DE60019458T2

DE60019458T2 - Stabilisierendes verdünnungsmittel für polypeptide und antigene

Info

Publication number: DE60019458T2
Application number: DE60019458T
Authority: DE
Inventors: W. Jeffrey STEAFFENS; Laura Panzarella
Original assignee: Asahi Kasei Corp; Asahi Kasei Chemicals Corp; Asahi Chemical Industry Co Ltd; Thermo Biostar Inc
Current assignee: Asahi Kasei Corp; Inverness Medical Biostar Inc
Priority date: 1999-12-14
Filing date: 2000-12-07
Publication date: 2006-02-23
Anticipated expiration: 2020-12-08
Also published as: AU783246C; US20020160359A1; US6579688B2; US20020076813A1; TWI257953B; DE60019458D1; AU2075001A; WO2001044441A1; AU783246B2; CN1409758A; KR20020082206A; JP3884652B2; EP1242576B1; KR100771294B1; ATE293159T1; CN1286969C; CA2396503A1; JP2003517153A; EP1242576A1

Description

Fachgebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft wässrige Zusammensetzungen, die zur Stabilisierung von Polypeptiden und Antigenen nützlich sind. Die stabilisierten Polypeptide und Antigene sind bei analytischen Methoden wie dem Antigen-spezifischen Nachweis, ebenso wie bei anderen pharmazeutischen Anwendungen, bei denen die Stabilisierung dieser Komponenten in einer wässrigen Lösung erwünscht ist, nützlich.
Hintergrund der Erfindung
Im Folgenden handelt es sich um eine Erörterung der Literatur, die für die hierin beschriebene Erfindung potentiell relevant ist. Allerdings ist keiner der hierin erörterten Literaturverweise als Stand der Technik anerkannt.
Die Stabilisierung von Polypeptiden und Antigenen in wässrigen Lösungen ist oftmals schwierig. So führt beispielsweise die Lagerung dieser Lösungen bei Raumtemperatur über längere Zeiträume hinweg zur Zerstörung der in der wässrigen Lösung enthaltenen Polypeptide oder Antigene. Insbesondere Antigene von Bakterien, Viren und anderen Mikroorganismen wurden bei Lagerung in einem wässrigen Medium als instabil dokumentiert. Ein Beispiel stellen Hüllviren dar, wie z.B. Influenza-Viren der Orthomyxovirus-Familie, die Antigene enthalten, die bei einem breiten Bereich von Lagertemperaturen mit der Zeit in Lösung zerstört werden. Fachleute des Gebiets werden bei üblicher Sachkenntnis verstehen, dass die Stabilisierung in Lösung von verschiedenen bakteriellen Antigenen, z.B. einigen Toxinen, ebenfalls schwierig ist. Um eine Zerstörung in wässriger Lösung zu vermeiden, haben Fachleute des Gebiets die Lyophilisierung und Gefriertrocknung als Methoden zur Konservierung von Polypeptiden oder Antigenen angewandt. In der Tat zeigt der breite Einsatz der Lyophilisierung und Gefriertrocknung die Unzulänglichkeiten und Schwierigkeiten beim Konservieren solcher Komponenten in wässrigen Lösungen auf.
Zahlreiche Veröffentlichungen im Fachgebiet beschreiben Methoden zur Erhöhung der Stabilität eines lyophilisierten Reagens, ebenso wie die Schwierigkeiten, die selbst diesem Stand der Technik anhaften. Zum Beispiel beschreiben US-Patent Nrn. 5.955.448, 4.496.537 als auch PCT-Einreichung WO 97/04801 allesamt Verbesserungen bei den Lyophilisationstechniken. Die Lyophilisation von proteinhaltigen Lösungen erlegt jedoch dem Hersteller und dem Endverbraucher beträchtliche Kosten und Unannehmlichkeiten auf, ebenso wie die Inkaufnahme eines erhöhten Fehlerrisikos durch Rekonstitution und Kontamination. Darüber hinaus erfordert die Gefriertrocknung einer Lösung spezielle Geräte und kann letztlich, wenn wiederholte Kreislaufprozesse erfolgen, zu einem Abbau des Proteins führen. Für die kommerzielle Anwendung erweist sich die Zerstörung von Polypeptiden und Antigenen in wässrigen Lösungen als kostspielig, da solche Lösungen nach nur kurzer Lagerdauer ersetzt werden müssen.
Diese Erfindung betrifft ein wässriges Stabilisationsreagens oder -verdünnungsmittel, welches die Stabilität von Polypeptiden und anderen nicht-proteinhaltigen Verbindungen in Lösung erhöht. Antigene, zum Beispiel Kohlehydrate, Proteine, Lipoproteine, Lipopolysaccharide, Polysaccharide, Nukleinsäuren, Nukleoproteine und mit Proteinen, Lipiden und anderen Verbindungen komplexierte Kohlehydrate stellen anschauliche Beispiele der Typen von Antigenen dar, die unter Anwendung der vorliegenden Erfindung stabilisiert werden können. Unter Anwendung neuartiger Reagens-Komponenten wird mit der Erfindung die Stabilität von Polypeptiden und Antigenen in derzeit kommerziell verfügbaren Verdünnungsmitteln oder bei im Fachgebiet beschriebenen Verdünnungsmitteln verbessert. Die Erfindung ist besonders nützlich zur Stabillisierung von Antigenen und Polypeptiden, die als Kontrollreagentien bei diagnostischen Assays oder bei anderen Anwendungen, die stabile wässrige Lösungen solcher Komponenten erfordern, verwendet werden. Das stabilisierende Verdünnungsmittel der vorliegenden Erfindung ist zur Stabilisierung von Polypeptiden und Antigenen für eine Lagerung bei etwa 2 – 8°C, bei Raumtemperatur oder bei Temperaturen von etwa 45°C über längere Zeiträume hinweg nützlich.
In der PCT-Einreichung Nr. WO 99/15901 ist ein Verdünnungsmittel für die Stabilisation von Antigenen, insbesondere von Hepatitis-C-Virus-(HCV)-Antigenen, beschrieben. Das HCV-Verdünnungsmittel umfasst ein Reduktionsmittel, um die HCV-Antigene in einer reduzierten Form zu halten. Die Veröffentlichung berichtet, dass die Aufnahme eines Reduktionsmittels in ein Verdünnungsmittel die Immunreaktivität eines HCV-Antigens für bis zu sieben Tagen aufrechterhielt. Das berichtete Verdünnungsmittel umfasste weiterhin Natriumphosphat, pH 6,5 (oder einen anderen Puffer), EDTA (oder einen anderen Chelatbildner), DTT (oder ein anderes Reduktionsmittel), Gelatine (oder eine andere Proteinblockierungsquelle), Ammoniumthiocyanat (oder ein anderes Chaotrop), Natriumazid (oder ein anderes Konservierungsmittel) und SDS (oder ein anderes Detergens). Allerdings kann die Aufnahme eines Reduktionsmittels in das Verdünnungsmittel bei der Stabilisierung von einer Reihe von Antigenen anderer Mikroorganismen unwirksam oder schädlich sein.
US-Patent Nr. 4.956.274 betrifft Techniken zum Stabilisieren von Peptidfragmenten von β-Galactosidase zur Verwendung in Komplementierungs-Assays. Die in US-Patent Nr. 4.956.274 beschriebene Lösung enthielt ein ionisches grenzflächenaktives Mittel oder ein von einem Zucker-Rest abgeleitetes grenzflächenaktives Mittel, um den Abbau der β-Galactosidase-Peptidfragmente zu verlangsamen. Die grenzflächenaktiven Mittel denaturierten allerdings auch die Enzymfragmente und mussten daher entfernt oder neutralisiert werden, um den enzymatischen Fragmenten die Rückkehr in ihre korrekte Konformation und die Rückgewinnung der enzymatischen Aktivität zu ermöglichen, was darauf hinweist, dass die Lösung die native Form des Proteins nicht stabilisierte. Die grenzflächenaktiven Mittel werden direkt vor dem Assay unter Verwendung von Cyclodextrin neutralisiert. Alternativ wurde die Wirkung der grenzflächenaktiven Mittel mit einer hohen Konzentration an Serum maskiert. Weitere Komponenten des beschriebenen Reagens umfassten einen Chelatbildner, Puffer, Bakteriozid, Magnesium oder andere Ionen, Reduktionsmittel, Lösungsvermittler, z.B. Lösungsmittel wie Ethylenglycol, und nicht-ionische Detergentien. Wie Fachleute des Gebiets erkennen werden, kann das Denaturieren und Renaturieren von Proteinen oder Enzymfragmenten einige antigene Epitope beschädigen und sie inaktiv machen.
