limitierung für die zu verwendende Testprobe und sie kann zum Beispiel Zellkulturüberstände, fermentierende bakterielle Produkte, Extrakte von Meeresorganismen, Pflanzenextrakte, Extrakte von prokaryontischen Zellen, Extrakte von eukaryontischen Einzellern, tierische Zellextrakte oder deren Genbanken, aufgereinigte oder rohe Proteine, Peptide, Nicht-Peptid-Verbindungen, synthetische Verbindungen von niedrigem Molekulargewicht und natürliche Verbindungen einschließen.
Das Mortalin-Peptid zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung, das mit einer Testprobe in Kontakt gebracht werden soll, ist nicht in irgendeiner Weise beschränkt, so lange es die Aminosäurereste 253 bis 282 der Aminosäuresequenz des menschlichen mot-1-Proteins einschließt (diese Region ist dem menschlichen mot-1-Protein und menschlichen mot-2-Protein gemeinsam). Vorzugsweise umfasst das Peptid 600 Aminosäurereste oder weniger der Aminosäurereste dieser Proteine, mehr bevorzugt 300 Aminosäurereste oder weniger und noch mehr bevorzugt 100 Aminosäurereste oder weniger (z.B. 50 Aminosäurereste oder weniger). Darüber hinaus existieren keine besonderen Limitierungen für das p53-Peptid für die Verwendung in der vorliegenden Erfindung, so lange es die Aminosäurereste 312 bis 352 der Aminosäuresequenz von menschlichem p53 einschließt. Vorzugsweise umfasst das Peptid 300 Aminosäurereste oder weniger der Aminosäurereste dieser Proteine, mehr bevorzugt 200 Aminosäurereste oder weniger und noch mehr bevorzugt 100 Aminosäurereste oder weniger (z.B. 50 Aminosäurereste oder weniger). Vorzugsweise ist mindestens eines der im Screenen der vorliegenden Erfindung verwendeten Peptide nicht ein Voll-Längen-Protein. Diese Peptide können von natürlichem Ursprung sein oder können in Übereinstimmung mit bekannten Peptidsynthese-Verfahren hergestellt werden.
Zusätzlich können diese Peptide mit einer Testprobe zum Beispiel in der Form von aufgereinigten Peptiden, solubilisierten Peptiden, an einen Träger gebundenen Peptiden oder Peptiden, die an andere Peptide fusioniert sind, in Kontakt gebracht werden.
Die Herstellung dieser Peptide als rekombinante Peptide kann speziell, wie unten beschrieben, durchgeführt werden. Ein Gen, das das Zielpeptid codiert, wird in einen exogenen Genexpressionsvektor wie pSV2neo, pcDNA3 oder pCD8 inseriert, um das Gen in Tierzellen und so weiter zu exprimieren. Alle allgemein verwendeten Promotoren können für die Expression verwendet werden, einschließlich zum Beispiel des frühen SV40-Promotors (Rigby in Williamson (Hrsg.), Genetic Engineering, Bd. 3, Academic Press, London, S. 83–141 (1982)), des EF-1α-Promotors (Kim et al., Gene 91, S. 217–223 (1990)), des CAG-Promotors (Niwa et al., Gene 108, S. 193–200 (1991)), des RSV-LTR-Promotors (Cullen, Methods in Enzymology 152, S. 684–704 (1987)), des SRα-Promotors (Takebe et al., Mol. Cell. Biol. 8, S. 466 (1988)), des sehr frühen CMV-Promotors (Seed und Aruffo, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84, S. 3365–3369 (1987)), des späten SV40-Promotors (Gheysen und Friers, J. Mol. Appl. Genet. 1, S. 385–394 (1982)), des späten Adenovirus-Promotors (Kaufman et al., Mol. Cell. Biol. 9, S. 946 (1989)), des HSV-TK-Promotors und so weiter.
Beispiele für Verfahren zum Einbringen eines exogenen Gens in Tierzellen, um Expression des Gens zu ermöglichen, schließen das Elektroporations-Verfahren (Chu, G. et al., Nucl. Acids Res. 15, S. 1311–1326 (1987)), das Calciumphosphat-Verfahren (Chen, C. und Okayama, H., Mol. Cell. Biol. 7, S. 2745–2752 (1987)), das DEAE-Dextran-Verfahren (Lopata, M. A. et al., Nucl. Acids Res. 12, S. 5707–5717 (1984); Sussman, D. J. und Milman, G., Mol. Cell. Biol. 4, S. 1642–1643 (1985)), das Lipofectin-Verfahren (Derijard, B., Cell 7, S. 1025–1037 (1994); Lamb, B. T. et al., Nature Genetics 5, S. 22–30 (1993); Rabindran, S. K. et al., Science 259, S. 230–234 (1993)) und so weiter ein; es kann jedoch jedes geeignete Verfahren verwendet werden. Die Peptide der vorliegenden Erfindung können als Fusionspeptide exprimiert werden, die durch Einbringen einer Erkennungsstelle (Epitop) für einen monoclonalen Antikörper mit einer vorbestimmten Spezifität in den N-Terminus oder C-Terminus eines Peptids der vorliegenden Erfindung eine Erkennungsstelle für einen monoclonalen Antikörper aufweisen. Kommerziell erhältliche Epitop-Antikörper-Systeme können verwendet werden (Experimental Medicine 13, S. 85–90 (1995)). Vektoren, die Fusionspeptide zum Beispiel mit β-Galactosidase, Maltose-bindendem Protein, Glutathion-S-Transferase, grünem Fluoreszenzprotein (GFP) und ähnlichen durch eine Multi-Clonierungsstelle exprimieren, sind kommerziell erhältlich.
Um Veränderungen in den Eigenschaften der Peptide der vorliegenden Erfindung als ein Ergebnis von deren Herstellung in der Form eines Fusionspeptids zu minimieren, ist von einem Verfahren berichtet worden, in dem die Fusionspeptide durch Einbringen von nur einem kleinen Epitop-Teil hergestellt werden, die einige bis Dutzende Aminosäuren umfassen. Beispiele schließen Epitope wie Polyhistidin (His-Markierung), Influenza-Agglutinin-HA, menschliches c-myc, FLAG, vesikuläres Stomatitisvirus-Glycoprotein (VSV-GP), T7-Gen 10-Protein (T7-Markierung), menschliches Herpes simplex-Virus-Glycoprotein (HSV-Markierung) und E-Markierung (Epitop auf einem monoclonalen Phagen) ein; diese Epitope können zusammen mit monoclonalen Antikörpern, die die Epitope erkennen, als ein Epitop-Antikörper-System zum Screenen von Proteinen verwendet werden, die an die Peptide der vorliegenden Erfindung binden (Experimental Medicine 13, S. 85–90 (1995)).
Das Screening-System, das durch die vorliegende Erfindung geliefert wird, kann als ein in vitro-Testsystem ausgeführt werden. Spezifische Beispiele schließen in vitro-Testsysteme ein, die in einem nicht-zellulären System ausgeführt werden. Genauer, ein Screenen, das die Bindung der obigen Peptidpaare als einen Index verwendet, kann durch Bindung von einem der Peptide an eine Unterlage und Zugabe des anderen Peptids und einer Testprobe dazu, Inkubieren des Gemisches, gefolgt von Waschen und Nachweisen oder Messen der Bindung des anderen Peptids an das Peptid, das an die Unterlage gebunden ist, ausgeführt werden.
Die Peptide der vorliegenden Erfindung können als aufgereinigte oder grob aufgereinigte Peptide verwendet werden, die aus Zellen, die die Peptide endogen exprimieren, Zellen, die mit einer DNA transformiert wurden, die die Peptide codiert, und Tieren oder Pflanzen, die mit einer DNA transformiert wurden, die die Peptide codiert, produziert werden.
Die Peptide, die in der vorliegenden Erfindung verwendet werden, können an eine Unterlage gebunden werden. Zum Beispiel wird zuerst eines der zwei Peptide, das aufgereinigt oder grob aufgereinigt ist, an eine Unterlage gebunden. Das Peptid kann durch konventionelle Verfahren, um Peptide an eine Unterlage zu binden, an eine Unterlage gebunden werden. Beispiele von Unterlagen, die verwendet werden können, um die Peptide zu binden, schließen unlösliche Polysaccharide wie Agarose, Dextran und Cellulose; synthetische Harze wie Polystyrol, Polyacrylamid und Silicon; und so weiter ein. Genauer gesagt können auch kommerziell erhältliche Kugeln und Platten, die aus den obigen Rohmaterialien hergestellt sind, verwendet werden. Für die Verwendung von Kugeln kann eine Säule mit den Kugeln gefüllt werden. Beispiele von Platten, die verwendet werden können, schließen Platten mit vielen Vertiefungen (Platten mit 96 Vertiefungen) und Biosensor-Chips ein.
Um Peptide an eine Unterlage zu binden, können Routineverfahren, die chemische Bindung, physikalische Adsorption und dergleichen ausnutzen, verwendet werden. Zusätzlich können Antikörper, die das Peptid spezifisch erkennen, vorher an die Unterlage gebunden werden, und die Peptide können dann durch die Antikörper an die Unterlage gebunden werden. Darüber hinaus kann die Bindung eines Peptids und einer Unterlage auch durch Avidin/Biotin-Bindung ausgeführt werden.
Bindung zwischen Peptiden wird normalerweise in einem Puffer durchgeführt. Beispiele von Puffern schließen Phosphat-Puffer, Tris-Puffer und so weiter ein. Die Bedingung für das Inkubieren schließt solche Bedingungen ein, die auf dem Fachgebiet schon wohlbekannt sind, zum Beispiel von 4°C bis Zimmertemperatur für 1 bis 24 Stunden. Waschen nach dem Inkubieren kann mit allen Lösungen ausgeführt werden, so lange die Bindung der Peptide nicht verhindert wird, und kann durch Puffer, die oberflächenaktive Substanzen enthalten, beispielhaft wiedergegeben werden. Ein Beispiel der oberflächenaktiven Substanz ist 0,05% Tween 20.
Bei der Auswahl der gewünschten Verbindung können spezifische Bindung und nicht-spezifische Bindung durch Inkubieren von jedem der Peptide und der Testprobe unter geeigneten Bedingungen, gefolgt von Waschen unterschieden werden. Jedes der Peptide kann für die Auswahl der gewünschten Verbindung an die Unterlage gebunden werden. Zum Beispiel können, wenn ein vom Mortalin-Protein abstammendes Peptid an eine Unterlage gebunden wird, nach Fixierung des Peptids ein vorgemischtes Gemisch von Peptid, das vom p53-Protein stammt, und einer Testprobe zu der Unterlage zugefügt werden, oder ein Peptid, abstammend vom p53-Protein, kann nach der Zugabe einer Testprobe zugefügt werden. In ähnlicher Weise können im Fall der Fixierung des vom p53-Protein abstammenden Peptids ein vorgemischtes Gemisch von Peptid, das vom Mortalin-Protein abstammt, und eine Testprobe zum fixierten Peptid zugefügt werden, oder ein Peptid, abstammend vom Mortalin-Protein, kann nach der Zugabe einer Testprobe zugefügt werden. Dann kann der Status der Bindung zwischen den Peptiden durch Inkubieren der Peptide und der Testprobe, die in der obigen Reihenfolge unter geeigneten Bedingungen zugefügt wurde, bewertet werden.
