DE60014537T2

DE60014537T2 - Dna polymerase aus i(pyrobaculum islandicum)

Info

Publication number: DE60014537T2
Application number: DE60014537T
Authority: DE
Inventors: Markus Kaehler; Bruno Frey; Harald Sobek; Garabed Antranikian
Original assignee: Roche Diagnostics GmbH
Current assignee: Roche Diagnostics GmbH
Priority date: 1999-03-06
Filing date: 2000-03-04
Publication date: 2006-02-02
Anticipated expiration: 2020-03-05
Also published as: WO2000053772A1; ATE278783T1; DE60014537D1; JP3702182B2; EP1075525A1; JP2003508012A; EP1075525B1

Description

Die Erfindung bezieht sich auf eine aus Pyrobaculum islandicum gewinnbare Polymerase, worin sechs konservierte Motive, die für die Polymerasen der Familie B indikativ sind, in der Pyrobaculum islandicum DNA-Polymerasesequenz enthalten waren und wobei diese Polymerase 3'-5'-Exonucleaseaktivität zeigt.
Archaea bilden das dritte Reich der Lebewesen, unterscheidbar von den Bereichen Eukarya und Bacteria (Woese und Fox 1977). Während der letzten zwei Jahrzehnte sind viele Archaea isoliert und charakterisiert worden. Hyperthermophile Archaea, die die tiefsten und kürzesten Zweige des phylogenetischen Baums bilden, können bei Temperaturen bis zu 110°C wachsen (Stetter 1996). Somit sind diese Organismen exzellente Kandidaten, um ihre thermostabilen Enzyme zu untersuchen. Während unser Wissen über die DNA-Replikation bei Eukarya und Bacteria recht fortgeschritten ist (Kornberg und Baker 1992), ist nur beschränkte Information über die Replikation von DNA in hyperthermophilen Archaea verfügbar. Es ist immer noch eine offene Frage, wie die Genome bei Temperaturen nahe oder über 100°C bewahrt und dupliziert werden können.
Mehr als 50 DNA-Polymerasegene aus Eukarya, Bacteria und Archaea sind kloniert und sequenziert worden. Aus ihren Aminosäuresequenzen abgeleitet, können diese Enzyme in vier Gruppen klassifiziert werden, die durch die Escherichia coli DNA-Polymerase I (Familie A), DNA-Polymerase II (Familie B), DNA-Polymerase III (Familie C) und eukaryotische DNA-Polymerase β (Familie X) repräsentiert werden (Braithwaite und Ito 1993). Die Mehrzahl der archaealen DNA-Polymerasen, die soweit beschrieben worden sind, gehört zur Familie B. Es ist eine Anzahl von euryarchaealen DNA-Polymerasegenen geklont und sequenziert worden. Die thermostabilen Enzyme aus verschiedenen Thermococcus- und Pyrococcus-Stämmen sind erfolgreich exprimiert und charakterisiert worden und können kommerziell erworben werden (Perler et al 1996). Über DNA-Polymerasen aus hyperthermophilen Crenarchaeota ist relativ wenig Information verfügbar. Uemori et al. (1995) beschreibt die Klonierung und Charakterisierung von zwei DNA-Polymerasen der Familie B aus dem hyperthermophilen Crenarchaeon Pyrodictium occultum. Trotz der Tatsache, dass drei Familie B DNA-Polymerasegene in Sulfolobus solfataricus entdeckt worden sind (Prangishvili et al. 1993; Datukishvili et al. 1996; Edgell et al. 1997) ist nur eines dieser Gene erfolgreich exprimiert worden (Pisani et al. 1992).
DNA-Polymerasen aus Hyperthermophilen spielen eine Hauptrolle bei einer Vielzahl von molekular-biologischen Anwendungen, z.B. DNA-Amplifikation, Sequenzierung, Markierung oder reverse Transkription. Die Entwicklung der Polymerasekettenreaktion (PCR; Mullis et al. 1986; Erlich et al. 1988) war einer der wichtigsten Beiträge zur Biotechnologie in der letzten Dekade. Die DNA-Polymerase I aus dem Bakterium Thermus aquaticus, als Taq-Polymerase bezeichnet, war die erste bei der PCR eingesetzte thermostabile DNA-Polymerase. Aufgrund der Abwesenheit einer 3'-5'-Exonucleaseaktivität ist dieses Enzym nicht in der Lage, Fehlpaarungen auszuschneiden, und als Ergebnis ist die Baseninsertionsgenauigkeit niedrig (Longley et al. 1990; Keohavong und Thilly 1989). Weiterhin hat die Forschung aufgezeigt, dass die Taq-Polymerase eine thermische Stabilität von nicht mehr als ein paar Minuten bei 100°C aufweist. Mehrere euryarchaeale DNA-Polymerasen mit viel höherer Thermostabilität und einer assoziierten 3'-5'-Exonucleaseaktivität, z.B. Pfu pol (Lundberg et al. 1991) aus Pyrococcus furiosus oder Vent pol (Cariello et al. 1991) aus Thermococcus litoralis sind beschrieben worden und kommerziell erhältlich. Jedoch wurde die Taq-Polymerase durch diese Polymerasen nicht ersetzt, hauptsächlich aufgrund ihrer niedrigen Extensionsraten. Daher werden noch DNA-Polymerasen mit verbesserter Thermostabilität, hoher Baseneinfügegenauigkeit und hinreichenden Extensionsraten gebraucht. Hyperthermophile Crenarchaeota könnten eine vielversprechende Quelle für thermostabile DNA-Polymerasen mit neuen Eigenschaften sein. Zusätzlich würde die Herstellung von großen Mengen rekombinanter Enzyme von großem Wert sein.