In US-Patent Nr. 5.459.033 ist eine Lösung beschrieben, die zur Vermeidung einer Virusaggregation nützlich ist. Die Lösung enthält berichtetermaßen N-Laurylsarcosin oder andere anionische grenzflächenaktive Mittel. Von der Lösung wurde angegeben, dass sie die Stabilität ausgehend von der Annahme erhöht, dass Virionpartikel, insbesondere Hepatitis- und Herpes-Viren, aufgrund hydrophober Anziehungskräfte aggregieren und dabei die Empfindlichkeit herabsetzen. Von diesem Verdünnungsmittel wurde nicht berichtet, dass es die katalytische Aktivität oder Immunogenität des Antigens verbessert oder konserviert, doch eine Aggregation verhütet. Auch musste die Lösung, bevor sie verwendet werden konnte, berichtetermaßen 15 Stunden bis 10 Tage bei 2 – 35°C inkubiert werden, um eine dauerhafte Stabilität zu gewährleisten, was der Herstellbarkeit des Endprodukts eine zusätzliche wesentliche Beschränkung auferlegt.
In US-Patent Nr. 5.660.978 ist eine Methode zum Stabilisieren eines Antigens, insbesondere eines labilen Proteinantigens, speziell eines Enzyms, durch Aufnahme in eine konzentrierte Lösung eines Antigens (z.B. eines Serums), eines Antigen-spezifischen Antikörpers oder eines Abschnitts davon (insbesondere eines Fab) zur Verhinderung von Proteolyse oder Oxidation beschrieben. Die Einführung des Serums oder nicht-spezifischen IgG würde nicht erwartetermaßen den gewünschten Schutz oder die Spezifität an Schutz für solch ein Verdünnungsmittel bereitstellen. Darüber hinaus war die Stabilisierung abgeschlossen, bevor die Antigene in ein Verdünnungsmittel eingebracht wurden. Im Gegensatz dazu wird die vorliegende Erfindung durch das Verdünnungsmittel selbst stabilisiert. Außerdem stabilisiert die vorliegende Erfindung eine relativ verdünnte Lösung, und zwar von Anfang an und nicht erst in Stadien, wie sie die patentierte Erfindung nahelegt. Die Verwendung von Antikörpern zur strukturellen Stabilisierung eines Antigens wäre insbesondere dann problematisch, wenn eine oder mehrere der antigenen Stellen das Ziel eines immunologischen Assays sind. Außerdem würde ein Fachmann des Gebiets Schwierigkeiten damit haben, kontinuierlich ein Verdünnungsmittel wie das im '978-Patent beschriebene zu erzeugen, welches konformationell das Antigen konserviert, doch die spezifische Enzymaktivität nicht hemmt. Die Erfindung nützt im wesentlichen die Antikörper-Abschnitte als ein fixatives Reagens, anstelle ei nes chemischen Fixativs, aus und beschreibt daher eigentlich nicht ein stabilisierendes Verdünnungsmittel.
Landi, S. und Held, HR (Tubercle 59 (1978) 121-133) berichteten von der Zugabe eines Tween-80-Detergens zu einer verdünnten Lösung und schlugen vor, dass die Tuberculin-PPD-Stabilität durch diese Zugabe aufgrund der anti-adsorptiven Eigenschaften des Detergens erhöht war. Das Tuberculin-Präparat, wie hergestellt von Connaught Laboratories, Ltd., enthält Tuberculin-PPD, 0,3 % Phenol (wirkt berichtetermaßen als ein Konservierungsmittel) und 0,0005 % Tween-80 in PBS. Phenol ist ein gefährlicher Stoff, der in der vorliegenden Erfindung nicht akzeptabel wäre und wahrscheinlich einige Proteine denaturiert.
Trotz der Fortschritte in der Formulierung von Verdünnungen und der Lagermethoden von Lyophilisaten besteht nach wie vor Bedarf an einem Verdünnungsmittel, das die langfristige Stabilität verschiedener Polypeptide und Antigene, insbesondere der Antigene von Mikroorganismen, die in Lösung gelagert sind, angemessen verbessert.
Zusammenfassung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung stellt ein Reagens zur Stabilisierung von Polypeptiden und Antigenen bereit. Das Reagens ist besonders nützlich für die Stabilisierung von Kontroll- oder Bezugs-Antigenen, die bei analytischen Verfahrensweisen Verwendung finden. Antigene wie Kohlehydrate, Proteine, Polypeptide, Polypeptid-Fragmente, Lipoproteine, Lipopolysaccharide, Polysaccharide, Nukleinsäuren, Nukleoproteine und mit Polypeptiden, Lipiden und anderen Verbindungen komplexierte Kohlehydrate stellen anschauliche Beispiele der Typen von Antigenen bereit, die unter Anwendung der vorliegenden Erfindung stabilisiert werden können.
Das beschriebene Reagens übertrifft bisherige Formulierungen hinsichtlich der Polypeptid- und Antigenstabilität sowohl bei niedrigen als auch erhöhten Temperaturen. Polypeptide und Antigene können im Reagens in löslicher Form über längere Zeiträume hinweg bei einer Vielzahl von Temperaturen von etwa 0,5°C bis zu mehr als etwa 50°C, vorzugsweise von etwa 2 bis 8°C, um Raumtemperatur (typischerweise von etwa 23°C bis etwa 28°C, wobei 25°C besonders bevorzugt sind) und etwa 42°C bis etwa 43°C, insbesondere etwa 45°C, gelagert werden. Die Stabilität bei 45°C ist prädiktiv für die Fähigkeit des Reagens, eine langfristige Antigenstabilität zu verleihen. Für den Zweck des Stabilisierens von Polypeptiden und Antigenen weist das beschriebene Reagens außerdem den Vorteil auf, eine einzelne wässrige Lösung zu sein.
In einem ersten Aspekt stellt die Erfindung eine wässrige Reagenszusammensetzung zur Erhöhung der Polypeptid- oder Antigenstabilität bereit. In bestimmten bevorzugten Ausführungsformen umfasst das Reagens eines oder mehrere der folgenden: ein oder mehrere Puffer, Blockiermittel, Lösungsmittel, Salze, Chelatbildner, Detergentien und Konservierungsmittel. Vorzugsweise enthält das Reagens kein N-Dodecanoyl-N-methylglycin oder Decanoyl-N-methylgluconamid. Das Reagens kann auch Komponenten umfassen, wie etwa ein Gewebekulturmedium oder handelsübliche Verdünnungsmittel.
Der Begriff "Puffer", wie hierin verwendet, bezieht sich auf einem Fachmann des Gebiets wohlbekannte Zusammensetzungen, die auf eine Minimierung der Veränderung des pH-Werts einer Lösung hinwirken. Bevorzugte Puffer weisen einen pKa auf, der eine wirksame Pufferung bei einem pH-Wert von 7 bis 9 ermöglicht. Bevorzugte Puffer sind ACES, ADA, BES, Bicin, Bis-Tris, CAPS, CHES, Diethylmalonat, Glycylglycin, Glycinamid-HCl, HEPES, HEPPS, Imidazol, MES, MOPS, PIPES, POPSO, TAPSO, TES, Tricin, Tris, Bicarbonat und Borat. Besonders bevorzugt sind Phosphat-Puffer. Bevorzugte Puffermittel-Konzentrationen betragen weniger als 2 M; die bevorzugtesten Konzentrationen sind 0,2 M, 0,1 M, 0,05 M, 0,02 M, 0,01 M, 0,005, 0,001 und 0,0001 M, mit einem pH-Wert von 7, 7,25, 7,5, 7,75, 8, 8,25, 8,5, 8,75 und 9.
Wie hierin verwendet, bezieht sich der Begriff "Blockiermittel" auf eine proteinreiche Quelle, die ein Gemisch von Proteinen und/oder Polypeptiden enthält, die eine oder mehrere zusätzliche Komponenten wie Lipide, Kohlehydrate, Salze und Cofaktoren wie Häm enthalten können. Der Begriff "proteinreich" wird hierin definiert. Diese Blockiermittel können zur Stabilisation von ein oder mehreren Proteinen, Polypeptiden und/oder Antigenen in den hierin beschriebenen Zusammensetzungen und Methoden verwendet werden. Bevorzugte Blockiermittel weisen einen pH-Wert von etwa 6,5 bis etwa 8,0 auf und/oder eine Osmolalität von etwa 250 bis etwa 350 mOsm/kg H₂O auf. Besonders bevorzugte Blockiermittel sind Seren, wie etwa Pferdeserum, neugeborenes Kälberserum, Kälberserum, adultes Rinderserum, Humanserum, Kaninchenserum, Schafserum, etc. als auch Serum-Ersatzstoffe, die dem Fachmann des Gebiets bekannt sind. Am bevorzugtesten als ein Blockiermittel ist fötales Kälberserum.
Der Begriff "proteinreich", wie hierin verwendet, bezieht sich auf eine Lösung, die ein Gemisch von Proteinen und/oder Polypeptiden enthält und eine Gesamtproteinkonzentration von etwa 1 g-% bis etwa 50 g-%, am bevorzugtesten etwa 3 g-% bis etwa 10 g-% aufweist. Zum Beispiel weist fötales Kälberserum einen Gesamtproteingehalt von etwa 3 g-% bis etwa 4,5 g-% auf, wohingegen adultes Rinderserum einen Gesamtproteingehalt von etwa 4,5 g-% bis etwa 8,5 g-% besitzt.