Gemäß dem Screening-Verfahren der vorliegenden Erfindung kann eine Kontrollgruppe zusammen mit einer „Test"-Gruppe eingesetzt werden, wobei Testproben mit den Peptiden in Kontakt gebracht werden. Eine Negativ-Kontrollgruppe, die keine Testprobe enthält, eine Positiv-Kontrollgruppe oder beide können im Screening-Verfahren der vorliegenden Erfindung verwendet werden.
In der vorliegenden Erfindung kann während des Nachweises oder der Messung von gebundenen Peptiden das gebundene Peptid entweder direkt nachgewiesen oder quantitativ gemessen werden. Die gewünschte Verbindung kann durch Vergleichen des Ergebnisses, das für eine Negativ-Kontrollgruppe, die keine Testprobe enthält, erhalten wurde, und des Ergebnisses, das für die Gruppe, die die Testprobe enthält, und/oder der Ergebnisse, die für eine Positiv-Kontrollgruppe erhalten werden, nachgewiesen werden.
Zusätzlich können diese Ergebnisse als nummerische Werte erhalten werden, und Vergleichen jener nummerischen Werte ermöglicht die quantitative Messung der Aktivität der erwünschten Verbindung. Für eine quantitative Messung kann die gewünschte Verbindung durch Vergleichen des nummerischen Wertes, der mit einer Negativ-Kontrollgruppe erhalten wurde, die keine Testprobe enthält, mit dem nummerischen Wert, der mit einer Gruppe erhalten wurde, die die Testprobe einschließt, nachgewiesen werden. Wenn die resultierenden nummerischen Werte im Vergleich zu der Negativ-Kontrollgruppe sinken, wird die Testprobe bewertet, dass sie die gewünschte Verbindung enthält.
Darüber hinaus kann eine quantitative Messung unter Verwendung einer Standardkurve ausgeführt werden, die basierend auf nummerischen Werten hergestellt wird, die mit einer Positiv-Kontrollgruppe erhalten wurden, die bekannte Mengen einer Verbindung enthält, von der bekannt ist, dass sie die Bindung zwischen den Peptiden inhibiert. Die Aktivität einer Verbindung, die Peptidbindung zu inhibieren, wird als schwach bewertet, wenn eine große Menge von Peptiden gebunden wird; auf der anderen Seite, wenn die Menge an gebundenem Peptid klein ist, wird die inhibierende Aktivität der Verbindung, die Bindung des Peptids zu inhibieren, als stark bewertet.
In der vorliegenden Erfindung kann ein Biosensor, der das Oberflächen-Plasmonresonanz-Phänomen ausnutzt, als Mittel zum Nachweis oder Messen von gebundenen Peptiden verwendet werden. Biosensoren, die das Oberflächen-Plasmonresonanz-Phänomen ausnutzen, ermöglichen Echtzeit-Beobachtung der Peptid-Peptid-Interaktion durch Herstellen eines Oberflächen-Plasmonresonanz-Signals, sogar mit einer extrem kleinen Menge an Peptid und ohne ein Markieren der Peptide zu benötigen (z.B. BIAcore, Pharmacia). So ermöglicht die Verwendung von BIAcore oder einem anderen Biosensor eine Echtzeit-Bewertung der Bindung der Peptide der vorliegenden Erfindung.
Genau gesagt wird zuerst eines der zwei Peptide, die im Screenen der vorliegenden Erfindung verwendet werden, auf einen Sensor-Chip fixiert; das andere Peptid wird mit dem Sensor-Chip in Kontakt gebracht. Das andere Peptid, das an die Peptide am Sensor-Chip bindet, wird als eine Änderung im Resonanz-Signal nachgewiesen.
Genauer gesagt kann das obige Verfahren, wie unten beschrieben, ausgeführt werden. Zuerst wird der CM5-Sensor-Chip (Biosensor) aktiviert, um entweder die Peptide, die von p53 stammen, oder jene, die vom Mortalin-Protein stammen, auf dem Sensor-Chip zu fixieren. Genauer gesagt wird der Sensor-Chip mit wässriger EDC/NHS-Lösung (enthaltend 200 mM EDC (N-Ethyl-N'-(3-Dimethylaminopropyl)carbonat-Hydrochlorid) und 50 mM NHS (N-Hydroxysuccinimid)) aktiviert und wird dann mit HBS-Puffer (enthaltend 10 mM HEPES pH 7,4, 150 mM NaCl, 3,4 mM EDTA und 0,05% Tween 20) gewaschen.
Als Nächstes wird eine geeignete Menge des ersten Peptids mit Interaktions- Fähigkeit, gelöst in HBS-Puffer, mit dem Sensor-Chip in Kontakt gebracht, um die Peptide daran zu fixieren. Nach Waschen des Sensor-Chips mit HBS-Puffer wird die verbleibende Aktivitätsgruppe des Sensor-Chips mit Ethanolamin-Lösung (1 M Ethanolamin-Hydrochlorid, pH 8,5) blockiert. Dann wird der Sensor-Chip wieder mit HBS-Puffer für die Verwendung in der Bindungsbewertung gewaschen.
Als nächstes wird eine geeignete Menge des zweiten Peptids (das andere Peptid der zwei Peptide, die im Screenen der vorliegenden Erfindung verwendet werden, das nicht an den Sensor-Chip gebunden wurde), gelöst in HBS-Puffer, injiziert. Die Menge des zweiten Peptids, das eine Fähigkeit hat, mit dem an den Sensor-Chip fixierten Peptid zu interagieren, zu binden, wird als eine Erhöhung im Wert des Resonanz-Signals zum Zeitpunkt der Zugabe beobachtet.
Dann wird eine Testprobe nach der Injektion des zweiten Peptids, das mit dem ersten Peptid im obigen Bindungsbewertungs-System interagiert, injiziert. Zusätzlich kann eine Kontrollgruppe zusammen mit der Testgruppe eingesetzt werden, wobei eine Testprobe injiziert wird. Die Kontrollgruppe kann eine Negativ-Kontrollgruppe, der die Testprobe fehlt, eine Positiv-Kontrollgruppe, die die Testprobe einschließt, oder beide einschließen.
Das gebundene Peptid kann quantitativ als ein Grad der Änderung im Resonanz-Signalwert gemessen werden. Die gewünschte Verbindung kann durch Vergleichen der Ergebnisse, die für eine Negativ-Kontrollgruppe erhalten wurden, die keine Testprobe enthält, mit Ergebnissen, erhalten für eine Gruppe, die die Testprobe enthält, und/oder Ergebnisse, die für eine Positiv-Kontrollgruppe erhalten wurden, nachgewiesen und gemessen werden.
In der vorliegenden Erfindung kann jedes der zwei Peptide markiert sein, und die Markierung des gebundenen Peptids kann verwendet werden, um das gebundene Peptid nachzuweisen oder zu messen.
Zum Beispiel werden in dem oben erwähnten Screening-Verfahren nach der Vormarkierung des zweiten Peptids, das mit dem anderen Peptid zusammen mit einer Testprobe in Kontakt gebracht wird, die Peptide mit der Testprobe inkubiert, und dann werden gebundene Peptide gemäß der Markierung nach dem Waschen nachgewiesen oder gemessen. Genau gesagt werden eine Testprobe und ein markiertes Peptid mit einem Peptid in Kontakt gebracht, das vorzugsweise an eine Unterlage gebunden ist. Nach Inkubieren und Waschen kann die Markierung des Peptids, das an das andere Peptid gebunden ist, nachgewiesen und gemessen werden.
Die Peptide, die in der vorliegenden Erfindung verwendet werden, können durch allgemein bekannte Verfahren markiert werden. Ein Beispiel einer Markierungssubstanz schließt Radioisotope, Enzyme, fluoreszierende Substanzen, Biotin/Avidin und so weiter ein. Kommerziell erhältliche Markierungssubstanzen können als solche Markierungssubstanzen verwendet werden. Beispiele von Radioisotopen schließen ³²P, ³³P, ¹³¹I, ¹²⁵I, ³H, ¹⁴C und ³⁵S ein. Beispiele von Enzymen schließen alkalische Phosphatase, Meerrettich-Peroxidase, β-Galactosidase, β-Glucosidase usw. ein. Beispiele von fluoreszierenden Substanzen schließen Fluorescein-Isothiocyanat (FITC) und Rhodamin ein. Solche Markierungssubstanzen sind kommerziell erhältliche Produkte und können verwendet werden, um Substanzen im Einklang mit bekannten Verfahren zu markieren.
Genauer gesagt kann die Markierung, wie unten beschrieben, ausgeführt werden. Er wird nämlich eine Lösung, die eines der Peptide enthält, zu einer Platte zugefügt und über Nacht stehen gelassen. Nach dem Waschen der Platte wird eine Blockierung zum Beispiel mit BSA durchgeführt, um nicht-spezifische Peptidbindung zu verhindern. Nach nochmaligem Waschen der Platte werden eine Testprobe und das andere Peptid, das nicht auf die Platte fixiert wurde, aber markiert worden ist, zu der Platte zugefügt. Zur gleichen Zeit werden eine Negativ-Kontrollgruppe, die keine Testprobe enthält, und/oder eine Positiv-Kontrollgruppe geliefert und werden auch inkubiert. Nach der Inkubation wird die Platte gewaschen, um das gebundene Peptid nachzuweisen oder zu messen. Das gebundene Peptid kann durch Flüssigszintillation eines Radioisotops nachgewiesen oder gemessen werden. Im Fall, in dem ein Enzym als die Markierung verwendet wird, wird alternativ ein Substrat des Enzyms zugefügt, und die enzymatische Änderung des Substrats wie die Bildung von Farbe kann unter Verwendung eines Absorptiometers nachgewiesen oder gemessen werden. Darüber hinaus kann, wenn eine fluoreszierende Substanz als die Markierung verwendet wird, das gebundene Peptid unter Verwendung eines Fluorophotometers nachgewiesen oder gemessen werden. Dann kann die erwünschte Verbindung durch Vergleich dieser Ergebnisse mit den nummerischen Werten, die für eine Kontrollgruppe erhalten wurden, bestimmt werden.
In der vorliegenden Erfindung können Antikörper, die spezifisch eines der zwei Peptide erkennen, als Mittel zum Nachweisen oder Messen des gebundenen Peptids verwendet werden.
Zum Beispiel wird das Material nach Inkontaktbringen eines der zwei Peptide mit einer Testprobe und dem anderen Peptid inkubiert und gewaschen, und das gebundene Peptid wird durch einen primären Antikörper, der das Peptid spezifisch erkennt, nachgewiesen oder gemessen. Speziell werden die Testprobe und das andere Peptid mit dem Peptid, das auf eine Unterlage fixiert ist, in Kontakt gebracht. Nach Inkubation und Waschen kann das gebundene Peptid mit einem primären Antikörper, der spezifisch das gebundene Peptid erkennt, nachgewiesen oder gemessen werden. Der primäre Antikörper ist vorzugsweise mit einer Markierungssubstanz markiert.