Das anaerobe hyperthermophile Archaeon Pyrobaculum islandicum, das zu den Crenarchaeota gehört, wurde aus einer isländischen Heiß-Quelle isoliert (Huber et al. 1987). Es war nicht möglich, Polymerasen aus dem nativen Stamm ohne unzumutbare Experimente zu isolieren, weil dieser Stamm schwierig zu kultivieren ist. Weiterhin war es nicht möglich, Fragmente des B DNA-Polymerasegens von Pyrobaculum islandicum unter Verwendung konventioneller Primer zu amplifizieren.
PCR-Primer-Screening
Um Fragmente der Pyrobaculum ilsandicum DNA-Polymerase zu amplifizieren, führten wir ein Primer-Screening mit verschiedenen Arten von Primern durch. Die Archaea-Familie B DNA-Polymerase ist aufgrund kurzer, hochkonservierter Domänen, die von langen Ketten niedriger oder keiner Aminosäurekonservierung getrennt sind, schwierig auszurichten. Es scheint besonders schwierig zu sein, ein neues Familie B DNA-Polymerasegen aus einem Archaeon zu klonieren, das phylogenetisch große Distanzen zu Archaea zeigt, bei denen Polymerasesequenzen identifiziert worden sind.
Pyrobaculum islandicum gehört zu der Crenarchaea-Ordnung Thermoproteale. Als wir unsere Untersuchungen begannen, waren nur wenige crenarchaeale Polymerasegene aus Pyrodictium- und Sulfolobus-Species und einige Polymerasegensequenzen aus den euryarchaealen Pyrococcus- und Thermococcus-Species identifiziert worden.
Das PCR-Primer-Screening (unter Verwendung von Pyrobaculum islandicum DNA als Template) wurde mit der Kombination verschiedener Primer begonnen, die von konservierten Thermococcus und Pyrococcus Polymerasesequenzen abgeleitet waren.
Vorwärtsprimer
Reverse Primer
Das Primerpaar tcgl/c1190 wurde früher erfolgreich verwendet, um ein Thermococcus Polymerasegenfragment zu amplifizieren (Niehaus et al. 1997).
Im Gegensatz zum Thermococcus Polymerasegen war es jedoch nicht möglich, irgendwelche PCR-Produkte aus Pyrobaculum islandicum zu amplifizieren, die Identitäten zu den Familie B DNA-Polymerasen zeigten.
Uemori et al. (1995) verwendeten ebenfalls degenerierte Primer, die von hochkonservierten Regionen der Familie B DNA-Polymerasegene abgeleitet waren:
Vorwärts, 5'-(TA)(CG)(CG)(CT)T(CG)TAC CC(CG)(TA)(CG)ATCAT-3'
Reverse, 5'-TC(TCAG)GT(AG)TC(TCAG)CC(AG)TA(AG)AT(TCAG)AC-3
Eine PCR mit diesen Primern und Pyrobaculum islandicum DNA als Template war ebenfalls nicht erfolgreich.
Daher war es notwendig, neue degenerierte Primer zu entwerfen. Zusätzlich kann angenommen werden, dass die Verwendung degenerierter Primer, die Desoxyinosit (I) beinhalten, ein großer Vorteil beim Amplifizieren neuer archaealer Gene sein kann, weil Primer mit Desoxyinosit verschiedene degenerierte Tripletts akzeptieren.
Die zwei verfügbaren Familie B DNA-Polymerasegene aus Pyrodictium occultum (Uemori et al. 1995; bez. Nr. D38574 und D38573) und ein Polymerasegen aus Sulfolobus solfataricus (bez. Nr. Y08257) wurden für ein Alignment verwendet, um geeignete Primer für ein Primer-Screening zu synthetisieren.
Aufgrund des degenerierten Triplett-Codes war es notwendig, degenerierte Primer zu entwerfen, unter Verwendung von Desoxyinosin (1). Die Primer wurden aus hochkonservierten Bereichen der Familie B DNA-Polymerasen abgeleitet.
Vorwärts-Primer
Reverse Primer
Ein Mehrfach-Primer-Screening wurde mit Kombinationen jedes Vorwärts- und jedes reversen Primers durchgeführt. Es wurde eine niedrige Annealing-Temperatur von 48°C verwendet.
Nur eine PCR mit dem Vorwärts-Primer f3 und dem reversen Primer r2b führten zur Amplifikation eines PCR-Produkts, das Identitäten zur archaealen Familie B DNA-Polymerase zeigte. Dieses Fragment wurde als eine Sonde verwendet, um das komplette Polymerasegen zu identifizieren, wie in Beispiel 2 beschrieben. Dieses Ergebnis zeigt an, dass es sehr schwierig ist, geeignete Primer für die Amplifikation neuer crenarchaealer DNA-Polymerasegen-Fragmente zu entwerfen.
Der Gegenstand der vorliegenden Erfindung umfasst die Klonierungsprozedur und die Sequenz eines DNA-Polymerasegens aus Pyrobaculum islandicum. Die Erfindung umfasst ein Gen mit der Sequenz SEQ ID NO: 3. Der Gegenstand der vorliegenden Erfindung umfasst auch eine B DNA-Polymerase aus Pyrobaculum islandicum. Die Erfindung umfasst eine Polymerase mit einer Sequenz gemäß SEQ ID NO: 4. Weiterhin wird die Expression, Reinigung und Charakterisierung der rekombinanten Polymerase aus P. islandicum offenbart.