Die Begriffe "Lösungsmittel" und "Lösungsvermittler", wie hierin verwendet, beziehen sich auf eine Flüssigsubstanz, die zum Dispergieren der anderen Komponenten der Zusammensetzung in der Lage ist. Bevorzugte Lösungsmittel sind Wasser, Glycerol, DMSO, Alkohole wie Ethanol, Methanol, etc., Aceton, Dimethylsulfoxid, Acetonitril und Dimethylformamid.
Der Begriff "Salz", wie hierin verwendet, bezieht sich auf eine oder mehrere Verbindungen, die aus der Ersetzung eines Teils oder des gesamten sauren Wasserstoffs einer Säure durch ein Metall oder ein Element, das sich wie ein Metall verhält, resultiert. Bevorzugte Salze sind KCl, NaCl, MgCl₂, MgSO₄ und CaCl₂. Bevorzugte Salzkonzentrationen liegen zwischen 4 M und 0,1 mM, am bevorzugtesten zwischen 2 M und 50 mM.
Der Begriff "Chelatbildner", wie hierin verwendet, bezieht sich auf ein Molekül, das Metallionen bindet, indem es üblicherweise zwei oder mehrere komplexbildende Gruppen innerhalb des Moleküls bindet. Chelatbildner sind im Fachgebiet wohlbekannt und umfassen bestimmte Proteine und Polypeptide, ebenso wie kleine Moleküle wie Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) und Ethylenglycol-bis(β-aminoethylether)-N,N,N',N'-tetraessigsäure (EGTA). Bevorzugte Konzentrationen der Chelatbildner liegen zwischen 100 mM und 0,01 mM, am bevorzugtesten zwischen 20 mM und 1 mM.
Der Begriff "Detergens", wie hierin verwendet, bezieht sich auf im Fachgebiet wohlbekannte Verbindungen, die zum Emulgieren von Ölen fähig sind und als Benetzungsmittel wirken. Bevorzugte Detergentien umfassen CHAPS, Cholinsäure, Desoxycholinsäure, Digitonin, n-Dodecyl-β-D-maltosid, Glycodesoxycholinsäure, N-Lauroylsarcosin, Laurylsulfat, Saponin, Tween 20 und Triton X-100. Bevorzugte Detergens-Konzentrationen liegen zwischen etwa 0,001 % und etwa 5 %. Am bevorzugtesten umfasst die Zusammensetzung etwa 0,01 %, 0,02 %, 0,03 %, 0,04 %, 0,05 %, 0,06 %, 0,07 %, 0,08 %, 0,09 %, 0,1 %, 0,2 %, 0,3 %, 0,4 %, 0,5 %, 1,0 % und 2 %.
Der Begriff "Konservierungsmittel", wie hierin verwendet, bezieht sich auf einem Fachmann des Gebiets wohlbekannte Verbindungen, die das Wachstum von Mikroorganismen verhindern. Zu bevorzugten Konservierungsmitteln zählen Thimerosal, Sorbinsäure, BHA, BHT, Microcide II (Trimethyltetradecylammoniumbromid) und Antibiotika wie Gentamycin, Penicillin, Streptomycin etc. Bevorzugte Konservierungsmittel-Konzentrationen liegen zwischen 10 % und 0,001 mM, am bevorzugtesten zwischen 1 % und 0,1 %.
Wie hierin verwendet, bezieht sich "Polypeptid" auf ein Polymer von Aminosäuren, jedoch nicht auf eine spezifische Länge des Produkts, weshalb Peptide, Oligopeptide, Proteine und Fragmente davon innerhalb der Definition liegen. Der Begriff "Polypeptid" schließt keine posttranslationale Modifikationen des Polypeptids, zum Beispiel die Glykosylierung, Acetylierung, Phosphorylierung und ähnliches, aus.
Wie hierin verwendet, umfassen "Antigene" Kohlehydrate, Proteine, Polypeptide, Lipoproteine, Lipopolysaccharide, Polysaccharide, Nukleinsäuren und mit Polypeptiden, Lipiden und anderen Verbindungen komplexierte Kohlehydrate. Antigene können zum Auslösen einer Immunantwort in einem Tier mit einem funktionalen Immunsystem fähig sein. In einer bevorzugten Ausführungsform sind die stabilisierten Antigene Polypeptidantigene. Diese Polypeptidantigene können einzeln oder in Verbindung mit anderen Molekülen vorgefunden werden. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform sind die stabilisierten Polypeptide Nukleoproteinantigene. Nukleoproteinantigene können aus einer beliebigen Anzahl von Quellen stammen und können einzeln oder in Verbindung mit anderen Molekülen vorgefunden werden.
Mit "Nukleoproteinantigenen" ist jegliches Polypeptid gemeint, das in Verbindung mit oder gebunden an einen nuklearen Komplex gefunden wird.
Ein besonders bevorzugtes Nukleoprotein ist ein Nukleoprotein vom Influenzavirus, insbesondere dem Influenza-Typ B-Virus.
Mit "Antigenstabilität" ist die Fähigkeit zur Aufrechterhaltung eines konsistenten Signals gemeint, wie von einem Reagens in einem Assay oder einer analytischen Methode, speziell einem diagnostischen Assay oder einem Immunoassay, nach der Lagerung des Reagens für einen gegebenen Zeitraum bei einer eingestellten Temperatur erzeugt. Typische Lagertemperaturen betragen etwa 2 bis 30°C. Die Antigenstabilität kann auch durch Messen der Antigen-Zerstörung bei erhöhten Temperaturen für einen kürzeren Zeitraum gemessen werden. Typische Temperaturen für akzelerierte Stabilitätstests betragen etwa 30°C bis 60°C.
Mit "Mikroorganismen" ist ein Prokaryonte, Eurkaryonte, z.B. Hefe, Virus, Prion, oder ein anderer infektiöser Partikel gemeint.
Mit "analytischer Methode" ist jegliche Technik gemeint, die den spezifischen Nachweis von ein oder mehreren Antigenen erlaubt. Zu analytischen Methoden zählen Immunoassays von jeglichem Detektions-Format und die Nukleinsäure-Hybridisation, wofür zahlreiche Beispiele im Fachgebiet bekannt sind. Eine besonders bevorzugte optische Immunoassay-Methode ist in US-Patent Nrn. 5.550.063; 5.955.377 und 5.541.057 beschrieben.
In einem zweiten Aspekt betrifft die Erfindung eine wässrige Reagenszusammensetzung zur Erhöhung der Antigen- oder Polypeptidstabilität, wobei das Antigen von einem Mikroorganismus stammt. In einer bevorzugten Ausführungsform umfassen die Mikroorganismen Viren und/oder Bakterien. Die Erfindung ist besonders bevorzugt zur Verwendung mit viralen Analyten. In der bevorzugtesten Ausführungsform betrifft die Erfindung eine Reagenszusammensetzung zur Stabilisierung von Antigenen und Polypeptiden von Influenza, insbesondere Polypeptide und Antigene von Influenza B.
In einem dritten Aspekt betrifft die Erfindung eine Reagenszusammensetzung zur Stabilisierung eines Nukleoproteins des Influenzavirus, insbesondere eines Nukleoproteins von Influenza B.
In einem vierten Aspekt betrifft die Erfindung eine wässrige Reagenszusammensetzung zur Stabilisierung eines Antigen-Präparats, das als ein Kontroll- oder Bezugsreagens in Verbindung mit einer analytischen Methode verwendet werden soll.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform umfasst das Reagens einen Puffer, ein Blockiermittel, ein Salz, einen Chelatbildner, einen Lösungsvermittler, ein nichtionisches Detergens und ein Konservierungsmittel. Am bevorzugtesten enthält das Reagens kein N-Dodecanoyl-N-methylglycin oder Decanoyl-N-methylgluconamid.
In weiteren bevorzugten Ausführungsformen kann das Reagens auch Gewebekulturmedium, Stabilcoat^®-Puffer (BSI, Inc.) und Formalin-inaktiviertes Virus enthaltendes Zellkulturmedium enthalten.