Genauer gesagt kann das Verfahren, wie unten beschrieben, ausgeführt werden. Es wird nämlich eine Lösung, die eines der zwei Peptide enthält, zu einer Platte zugefügt und über Nacht stehen gelassen. Nach Waschen der Platte wird Blockieren zum Beispiel mit BSA ausgeführt, um nicht-spezifische Peptidbindung zu verhindern. Nach nochmaligem Waschen der Platte werden eine Testprobe und das andere Peptid zu der Platte zugefügt. Zur gleichen Zeit werden eine Negativ-Kontrollgruppe, die keine Testprobe enthält, und/oder eine Positiv-Kontrollgruppe bereitgestellt und werden auch inkubiert.
Nach Inkubation und Waschen wird der primäre Antikörper gegen das Peptid, das zusammen mit der Testprobe zugefügt wurde, zugefügt. Nach geeigneter Inkubation wird die Platte gewaschen, und das gebundene Peptid wird durch den primären Antikörper nachgewiesen oder gemessen. Zum Nachweis oder Messen kann das gebundene Peptid, wenn der primäre Antikörper mit einem Radioisotop markiert ist, einer Flüssigszintillation unterzogen werden. Im dem Fall, in dem die Markierung ein Enzym ist, wird ein Enzymsubstrat zugefügt, und die enzymatische Änderung im Substrat wie Bildung von Farbe kann unter Verwendung eines Absorptiometers nachgewiesen oder gemessen werden. Wenn eine fluoreszierende Substanz als die Markierung verwendet wird, kann das gebundene Peptid unter Verwendung eines Fluorophotometers nachgewiesen oder gemessen werden. Dann kann die gewünschte Verbindung durch Vergleichen dieser Ergebnisse mit den nummerischen Werten, die für eine Kontrollgruppe erhalten wurden, nachgewiesen werden.
Darüber hinaus kann ein primärer Antikörper, der spezifisch Peptide erkennt, die an die in der vorliegenden Erfindung verwendeten Peptide fusioniert sind, als ein Mittel zum Nachweisen oder Messen des gebundenen Peptids in der vorliegenden Erfindung verwendet werden.
Zum Beispiel wird gemäß dem oben erwähnten Screening-Verfahren nach Inkontaktbringen und Inkubieren von einem der zwei Peptide (z.B. dem ersten Peptid), die im Verfahren der vorliegenden Erfindung verwendet werden, mit einer Testprobe und dem anderen Peptid (z.B. dem zweiten Peptid) Waschen ausgeführt, und das zweite Peptid, das an das erste Peptid gebunden ist, wird durch einen primären Antikörper, der spezifisch eine Peptid erkennt, das an das zweite Peptid fusioniert ist, nachgewiesen oder gemessen. Genau gesagt werden die Testprobe und das zweite Peptid mit dem ersten Peptid, das vorzugsweise auf einer Unterlage fixiert ist, in Kontakt gebracht. Nach Inkubieren und Waschen wird das zweite Peptid, das an das erste Peptid gebunden ist, durch einen primären Antikörper, der spezifisch das Peptid erkennt, das an das zweite Peptid fusioniert ist, nachgewiesen oder gemessen. Der primäre Antikörper ist vorzugsweise mit einer Markierungssubstanz markiert.
Genauer gesagt wird das Verfahren, wie unten beschrieben, ausgeführt. Es wird nämlich eine Lösung, die eines der zwei Peptide (erstes Peptid) enthält, die im vorliegenden Verfahren verwendet werden, zu einer Platte zugefügt und über Nacht stehen gelassen. Nach dem Waschen der Platte wird Blockieren zum Beispiel mit BSA ausgeführt, um nicht-spezifische Peptidbindung zu verhindern. Nach nochmaligem Waschen der Platte werden eine Testprobe und das andere Peptid (zweites Peptid), das mit einem anderen Peptid (drittes Peptid) fusioniert ist, zu der Platte zugefügt. Zur gleichen Zeit werden eine Negativ-Kontrollgruppe, die keine Testprobe enthält, und/oder eine Positiv-Kontrollgruppe bereitgestellt und werden inkubiert.
Nach Inkubation und Waschen werden Antikörper gegen das dritte Peptid, das an das zweite Peptid fusioniert ist, das zusammen mit der Testprobe zugefügt wurde, zugefügt. Nach geeigneter Inkubation wird die Platte gewaschen, und das zweite Peptid wird durch einen primären Antikörper, der spezifisch das dritte Peptid erkennt, das an das zweite Peptid fusioniert ist, nachgewiesen oder gemessen. Der Nachweis oder das Messen des zweiten Peptids kann durch Flüssigszintillation ausgeführt werden, wenn der primäre Antikörper mit einem Radioisotop markiert ist. In dem Fall, in dem die Markierung ein Enzym ist, wird ein Enzymsubstrat zugefügt, und die enzymatische Änderung des Substrats wie die Bildung von Farbe kann unter Verwendung eines Absorptiometers nachgewiesen oder gemessen werden. In dem Fall einer fluoreszierenden Substanz als Markierung kann das zweite Peptid unter Verwendung eines Fluorophotometers nachgewiesen oder gemessen werden. Dann kann die gewünschte Verbindung durch Vergleichen dieser Ergebnisse mit den nummerischen Werten, die für eine Kontrollgruppe erhalten wurden, nachgewiesen werden.
In der vorliegenden Erfindung können ein primärer Antikörper, der spezifisch die in der vorliegenden Erfindung verwendeten Peptide erkennt, und ein sekundärer Antikörper, der spezifisch den primären Antikörper erkennt, als Mittel zum Nachweis oder Messen der gebundenen Peptide verwendet werden.
Zum Beispiel wird nach Inkontaktbringen eines der zwei Peptide (erstes Peptid) mit dem anderen Peptid (zweites Peptid) zusammen mit einer Testprobe das Gemisch inkubiert und gewaschen, und das zweite Peptid, das an das erste Peptid gebunden ist, wird mit primären Antikörpern, die spezifisch das zweite Peptid erkennen, und sekundären Antikörpern, die spezifisch den primären Antikörper erkennen, nachgewiesen oder gemessen. Genau gesagt werden die Testprobe und das zweite Peptid mit dem ersten Peptid, das vorzugsweise auf einer Unterlage fixiert ist, in Kontakt gebracht. Nach Inkubieren und Waschen kann das zweite Peptid, das an das erste Peptid gebunden ist, mit einem primären Antikörper, der spezifisch das zweite Peptid erkennt, und einem sekundären Antikörper, der spezifisch den primären Antikörper erkennt, nachgewiesen oder gemessen werden. Der sekundäre Antikörper ist vorzugsweise mit einer Markierungssubstanz markiert.
Genauer gesagt kann das Verfahren, wie unten beschrieben, ausgeführt werden. Es wird nämlich eine Lösung, die eines der zwei Peptide (erstes Peptid) enthält, zu einer Platte zugefügt und über Nacht stehen gelassen. Nach dem Waschen der Platte, wird Blockieren zum Beispiel mit BSA ausgeführt, um nicht-spezifische Peptidbindung zu verhindern. Nach nochmaligem Waschen der Platte werden eine Testprobe und das andere Peptid (zweites Peptid) zu der Platte zugefügt. Zur gleichen Zeit werden eine Negativ-Kontrollgruppe, die keine Testprobe enthält, und/oder eine Positiv-Kontrollgruppe bereitgestellt und inkubiert.
Nach der Inkubation wird ein primärer Antikörper gegen das zweite Peptid, das zusammen mit der Testprobe zugefügt worden ist, nach dem Waschen zugefügt. Nach geeigneter Inkubation wird die Platte gewaschen, und ein sekundärer Antikörper wird zugefügt, der spezifisch den primären Antikörper erkennt. Nach geeigneter Inkubation und Waschen der Platte wird das gebundene Peptid durch den sekundären Antikörper nachgewiesen oder gemessen, der spezifisch den primären Antikörper erkennt, der im Gegenzug spezifisch das zweite Peptid erkennt. Der Nachweis oder das Messen kann durch Flüssigszintillation ausgeführt werden, wenn ein Radioisotop als die Markierung verwendet wird. Im dem Fall, in dem die Markierung ein Enzym ist, wird das Enzymsubstrat zugefügt, und die enzymatische Änderung des Substrats wie die Bildung von Farbe kann unter Verwendung eines Absorptiometers nachgewiesen oder gemessen werden. In dem Fall einer fluoreszierenden Substanz als die Markierung kann der Nachweis oder das Messen unter Verwendung eines Fluorophotometers durchgeführt werden. Dann wird die gewünschte Verbindung durch Vergleichen dieser Ergebnisse mit den nummerischen Werten, die für eine Kontrollgruppe erhalten wurden, ausgewählt.
In der vorliegenden Erfindung können ein primärer Antikörper, der spezifisch ein anderes Peptid erkennt, das an eines der zwei Peptide fusioniert ist, die in der vorliegenden Erfindung verwendet werden, und ein sekundärer Antikörper, der spezifisch den primären Antikörper erkennt, als Mittel zum Nachweisen oder Messen des Peptids, das an das andere Peptid gebunden ist, verwendet werden.
Zum Beispiel werden entsprechend dem oben erwähnten Screening-Verfahren nach Inkontaktbringen eines der zwei Peptide (erstes Peptid) mit dem anderen Peptid (zweites Peptid) zusammen mit einer Testprobe Inkubieren und Waschen durchgeführt, und das zweite Peptid, das an das erste Peptid gebunden ist, wird durch einen primären Antikörper, der spezifisch ein anderes Peptid (drittes Peptid) erkennt, das an das zweite Peptid fusioniert ist, und einen sekundären Antikörper, der spezifisch den primären Antikörper erkennt, nachgewiesen oder gemessen. Genau gesagt werden das zweite Peptid und die Testprobe mit dem ersten Peptid, das vorzugsweise an eine Unterlage fixiert ist, in Kontakt gebracht. Nach Inkubieren und Waschen kann das zweite Peptid, das an das erste Peptid gebunden ist, durch einen primären Antikörper, der spezifisch das dritte Peptid erkennt, das an das zweite Peptid fusioniert ist, und einen sekundären Antikörper, der spezifisch den primären Antikörper erkennt, nachgewiesen oder gemessen werden. Der sekundäre Antikörper ist vorzugsweise mit einer Markierungssubstanz markiert.
Genauer gesagt kann das Verfahren, wie unten beschrieben, ausgeführt werden. Es wird nämlich eine Lösung, die eines der zwei Peptide (erstes Peptid) enthält, zu einer Platte zugefügt und über Nacht stehen gelassen. Nach Waschen der Platte wird Blockierung zum Beispiel mit BSA durchgeführt, um nicht-spezifische Peptidbindung zu verhindern. Nach nochmaligem Waschen der Platte werden eine Testprobe und das andere Peptid (zweites Peptid), fusioniert mit einem anderen Peptid (drittes Peptid), zu der Platte zugefügt. Zur gleichen Zeit werden eine Negativ-Kontrollgruppe, die keine Testprobe enthält, und/oder eine Positiv-Kontrollgruppe bereitgestellt und inkubiert.