Klonierung und Nucleotidsequenzierung des DNA-Polymerasegens aus P. islandicum
Basierend auf den konserviertesten Aminosäuresequenzen, die man bei archaealen α-artigen DNA-Polymerasen fand, wurden zwei degenerierte Primer gemäß SEQ ID NO: 1 und SEQ ID NO: 2 entworfen. Die PCR wurde mit chromosomaler DNA aus P. islandicum durchgeführt, und wir waren in der Lage, ein Amplifikat von 445 bp zu erhalten. Das PCR-Produkt wurde sequenziert und die Sequenz zeigte in einem BLAST Vergleich die erwartete Homologie zu bekannten archaealen Polymerasebereichen. Als ein wichtiges Ergebnis der vorliegenden Erfindung können bekannte archaeale DNA-Polymerasesequenzen erfolgreich verwendet werden, um neuartige degenerierte Primer zu entwerfen, um neue DNA Polymerasegene von hyperthermophilen Archaea zu finden. Daher ist auch die die degenerierten Primer gemäß SEQ ID No: 1 and SEQ ID NO: 2 verwendende Klonierungsprozedur ein Gegenstand der vorliegenden Erfindung. Das PCR-Produkt wurde dann als eine Sonde verwendet, um das gesamte DNA-Polymerasegen zu erhalten. In Southern-Blot-Hybridisierungen wurden P. islandicum DNA-Fragmente in einer Größe von 6 bis 7,5 kbp, verdaut mit SacI, ausgewählt, um in ein Cosmidvektorsystem kloniert zu werden. Eine aus 2356 bp bestehender und für ein Protein mit 784 Aminosäuren kodierender offener Leserahmen (1) wurde auf einem Insert eines Cosmidklons entdeckt, der durch Koloniefilterhybridisierung identifiziert wurde. Der offene Leserahmen begann mit GTG, das für Valin kodiert.
Es ist gezeigt worden, dass einige archaeale Proteine (ungefähr 25 %) mit GTG-Codons zu starten scheinen (Dennis 1997). Beispielsweise beschrieb Schleper et al. (1997; 1998) verschiedene offene Leserahmen beim Crenarchaeoten Cenarchaeum symbiosum, einschließlich desjenigen eines Familie B DNA-Polymerasegens, die mit GTG anstelle von ATG begannen. Um den erwarteten Transkriptions- und Translations-Startbereich des Polymerasegens aus P. islandicum zu untersuchen, wurde eine 5'RACE PCR durchgeführt und die amplifizierte cDNA sequenziert. Die Sequenz der mRNA startete ein oder zwei Nucleotide stromaufwärts des determinierten Startcodons (Daten nicht gezeigt).
Die DNA-Polymerasesequenz wurde mit denjenigen aller archaealen DNA-Polymerasen aligned, die in öffentlichen Datenbanken zugänglich waren. Die die Familie B DNA-Polymerasen anzeigenden sechs konservierten Motive (Braithwaite und Ito 1993) wurden in der P. islandicum-Sequenz identifiziert, einschließlich solcher Reste, die bei allen DNA-Polymerasen invariant sind und die als funktionell wichtig gezeigt worden waren. Auch die drei 3'-5'-Exonuclease-Motive (Blanco et al. 1991) wurden in der Sequenz lokalisiert. Bei einem mit dem ClustalW-Softwareprogramm durchgeführten Mehrfach-Alignment (Higgins, EMBL, Heidelberg, Deutschland) zeigte die DNA-Polymerasesequenz höchste Identitäten mit einer oder zwei Familie B DNA-Polymerasen aus Pyrodictium occultum (polB; Zugangsnr. D38574), einer Familie B DNA-Polymerase aus Archaeoglobus fulgidus (Zugangsnr. AE001070) und der Pfu Polymerase (Zugangsnr. D12938), die 51, 37 bzw. 32 % identische Reste zeigten.
Expression und Reinigung von P. islandicum DNA-Polymerase
Nach Bestimmung der Sequenz klonierten wir das Gen in den Vektor pASK-IBA3 und exprimierten die Polymerase als ein Fusionsprotein mit einem C-terminalen Streptactin-bindenden Oligopeptid. Die rekombinante DNA-Polymerase wurde fast bis zur Homogenität durch die Kombination eines Hitzedenaturierungsschritts und Affinitätschromatographie auf Streptactin gereinigt. Ausgehend von 1000 ml E. coli BL21-Kultur reinigten wir 1 mg rekombinanter DNA-Polymerase mit einer spezifischen Aktivität von ungefähr 2000 Einheiten/mg an Präparationen rekombinanter DNA-Polymerase. Versuche, die Polymerase ohne Zugabe von Proteaseinhibitoren zum Puffer W aufzureinigen, führte zum Auftreten vieler kleiner Kontaminanten, wie durch SDS-PAGE beurteilt wurde (Daten nicht gezeigt). Die Reinheit der DNA-Polymerase jeder Fraktion wurde durch SDS-PAGE überprüft (2). Das Fusionprotein wurde mit einer kleinen Menge eines ca. 70 kDa-Proteins als ein Kontaminant mit gereinigt. Das Aktivitätsgel illustrierte, dass das gereinigte Protein von ungefähr 90 kDa in der Streptactin-Präparation DNA-Polymeraseaktivität besitzt (3). Eine kleine Aktivität war auch bei ungefähr 70 kDA detektierbar, was anzeigt, dass das mitgereinigte Protein ein proteolytisches Abbauprodukt der rekombinanten Polymerase war. Zusätzlich waren wir in der Lage, in Rohextrakt aus P. islandicum eine entsprechende DNA-Polymeraseaktivität in einem Proteinband von ungefähr 90 kDa zu entdecken.
Die Gegenstände der vorliegenden Erfindung sind auch Mutanten der erfinderischen B DNA-Polymerase und eine diese Mutanten kodierende DNA-Sequenzierung. Diese Mutanten können beispielsweise eine verminderte Proofreading-Aktivität anhand von Mutationen in den hochkonservierten Aminosäurebereichen für diese Exonukleaseaktivität (ExoI, ExoII und ExoIII) zeigen, z.B. enthält die ExoI-Region ein X1DX2EX3-Motiv, und es ist bekannt, dass die Aminosäuren D (Aspartansäure) und E (Glutaminsäure) essentiell für die Exonuclease-Aktvitität von B-Typ-Polymerasen sind.