In wiederum weiteren bevorzugten Ausführungsformen umfasst das Reagens Natriumphosphat-Puffer, fötales Kälberserum, Glycerol, Natriumchlorid, EDTA, Tween-20^®-Detergens (Polyoxyethylensorbitanmonolaurat), Microcide II^®-Konservierungsmittel (eine quaternäre Ammonium-Verbindung; Amresco, E423), Gentamycinsulfat, und kann Sucrose, Gewebekulturmedium und Stabilcoat^®-Puffer (BSI, Inc.) enthalten. Der pH der Lösung liegt zwischen etwa 7 und etwa 9, am bevorzugtesten zwischen 7,5 und 8,5. Ein Fachmann des Gebiets erkennt, dass ähnliche Reagentien die oben aufgelisteten ersetzen können. Zum Beispiel kann EDTA durch EGTA ersetzt werden, und Microcide II^® oder Gentamycin kann durch andere antibakterielle Agenzien ersetzt werden. Bevorzugte Konzentrationen der oben aufgelisteten Reagentien sind die folgenden: für Natriumphosphat, 0,1 mM bis 1000 mM, bevorzugter 1 mM bis 200 mM, am bevorzugtesten 50 mM bis 100 mM; für fötales Kälberserum, 0,1 % bis 40 % v/v, am bevorzugtesten 2 % bis 20 % v/v; für Glycerol 0,1 % bis 30 % v/v, am bevorzugtesten 2,5 % bis 10 % v/v; für Natriumchlorid, 0,1 mM bis 4 M, am bevorzugtesten 50 mM bis 2 M; für EDTA, 0,01 mM bis 100 mM, bevorzugter 1 mM bis 20 mM, am bevorzugtesten 10 mM bis 15 mM; für Tween-20, 0,001 % bis 1 %, bevorzugter 0,01 % bis 0,1 %, am bevorzugtesten 0,5 %; für Microcide II, 0,001 % bis 1 % w/v, am bevorzugtesten 0,002 % bis 0,1 % w/v; für Gentamycinsulfat, 0,01 % bis 10 % w/v; bevorzugter 0,1 % bis 2,5 %, am bevorzugtesten 0,25 % bis 1 %; und für Sucrose, 0,01 % bis 5 % w/v, am bevorzugtesten 0,1 % bis 0,5 %.
In besonders bevorzugten Ausführungsformen umfasst das Verdünnungsmittel eine Menge von größer als oder gleich etwa: 50 mM Natriumphosphat; 2 % v/v fötales Kälberserum; 10 % v/v Glycerol; 50 mM Natriumchlorid; 10 mM EDTA; 0,05 % v/v Tween-20-Detergens; 0,01 % w/v Microcide II-Konservierungsmittel; und 0,5 % w/v Gentamycinsulfat. Das Reagens kann außerdem bis zu 0,5 % Sucrose, 15 % Stabilcoat^®-Puffer und 20 % Gewebekulturmedium aus dem Antigen-Präparat oder durch separate Zugabe umfassen. Der bevorzugte pH-Wert der Lösung liegt zwischen etwa 7,5 und etwa 8,5. Es mag auch möglich sein, den Puffer und/oder das Salz durch eine Konzentration von vorformuliertem Gewebekulturmedium zu ersetzen (z.B. Eagles Minimum Essential Medium oder Dulbeccos Modified Eagle Medium von BioWhittaker).
In einem fünften Aspekt betrifft die Erfindung Methoden zum Stabilisieren von Polypeptiden und Antigenen, die von Mikroorganismen stammen. In einer bevorzugten Ausführungsform wird diese Methode zum Stabilisieren eines Antigen-Präparats von einem Mikroorganismus zur Verwendung als ein Kontroll- oder Bezugsreagens in Verbindung mit einer analytischen Methode oder zur Verwendung in einem pharmazeutischen Präparat verwendet.
Kurzbeschreibung der Zeichnungen
1 zeigt die Vorteile des Verdünnungsmittels dieser Erfindung auf die Stabilität des inaktivierten Influenza B-Virus.
2 zeigt die Fähigkeit des Zellkulturmediums, die stabilisierenden Eigenschaften des Verdünnungsmittels der Erfindung weiter zu steigern.
Ausführliche Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen
A. Einführung
Zum leichteren Verständnis der vorliegenden Erfindung wird die Entwicklung der Reagenszusammensetzung für eine spezifische Anwendung beschrieben, nämlich die Stabilisierung von Influenza-abgeleiteten Antigenen. Allerdings lässt sich der generelle Nutzen der stabilisierenden Reagenszusammensetzung für andere Antigene oder Polypeptide unter Durchführung ähnlicher Experimente zeigen.
Während der Entwicklung von Reagentien für diagnostische Assay-Komponenten oder andere Anwendungen ist eine Bestimmung der langfristigen Stabilität eines Reagens erforderlich. Zunächst werden akzelerierte Stabilitätsvalidierungen zur Auswertung der Lagerdauer eines Reagens abgeschlossen, bevor die Realzeit-Stabilitätsbestimmung erfolgt. Akzelerierte Stabilitätsstudien lassen sich schnell durchführen und werden von Fachleuten des Gebiets zur Vorhersage der Stabilität häufig angewendet. Eine Methode, um dies vorzunehmen, besteht im Inkubieren des Reagens bei erhöhten Temperaturen und im Untersuchen in relativ kurzen Zeitabständen. Zum Beispiel werden Inkubationen für 3 bis 7 Tage bei 37°C, 45°C und anderen erhöhten Temperaturen unter Anlegen der Arrhenius-Gleichung zur Vorhersage dessen analysiert, ob ein Reagens bei etwa 2 bis 8°C für einen langen Zeitraum stabil bleiben wird. Diese Methode wird zur Vorhersage eines Reagensversagens für die derzeit präziseste gehalten. Ist ein Reagens nicht in der Lage, einer Provokation mit einer erhöhten Temperatur standzuhalten, so ist es unwahrscheinlich, dass es über einen längeren Zeitraum unter normalen Lagerbedingungen stabil sein wird. Eine Stabilität bei erhöhter Temperatur ist für die langfristige Stabilität weniger prädiktiv, da dies nicht exakt die Zersetzungsrate voraussagt, doch einen Hinweis auf die Stabilität durch Identifizieren eines möglichen Punkts des Reagensversagens gibt. Mit abnehmendem Verlust der Stabilität bei erhöhten Temperaturen nimmt auch die Wahrscheinlichkeit eines Versagens unter realen Bedingungen ab.
Über die akzelerierte Validierung hinaus sind auch langfristige Realzeit-Studien erforderlich, um das Potenzial eines Reagens zur Stabilisierung von Polypeptiden oder Antigenen auszuwerten. Bedingungen für Realzeit-Studien sind den Fachleuten des Ge biets bekannt. So kann zum Beispiel zu den Realzeit-Auswertungsbedingungen die Lagerung des Reagens bei normalen Lagertemperaturen von etwa 2 bis 8°C oder bei Raumtemperatur (18 – 30°C) zählen, bis der Punkt des Reagensversagens erreicht ist.
In der Entwicklung von positiven Kontrollreagentien für einen Immunoassay für Influenzaviren wurden sowohl Formalin-inaktivierte Influenza-Typ A- und -B-Viren auf ihre Stabilität in einem Verdünnungsmittel auf Proteinbasis ausgewertet. Ist das im Assay nachgewiesene Epitop vom viralen Nukleoprotein, so war inaktiviertes Influenza A-Virus signifikant stabiler in einfachen Verdünnungsmitteln und handelsüblichen stabilisierenden Verdünnungsmitteln als das inaktivierte Influenza B-Virus. Um die kommerzielle Lebensfähigkeit eines neuen Produkts für den Influenza-A- und -B-Nachweis zu gewährleisten, war eine Methode zur Stabilisierung des inaktivierten Influenza B erforderlich. Ein Verdünnungsmittel wurde formuliert, welches beiden Typen von inaktivierten Influenzavirus-Suspensionen Stabilität verleiht. Dieses Verdünnungsmittel hat sich als fähig erwiesen, die Stabilität des inaktivierten Influenza-B-Virus in Lösung über längere Zeiträume hinweg als bisherige Verdünnungsmittel-Formulierungen zu verbessern.
Influenza A wurde als in einfachen Verdünnungsmitteln auf Proteinbasis stabil nachgewiesen. Ein derartiges Verdünnungsmittel enthält Rinderserumalbumin (BSA) und Tween-20^®-Detergens in Phosphat-gepufferter Salzlösung (PBS), auch PBT genannt. Eine zweite Formulierung ist ein handelsübliches Produkt, Stabilcoat^®-Puffer (BSI, Inc.), und wurde ebenfalls als Influenza A stabilisierend nachgewiesen. Allerdings war keine dieser Lösungen zur Stabilisierung von Influenza B in der Lage. Es ist wahrscheinlich, dass die monoklonalen Antikörper, welche die verschiedenen Stämme in den vorgenommenen Assays nachweisen, verschiedene Epitope auf den beiden Nukleoproteinen erkennen. Diese Epitope werden möglicherweise durch die Inaktivierungs- und Lagerbedingungen unterschiedlich beeinflusst. Außerdem können die Immunogene, die in den Ausgangspräparaten der in einem Assay zu verwendenden monoklonalen Antikörper Verwendung fanden, unterschiedlich präpariert worden sein und daher die Erzeugung von monoklonalen Antikörpern begünstigt haben, die unterschiedlich konformierte Epitope erkennen. Wir glauben, dass die hierin beschriebenen Verdünnungs-Zusammensetzungen ähnliche stabilisierende Wirkungen auf inaktiviertes Influenza A-Nukleoprotein aufweisen wie auf inaktiviertes Influenza B-Nukleoprotein. Außerdem wird davon ausgegangen, dass andere virale und bakterielle Proteine ebenfalls stabilisiert werden.