Nach Inkubation wird ein primärer Antikörper gegen das dritte Peptid, das an das zweite Peptid fusioniert ist, das zusammen mit der Testprobe zugefügt worden ist, nach dem Waschen zugefügt. Nach geeigneter Inkubation wird die Platte gewaschen, und ein sekundärer Antikörper wird zugefügt, der spezifisch den primären Antikörper erkennt. Nach geeignetem nochmaligen Inkubieren und Waschen der Platte wird das zweite Peptid durch einen sekundären Antikörper, der spezifisch den primären Antikörper erkennt, nachgewiesen oder gemessen, wobei der primäre Antikörper im Gegenzug spezifisch das dritte Peptid erkennt, das an das zweite Peptid fusioniert ist. Der Nachweis oder die Messung kann durch Flüssigszintillation durchgeführt werden, in der ein Radioisotop als die Markierung verwendet wird. Im Fall eines Enzyms als Markierung wird Enzymsubstrat zugefügt, und die enzymatische Änderung im Substrat wie die Bildung von Farbe kann unter Verwendung eines Absorptiometers nachgewiesen oder gemessen werden. Im Fall einer fluoreszierenden Substanz als Markierung kann das gebundene zweite Peptid unter Verwendung eines Fluorophotometers nachgewiesen oder gemessen werden. Die gewünschte Verbindung kann dann durch Vergleichen dieser Ergebnisse mit nummerischen Werten, die für eine Kontrollgruppe erhalten wurden, nachgewiesen werden.
Der Nachweis oder die Messung wird vorzugsweise durch Enzym-verbundenen Immunabsorptionstest (ELISA), wie unten beschrieben, ausgeführt. Es wird nämlich ein Peptid (erstes Peptid) des Peptidpaars, das in dem vorliegenden Verfahren verwendet wird, zum Beispiel irgendein Peptid, das mit 6× His fusioniert ist, wird mit Fixierungspuffer (0,1 M NaHCO₃, 0,02% NaN₃, pH 9,6) verdünnt. Eine geeignete Menge der verdünnten Lösung wird dann zu jeder Vertiefung einer Immunoplate mit 96 Vertiefungen (Nunc) zugefügt, gefolgt von Inkubation über Nacht bei 4°C.
Nach dreimaligem Waschen jeder Vertiefung mit Waschpuffer (hergestellt, um 0,05% Tween 20 in PBS zu enthalten) werden 200 μl einer Lösung von 5% BSA (SIGMA), gelöst in PBS, zugefügt, um Blockierung über Nacht bei 4°C durchzuführen.
Als Nächstes, nach dreimaligem Waschen jeder Vertiefung mit Waschpuffer, werden geeignete Mengen des anderen Peptids (zweites Peptid) des vorliegenden Peptidpaars, verdünnt mit Verdünnungspuffer (1% BSA, 0,5% Tween 20 und PBS), zum Beispiel ein Peptid, das mit FLAG fusioniert ist, und eine Testprobe zugefügt und für 1 Stunde bei Raumtemperatur inkubiert. Nach dreimaligem Waschen jeder Vertiefung mit Waschpuffer werden 100 μl Maus-anti-FLAG-Antikörper (IBI), verdünnt auf 3 μg/ml mit Verdünnungspuffer, zu jeder Vertiefung zugefügt, gefolgt von Inkubation für 1 Stunde bei Raumtemperatur.
Nach dreimaligem Waschen jeder Vertiefung mit Waschpuffer werden 100 μl mit alkalischer Phosphatase-markierter Ziegen-anti-Maus-IgG-Antikörper (ZYMED), 1000-fach verdünnt mit einem Verdünnungspuffer, zu jeder Vertiefung zugefügt, gefolgt von Inkubation für 1 Stunde bei Raumtemperatur. Nach fünfmaligem Waschen jeder Vertiefung mit Waschpuffer werden 100 μl Farbentwicklungs-Lösung (p-Phenylphosphat (SIGMA), gelöst in einer Konzentration von 1 mg/ml in Substratpuffer (50 mM NaHCO₃, 10 mM MgCl₂, pH 9,8)) zu jeder Vertiefung zugefügt, und nach Reagierenlassen bei Raumtemperatur wird das Absorptionsvermögen bei 405 nm unter Verwendung eines Mikroplatten-Lesegeräts (Modell 3550, BIO-RAD) gemessen. Die erwünschte Verbindung kann dann durch Vergleich dieser Ergebnisse mit nummerischen Werten, die für eine Negativ-Kontrollgruppe und/oder Positiv-Kontrollgruppe erhalten wurden, bestimmt werden.
Es sollte erwähnt werden, dass der Nachweis oder die Messung unter Verwendung eines Antikörpers der vorliegenden Erfindung auch durch Verwendung von Protein G oder Protein A anstelle des sekundären Antikörpers durchgeführt werden kann.
Screening mit hohen Durchgangszahlen (HTS) kann für das Screeningverfahren der vorliegenden Erfindung ausgenutzt werden. Genauer gesagt kann Screening mit hohen Durchgangszahlen manuelles Ausführen des Verfahrens bis zum Blockierungsschritt und dann automatisches Ausführen der folgenden Reaktionen mit der Hilfe zum Beispiel eines Roboters einbeziehen.
Es wird nämlich das erste Peptid, zum Beispiel ein Peptid, das an 6× His fusioniert ist, mit Fixierungspuffer (0,1 M NaHCO₃, 0,02% NaN₃, pH 9,6) verdünnt. Eine geeignete Menge dieser verdünnten wässrigen Lösung wird dann zu jeder Vertiefung einer Immunoplate mit 96 Vertiefungen (Nunc) zugefügt, gefolgt von Inkubation über Nacht bei 4°C.
Nach dreimaligem Waschen jeder Vertiefung mit Waschpuffer (hergestellt, um 0,05% Tween 20 in PBS zu enthalten) wurden 200 μl einer Lösung von 5% BSA (SIGMA), gelöst in PBS, zugefügt, um Blockierung über Nacht bei 4°C durchzuführen.
Als Nächstes wird die blockierte Immunoplate zum Beispiel in ein Biomek 2000-HTS-System (Beckman) platziert, worauf ein System-Kontrollprogramm durchlaufen wird. Zu dieser Zeit können Injektion und Entfernen von Lösung in und aus jeder Vertiefung durch einen Biomek 2000 (Beckman)- oder Multipipette-Injektor (Sagian), der 96 Vertiefungen gleichzeitig versorgt, als Injektor ausgeführt werden. Zusätzlich kann ein EL404 Microplate-Washer (Bio-Tek) zum Waschen von jeder Vertiefung der Immunplatte verwendet werden. Darüber hinaus kann ein SPECTRAmax 250-Plattenlesegerät (Molecular Devices) zum Messen der Absorptionsfähigkeit verwendet werden.
Das Programm ist so aufgebaut, dass die folgende Vorgehensweise durchgeführt werden kann. Es werden nämlich nach dreimaligem Waschen jeder Platte mit Waschpuffer geeignete Mengen von Testprobe und dem zweiten Peptid, zum Beispiel einem Peptid, das mit einem anderen Peptid wie MBP (Maltose-gebundenes Protein) fusioniert ist, wobei sie mit einem Verdünnungspuffer (1% BSA, 0,5% Tween 20 und PBS) verdünnt sind, zugefügt. Zur gleichen Zeit werden eine Negativ-Kontrollgruppe, die keine Testprobe enthält, und eine Positiv-Kontrollgruppe bereitgestellt und werden für 1 Stunde bei Raumtemperatur inkubiert.
Nach dreimaligem Waschen jeder Vertiefung mit Waschpuffer werden 100 μl Kaninchen-anti-MBP-Antiserum (New England Biolabs), 5000-fach verdünnt mit Verdünnungspuffer, zu jeder Vertiefung zugefügt, gefolgt von Inkubation für 1 Stunde bei Raumtemperatur. Nach nochmaligem dreimaligen Waschen jeder Vertiefung mit Waschpuffer werden 100 μl mit alkalischer Phosphatase-markierter Ziegen-anti-Kaninchen-IgG-Antikörper (TAGO), 5000-fach verdünnt mit Verdünnungspuffer, zu jeder Verdünnung zugefügt, gefolgt von Inkubation für 1 Stunde bei Raumtemperatur.
Nach fünfmaligem Waschen jeder Vertiefung mit Waschpuffer werden 100 μl einer Farbentwicklungs-Lösung (p-Nitrophenylphosphat (SIGMA), gelöst in einer Konzentration von 1 mg/ml in Substratpuffer (50 mM NaHCO₃, 10 mM MgCl₂, pH 9,8)) zu jeder Vertiefung zugefügt, und nach Reagierenlassen bei Raumtemperatur kann die Absorptionsfähigkeit bei 405 nm unter Verwendung eines Microplatten-Lesegeräts oder Biomek-Plattenlesegeräts (Beckman/Molecular Devices) gemessen werden. Dann wird die gewünschte Verbindung durch Vergleichen dieser Ergebnisse mit nummerischen Werten, die für die Kontrollgruppen erhalten wurden, bestimmt.
Kommerziell erhältliche Antikörper oder Antikörper, die in kommerziell erhältlichen Kits enthalten sind, können als der Antikörper verwendet werden, der in den Verfahren der vorliegenden Erfindung verwendet wird, und monoclonale Antikörper oder polyclonale Antikörper, die gemäß bekannten Verfahren erhalten werden, können auch verwendet werden.
Primäre Antikörper oder sekundäre Antikörper können durch bekannte Verfahren markiert werden. Beispiele von Markierungssubstanzen schließen Radioisotope, Enzyme und fluoreszierende Substanzen ein. Kommerziell erhältliche Markierungssubstanzen können auch für diese Markierungssubstanzen verwendet werden. Beispiele für Radioisotope schließen ³²P, ³³P, ¹³¹I, ¹²⁵I, ³H, ¹⁴C und ³⁵S ein. Beispiele von Enzymen schließen alkalische Phosphatase, Meerrettich-Peroxidase, β-Galactosidase und β-Glucosidase ein. Beispiele von fluoreszierenden Substanzen schließen Fluorescein-Isothiocyanat (FITC) und Rhodamin ein.
Zusätzlich kann Nachweis der Peptidbindung durch Nachweisen und/oder Messen von Änderungen in der Menge von exprimiertem Reportergen ausgeführt werden, dessen Expression als Reaktion auf die Bindung der Peptide aktiviert wird. Beispiele solcher Reportergene schließen Luciferase, β-Galactosidase, HIS3-Gen, Chloramphenicol-Acetyl-Transferase (CAT) und grünes Fluoreszenzprotein (GFP)-Gen ein.
Die in Zellen exprimierten Peptide können Peptide sein, die mit anderen Peptiden fusioniert sind. Obwohl das andere Peptid, das für die Fusion mit den in Zellen exprimierten Peptiden verwendet wird, jedes Peptid sein kann, so lange es in dem Screening-Verfahren der vorliegenden Erfindung verwendet werden kann, ist es vorzugsweise ein Transkriptions-regulierender Faktor.