Biochemische Eigenschaften
Um die biochemischen Eigenschaften der gereinigten rekombinanten DNA-Polymerase zu bestimmen, führten wir die nicht-radioaktive Analyse aus, die bei Materialien und Methoden unter verschiedenen Reaktionsbedingungen beschrieben ist.
Die optimalen Bedingungen für die DNA-Polymeraseaktivität wurden bei 75°C in Anwesenheit von aktivierter Kalbthymus-DNA als Template getestet. Wie in 4 gezeigt, war die Polymerase bei pH 7,3 am aktivsten. Die optimale Temperatur für die Aktivität war nicht feststellbar, weil die aktivierte DNA nicht oberhalb von 80°C stabil war. Das Enzym erforderte eine extrem niedrige Konzentration an divalenten Kationen für seine Aktivität. Konzentrationen über dem Optimum von 0,5 mM MgCl₂ hemmten die Polymerase (5). Keine Aktivität wurde in Abwesenheit von divalenten Kationen festgestellt. Wie in 6 illustriert, hemmten monovalente Kaliumionen die DNA-Polymerase stark. In Anwesenheit von 100 mM KCl wurden nur 7% der Restaktivität entdeckt.
Um die Thermostabilität der DNR-Polymerase zu bestimmen, wurde eine Präinkubation des Enzyms in 50 mM Tris-HCl, pH 7,2, bei 90 und 100°C durchgeführt, gefolgt von einer Inkubation bei 75°C unter Standardanalysebedingungen. Halbwertzeiten von 30-40 min bei 100°C und >10 h bei 90°C sind festgestellt worden (7).
Der Einfluss repräsentativer Inhibitoren auf die DNA-Polymeraseaktivität wurde untersucht (Tabelle 1). Das Sulfhydrylblockreagens N-Ethylmaleimid (NEM) hemmte die DNA-Polymeraseaktivität stark. In Anwesenheit von 1 mM NEM wurden 40% Restaktivität entdeckt. Ein Gesamtverlust der Aktivität wurde festgestellt nach einer Präinkubation mit 5 mM NEM. Die Sensitivität des Enzyms gegenüber tetracyclischem Diterpenoidaphidicolin, das mit jedem dNTP um die Bindung an die DNA-Polymerase kompetiert, wurde ebenfalls untersucht. Die DNA-Polymerase wurde durch eine vergleichbare Menge an Aphidicolin gehemmt, welche polB aus Pyrodictium occultum und Pfu-Polymerase hemmte (Uemori et al. 1995). In Anwesenheit von 500 und 2000 μM Aphidicolin stellten wir 55 und 21 Restaktivität für die P. islandicum DNA-Polymerase fest. Eine sehr niedrige Sensitivität der Polymerase gegen ddGTP wurde festgestellt. Es wurde keine Hemmung bei einem ddGTP/dGTP-Verhältnis von 2 gemessen und bei einem ddGTP/dGTP-Verhältnis von 10 konnten ungefähr 80 % Restaktivität festgestellt werden.
Um die assoziierte Exonucleaseaktivität in der DNA-Polymerase aus P. islandicum festzustellen, inkubierten wir zuerst BamHI verdaute pUC19-DNA mit dem gereinigten Enzym in Abwesenheit von dNTP. Ein signifikanter Abbau wurde nach 2 h bei 75°C auf einem Agarosegel (Daten nicht gezeigt) festgestellt. Es wurde kein Abbau bei 37°C gemessen, was anzeigt, dass keine Exonucleasekontamination aus den E. coli BL21-Zellen in der Enzympräparation nach Hitzebehandlung und Reinigung auf Streptactin-Sepharose vorhanden war.
Die Exonucleaseaktivität wurde in einer Standardanalyse quantifiziert, basierend auf der Freisetzung von ³H- markierten Nucleotiden aus einem beschallten Kalbsthymus DNA-Template. Die Freisetzung von Nukleotiden nach einer Inkubation des Templates mit 1,5 Einheiten gereinigter Polymerase bei 65°C war mit der vergleichbar, die durch andere Archaea Proofreading-DNA-Polymerasen verursacht wird. Nach 4 h Inkubation wurden 104 cpm/10 min gemessen. Im Vergleich dazu verursachten 15 Einheiten (10-fach höhere Konzentration) Taq-Polymerase einen cpm/10 min von 150-250, und dieselbe Menge an Proofreading-Polymerasen wie etwa Pfu-Polymerase verursachten 1000-3000 cpm/min. Es wurde nach Inkubationen bei 37°C keine Freisetzung von Nucleotiden beobachtet, was anzeigt, dass mit dem Test keine E. coli-Nucleaseaktivität interferiert. Die festgestellte Exonucleaseaktivität der P. islandicum DNA-Polymerase entspricht den innerhalb der abgeleiteten DNA-Polymerasesequenz (Blanco et al. 1991) identifizierten 3'-5'-Exonucleasedomänen, was anzeigt, dass diese Art von Exonucleaseaktivität und nicht eine 5'-3'-Exonuclaseaktivität gemessen wurde.