Es sollte zur Kenntnis genommen werden, dass dem Prozess der viralen Inaktivierung und Verdünnung zu jedem der Verdünnungsmittel-Formate die Aufnahme der Komponenten der Ausgangssuspensionen von inaktiviertem Virus inhärent ist. Die Ausgangssuspension des inaktivierten Virus setzt sich aus 50 % Formalin-inaktiviertes Virus enthaltendem Zellkulturmedium (ICC) und 50 % Stabilcoat^®-Puffer zusammen. Jede der getesteten positiven Kontrollzusammensetzungen umfasst ein gewisses Volumen dieser Ausgangssuspension.
B. Bildung des neuen Verdünnungsmittels
Die Formulierung eines neuen Verdünnungsmittels begann mit dem einfachen Proteinverdünnungsmittel PBT, welches BSA, Tween-20 und PBS-Lösung umfasst. Jede der Komponenten wurde auf ihre Fähigkeit ausgewertet, inaktiviertes Influenza B-Virus unter Aufrechterhaltung oder Erhöhung der Stabilität des inaktivierten Influenza A-Virus zu stabilisieren. Eine Zunahme der Stabilität des Antigen-Präparats wurde in der folgenden Weise ausgewertet: inaktivierte virale Materialien wurden zu einer gewünschten Stärke der Signalintensität für die analytische Testmethode verdünnt, mit der das Kontrollreagens auf den Markt gebracht werden wird. Allgemein wird eine geringe bis mittlere Signalstärke für das Kontrollreagens bei seiner entsprechenden analytischen Methode gewählt. Die verschiedenen Reagenszusammensetzungen mit der gewählten Antigenverdünnung werden sofort anhand der entsprechenden analytischen Methode getestet. Die verschiedenen Reagenszusammensetzungen (die Antigen enthalten) werden bei verschiedenen Lagerbedingungen gehalten und dann periodisch anhand der analytischen Methode nochmals getestet. Jene Reagenszusammensetzungen, die das ursprüngliche Signal beibehalten oder einen lediglich minimalen Abbau der ursprünglichen Signalstärke über den Bereich der Lagerbedingungen zeigen, werden bestimmt, um eine erhöhte Stabilität bereitzustellen. Die Signalstärke kann qualitativ, quantitativ, visuell oder durch Instrumente bestimmt werden. Während des Vorgangs der Komponentenauswahl wurden mehrere Modifikationen am PBT-Verdünnungsmittel vorgenommen. Zunächst wurde ein anderes Blockiermittel, z.B. fötales Kälberserum, anstatt BSA eingesetzt. Dann wurde ein Lösungsvermittler wie Glycerol und ein Chelatbildner wie EDTA oder EGTA zur Erhöhung der Stabilität zugesetzt. Außerdem wurde bestimmt, dass die Aufnahme eines nicht-ionischen Detergens, wie etwa Tween-20^®-Detergens, für die Stabilität wesentlich war. Konservierungsmittel wie eine Kombination aus Microcide II und Gentamycinsulfat wurden als antimikrobielle Agenzien aufgenommen.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform umfasst das Verdünnungsmittel der Erfindung eine Menge größer als oder gleich: 50 mM Natriumphosphat, 2 % v/v fötales Kälberserum, 1 % v/v Glycerol, 50 mM Natriumchlorid, 5 mM EDTA, 0,05 % v/v Tween-20-Detergens, 0,01 % w/v quaternäre Ammonium-Verbindung und 0,5 % w/v Gentamycinsulfat. Das Reagens kann außerdem bis zu 15 % Stabilcoat-Puffer und 20 % Gewebekulturmedium vom Antigen-Präparat oder durch separate Zugabe umfassen. Der bevorzugte pH-Wert der Lösung liegt zwischen etwa 7,5 und etwa 8,5. Es ist auch möglich, den Puffer und/oder das Salz durch eine Konzentration eines vorformulierten Gewebekulturmediums (z.B. Eagles Minimum Essential Medium oder Dulbeccos Modified Eagle Medium von BioWhittaker) zu ersetzen.
Ohne an eine bestimmte Theorie gebunden werden zu wollen, können die Modifikationen am ursprünglichen Verdünnungsmittel die Polypeptid- oder Antigenstabilität aufgrund der folgenden Mechanismen erhöhen: fötales Kälberserum mag eine reichere Proteinquelle als BSA bereitstellen, da es ein Gesamtserumprodukt anstelle eines gereinigten Proteins ist. Es kann weitere stabilisierende Materialien umfassen. Glycerol kann die Hydratisierung des Antigens über eine Wasserstoffbindung erhöhen. Der Chelatbildner kann die Stabilität durch Entfernung von Kationen erhöhen, welche das Polypeptid oder Antigen selbst negativ beeinflussen können, oder was für die Aktivität bestimmter abbauender Enzyme erforderlich sein kann, die das Antigen oder Polypeptid beschädigen oder die katalytischen Stellen auf dem Antigen hemmen könnten. Das Detergens kann wichtige Sekundärstrukturen und unterstützende Verbindungen des Antigens oder Polypeptids bei gleichzeitiger Zerstörung unbedeutender oder abbauender Strukturen/Wechselwirkungen erhalten.
Die vorliegende Erfindung wurde zunächst durch Benchmarking der Antigenstabilität in einem einfachen BSA-Proteinverdünnungsmittel (PBT) wie oben beschrieben ausge wertet. Typischerweise reicht bei der Reagens-Entwicklung die Beibehaltung der Positivität bis etwa 3 Tage bei 45°C zur Auswertung der langfristigen Stabilität bei niedrigeren Temperaturen aus. Fachleute des Gebiets glauben, dass eine Stabilität von bis zu etwa 14 Tagen bei erhöhter Temperatur ein wohl-stabilisiertes Antigen anzeigt. Außerdem ist, je länger ein Reagens eine Aktivität bei 45°C beibehält, es umso wahrscheinlicher, dass es bei niedrigeren Temperaturen länger stabil bleibt, zum Beispiel bei etwa 2 bis 8°C und bei Raumtemperatur. Zunächst wurden Formalin-inaktivierte Influenzaviren-Ausgangssuspensionen in einer im Fachgebiet allgemein bekannten Weise und in nachstehendem Beispiel 1 beschriebenen Weise hergestellt. Dann wurden sowohl Influenza A- als auch Influenza B-inaktivierte Ausgangssupensionen in ein einfaches Proteinverdünnungsmittel bei einer 1:2- bzw. 1:4-Verdünnung untergemengt. Bei diesen Verdünnungen enthielt das Testverdünnungsmittel in seiner Gesamtheit 50 % Verdünnungsmittel, 25 % ICC und 25 % Stabilcoat-Puffer bzw. 75 % Verdünnungsmittel, 12,5 ICC und 12,5 % Stabilcoat^®-Puffer. Diese Antigen-Verdünnungen wurden ausgewählt, um ein gemäßigt positives Signal bei visueller Untersuchung eines umgesetzten Testelements zu erhalten. Die beiden resultierenden Lösungen wurden am Tag 0, Tag 3 bei 4°C und am Tag 3 bei 45°C mit dem FLU OIA^®-Testkit (Biostar, Inc.) auf Positivität getestet. Die Tests wurden gemäß der Packungsbeilage vorgenommen. Inaktiviertes Influenza B verlor all seine Positivität am Tag 3 bei 45°C, und inaktiviertes Influenza A verlor einen Teil seiner Positivität. Die Tests wurden aufgrund des Versagens des Reagens nicht zu späteren Zeitpunkten vorgenommen. Das PBT-Proteinver-dünnungsmittel versagte darin, die Stabilität des Antigens beim gewünschten Grad aufrechtzuerhalten.
Außerdem wurde Stabilcoat^®-Puffer (BSI, Inc.), ein handelsübliches Verdünnungsmittel, das zum Schutz und zur Stabilisierung von Antikörper-beschichteten Oberflächen formuliert ist, unter Verwendung der oben beschriebenen Antigen-Verdünnungen getestet. Die Stabilität des Stabilcoat^®-abgeleiteten Kontrollreagens wurde wie oben ausgewertet, mit der Ausnahme, dass die Testpunkte der Tag 0 und Tag 4 (4°C und 45°C Lagerbedingungen) waren. Unter diesen Bedingungen war die vollständige Zusammensetzung des Verdünnungsmittels 75 % Stabilcoat^®-Puffer und 25 % ICC. Selbst bei Vorhandensein des Gewebekulturmediums war Stabilcoat^® nicht dazu in der Lage, die Stabilität des inaktivierten Influenza B-Antigens länger als bis Tag 4 aufrechtzuerhalten, was das Fehlen eines langfristigen Lagerpotenzials anzeigt.