Zum Beispiel können DNAs, die zwei unterschiedliche Peptide codieren (die Bindung der zwei Peptide wird gemessen), wobei die Peptide dementsprechend mit Untereinheiten eines Transkriptions-regulierenden Faktors fusioniert sind, der ein Heterodimer ist, von dem bekannt ist, dass er die Transkription eines Reportergens durch Bindung an DNA aktiviert, konstruiert und in Expressionsvektoren eingebracht werden, um Zellen zu transformieren. Wenn die Testprobe keine Verbindungen enthält, die die Bindung der Peptide verhindern, formen die zwei Peptide ein Heteromer, d.h. den Transkriptions-regulierenden Faktor, der an die DNA bindet, um das Reportergen zu aktivieren.
Auf der anderen Seite, wenn eine Verbindung, die die Bindung der Peptide verhindert, in der Testprobe enthalten ist, wird die Bindung zwischen den Peptiden verhindert, und als eine Folge sind die Untereinheiten des Transkriptions-regulierenden Faktors nicht in der Lage, das Heteromer zu bilden, das nötig ist, um Transkription des Reportergens zu induzieren. Dann kann die gewünschte Verbindung durch Bestimmen der Änderung der Menge des exprimierten Reportergens nachgewiesen oder gemessen werden. Um die Änderung der Menge des Reportergens, das in dieser Art von System exprimiert wird, zu bestimmen, kann ein Zwei-Hybrid-System („Two-hybrid system" Fields, S., und Sternglanz, R., Trends. Genet. (1994) 10, 286–292) oder ein Drei-Hybrid-System verwendet werden.
Das Hybrid-System kann durch konventionelle Verfahren oder unter Verwendung von kommerziell erhältlichen Kits konstruiert werden. Beispiele von kommerziell erhältlichen Zwei-Hybrid-System-Kits schließen MATCHMAKER Two-Hybrid System, Mammalian MATCHMAKER Two-Hybrid Assay Kit (beide hergestellt von CLONTECH) und HybriZAP Two-Hybrid Vector System (Stratagene) ein.
Genauer gesagt kann ein Zwei-Hybrid-System, wie unten beschrieben, konstruiert werden. Es werden nämlich ein Gen, das eines der zwei Peptide codiert (z.B. das erste Peptid), und ein Gen, das die DNA-bindende Domäne von LexA codiert, verknüpft, um einen Expressionsvektor zu produzieren. Hierin wird das Expressionsplasmid durch Inserieren des erwünschten Genfragments in ein Hefe-Zwei-Hybrid-Expressionsplasmid pBTM116 konstruiert (Vojtek, A. B., et al., Cell (1993) 74, 205–214).
Dann wird ein Expressionsvektor durch Verknüpfen eines Gens, das das andere Peptid codiert (z.B. das zweite Peptid), mit einem Gen, das die Transkriptions-aktivierende Domäne von GAL4 codiert, hergestellt. Das Hefe-zwei-Hybrid-Expressionsplasmid pGAD10 (Clontech) kann für den Expressionsvektor verwendet werden.
Nach Transformieren des Hefestammes L40, in den ein HIS3-Gen eingebaut ist, dessen Transkription durch einen Promotor reguliert wird, der ein LexA-Bindungsmotiv enthält, mit beiden Zwei-Hybrid-Expressionsplasmiden wird das Wachstum der Hefe nur beobachtet, wenn Peptid-Interaktion nach der Inkubation auf Histidin-freiem synthetischen Medium erfolgt. So kann eine Steigerung in der Menge an exprimiertem Reportergen entsprechend dem Grad des Wachstums der Transformante bestimmt werden, wodurch das Screenen der erwünschten Verbindung ermöglicht wird.
Zusätzlich bezieht sich eine andere Ausführungsform des Screening-Verfahrens der vorliegenden Erfindung auf ein Verfahren, das ein Konstrukt verwendet, das den auf p53 ansprechenden Promotor und ein Reportergen, das als Reaktion auf die Aktivierung des Promotors exprimiert wird, enthält. Genauer gesagt umfasst das Verfahren die Schritte von:

(a) Inkontaktbringen einer Testprobe mit einer Zelle, die mit den folgenden Vektoren transfiziert worden ist:
(i) einem Vektor, umfassend eine DNA, die ein Peptid codiert, das die Aminosäurereste 253 bis 282 der Aminosäuresequenz des menschlichen mot-1-Proteins oder menschlichen mot-2-Proteins umfasst;
(ii) einem Vektor, umfassend eine DNA, die ein Peptid codiert, das die Aminosäurereste 312 bis 352 der Aminosäuresequenz von menschlichem p53 umfasst, wobei das Peptid die Funktion des Aktivierens des auf menschliches p53 ansprechenden Promotors hat; und
(iii) einem Vektor, umfassend ein Reportergen, das stromabwärts des auf menschliches p53 ansprechenden Promotors funktionell gebunden ist;
(b) Nachweis der Reporteraktivität in der Zelle; und
(c) Auswählen der Verbindung, die die Reporteraktivität im Vergleich zu jener verstärkt, die in der Abwesenheit der Testprobe auftritt.

Gemäß dem Verfahren werden zuerst ein Vektor, der menschliches Mortalin exprimiert, ein Vektor, der menschliches p53 exprimiert, und ein Vektor, der ein Reportergen als Reaktion auf die Expression von menschlichem p53 exprimiert, konstruiert und in Zellen eingebracht.
Das menschliche Mortalin, das durch den Vektor exprimiert wird, ist nicht besonders eingeschränkt, und jedes Peptid kann verwendet werden, so lange das Peptid die Domäne zur Interaktion mit p53 (d.h. Aminosäurereste 253 bis 282) einschließt. Vorzugsweise enthält das Peptid 600 Aminosäurereste oder weniger der Aminosäurereste dieser Proteine, mehr bevorzugt 300 Aminosäurereste oder weniger und noch mehr bevorzugt 100 Aminosäurereste oder weniger (zum Beispiel 50 Aminosäurereste oder weniger). Auf der anderen Seite gibt es keine besonderen Einschränkungen in Bezug auf das menschliche p53, das durch den Vektor exprimiert wird, so lange es die Domäne einschließt, die mit Mortalin interagiert (d.h. Aminosäurereste 312 bis 352). Vorzugsweise enthält das Peptid 300 Aminosäurereste oder weniger der Aminosäurereste dieser Proteine, mehr bevorzugt 200 Aminosäurereste oder weniger und noch mehr bevorzugt 100 Aminosäurereste oder weniger (zum Beispiel 50 Aminosäurereste oder weniger).
Diese Vektoren können zum Beispiel durch Inserieren einer DNA, die diese Peptide codiert, in einen Säuger-Expressionsvektor wie pSG5 oder pcDNA3 konstruiert werden. Zusätzlich kann Konstruktion eines Vektors, in dem das Reportergen stromabwärts des auf menschliches p53 ansprechenden Promotors funktionell gebunden ist, durch Inserieren eines auf menschliches p53 ansprechenden Promotors in einen Expressionsvektor, der das Reportergen umfasst, ausgeführt werden. Hierin bezieht sich der Ausdruck „funktionell gebunden" auf die Bindung eines Promotors und eines Reportergens, um Expression des Reportergens als Reaktion auf die Aktivierung des auf menschliches p53 ansprechenden Promotors zu ermöglichen. Ein Beispiel eines auf menschliches p53 ansprechenden Promotors, der in der vorliegenden Erfindung verwendet werden kann, ist in der Literatur beschrieben (El-Deiry, W. S., et al., (1993) Cell, 75, 817–825). Zusätzlich kann jedes Reportergen verwendet werden, so lange seine Expression nachgewiesen werden kann; Beispiele schließen das β-gal-Gen, das CAT-Gen und das Luciferasegen ein. Obwohl es keine besonderen Einschränkungen in Bezug auf die Zellen gibt, in die ein Vektor eingebracht wird, schließen bevorzugte Beispiele MCF-7-Zellen und NIH3T3-Zellen ein.
Entsprechend der vorliegenden Erfindung wird eine Testprobe mit den wie oben bereitgestellten Zellen in Kontakt gebracht. Es gibt keine besonderen Einschränkungen in Bezug auf die Testprobe; Beispiele schließen Zellkultur-Überstände, Produkte von fermentierenden Microorganismen, Extrakte von Meeresorganismen, Pflanzenextrakte, prokaryontische Zellextrakte, Extrakte von eukaryontischen Einzellern, tierische Zellextrakte oder deren Genbanken, aufgereinigte oder Roh-Proteine, Peptide, Nicht-Peptid-Verbindungen, synthetische Verbindungen mit niedrigem Molekulargewicht und natürlich vorkommende Verbindungen ein.
Nach Inkontaktbringen einer Testprobe wird die Aktivität des Reporters in den Zellen bestimmt. Bestimmen der Reporteraktivität kann entsprechend dem Typ des Reportergens durch Verfahren, die Fachleuten bekannt sind, ausgeführt werden. Als ein Ergebnis des Bestimmens der Reporteraktivität, wenn die nachgewiesene Reporteraktivität in den Zellen, die mit der Testprobe in Kontakt gebracht wurden, im Vergleich zum Ergebnis, das ohne eine Testprobe (Kontrolle) erhalten wurde, signifikant steigt, dient die verwendete Testverbindung als ein Kandidat für eine Verbindung, die die Interaktion zwischen Mortalin-Protein und p53 inhibiert.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch einen Kit zum Ausführen des oben beschriebenen Screening-Verfahrens, der umfasst: (a) ein Peptid, umfassend die Aminosäurereste 253 bis 282 der Aminosäuresequenz von menschlichem mot-1-Protein oder menschlichem mot-2-Protein; und (b) ein Peptid, umfassend die Aminosäurereste 312 bis 352 der Aminosäuresequenz von menschlichem p53.
Darüber hinaus bezieht sich die vorliegende Erfindung auch auf einen Kit zum Ausführen des oben beschriebenen Screening-Verfahrens, der umfasst: (a) einen Vektor, umfassend eine DNA, die ein Peptid codiert, das die Aminosäurereste 253 bis 282 der Aminosäuresequenz von menschlichem mot-1-Protein oder menschlichem mot-2-Protein umfasst; (b) einen Vektor, umfassend eine DNA, die ein Peptid codiert, das die Aminosäurereste 312 bis 352 der Aminosäuresequenz von menschlichem p53 umfasst, wobei das Peptid die Funktion hat, einen auf menschliches p53 ansprechenden Promotor zu aktivieren; und (c) einen Vektor, umfassend ein Reportergen, das stromabwärts des auf menschliches p53-ansprechenden Promotors funktionell gebunden ist. Der Kit kann zusätzlich Zellen zum Einbringen dieser Vektoren enthalten.
Zusätzlich liefert die vorliegende Erfindung auch Verbindungen, die durch die Screening-Verfahren der vorliegenden Erfindung isoliert werden, und pharmazeutische Anwendungen davon. p53 ist als ein Tumorsuppressorgen etabliert (Levine, A. J. (1997) Cell, 88, 323–331; Metz, T. et al. (1995) Cell, 82, 29–36). Folglich dienen Verbindungen, die durch die Screening-Verfahren der vorliegenden Erfindung isoliert worden sind, als wichtige Kandidaten für Krebsheilmittel.