Zusätzlich zu der oben beschriebenen Exonucleaseaktivitäts-Analyse wurde die 3'-5'-Exonucleaseaktivität auf Einzelstränge, wie unten beschrieben, getestet. Um zu untersuchen, ob eine 3'-5'-Exonucleaseaktivität auf einzel- und doppelsträngige DNA entdeckt werden könnte, verwendeten wir einen 5'-DIG-markierten Primer und einen Primer/Template-Komplex. 3'-5'-Exonucleaseaktivität wurde durch den Abbau des Primers nach Inkubation mit der DNA-Polymerase bei 70°C für 1 h gezeigt. Wie in 8 angezeigt, hängt die Rate der P. islandicum DNA-Polymerase assoziierten 3'-5'-Exonucleaseaktivität stark vom pH des Reaktionspuffers ab. Unter Verwendung des optimalen Polymerasepuffers (pH 7,3) war der Abbau des Primers durch das Enzym P. islandicum signifikant niedriger als mit Pwo-Polymerase, wobei in Puffer 2 (pH 8,6) der Wert für Exonucleaseaktivität vergleichbar mit dem von Pwo-Polymerase war. Sowohl auf Einzelstrang-Primer als auch auf Doppelstrang-Primer/Template zeigte die DNA-Polymerase aus P. islandicum 3'-5'-Exonucleaseaktivitäten in Abwesenheit von dNTPs. Selbst in Anwesenheit von 0,01 oder 0,1 μM dNTPs zeigte eine Taq-Polymerase keinerlei Abbau des Primers, weder auf Einzelstrang- noch auf Doppelstrang-DNA-Substrat (8). Wie für DNA-Polymerasen mit 3'-5'-Exonucleaseaktivität erwartet, war der Abbau des Primer/Template-Substrats durch die DNA-Polymerasen aus P. islandicum und P. woesei in Anwesenheit großer Mengen (1 μM) von dNTPs vermindert. Weder ein Abbau noch eine Verlängerung des Primers durch die DNA-Polymerase aus P. islandicum war feststellbar, wenn die Analyse bei 37°C durchgeführt wurde (Daten nicht gezeigt). Dieses Ergebnis zeigt klar an, dass die Enzympräparation keine kontaminierende Exonucleaseaktivität aus E. coli enthielt, die mit dem Test interferieren könnte.
Anwendungen
In dieser Erfindung präsentieren wir das Klonierungsverfahren eines DNA-Polymerasegens und einige biochemische Eigenschaften einer neuen thermostabilen DNA-Polymerase aus Pyrobaculum islandicum. Die Hauptverwendungen thermostabiler DNA-Polymerasen sind die in vitro Amplifikation von DNA-Fragmenten und die Bestimmung von DNA-Sequenzen. Die Taq-Polymerase wird in vielen Fällen immer noch genutzt, aber ihre Genauigkeit ist aufgrund der Abwesenheit einer 3'-5'-Exonucleaseaktivität sehr niedrig (Keohavong und Thilly 1989; Longley et al. 1990). Zusätzlich hat Taq-Polymerase eine Thermostabilität von nicht mehr als einigen Minuten bei 100°C.
Die in dieser Erfindung präsentierte DNA-Polymerase besitzt eine hohe Thermostabilität von 90 und 100°C. Es muss untersucht werden, ob die Anwesenheit von Stabilisatoren, wie etwa nicht-ionischen Detergenzien oder Rinderserumalbumin (BSA) zu noch weiter verbesserter Thermostabilität führen kann. Der positive Einfluss des nicht-ionischen Detergens Octoxynol (allgemein als TRITON X-100 bekannt) und BSA auf die Thermostabilität von DNA-Polymerasen aus Pyrococcus furiosus und Thermococcus litoralis ist beschrieben worden (EP-Anmeldung Nr. 92 118 965 und 91 303 787.5). Die thermostabile DNA-Polymerase aus Pyrobaculum islandicum wird nicht irreversibel inaktiviert, wenn sie den erhöhten Temperaturen für den Zeitraum unterworfen werden, der notwendig ist, um die Denaturierung von doppelsträngiger DNA zu bewirken, ein Schlüsselschritt im PCR-Verfahren. Als Ergebnis kann das Enzym zusätzliche Vorteile gegenüber zuvor charakterisierten thermostabilen Enzymen bereitstellen. Höhere Temperaturen bis zu 100°C können erforderlich sein, z.B. wenn der GC-Gehalt des DNA-Templates gesteigert wird. Für Zielsequenzen werden Denaturierungstemperaturen über 95°C erforderlich. Aus diesem Zweck werden Lösungsmittel, wie etwa Glycerin oder DMSO in die PCR eingebaut, um partiell die Duplex-DNA zu destabilisieren (Wong et al. 1991; Korge et al. 1992). Diese Agenzien werden zusätzlich zur destabilisierenden Duplex-DNA die Primer-Stabilität beeinträchtigen, können die Aktivität hemmen und die Thermostabilität von Polymerasen senken. Im Gegensatz dazu kann ein einfaches Anheben der Denaturierungstemperatur bis auf 95 oder 100°C bei Pyrobaculum islandicum DNA-Polymerase in einer ansonsten Standard-PCR eine komplette Strangtrennung von PCR-Produkt erleichtern, was die Notwendigkeit für DNA-Helix-destabilisierende Agenzien eliminiert.
Weiterhin besteht noch ein Bedarf, eine gereinigte DNA-Polymerase mit 3'-5'-Proofreading-Exonucleaseaktivität sogar mit hoher thermischer Stabilität herzustellen. Die P. islandicum DNA-Polymerase mit 3'-5'-Proofreading-Exonucleaseaktivität hat eine substantiell niedrigere Basiseinbaufehlerrate im Vergleich zur Nicht-Proofreading DNA-Polymerase.
Mit P. islandicum DNA-Polymerase durchgeführte PCR. Thermostabile DNA-Polymerasen werden insbesondere für in vitro Amplifikation von DNA-Fragmenten durch PCR und zur DNA-Sequenzierung verwendet. Aufgrund der assoziierten 3'-5'-Exonucleaseaktivität offerieren Archaea DNA-Polymerasen die Möglichkeit, DNA-Fragmente mit hoher Genauigkeit (niedrige Mutationsfrequenz) zu amplifizieren. Zur Zeit werden alle archaelen DNA-Polymerasen, die in der PCR verwendet werden, von Euryarchaeota abgeleitet. Es sind keine Berichte verfügbar, welche die erfolgreiche Anwendung von Crenarchaea DNA-Polymerasen in PCR betreffen.