Dann wurde die Reagenszusammensetzung der vorliegenden Erfindung wie oben getestet, um ihre Leistungsfähigkeit auszuwerten. In diesem Fall enthielt die Gesamtzusammensetzung des Verdünnungsmittels 50 % Verdünnungsmittel, 25 % ICC und 25 % Stabilcoat^®-Puffer für inaktivierte Influenza A- und 75 % Verdünnungsmittel, 12,5 ICC und 12,5 % Stabilcoat^®-Puffer für inaktivierte Influenza B-Lösungen. Am Tag 3 bei 45°C verlor sowohl inaktiviertes Influenza A als auch B einige Positivität, wobei jedoch beide nach wie vor positiv waren. Das inaktivierte Influenza B-Reagens wurde am Tag 7, Tag 14 und Tag 21 ausgewertet. Schließlich verlor inaktiviertes Influenza B nach 21 Tagen bei 45°C all seine Positivität. Vorangegangene Studien haben gezeigt, dass inaktiviertes Influenza A einen beträchtlichen Anteil seiner Positivität bis zum Tag 21 ebenfalls verliert. Die erhöhte Stabilität des inaktivierten Influenza A unter diesen speziellen Assay-Bedingungen ist in den Daten nicht gezeigt, da diese nicht bis zum Versagen getestet wurde. Allerdings könnte die Stabilität von inaktiviertem Influenza A unter diesen Bedingungen sehr hoch sein und sich bis über die getesteten Zeitpunkte hinaus erstrecken. Sofern unter diesen oder anderen Assay-Bedingungen bis zum Versagen getestet, sollte das Verdünnungsmittel der Erfindung die Stabilität des Influenza A-Antigens ebenfalls erhöhen. Daher ist, relativ zum einfachen PBT-Proteinverdünnungsmittel und Stabilcoat^®-Verdünnungsmittel, die Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung zum Stabilisieren von Antigenen in Lösung für die Lagerung viel besser befähigt.
Bei einer anderen Auswertung der vorliegenden Erfindung wurde das Stabilisieren des Verdünnungsmittels der Erfindung bei einer empfindlicheren optischen Assay-Methode angewendet. Die positive Kontrolle bei dieser Methode verwendet Antigene, die zu einer 1:10-Verdünnung sowohl von Formalin-inaktiviertem Influenza A als auch Formalin-inaktiviertem Influenza B verdünnt sind, um das für solch eine Kontrolllösung erforderliche mäßige Signal zu erzielen. Die bei dieser Auswertung erforderlichen Antikörper wurden auf der Grundlage der optimalen analytischen Leistung bei der Art von verwendeten Oberflächen ausgewählt. Reaktive Bereiche auf den Assay-Oberflächen wurden mittels einer bevorzugten Methode des Aufstreifens eines monoklonalen Anti-Influenza A-Antikörpers oder monoklonalen Anti-Influenza B-Antikörpers auf der Oberfläche in einer Weise erzeugt, dass jede Assay-Oberfläche einen Influenza A-reaktiven Bereich und einen Influenza B-reaktiven Bereich erhielt. Die Oberflächen wurden getrocknet und mit einer Konservierungsmittellösung bei Raumtemperatur überzogen. Die Antikörper-Oberflächen wurden unter Verwendung eines Heißlötgeräts an einen Polystyrolring heißgesiegelt, welcher der Lösung das Fließen durch und um die poröse Oberfläche ermöglicht. Der Kunststoffring unterstützt eine erleichterte Handhabung und dient als Methode zum Montieren der porösen Oberfläche auf einer Vakuumquelle, um die Entfernung von Flüssigkeiten von und Trocknung der porösen Oberfläche zu fördern. Für den Zweck dieses Experiments wurden die Assays in einer Durchflussweise vorgenommen. Durchfluss bedeutet, dass die Probe die Assay-Oberfläche kontaktierte und während des Assay-Verfahrens durch sie hindurch, über sie hinweg oder um sie herum floss.
Bei diesem Experiment wurde die Fähigkeit des Zellkulturmediums (EMEM, BioWhittaker Kat. #12136Q), die Stabilität der Antigene als einer Komponente des stabilisierenden Verdünnungsmittels der Erfindung zu erhöhen, getestet. Vier Testlösungen wurden hergestellt: (A) 75 % Verdünnungsmittel der Erfindung, 12,5 % EMEM und 12,5 % Stabilcoat-Puffer, (B) Lösung A, worin das EMEM außerdem 2 % FCS enthält, 1 % L-Glutamin und 0,5 % PenStrep/Fungizon (eine antimikrobielle Lösung, BioWhittaker Kat. #17-745H), (C) 75 % Verdünnungsmittel der Erfindung und 25 % Stabilcoat-Verdünnungsmittel, und (D) lediglich Verdünnungsmittel der Erfindung. Eine 1:10-Verdünnung der inaktivierten Influenza B-Ausgangssuspension wurde in jedem der vier Verdünnungsmittel hergestellt, indem zunächst eine 1:4-Verdünnung und anschließend eine 1:2,5-Verdünnung mit dem jeweiligen Testverdünnungsmittel vorgenommen wurde. Jede Lösung wurde am Tag 3 bei 4°C und Tag 3 bei 45°C getestet. Lösung A zeigte die beste Stabilität nach drei Tagen bei 45°C, gefolgt von Lösung B, D und C. Die Ergebnisse zeigen, dass die Aufnahme von Zellkulturmedium/Stabilcoat^® in das Verdünnungsmittel unter zunehmend verdünnten Antigen-Bedingungen die Stabilität des Antigens erhöht (vgl. Stabilität in Lösung A zu der in Lösung D). Die Verwendung einer höheren Konzentration von Stabilcoat^®-Puffer als dem einzigen anderen Bestandteil (Lösung C) erwies sich als schädlich für die Stabilität des Antigens (relativ zu Lösung A).
Daher zeigen diese Ergebnisse eindeutig, dass die vorliegende Erfindung andere Verdünnungsmittel dieses Typs hinsichtlich ihrer Fähigkeit zum Stabilisieren von Protein antigenen in einem wässrigen Medium, insbesondere jene von Influenzavirus, bei weitem übertrifft.
Die folgenden Beispiele sind zur Veranschaulichung und nicht als Einschränkung dargestellt und sollen weitere Aspekte und Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung weiter verdeutlichen. Die Beispiele sind in keinster Weise dazu gedacht, den Rahmen zu beschränken.
Beispiele
Beispiel 1:
Die Antigenstabilität wurde in einem einfachen Protein-Verdünnungsmittel (PBT) ausgewertet, das 1 × Dulbecco's PBS, 0,05 % Tween-20-Detergens, 2 % BSA, 0,01 % Microcide-II-Konservierungsmittel und 0,5 % Gentamycinsulfat umfasste. Zunächst wurden Ausgangssuspensionen von inaktiviertem Influenzavirus wie folgt zubereitet. Zusammenfließende MDCK p83-Zellen wurden entweder mit Influenza A (1:10.000-Verdünnung von A/Hong Kong 68 pro Kolben) oder Influenza B (1:1000-Verdünnung von B/Panama 45/90 pro Kolben) infiziert und in Eagles MEM Maintenance Medium (mit 2 % hitzeinaktiviertem FCS, 1 % L-Glutamin und 0,5 % Pen/Strep/Fungizon) gezüchtet, bis 90 bis 100 % CPE (zytopathische Wirkung) beobachtet wurden. Das Virus wurde durch Verwirbeln und dann Zentrifugieren der Zellsuspension abgeerntet. Der resultierende Überstand wurde durch Zugabe von 37°C Formaldehydlösung (Sigma Chemical, F-1268) auf 0,2 % des Gesamtvolumens (2 μl/ml) und Inkubieren bei Raumtemperatur für 1 Stunde inaktiviert. Dann wurde die Virus-enthaltende Lösung mit gleichen Mengen an Stabilcoat^®-Puffer (BSI, Inc.) gemischt, in Teilmengen aufgeteilt und verwendet oder sofort eingefroren.
Die inaktiviertes Influenza A- und Influenza B-Virus-Ausgangssuspensionen wurden in das einfache BSA-Verdünnungsmittel bei 1:2 bzw. 1:4 untergemengt, indem 1 ml inaktivierte Influenza A-Ausgangssuspension 1 ml des einfachen Verdünnungsmittels, und in einem separaten Behälter 0,5 ml inaktivierte Influenza B-Ausgangssuspension 1,5 ml des einfachen Verdünnungsmittels zugegeben wurden. Bei diesen Verdünnungen enthielt das Testverdünnungsmittel in seiner Gänze 50 % Verdünnungsmittel, 25 % ICC und 25 % Stabilcoat^®-Puffer bzw. 75 % Verdünnungsmittel, 12,5 % ICC und 12,5 % Stabilcoat^®-Puffer. Als nächstes wurde jede resultierende Lösung am Tag 0 mit dem FLU OIA^®-Testkit (Biostar, Inc.) auf Positivität getestet. Die Tests wurden gemäß der Packungsbeilage vorgenommen, und die Signalqualität oder Positivität wurde durch visuelle Interpretation des umgesetzten FLU OIA-Testelements wie folgt ausgewertet:
(0) negativ; (1) Schatten; (2) sehr schwach positiv; (3) positiv zwischen sehr schwach und schwach; (4) schwach positiv; (5) positiv zwischen schwach und mäßig; (6) mäßig positiv; (7) positiv zwischen mäßig und stark; (8) stark positives Ergebnis. Ein Signal wurde als positiv erachtet, wenn es mit 2 – 8 punktbewertet war.