Die Verbindungen, die durch die Screening-Verfahren der vorliegenden Erfindung isoliert worden sind, können als Arzneimittel zum Beispiel für Menschen, Mäuse, Ratten, Meerschweinchen, Kaninchen, Hühner, Katzen, Hunde, Schafe, Schweine, Kühe, Affen, Paviane oder Schimpansen durch direkte Verabreichung des Proteins oder der isolierten Verbindung selbst verwendet werden, und sie können auch in der Form eines Arzneimittels durch Formulierung im Einklang mit bekannten pharmazeutischen Verfahren verabreicht werden.
Zum Beispiel können sie oral als Tabletten, die ggf. Zucker-beschichtet sein können; Kapseln; Elixiere; und Mikrokapseln verabreicht werden, oder parenteral als Injektionen in der Form einer aseptischen Lösung oder Suspension mit Wasser oder einer anderen pharmazeutisch verträglichen Flüssigkeit verabreicht werden. Zum Beispiel kann ein Arzneimittel durch Mischen in eine Einheitsdosisform, die für typischerweise beobachtete pharmazeutische Präparierung benötigt wird, durch geeignete Kombinierung mit einem pharmakologisch verträglichen Träger oder Medium, formuliert werden, spezifische Beispiele davon schließen sterilisiertes Wasser oder physiologische Kochsalzlösung, Pflanzenöl, Emulgator, Suspensionsmittel, oberflächenaktive Substanz, Stabilisator, Geschmacksstoff, Excipient, Vehikel, Antisepticum, Bindemittel und so weiter ein. Die Menge des aktiven Bestandteils in diesen Präparaten wird so angepasst, dass ein geeignetes Volumen innerhalb eines festgelegten Bereichs erhalten wird.
Beispiele von Zusätzen, die in Tabletten und Kapseln gemischt werden können, schließen Bindemittel wie Gelatine, Maisstärke, Tragantgummi und Gummi arabicum; Excipienten wie kristalline Cellulose; Quellmittel wie Maisstärke, Gelatine und Alginsäure; Gleitmittel wie Magnesiumstearat; Süßungsmittel wie Saccharose, Lactose und Saccharin; und Geschmacksmittel wie Pfefferminze, Gaultheria adenothrix-Öl und Kirschgeschmack ein. Wenn die Präparat-Einheit in der Form einer Kapsel vorliegt, können flüssige Träger wie Fette und Öle zusätzlich zu den obigen Materialien enthalten sein. Aseptische Zusammensetzungen zur Injektion können in Übereinstimmung mit gewöhnlicher Präparat-Herstellung unter Verwendung von Vehikeln wie destilliertes Wasser zur Injektion formuliert werden.
Beispiele von wässrigen Lösungen, die zur Injektion geeignet sind, schließen physiologische Kochsalzlösung und isotonische Flüssigkeiten, die Glucose oder andere Adjuvanzien wie D-Sorbit, D-Mannose, D-Mannit und Natriumchlorid enthalten, ein, und diese Adjuvanzien können in Kombination mit geeigneten Lösungshilfsmitteln verwendet werden, Beispiele davon schließen Alkohole wie Ethanol; Polyalkohole einschließlich Propylenglycol und Polyethylenglycol; und nicht-ionische oberflächenaktive Substanzen wie Polysorbat 80 (TM) und HCO-50 ein.
Beispiele von öligen Flüssigkeiten schließen Sesamöl und Sojabohnenöl ein, und diese können in Kombination mit Lösungshilfsmitteln wie Benzylbenzoat und Benzylalkohol verwendet werden. Zusätzlich können Puffer wie Phosphatpuffer und Natriumacetatpuffer; Analgetica wie Procainhydrochlorid; Stabilisatoren wie Benzylalkohol und Phenol; und Antioxidanzien auch eingemengt werden. Die hergestellte Injektionsflüssigkeit wird normalerweise in geeignete Ampullen gefüllt.
Verabreichung an Patienten kann durch Verfahren ausgeführt werden, die Fachleuten bekannt sind, zum Beispiel durch intraarterielle Injektion, intravenöse Injektion oder subcutane Injektion; oder intranasale, transbronchiale, intramuskuläre, percutane oder orale Verabreichung. Obwohl die Dosierung in Abhängigkeit vom Körpergewicht und Alter des Patienten, Verabreichungsverfahren und so weiter variiert, kann eine geeignete Dosierung durch eine Fachperson passend ausgewählt werden. Zusätzlich, wenn die Verbindung durch eine DNA codiert werden kann, kann Gentherapie auch durch Einbau der DNA in einen Vektor zur Gentherapie ausgeführt werden. Obwohl die Dosierung und das Verabreichungsverfahren entsprechend dem Körpergewicht, Alter und den Symptomen des Patienten variieren, können sie durch eine Fachperson passend ausgewählt werden.
Obwohl die Dosierung der Verbindung der vorliegenden Erfindung entsprechend den Symptomen variiert, reicht die Dosierung für einen Erwachsenen (das Körpergewicht von 60 kg) im Fall von oraler Verabreichung typischerweise von etwa 0,1 bis 100 mg pro Tag, vorzugsweise etwa 1,0 bis 50 mg pro Tag und mehr bevorzugt etwa 1,0 bis 20 mg pro Tag.
Im Fall von parenteraler Verabreichung ist die Einzeldosierung in der Form eines Injektionspräparats zum Beispiel für einen Erwachsenen (ein Körpergewicht von 60 kg) normalerweise etwa 0,01 bis 30 mg pro Tag, bevorzugt etwa 0,1 bis 20 mg pro Tag und mehr bevorzugt etwa 0,1 bis 10 mg pro Tag, obwohl sie entsprechend dem Individuum der Verabreichung, Zielorgan, den Symptomen und dem Verabreichungsverfahren variiert; und die Verabreichung wird vorzugsweise durch intravenöse Injektion ausgeführt. Zur Verabreichung an andere Tiere kann eine Menge der Verbindung, umgerechnet auf die Menge pro 60 kg Körpergewicht, oder die Menge, umgerechnet auf die Menge pro Körperoberfläche, verabreicht werden.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1 zeigt Photographien, die die Ergebnisse des Nachweises der in vitro-Bindung von mot-1 und mot-2 an p53 zeigen.

(A) In vitro-translatiertes, ³⁵S-markiertes murines p53 wurde mit anti-p53-Antikörpern immunpräzipitiert. Das kleine (43 kDa) Produkt präzipitierte mit PAb 1620 (spezifisch gegen Wildtyp-p53-Konformation), aber nicht mit PAb 421, das ein Carboxy-terminales Epitop erkennt.
(B) p53 co-präzipitierte mit sowohl mot-1 als auch mot-2 (Reihen 2–3), wohingegen die Carboxy-terminal verkürzte Form von p53 das nicht tat. Immunpräzipitierte Mortaline wurden durch Western-Blot-Verfahren mit anti-His-Markierungs-Antikörpern nachgewiesen, und p53 wurde durch Autoradiographie nachgewiesen.

2 zeigt Zeichnungen ((B)–(D) sind Photographien), die die Kartierung der p53-Bindungsdomäne von Mortalinen zeigen.

(A) Schematische Illustration von Mortalin-Deletionsmutanten. Die zwei Aminosäuren (Reste 618 und 624), die sich zwischen mot-1 und mot-2 unterscheiden, sind angezeigt. Fragmente, die die Fähigkeit zur Bindung an p53 beibehalten, sind mit durchgehenden Linien angezeigt, und jene ohne die Bindungsfähigkeit sind mit gepunkteten Linien angezeigt.
(B) His-markierte Mortalin-Deletionsmutanten wurden zu COS7-Zelllysaten zugefügt und wurden durch Western-Blot-Verfahren mit anti-His-Markierungs-Antikörpern nachgewiesen (Input (10%), linkes Feld). p53-Immunkomplexe (p53-IC) wurden auf Co-Präzipitation mit Mortalin durch Western-Blot-Verfahren mit anti-His-Markierungs-Antikörpern analysiert (rechtes Feld). Die Banden, die mit den Deletionsmutanten korrespondieren, die keine Bindung zeigten, sind eingerahmt. Immunpräzipitiertes p53 wurde durch Sondieren der gleichen Membran mit anti-p53 (monoclonalem)-Antikörper nachgewiesen.
(C) Die Steigerung der Mengen des Peptids (comp. Pep), das den Mortalin-Aminosäureresten 253–282, die zugegeben werden sollen, entspricht, senkte die Menge des Peptids, das den Mortalin-Aminosäureresten 1–435 (mot 1–435) korrespondiert, und des Peptids, das mit den Mortalin-Aminosäureresten 105–435 (mot-105–435) entspricht. p53 wurde mit dem polyclonalen anti-p53-Antikörper (CM-1) immunpräzipitiert und durch Western-Blot-Verfahren mit einem monoclonalen anti-p53-Antikörper (PAb 421)) (Banden mit einer Pfeilspitze dargestellt) nachgewiesen. Co-immunpräzipitiertes Mortalin wurde durch Western-Blot-Verfahren mit anti-His-Markierungs-Antikörpern nachgewiesen (angezeigt durch Pfeile).
(D) COS7-Zellen wurden mit Expressionskonstrukten transfiziert, die V5-markierte Mortalin-Deletions-Mutantenproteine (Reste von Aminosäurerest 250 bis 435 und 1 bis 435) codieren, und die Zelllysate wurden mit anti-p53-Antikörper (CM-1, Novocastra) immunpräzipitiert. p53-Immunkomplexe (Reihen 3–4) und Eingangs-Protein (Reihen 1–2, 10% der Menge des Zelllysats, das für Immunpräzipitation verwendet wurde) wurden mit anti-Mortalin- und anti-VS-Markierungs-Antikörpern einem Western-Blot-Verfahren unterzogen, um endogenes Mortalin (angezeigt durch Pfeil) beziehungsweise Mortalinfragmente nachzuweisen. Die p53-Immunkomplexe (IC) wurden auch mit einem monoclonalen anti-p53-Antikörper (Pab 421) einem Western-Blot-Verfahren unterzogen (angezeigt durch Pfeilspitze; Reihen 3–4, überlappt mit V5-markierten Mortalin-Aminosäureresten 1–435 in Reihe 4), um immunpräzipitiertes p53 nachzuweisen.

3 beschreibt eine Illustration, Graphik und Photographie (Feld C), die das Ergebnis eines p53-vermittelten in vivo-Reportertests in der Anwesenheit von verschiedenen Mortalinmutanten zeigen.

(A) Schematische Illustration der Struktur von Mortalin und Mutanten davon. Positionen von hsp70, EF-Hand- und Leucin-Reisverschlußmotiven sind gezeigt, und Deletionen von diesen Motiven (Mutanten 11–13) sind durch gepunktete Linien gezeigt. Die Längen der drei Carboxy-terminalen Deletionsmutanten (mut-14, -15 und -16) sind angezeigt, und die Aminosäuren an den Resten 618 und 624 sind durch Einzelbuchstaben-Aminosäure-Codes über der Linie, die jedes Konstrukt repräsentiert, angezeigt.