Um die Geeignetheit der DNA-Polymerasen aus P. islandicum bei DNA-Amplifikation zu verifizieren, wurde eine PCR unter Verwendung von einer Einheit Enzym und von verschiedenen Primerkombinationen durchgeführt. Wie in 9 gezeigt, könnten bis zu 1500 bp eines λ-DNA-Templates amplifiziert werden. Dies ist der erste Bericht über die mögliche Verwendung einer crenarchaealen DNA-Polymerase in der PCR.
Wie oben ausgesagt, ist auch ein Verfahren einer Klonierungsprozedur für B DNA-Polymerasen unter Verwendung degenerierter Primer gemäß SEQ ID NO: Z und SEQ ID NO: 2 Gegenstand der vorliegenden Erfindung. Weiterhin ist ein Verfahren zur Amplifikation von Fragmenten einer B DNA-Polymerase unter Verwendung von Primern gemäß der SEQ ID NO: 1 und 2 Gegenstand der vorliegenden Erfindung. Die Erfindung beinhaltet auch die oben erwähnten Verfahren, falls die folgenden Varianten der Primer mit SEQ ID NO: 1 und 2 verwendet werden:

– Primer, bei denen Tripletts zugegeben oder vermieden werden, insbesondere falls 1-3 Tripletts vermieden und 1-5 Tripletts zugegeben werden
– Primer, bei denen ein oder mehrere der in SEQ ID NO: 1 oder SEQ ID NO: 2 gezeigten Inosine wieder durch eine natürlich vorkommende Base ersetzt werden
– Primer, bei denen ein oder mehrere natürlich vorkommende Basen durch Inosin substituiert werden, zusätzlich zu den Substitutionen gemäß SEQ ID NO: 1 oder SEQ ID NO: 2, vorzugsweise wird ein natürlich vorkommende Base durch Inosin substituiert, das an der dritten Position eines Tripletts ist.

Tabelle 1: Einfluss von Inhibitoren auf die DNA-Polymerase aus P. islandicum
Der Einfluss verschiedener Inhibitoren wurde bei Standard-Analysebedingungen (pH 7,5; 0,5 mM MgCl₂; 0 mM KCl; 75°C) unter Verwendung von 0,5 Einheiten gereinigter DNA-Polymerase festgestellt. Eine Präinkubation des Enzyms mit N-Ethylmaleimid wurde bei 90°C für 20 min durchgeführt.
Beispiel 1:
Stämme, Enzyme, Vektoren und Chemikalien
Pyrobaculum islandicum DSMZ4184 (Huber et al. 1987) wurde von der Deutschen Sammlung für Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ; Braunschweig, Deutschland), bezogen. Magnesiumkulturen von E. coli DH5α-Zellen wurden in das Expandierungs-Klonierungs-Kit (Boehringer Mannheim) eingeschlossen. E. coli BL21-Zellen wurden von Novagen Inc., Madison, USA bezogen.
Enzyme und Kits für die Manipulationen von DNA wurden von Boehringer Mannheim oder, falls erwähnt, von anderen Kunden bezogen. Kits für die Reinigung und Gelextraktion von DNA waren Produkte der QIAGEN (Hilden, Deutschland). Ein Kit für die Präparation von Plasmid- und Cosmid-DNA wurde von BioRad (München, Deutschland) erhalten.
Der Expressionsvektor pASK-IBA3, der Induktor Anhydrotetracyclin und die Streptactin-Sepharose-Säulen wurden von IBA, Göttingen, Deutschland bezogen.
Materialien für die Charakterisierung von DNA-Polymerase wurde von Boehringer Mannheim erworben. N-Ethylmaleimid wurde von Serva bezogen. Andere Chemikalien für die Präparation von Medien und Puffern wurden von Difco (Detroit, Wi), Serva (Heidelberg, Deutschland), Sigma (St. Louis, Mo.) und Merck (Darmstadt, Deutschland) bezogen.
Isolation von DNA
P. islandicum wurde anaerob bei 98°C in 1,5 1 Medium 390 gezogen, wie von der DMSZ empfohlen. Die Zellen wurden geerntet, mit TE-Puffer (10 mM Tris-HCl, pH 8,0, 1 mM EDTA) gewaschen und in 3 ml 20% Saccharose aufgenommen, die 10 mM Tris-HCl, pH 8,0 enthielt. Triton X-100 wurde zu einer Endkonzentration von 0,3 % zugegeben. Nach Inkubation bei 20°C für 1 h wurden 3 ml SET-Puffer (150 mM NaCl, 20 mM Tris-HCl, pH 8,0, 1 mM EDTA), 0,32 ml 10 % Natriumdodecylsulfat und 0,16 ml Proteinase K (10 mg/ml) zugegeben. Die Mischung wurde bei 37°C für 1 h inkubiert. Nach nachfolgender Phenol-Chloroform-Extraktion wurde die DNA durch Ethanol-Präzipitation wiedergewonnen (Maniatis et al. 1982).
Beispiel 2:
PCR und Herstellung von Sonden
Für die erste PCR entwarfen wir zwei degenerierte Primer, basierend auf den konservierten Bereichen I und II der α-artigen DNA-Polymerasen (Wang et al. 1989).