Nach der Verdünnung wurde jede Lösung in zwei Portionen aufgeteilt. Eine wurde bei 4°C und eine bei 45°C für 3 Tage gelagert. Alle vier Lösungen wurden am Tag 3 in derselben Weise wie am Tag 0 nochmals getestet. Die Tag 0 und 4°C-Kontrollen ergaben die erwarteten mäßig positiven Signale. Inaktiviertes Influenza B verlor alle Positivität am Tag 3 bei 45°C, und inaktiviertes Influenza A verlor einen Teil seiner Positivität. Die Tests wurden nicht zu aufeinanderfolgenden Zeitpunkten aufgrund des Versagens des Reagens vorgenommen. Typischerweise ist bei der Reagens-Entwicklung die Beibehaltung der Positivität von 3 Tagen bei 45°C zur Bewertung einer langfristigen Stabilität bei niedrigeren Temperaturen ausreichend. Die längere Zeitspanne, über die ein Reagens seine Aktivität bei 45°C beibehält, korreliert mit der Stabilität bei niedrigeren Temperaturen, wie etwa 2 – 8°C und bei Raumtemperatur. Daher versagte diese einfache PBT-Formulierung darin, die Stabilität des Antigens im gewünschten Grade beizubehalten.
Beispiel 2:
Stabilcoat^®-Puffer (BSI, Inc.), ein handelsübliches Verdünnungsmittel, das zum Schutz und zur Stabilisierung von Antikörper-beschichteten Oberflächen formuliert ist, wurde wie in Beispiel 1 beschrieben getestet, mit der Ausnahme, dass das Reagens am Tag 0 und Tag 4 (4° und 45°C Lagerbedingungen) getestet wurde. Zu beachten ist, dass die Gesamtzusammensetzung des Verdünnungsmittels 75 % Stabilcoat-Puffer und 25 % ICC betrug. Stabilcoat war nicht in der Lage, die Stabilität des inaktivierten Influenza B-Antigens über Tag 4 hinaus aufrechtzuerhalten, was das Fehlen eines langfristigen Lagerpotenzials anzeigt.
Beispiel 3:
Als nächstes wurde die Reagenszusammensetzung der vorliegenden Erfindung in einem ähnlichen Experiment wie in Beispiel 1 beschrieben getestet. Das Verdünnungsmittel wurde in einem Volumen von 20 ml wie folgt erzeugt. Einem konischen Röhrchen wurden 2 ml an 1 M Natriumphosphat-Puffer und 8 ml dH₂O zugegeben (100 mM), vermischt und der pH-Wert auf 7,5 eingestellt. Als nächstes wurden 0,175 g NaCl (150 mM) hinzugefügt und untergemischt. Dann wurde 0,1 ml einer 10 % Tween-20-Lösung (0,05 %) hinzugefügt und untergemischt. Als nächstes wurden 0,2 ml einer 1 % Ausgangslösung von Microcide^® II-Konservierungsmittel (0,01 %) und 0,1 ml Gentamycinsulfat (0,5 %) dem Röhrchen zugegeben und gut vermengt. Dann wurden 2 ml Glycerol (10 %) und 1 ml fötales Kälberserum (5 %) hinzugefügt und vermischt. Daraufhin wurden 0,4 ml einer 500 mM-Vorrats eines EDTA/dH₂O-(10 mm)-Gemischs zugegeben und vermischt und der pH-Wert auf 7,5 eingestellt. Das Gesamtvolumen wurde auf 20 ml mit dH₂O gebracht.
Die viralen Testreagentien wurden durch Zugabe von 5 ml des Verdünnungsmittels zu 5 ml der inaktivierte Influenza A-Virus-Ausgangssuspension (eine 1:2-Verdünnung) oder 7,5 ml des Verdünnungsmittels zu 2,5 ml der inaktivierte Influenza B-Virus-Ausgangssuspension (einer 1:4-Verdünnung) und gutes Vermischen hergestellt. In diesem Fall enthielt die Gesamtzusammensetzung des Verdünnungsmittels 50 % Verdünnungsmittel, 25 % ICC und 25 % Stabilcoat^®-Puffer für die inaktiviertes Influenza A- und 75 % Verdünnungsmittel, 12,5 % ICC und 12,5 % Stabilcoat^®-Puffer für die inaktiviertes Influenza B-Lösung. Der FLU OIA-Test wurde gemäß der Packungsbeilage für jedes Testreagens an jedem Tag während der Studie vorgenommen. Dieses Experiment wurde bis zum Tag 21 aufgrund der gesteigerten Stabilität der Antigene durchgeführt. Am Tag 3 bei 45°C hatten sowohl inaktiviertes Influenza A als auch B einige Posivität verloren, waren aber nach wie vor eindeutig positiv. Das inaktivierte Influenza B-Reagens wurde am Tag 7, Tag 14 und Tag 21 ausgewertet. Schließlich verlor am Tag 21 bei 45°C das inaktivierte Influenza B alle Positivität. In anderen Studien wurde von inaktiviertem Influenza A gezeigt, dass es einen beträchtlichen Anteil seiner Aktivität nach diesem Zeitraum ebenfalls verlor. Die Assay-Ergebnisse wurden visuell interpretiert, ausgehend von einer subjektiven Skala von 0 bis 8 wie folgt: (0) negativ; (1) Schatten; (2) sehr schwach positiv; (3) positiv zwischen sehr schwach und schwach; (4) schwach positiv; (5) positiv zwischen schwach und mäßig; (6) mäßig positiv; (7) positiv zwischen mäßig und stark; (8) stark positives Ergebnis. Ein Signal wurde als positiv erachtet, wenn es mit 2 – 8 punktbewertet war. Die erhöhte Stabilität des Influenza B im Verdünnungsmittel der Erfindung ist in 1 gezeigt.
Beispiel 4:
Bei einer anderen Auswertung der vorliegenden Erfindung wurde das stabilisierende Verdünnungsmittel in einem unterschiedlichen Assay verwendet, bei dem die positive Kontrolle Antigene verwendete, die zu einer 1:10-Verdünnung sowohl des Formalin-inaktivierten Influenza A als auch Formalin-inaktivierten Influenza B verdünnt wurde, um das für solch eine Kontrolllösung erforderliche mäßige Signal zu erzielen. Die inaktivierten viralen Ausgangssuspensionen wurden wie in Beispiel 1 und das stabilisierende Verdünnungsmittel wie in Beispiel 3 beschrieben präpariert. Antikörper wurden zur Beschichtung von optisch präparierten porösen Oberflächen ausgewählt, wobei die Oberfläche eine spurgeätzte Polycarbonatmembran war, beschichtet mit einer optischen Schicht aus Silicium, um Reflexionsvermögen zu erhalten, einer anti-reflektierenden Schicht aus Si₃N₄ und einer Haftschicht aus diamantartigem Carbon gemäß WO/98/18962. Die bei dieser Auswertung verwendeten Antikörper wurden auf der Grundlage einer optimalen analytischen Leistung bei dem Typ von verwendeter Oberfläche ausgewählt. Die reaktiven Bereiche auf den Assay-Oberflächen wurden mittels einer bevorzugten Methode durch Aufstreifen von monoklonalem Anti-Influenza A-Antikörper (40 μg/ml in 0,1 M HEPES, pH 8,0, 1 % Sucrose) oder monoklonalem Anti-Influenza B-Antikörper (40 μg/ml in 0,1 M HEPES, pH 8,0, 1 % Sucrose, 150 mM NaCl) auf der Oberfläche in einer Weise hergestellt, dass jede Assay-Oberfläche einen Influenza A-reaktiven Bereich und einen Influenza B-reaktiven Bereich erhielt. Die Oberflächen wurden mit einem BioJet^®-Instrument (BioDot, Inc.) bestreift, getrocknet und mit einer Konservierungsmittellösung bei Raumtemperatur überzogen. Die Antikörper-Oberflächen wurden unter Verwendung eines Heißlötgeräts an einen Polycarbonatring heißgesiegelt, wodurch der Lösung das Fließen durch und um die poröse Oberfläche ermöglicht wurde. Der Kunststoffring unterstützt eine erleichterte Handhabung und dient als einer Methode zum Montieren der porösen Oberfläche auf einer Vakuumquelle, um die Entfernung von Flüssigkeiten und die Trocknung der porösen Oberfläche zu unterstützen. Die beschichteten Oberflächen wurden bei 2 – 8°C vor der Verwendung gelagert. Für den Zweck dieses Experiments wurden die Assays in einer Durchflussweise vorgenommen. Durchfluss meint, dass die Probe die Assay-Oberfläche kontaktierte und während des Assay-Verfahrens durch sie hindurch, über sie hinweg oder um sie herum floss.