(B) Beide Aminosäuren, die einzigartig für mot-1 sind, zusammen mit den drei vorhergesagten Motivregionen, wurden benötigt, um Mortalin-induzierte Repression von p-53-induzierter Transaktivierung zu verhindern. Co-Transfektion des p53-Expressionsplasmids und der Mortalinkonstrukte, die eine (mut-V618M, mut-R624G) oder keine (mot-2) der Aminosäuren des mot-1-Typs an den Aminosäureresten 618 und 624 enthielten, resultierte in Repression der auf p53 ansprechenden Reporteraktivität in p53-/--Mauszellen. Entfernen von irgendeiner der drei vorhergesagten Motive (mut-11, -10 und -13) oder der Carboxy-terminalen Region einschließlich der Aminosäurereste 618 und 624 (mut-14 und -15) von mot-1 resultierte auch in Repression der p53-Aktivität. mot-1 und mut-16 (das die Aminosäuren des mot-1-Typs an den Aminosäureresten 618 und 624 beibehält, dem aber die 30 Aminosäuren des Carboxyendes fehlen) hatten nur einen geringen Effekt auf die Transaktivierung von p53. pSRα ist die Kontrolle für den leeren Plasmidvektor.
(C) Die p53-Aktivität, die für das auf p53 ansprechende β-Galactosidase-Reporterkonstrukt nachgewiesen wurde, wurde inhibiert, wenn ein Plasmid, das mot-2 (b und i), mut-11 (d und K) oder mutiertes V16M (f und m) codiert, simultan mit dem p53-Expressionsplasmid microinjiziert wurde. Im Gegensatz dazu senkten mot-1 (c und j) und mut-16 (e und l) die p53-induzierte Transaktivierung des Reporters nicht. Microinjizierte Zellen wurden durch Färben mit FITC-markiertem anti-Kaninchen-IgG sichtbar gemacht (a–g).

4 beschreibt eine Illustration und Photographien (Felder (B) und (C)), die die Mortalin-Bindungsdomäne von p53 zeigen.

(A) Schematische Illustration der Struktur von p53 und p53-Deletionsmutanten. TAD: Transaktivierungs-Domäne; SS-DBD: Sequenz-spezifische DNA-Bindungsdomäne; NLS I, II, III: Kern-Lokalisierungssignale I, II und III der Aminosäurereste 316–325, 369–375 beziehungsweise 379–384; TD: Tetramerisierungs-Domäne; und RD: regulatorische Domäne. Der schraffierte Balken weist auf die cytoplasmatische Sequestrations-Domäne (CSD) hin. GFP: grünfluoreszentes Protein, fusioniert mit p53. Die Region, die mit Mortalin band, wird mit durchgehenden Linien angezeigt.
(B) Eine Photographie, die die grüne Fluoreszenz von GFP in COS7-Zellen zeigt, die mit (a) GFP allein, (b) GFP-p53 (Aminosäurereste 312–352) und (c) GFP-p53 (Aminosäurereste 312–319) transfiziert worden sind.
(C) Mortalin wurde von Zellen, die mit GFP-markierten p53-Fragmenten transfiziert wurden, mit polyclonalen anti-Mortalin-Antikörpern immunpräzipitiert und wurde mit monoclonalen Antikörpern sichtbar gemacht. Immunkomplexe (Mot-IC) wurden auch mit monoclonalem anti-GFP-Antikörper sondiert, um nachzuweisen, ob die p53-Fusionsproteine mit Mortalin co-präzipitieren (linkes Feld). Während mit GFP alleine keine Präzipitation beobachtet wurde, co-präzipitierten GFP-p53 (Aminosäurereste 352–390) und GFP-p53 (Aminosäurereste 372–390); GFP-p53 (Aminosäurereste 312–352) und GFP-p53 (Aminosäurereste 312–390) mit Mortalin. Banden, die den schweren und leichten Ketten von IgG entsprachen, wurden auch auf Mot-IC-Gel nachgewiesen. Input-Gel (rechtes Feld) zeigt 10% der Probe, die für Immunpräzipitation verwendet wurde.

Beste Art und Weise zum Durchführen der Erfindung
Die vorliegende Erfindung wird unten detaillierter durch Beispiele beschrieben, aber die vorliegende Erfindung ist nicht auf diese Beispiele limitiert.
[Beispiel 1] Analyse der Interaktion zwischen Mortalin-Protein und p53-Protein (in vitro-Bindungstest)
Nach Herstellen der mRNA, die das Volllängen-Maus-Wildtyp-p53 codiert, mit einer Matrize des pSP65/p53-Plasmids (Braithwaite, A. W. und Jenkins, J. R. (1989) J. Virol. 63, 1792–1799) unter Verwendung des Transprobe T Kit (Pharmacia) wurde [³⁵S]-markiertes p53-Protein durch Durchführung einer in vitro-Translationsreaktion unter Verwendung von Kaninchen-Reticulocytenlysat (Stratagene) für 1 Stunde in der Anwesenheit von L-[³⁵S]Methionin erhalten. Nach Auftrennen der Translationsprodukte durch SDS-PAGE wurden die Translationsreaktionsprodukte durch Autoradiographie bestätigt. Das in vitro translatierte p53-Protein wurde durch Immunpräzipitation mit anti-p53-Antikörpern (Pab 421, Pab 1620 (Calbiochem) und PAb 122 (Boehringer-Mannheim)) aufgereinigt und wurde in dem folgenden, unten beschriebenen in vitro-Bindungstest verwendet.
Nach Herstellen der cDNAs, die das rekombinante Mortalin-Protein (Volllänge) und verschiedene Deletionsmutanten (später beschrieben) codieren, durch PCR und deren Konvertierung in eine Form durch Insertion der cDNAs in den pQE30-Vektor (Qiagen), um ein His-markiertes Protein zu codieren, wurden die cDNAs zur Expression in E. coli eingebracht. Die resultierenden bakteriellen Extrakte wurden mit Ni-NTA-Agarose (Qiagen) aufgereinigt. Die resultierenden, His-markierten rekombinanten Mortalin-Proteine (0,5 bis 1 μg) wurden mit dem vorher hergestellten, in vitro-translatierten, [³⁵S]-markierten p53-Protein in der Anwesenheit von entweder 1 bis 2 mg Rinderserumalbumin oder COS7-Zelllysat in Nonidet P-40-Lösung (400 μl) gemischt, gefolgt von der Zugabe von anti-Mortalin-Antikörper (anti-mtHSP70, Affinity Bioreagents) oder anti-p53-Antikörper (CM1, Novo Castra), und wurden für 1 bis 2 Stunden bei 4°C inkubieren. Die gebildeten Immunkomplexe wurden für 30 Minuten mit 20 μl Protein-A/G Sepharose (Gibco) gemischt und durch zentrifugale Auftrennung gewonnen. Darüber hinaus wurden Proteine, die durch Erhitzen der gewonnenen Sepharosekugeln auf 95°C in einem Probenpuffer, der SDS enthielt, eluiert wurden, durch SDS-PAGE aufgetrennt und auf eine Nitrocellulosemembran transferiert. Dann wurde p53-Protein durch Autoradiographie nachgewiesen; Mortalin und Deletionsmutanten davon wurden durch Western-Blot-Verfahren mit anti-His-Antikörper und ECL-Chemiluminiszenz (Amersham) nachgewiesen.
Als ein Ergebnis, wie in 1B gezeigt, banden die molekularen Mortalin-Arten von mot-1 und mot-2 spezifisch mit dem Volllängen-p53-Protein, während für das p53-Protein von 43 kDa, dem der C-Endteil resultierend von der inkompletten in vitro-Translationsreaktion fehlte, bestätigt wurde, dass es mit keiner der molekularen Mortalin-Arten bindet.
[Beispiel 2] Suche nach einer p53-Bindungsregion unter Verwendung von teilweise deletierten mutierten Mortalin-Proteinen (in vitro-Bindungstest)
Um die verschiedenen teilweise deletierten mutierten Mortalin-Proteine, die in 2A gezeigt sind, herzustellen, wurden entsprechende cDNA-Fragmente durch PCR hergestellt, gefolgt von der Herstellung von His-markierten Proteinen gemäß dem Verfahren, das in Beispiel 1 beschrieben ist. Die resultierenden, teilweise deletierten mutierten Mortalin-Proteine wurden einer Immunpräzipitation unter Verwendung von anti-p53-Antikörper gemäß dem in Beispiel 1 beschriebenen Verfahren unterzogen, und die co-präzipitierten Proteine wurden durch Western-Blot-Verfahren unter Verwendung eines anti-His-Antikörpers nachgewiesen.
Als ein Ergebnis, wie in 2B gezeigt, obwohl die Fragmente der Aminosäurereste 250–410, 105–282, 105–435, 105–538 und 1–435 die Fähigkeit, p53 zu binden, beibehielten, verloren die Fragmente der Aminosäurereste 105–252, 47–252 und 403–679 deutlich die Bindungsfähigkeit. Diese Ergebnisse sind in 2A gezeigt.
Daher wurde die Region des Mortalinmoleküls, die in die Bindung mit p53 involviert ist, als innerhalb der Region der Aminosäurereste 253–282 vorhanden betrachtet.
Als Nächstes wurde ein kompetitiver Inhibitionstest durchgeführt, um die Beteiligung dieses Peptids der Aminosäurereste 253–282 in der Bindung an p53 zu bestätigen. Wie in 2C gezeigt, inhibierte das Peptidfragment der Aminosäurereste 253–282 die Bindung zwischen p53 und Mortalin (Aminosäurereste 1–435 oder 105–435) in einer Dosis-abhängigen Weise.
Da jedoch eine große Menge an Peptid für die Inhibition der Bindung mit diesem Peptid der Aminosäurereste 253–282 nötig war, wurde nahe gelegt, dass der kompetitive Effekt des Peptids nicht hoch war. Daher exprimierte der vorliegende Erfinder als Nächstes die V5-markierten Mortalin-Deletionsmutanten, die Aminosäurereste 250–435, 252–679 (nicht gezeigt) und 1–435 in COS7-Zellen exprimierten. Ihre Anwesenheit in p58-Immunkomplexen wurde durch Western-Blot-Verfahren mit anti-V5-Markierungs-Antikörper analysiert (2D).
Als ein Ergebnis wurde jede der Mortalin-Deletionsmutanten in den p53-Immunkomplexen nachgewiesen (als eine einzelne Bande für das Fragment der Aminosäurereste 250–435 und als multiple Banden (degradierte Produkte) für das Fragment der Aminosäurereste 1–435).
Bemerkenswerterweise co-präzipitierten nur vernachlässigbare Mengen von endogenem Mortalin mit p53 von Zelllysaten, die das Mortalinfragment der Aminosäurereste 250–435 exprimierten (2D, Reihe 3), was zeigt, dass diese Region effizient mit Volllängen-Mortalin um die Bindung an p53 konkurrieren kann. Auf der anderen Seite konkurrierten die Peptide der Aminosäurereste 252–679 und 1–435, die eine p53-Bindungsregion ähnlich zu den Mortalin-Aminosäureresten 250–435 enthalten, nicht mit Volllängen-Mortalin um die Bindung an p53.