Der Vorwärts-Primer war:
SEQ ID NO: 1: 5'-GTI(CT)TIGATTT(CT)GCI(AT)(GC)I(CT)TITA(CT)CC-3'
und
der reverse Primer war:
SEQ ID NO: 2: 5'-GAAIAGIGAGTCIGTATCICCAT-3',
unter Verwendung von Desoxyinosin (I), das zu allen vier Nucleotiden komplementär ist. Die Primer wurden durch ARK Scientific, GmbH Biosystems (Darmstadt, Deutschland) maßsynthetisiert. Ungefähr ein Nanogramm P. islandicum DNA und 100 pmol jeden Primers wurden einer PCR-Reaktionsmischung zugegeben, die 200 μM Desoxyribonucleosid-Triphosphate, das Expand^TM hochgenaue Puffersystem und 2 Einheiten Expand^TM High Fidelity enzyme (Boehringer Mannheim) enthielten. Nach einem einfänglichen Denaturierungsschritt bei 94°C für 2 min wurden 30 Zyklen mit einem Temperaturprofil von 10 s bei 94°C, 30 s bei 46°C und 90 s bei 68°C mit einem DNA-Thermo-Cycler (GeneAmp PCR System 2400; Perkin-Elmer, Weiterstadt) durchgeführt. Nach dem letzten Zyklus wurden die Proben für weitere 7 min bei 68°C inkubiert, um den Abschluss des Extensionsschrittes sicherzustellen. Das PCR-Produkt wurde gereinigt und sequenziert. Andere PCR-Reaktionen wurden unter denselben Bedingungen mit unterschiedlichen Annealing-Temperaturen und Verlängerungszeiten durchgeführt. Dieselbe PCR-Reaktionsmischung, die ebenfalls die oben beschriebenen Template und Primer sowie 200 μM dATP, dGTP und dCTP, aber 190 μM dTTP und 10 μM DIG-11-dUTP (Digoxigenin-markierte dUTP, alkalistabil; Boehringer Mannheim) enthielten, wurden verwendet, um eine nicht-radioaktive Sonde herzustellen.
Genomische Southern-Blot-Hybridisierung
P. islandicum DNA wurde über Nacht mit verschiedenen Restiktionsenzymen verdaut und auf einen 0,7 % Agarosegel aufgetrennt. Die verdaute DNA wurde auf eine positiv-geladene Nylon-Membran übertragen. Die oben beschriebene DIG-markierte Sonde wurde verwendet, um eine Hybridisierung bei 68°C durchzuführen und es wurde ein Dreischrittverfahren, einschließlich Membranblockierung, Inkubierung mit anti-DIG-Antikörper, Fab-Fragmenten und einer Reaktion der Antikörperkonjugierten alkalischen Phosphatase mit dem chemilumineszenten Substanz CDP-Star^TM (Boehringer Mannheim) durchgeführt, um die Orte der hybridisierten Probe zu festzustellen.
Cosmid-Klonierung
Nach dem Southern-Blot wurde das Restriktionsenzym SacI ausgewählt, um einen präparativen Verdau von P. islandicum DNA durchzuführen. Die verdauten DNA-Fragmente mit einer Größe zwischen 6 und 7,5 kbp wurden aus dem Agarosegel extrahiert und unter Verwendung des Expand^TM-Clonierungs-Kits (Boehringer Mannheim) kloniert. Die Fragmente waren stumpfendig und in den Cosmidvektor einligiert, und die Konstrukte wurden in Bakteriophagen gepackt. Nachfolgend wurde eine E. coli DH5α-Magnesiumkultur infiziert und positive Klone wurden durch Vektor-mediierte Ampicillinresistenz selektiert. Ein das DNA-Polymerasegen enthaltender Cosmidklon wurde durch Koloniefilterhybridisierung (DIG System Handbuch für Filterhybridisierung) identifiziert, unter Verwendung der beschriebenen Sonde. Die Cosmid-DNA aus einem positiven Klon wurde präpariert und sequenziert.
DNA-Sequenzierung
Gereinigte PCR-Produkte und Cosmid-DNA-Präparationen wurden durch SeqLab (Göttingen, Deutschland) maßsequenziert. Die Nucleotidsequenzen wurden durch die Didesoxy-Kettenabbruchmethode (Sanger et al. 1977) bestimmt. Alle DNA-Proben wurden unter Verwendung von ABI PRISM^TM BigDye-Terminatoren sequenziert und durch automatische Sequenzer mit einer Sequenzanalyse-Software (Applied Biosystems) analysiert.
Beispiel 3:
RNA-Isolierung und Bestimmung des Transkriptionsstarts
Um einen vermutlichen Transkriptionsstartbereich des detektierten DNA-Polymerasegens zu untersuchen, wurde RNA aus frisch kultivierten P. islandicum-Zellen präpariert, nach einem von DiRuggiero und Robb (1995) geschriebenen Protokoll, und es wurde eine 5'RACE PCR durchgeführt, unter Verwendung des 5'/3'RACE Kits (Boehringer Mannheim). Für Erststrang-cDNA-Synthese, cDNA-Amplifikation und Kontroll-PCR wurden von der Gensequenz abgeleitete reverse Primer verwendet. Die amplifizierte cDNA wurde gelextrahiert und direkt sequenziert.