Bei diesem Experiment wurde die Fähigkeit des Zellkulturmediums (EMEM), die Stabilität der Antigene als einer Komponente des stabilisierenden Verdünnungsmittels der Erfindung zu erhöhen, getestet. Vier Testlösungen wurden hergestellt: (A) 75 % Verdünnungsmittel der Erfindung, 12,5 % EMEM und 12,5 % Stabilcoat-Puffer, (B) Lösung A, worin das EMEM außerdem 2 % FCS, 1 % L-Glutamin und 0,5 % PenStrep/Fungizon enthält, (C) 75 % Verdünnungsmittel der Erfindung und 25 % Stabilcoat-Verdünnungsmittel; und (D) lediglich Verdünnungsmittel der Erfindung. Eine 1:10-Verdünnung der inaktivierten Influenza B-Ausgangssuspension wurde in jedem der vier Verdünnungsmittel hergestellt, indem zunächst eine 1:4-Verdünnung und anschließend eine 1:2,5-Verdünnung erzeugt wurde. Jede der vier Lösungen (30 μl) wurde den einzelnen Röhrchen zugegeben, die 165 μl eines Extraktionsreagens enthielten, und für 1 Minute inkubiert. Die Gesamtheit jeder Probe wurde auf die oben beschriebenen Oberfläche übertragen und für 3 Minuten inkubiert. Dann wurden 100 μl eines Konjugats (Anti-Influenza A-Antikörper, konjugiert an HRP, gemischt mit einem Anti-Influenza B-Antikörper, konjugiert an HRP) auf die Oberfläche für weitere 3 Minuten platziert. Als nächstes wurde Vakuum an den Boden der Oberfläche angelegt, um das Proben/-Konjugat-Gemisch durch die Oberfläche und von ihr wegzuziehen. Die Oberfläche wurde dreimal gewaschen, indem eine wässrige Waschlösung auf die Oberfläche aufgebracht und diese durch die Oberfläche durchfließen gelassen wurde, bis sie unter Vakuumdruck getrocknet war. Das Vakuum wurde abgestellt, und 75 μl eines präzipitierenden TMB-Substrats wurden auf die Assay-Oberfläche aufgebracht und für 6 Minuten inkubiert. Das Substrat wurde durch die Oberfläche gezogen und die Oberfläche einmal gewaschen und wie oben beschrieben getrocknet. Dann wurden die Assay-Signale wie in Beispiel 3 interpretiert.
Jede Lösung wurde am Tag 3 bei 4°C und Tag 3 bei 45°C getestet. Lösung A zeigte die beste Stabilität am Tag 3 bei 45°C, gefolgt von Lösung B, D und C. Die Ergebnisse zeigen, dass die Aufnahme des Zellkulturmediums/Stabilcoat^® in das Verdünnungsmit tel unter zunehmenden Verdünnungsbedingungen des Antigens die Stabilität des Antigens erhöht (vergleiche Stabilität in Lösung A zu der in Lösung D). Die Verwendung einer höheren Konzentration an Stabilcoat^®-Puffer als dem einzigen anderen Bestandteil (Lösung C) erwies sich als schädlich für die Stabilität des Antigens. 2 zeigt die für das vorangegangene Experiment erhaltenen Ergebnisse.
Diese Ergebnisse zeigen eindeutig, dass die vorliegende Erfindung andere Verdünnungsmittel in ihrer Fähigkeit, Proteinantigene in einer wässrigen Lösung, insbesondere solche von Influenza, zu stabilisieren, bei weitem übertrifft.

Claims

Wässrige Reagenszusammensetzung, umfassend einen Puffer, ein proteinreiches Blockiermittel, welches ein Gemisch aus Proteinen und/oder Polypeptiden umfasst und eine Gesamtproteinkonzentration von 1 bis 50 g-% aufweist, einen Lösungsvermittler, ein Salz, einen Chelatbildner, ein Detergens und ein Konservierungsmittel, und welches einen endgültigen pH-Wert von 7,5 bis 8,5 aufweist.
Wässriges Reagens nach Anspruch 1, wobei das Blockiermittel ein Serum ist.
Wässriges Reagens nach Anspruch 2, wobei das Blockiermittel fötales Kälberserum ist.
Wässriges Reagens nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei der Lösungsvermittler Glycerol ist.
Wässrige Reagenszusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei das Salz ausgewählt ist aus Kaliumchlorid, Natriumchlorid, Magnesiumchlorid, Magnesiumsulfat und Calciumchlorid; der Chelatbildner ausgewählt ist aus Ethylenglycol-bis-(β-aminoethylether)-N,N,N',N'-tetraessigsäure (EGTA) und Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA); das Detergens ausgewählt ist aus CHAPS, Cholsäure, Desoxycholsäure, Digitonin, n-Dodecyl-β-D-maltosid, Glycodesoxycholsäure, n-Lauroylsarcosin, Laurylsulfat, Saponin, Polyoxyethylensorbitanmonolaurat und Polyethylenglycol-P-1,1,3,3-Tetramethylbutylphenylether; und wobei die Zusammensetzung kein N-Dodecanoyl-N-methylglycin oder Decanoyl-N-methylgluconamid umfasst.
Wässriges Reagens nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei das Salz Natriumchlorid ist.
Wässriges Reagens nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei der Chelatbildner EDTA ist.
Wässriges Reagens nach einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei das Detergens Polyoxyethylensorbitanmonolaurat ist.
Wässriges Reagens nach einem der Ansprüche 1 bis 8, wobei das Konservierungsmittel Trimethyltetradecylammoniumbromid und Gentamycin ist.
Wässriges Reagens nach einem der Ansprüche 1 bis 9, wobei der Puffer Natriumphosphat ist.
Wässriges Reagens nach Anspruch 5, wobei der Puffer Natriumphosphat ist, das Serum fötales Kälberserum ist, das Salz Natriumchlorid ist, der Chelatbildner EDTA ist, das Detergens Polyoxyethylensorbitanmonolaurat ist und das Konservierungsmittel Trimethyltetradecylammoniumbromid und Gentamycin ist.
Wässriges Reagens nach einem der Ansprüche 1 bis 11, welches außerdem ein Gewebekulturmedium oder Gewebekulturmedien und Stabilcoat^®-Puffer umfasst.
Wässriges Reagens nach Anspruch 12, wobei das Gewebekulturmedium ein Minimum Essential Medium ist.
Wässriges Reagens nach Anspruch 12 oder Anspruch 13, wobei das Gewebekulturmedium Eagle's Minimum Essential Medium ist.
Wässriges Reagens nach einem der Ansprüche 1 bis 14, umfassend 50 mM bis 100 mM Natriumphosphat, 2% bis 20% v/v fötales Kälberserum, 2,5% bis 10% v/v Glycerol, 50 mM bis 2 M Natriumchlorid, 10 mM bis 15 mM EDTA, 0,05% bis 0,1 % v/v Polyoxyethylensorbitanmonolaurat, 0,01 % w/v Trimethyltetradecylam moniumbromid und 0,5% w/v Gentamycinsulfat, und welches einen endgültigen pH-Wert von 7,5 bis 8,5 aufweist.
Wässriges Reagens nach einem der Ansprüche 1 bis 14, welches außerdem ein Antigen oder Polypeptid umfasst.
Wässriges Reagens nach Anspruch 16, wobei das Antigen oder Polypeptid von einem Mikroorganismus abstammt.
Wässriges Reagens nach Anspruch 17, wobei der Mikroorganismus ein Virus oder eine Bakterie ist.
Wässriges Reagens nach Anspruch 18, wobei das Virus Influenzavirus ist.
Wässriges Reagens nach Anspruch 19, wobei das Influenzavirus Influenza-B-Virus ist.
Wässriges Reagens nach einem der Ansprüche 16 bis 20, wobei das Antigen ein Polypeptid ist.
Wässriges Reagens nach Anspruch 21, wobei das Polypeptid ein Nukleoprotein ist.
Verfahren zum Stabilisieren eines Antigens oder Polypeptids in Lösung, umfassend das Einbringen des Antigens oder Polypeptids in ein wässriges Reagens nach einem der Ansprüche 1 bis 22.
Verwendung eines wässrigen Reagens nach einem der Ansprüche 1 bis 22 zum Nachweisen eines stabilisierten Antigens oder Polypeptids, umfassend das Einbringen eines Antigens oder Polypeptids in das wässrige Reagens nach einem der Ansprüche 1 bis 20, gefolgt von der Durchführung eines Analyseverfahrens zum Nachweisen des stabilisierten Antigens oder Polypeptids.
Verwendung nach Anspruch 24, wobei das Analyseverfahren ein Immunoassay oder eine Nukleinsäure-Hybridisationsmethode ist.
Verwendung nach Anspruch 25, wobei der Immunoassay ein Enzymimmunoassay oder ein optischer Immunoassay ist.