[Beispiel 3] Suche nach einer p53-Bindungsregion unter Verwendung von teilweise deletierten mutierten Mortalinproteinen (eine Suche, basierend auf der Inhibition von p53-abhängiger Transkriptions-Aktivierung)
Nach Herstellen von cDNAs, die mutierte Mortalinproteine, denen alle in 3A gezeigten Funktionen fehlen, und Mortalin-Proteine, die an zwei unterschiedlichen Aminosäureresten zwischen mot-1 und mot-2 gemäß dem in Beispiel 1 beschriebenen Verfahren punktmutiert sind, codieren, wurden die cDNAs für eine p53-abhängige Reporteranalyse verwendet. Genau gesagt wurden Zellen, die durch stabile Transfektion von Plasmid PG130-luc, worin das Leuchtkäfer-Luciferasegen mit einem auf p53 ansprechenden Promotor verknüpft worden ist (der die Promotorsequenz „GAACATGTCCCAACATGTTG" aufweist und das Gen stromabwärts von jener Sequenz als ein Ergebnis der Bindung mit dem p53-Protein exprimiert), und von Temperatur-empfindlichem mutiertem p53-Protein-Expressionsvektor pMSVp53Val135 in embryonale Maus-Fibroblasten, denen das funktionelle p53-Gen fehlt (P53-/-MEF) (siehe Wadhwa, R. et al. (1998) J. Biol. Chem. 273, 29586–29591), erhalten wurden, mit verschiedenen mutierten Mortalinprotein-Expressionsvektoren und pRL-CMV, das als eine interne Kontrolle für die Standardisierung der Transkriptionseffizienz diente, transfiziert. Nach Inkubieren bei 32,5°C, was eine zulässige Temperatur für das mutierte p53-Protein ist, wurde die Luciferase-Aktivität gemessen.
Als ein Ergebnis hatte, wie in 3B gezeigt, im Gegensatz zur Expression des mot-2-Proteins, das die p53-abhängige transkriptionelle Aktivierung signifikant inhibierte, das mot-1-Protein trotz des strukturellen Unterschieds von nur zwei Aminosäureresten keinen Effekt auf die Fähigkeit der p53-abhängigen transkriptionellen Aktivierung. Jede der Deletionen von jeder funktionellen Domäne oder der Regionen, die zwischen mot-1 und mot-2 unterschiedlich waren, bewirkte eine Hemmung der p53-abhängigen transkriptionellen Aktivierung ähnlich dem mot-2-Protein auf das mutierte Mortalin-Protein. Mutiertes V618M oder R624G, in denen einer der zwei Aminosäurereste, die sich zwischen mot-1 und mot-2 unterschieden, dem Aminosäurerest wie in mot-2 gleich gemacht wurde, zeigten die Inhibierung von p53-abhängiger transkriptioneller Aktivierung ähnlich wie mot-2, und der Effekt wurde besonders stark in mutiertem R624G beobachtet. Eine definitiv stärkere Fähigkeit, p53-abhängige transkriptionelle Aktivierung im Vergleich zu mot-2 zu inhibieren, wurde unter all den Deletionsmutanten auch in der Mutante mut 12 (Δ233–251) beobachtet, in der die EF-Hand und die Hsp70-homologe Domäne, die sich von der EF-Hand fortsetzt, deletiert worden sind. Die Aktivität von mutiertem mut16 (Δ651–679), in dem das C-Ende der Region deletiert worden ist, die die zwei Aminosäurereste enthält, die zwischen mot-1 und mot-2 unterschiedlich waren, war vergleichbar zu der Aktivität von mot-1.
Ähnliche Ergebnisse wurden gemäß einem Experiment erhalten, in dem die obigen mutierten Mortalinproteine, das Temperatur-empfindliche mutierte p53-Protein und das auf p53 ansprechende β-gal-Reportergen pRGCΔfos-lacZ durch Mikroinjektion in die menschliche Osteosarcom-Zelllinie Saos2 eingebracht wurden. Es wurde nämlich wie in 3C beobachtet, die p53-abhängige transkriptionelle Aktivierung durch die Transfektion eines Expressionsvektors, der mot-2 oder die mutierten mot-1-Proteine mut11 oder V618M codierte, signifikant inhibiert. Im Gegensatz dazu hatten mot-1- oder mut16-Protein keinen signifikanten Effekt auf die p53-abhängige transkriptionelle Aktivität ähnlich der Transfektion von embryonalen Maus-Fibroblasten (Tabelle 1). Zusätzlich wurde die Unterdrückung der p53-abhängigen transkriptionellen Aktivierung durch das mot-1-Protein, das die Mutation R624G aufweist, signifikant durch intrazelluläre Injektion von anti-Mortalin neutralisierendem Antikörper inhibiert (Tabelle 1).
Tabelle 1
Aus den obigen Ergebnissen wurde vorgeschlagen, dass das mot-2-Protein Translokation von p53 in den Kern durch die Interaktion mit dem p53-Protein durch die Region von Aminosäureresten 253–282 verhindert, was so die transkriptionelle Aktivierung durch p53 verhindert. Es wurde vorgeschlagen, dass die Substitution von zwei Aminosäuren in mot-1 die Interaktion mit p53-Protein durch Änderungen in der Sekundärstruktur des Proteins oder Interaktion mit einem anderen Protein (mot-1-p53-Bindung verhindernder Faktor) inhibiert.
[Beispiel 4] Suche nach Regionen im p53-Protein, die in die Bindung mit Mortalin involviert sind
Da dem in vitro-translatierten Produkt eines um 43 kDa verkürzten p53, dem das C-Ende fehlt, die Fähigkeit, wie in Beispiel 1 beschrieben, an Mortalin-Protein zu binden, fehlt, wurde angenommen, dass diese deletierte Region die Region enthält, die mit der Bindung an Mortalin in Beziehung steht. Daher wurden, wie in 4A gezeigt, kleinere Fragmente dieser Region hergestellt und in COS7-Zellen als GFP-fusioniertes Protein exprimiert.
Als ein Ergebnis, wie in 4B gezeigt, waren in Zellen, die mit GFP-p53 (Aminosäurereste 312–352) transfiziert wurden, etwa 90% der exprimierten Proteine in der Nähe des Kerns lokalisiert, während in Zellen, die mit GFP-p53 (Aminosäurereste 312–390) transfiziert wurden, alle Proteine im Cytoplasma lokalisiert waren.
Zusätzlich wurde als ein Ergebnis der Immunpräzipitation unter Verwendung von anti-Mortalin-Antikörper für sowohl GFP-p53 (Aminosäurereste 312–352) als auch GFP-p53 (Aminosäurereste 312–390) bestätigt, dass sie an Mortalin binden (4C).
Es ist berichtet worden, dass die Anwesenheit einer Tetramerisierungsdomäne und einer Aktivitäts-regulierenden Domäne im C-Ende von p53 existiert, und es ist auch bekannt, dass die Anwesenheit von drei Kernlokalisierungs-Signalen (netzartige Regionen I, II und III in 4A) und einem Signal, das mit Cytoplasma-Lokalisierung in Zusammenhang steht (CSD: Aminosäurereste 340–351), in dieser Region vorhanden ist. Die obigen Ergebnisse legen nahe, dass die Bindung von Mortalin und p53 durch eine Cytoplasma-Lokalisierungs-Signalsequenz von p53 vermittelt wird, und legen deutlich nahe, dass Bindung von Mortalin und p53 involviert ist in die cytoplasmatische Sequestrierung, die vor Kurzem bei Brustkrebs, Neuroblastom und Colonkrebs berichtet worden ist (Ostermeyer, A. G. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93, 15190–15194, 1996; Stommel, J. M. et al., EMBO J., 18, 1660–1672, 1999).
Industrielle Anwendbarkeit
Gemäß der vorliegenden Erfindung werden Verfahren zum Screenen auf Krebsheilmittel geliefert, die die interagierende Region von p53 und Mortalin ausnutzen. Als ein Ergebnis können im Vergleich zu Verfahren zum Screenen jener, die Interaktion zwischen Volllängen-Proteinen anwenden, spezifische Krebsheilmittel effizienter und wirtschaftlicher gescreent werden.

Claims

Verfahren zum Screenen für Kandidatenverbindungen als Krebsheilmittel, umfassend die Schritte: (a) Inkontaktbringen eines Peptids umfassend die Aminosäurereste 253 bis 282 einer Aminosäuresequenz des menschlichen mot-1-Proteins, auch bekannt als mt hsp75, mit einem Peptid umfassend die Aminosäurereste 312 bis 352 einer Aminosäuresequenz des menschlichen p53 in Gegenwart einer Testprobe; (b) Nachweisen der Bindung zwischen den Peptiden; und (c) Auswählen der Verbindung, welche die Bindung zwischen den Peptiden im Vergleich zur Bindung, die in Abwesenheit der Testprobe auftritt, schwächt.
Verfahren zum Screenen für Kandidatenverbindungen als Krebsheilmittel, umfassend die Schritte: (a) Inkontaktbringen einer Testprobe mit einer Zelle, die mit den folgenden Vektoren transfiziert wurde: i. einem Vektor enthaltend DNA, die ein Peptid umfassend die Aminosäurereste 253 bis 282 einer Aminosäuresequenz des menschlichen mot-1-Proteins, auch bekannt als mt hsp75, codiert; ii. einem Vektor enthaltend DNA, die ein Peptid umfassend die Aminosäurereste 312 bis 352 einer Aminosäuresequenz des menschlichen p53 codiert, wobei das Peptid den auf menschliches p53 ansprechenden Promotor aktiviert; und iii. einem Vektor enthaltend den auf menschliches p53 ansprechenden Promotor und ein Reportergen, das stromabwärts davon funktionell gebunden ist; (b) Nachweisen der Aktivität des Reportergens in der Zelle; und (c) Auswählen der Verbindung, welche die Reporterexpression im Vergleich zu derjenigen, die in Abwesenheit der Testprobe auftritt, verstärkt.
Kit zum Screenen für Kandidatenverbindungen als Krebsheilmittel, umfassend: (a) ein Peptid umfassend die Aminosäurereste 253 bis 282 einer Aminosäuresequenz des menschlichen mot-1-Proteins, auch bekannt als mt hsp75; und (b) ein Peptid umfassend die Aminosäurereste 312 bis 352 einer Aminosäuresequenz des menschlichen p53.
Kit zum Screenen für Kandidatenverbindungen als Krebsheilmittel umfassend: (a) einen Vektor enthaltend DNA, die ein Peptid umfassend die Aminosäurereste 253 bis 282 einer Aminosäuresequenz des menschlichen mot-1-Proteins, auch bekannt als mt hsp75, codiert; (b) einen Vektor enthaltend DNA, die ein Peptid umfassend die Aminosäurereste 312 bis 352 einer Aminosäuresequenz des menschlichen p53 codiert, wobei das Peptid den menschlichen p53-Promotor aktiviert; und (c) einen Vektor enthaltend den auf menschliches p53 ansprechenden Promotor und ein Reportergen, das stromabwärts davon funktionell gebunden ist.