Beispiel 4:
Expression und Reinigung von P. islandicum DNA-Polymerase
Das DNA-Polymerasegen wurde in E. coli unter Verwendung des Vektors pASK-IBA 3 (IBA, Göttingen) exprimiert. Die Expressionskassette dieses Vektors wird durch den chemischinduzierbaren Tetracyclinpromotor (Skerra 1994) transkriptionsgesteuert. Für eine bequeme Reinigung des rekombinanten Proteins enthielt der Vektor eine C-terminale, neun Aminosäuren kodierende Sequenz, die Strep-tag genannt wird. Die Strep-tag gestattet es, das sich ergebende Fusionsprotein mit einem Affinitätschromatographie-Schritt auf Sepharose-gekoppelten Streptavidin oder Streptactin aufzureinigen (Schmidt und Skerra 1994; Voss und Skerra 1997). Zwei Primer, Exforw-Bsal (5'-GCTGATGGTCTCGAAT GGAACTAAAAGTTTGGCCTCT-3') und Exrev-BsaI (5'-GCTGATGGTCTC CGCGCTACTTAGAAAATCAAGAAGCGACCT-3') wurden verwendet, um das Polymerasegen aus chromosomaler P. islandicum DNA zu amplifizieren. Der Vorwärtsprimer wurde so konstruiert, dass eine Restriktionsstelle für BsaI erzeugt wurde und das Startcodon, das für Valin kodiert, entfernt wurde. Das rekombinante Fusionsprotein begann mit dem Vektor-kodierten Methionin. Der reverse Primer wurde so ausgelegt, dass eine Restriktionsstelle für BsaI erzeugt wurde und das Stopp-Codon des Polymerasegens entfernt wurde. Das PCR-Produkt wurde durch Gelextraktion gereinigt, mit BsaI gespalten, wieder gelextrahiert und in den BsaI geschnittenen pASK-IBA 3 Vektor einligiert. Die Expression des Polymerasegens wurde in E. coli BL21 durchgeführt. Transformierte Zellen wurden bei 37°C in 1000 ml LB-Medium kultiviert, das 100 μg Ampicillin pro ml enthielt. Bei einer optischen Dichte von 0,5 bei 600 nm wurden die Zellen durch die Zugabe von 100 μl Anhydrotetracyclin (2 mg/ml in Dimethylformamid; Endkonzentration 200 μg/l) induziert und die Kultur wurde für weitere 15 Stunden inkubiert. Nach Abkühlen wurden die Zellen durch Zentrifugation bei 4°C geerntet, mit Puffer W gewaschen, gegengewichtet mit 50 mM Tris-HCl pH 8,0, 1 mM EDTA und dem kompletten mini, EDTA-freien Proteaseinhibitorcocktail (Boehringer Mannheim) und in 5 ml Puffer W resuspendiert. Die Zellen wurden durch Ultraschall aufgebrochen und nach Zentrifugation wurde der Rohextrakt für 20 min bei 80°C hitzebehandelt und wieder zentrifugiert. Die Probe wurde auf eine direkt einsatzfähige Streptactin- Sepharose-Säule (1 ml) aufgebracht, die mit 5 ml Puffer W äquilibriert war. Nach 2-maligem Waschen der Säule mit 5 ml Puffer W wurde die Elution des gebundenen Proteins durch schrittweises Aufbringen von 10 ml Puffer W, der 2,5 mM Desthiobiotin (Sigma) enthielt, bewirkt. Aktive Fraktionen wurden gepoolt und gegen das 500-fache Volumen von 50 mM Tris-HCl pH 7,2 und 10 % Glycerin dialysiert.
Beispiel 5:
Polymeraseaktivitätsanalyse
Ein nicht-radioaktiver kolorimetrischer Enzymimmunoassay (DNA-Polymerase-Assay, nicht-radioaktiv; Boehringer Mannheim) wurde basierend auf der Inkorporation von Digoxigenin- und Biotin-markiertem dUTP anstelle von radioaktiv-markierten Nucleotiden wie bei dem Standard-DNA-Polymerase-Assay in derselben DNA durchgeführt. Wie Suzuki et al. (1993) demonstrierten, zeigten die Ergebnisse einer chemolumineszenten Enzym-verknüpften Immunoanalyse, die demselben Prinzip wie der hier beschriebene Test folgte, vergleichbare Resultate zur Standard-Isotopen-Analyse. Das Bestimmen und Quantifizieren der synthetisierten DNA folgte dem Sandwich-ELISA-Protokoll, wie vom Hersteller empfohlen. Wenn nicht anders angemerkt, enthielt die Standard-Reaktionsmischung in einem 100 μl Volumen 50 mM Tris-HCl, pH 7,2, 0,5 mM MgCl₂, 60 μg BSA, 0,36 μM DIG-11-dUTP, 18 nM Biotin-11-dUTP, 18 μM jedes dNTPs, 0,27 μg DnaseI-aktivierte Kalbsthymus-DNA als ein Template und eine DNA-Polymeraseprobe. Die Reaktion wurde bei 75°C für 1 h inkubiert. Es wurde Taq-DNA-Polymerase als Standard verwendet, mit 50 mM Tris-HCl, pH 7,9, 5 mM MgCl₂ und 50 mM KCl in der Reaktionsmischung. Eine Einheit wurde als die Menge an Enzym definiert, die notwendig war, um 10 nmol dNTP in eine säureunlösliche Form bei 75°C in 30 min einzubauen. Um die Thermostabilität der DNA-Polymerase aus P. islandicum festzustellen, wurden Vorinkubationen in einem Reaktionsmix ohne BSA, markiertes oder nicht-markiertes dNTP und Template-DNA durchgeführt, dem die Zugabe der fehlenden Komponenten und Standardinkubation für 1 h bei 75°C folgte. Für die Bestimmung der biochemischen Eigenschaften von DNA-Polymerase enthielten alle Reaktionsmischungen 0,5 Einheiten Enzym.
Beispiel 6:
DNA-Polymeraseaktivitätsgel
Die Entdeckung von DNA-Polymeraseaktivitäten auf SDS-Polyacrylamidgelen (SDS-PAGE) wurde gemäß einer modifizierten Version (Niehaus et al. 1997) des von Spanos und Hübscher (1983) beschriebenen Verfahrens durchgeführt. Probenkonzentrationen von einer und fünf Einheiten jeder DNA-Polymerase wurden auf einer SDS-PAGE (10 %) gefahren. Die Probenaufbereitung und Gelelektrophorese wurden wie durch Laemmli (1970) beschrieben ausgeführt. Das Laufgel enthielt zusätzlich 150 μg/ml DNAseI-aktivierte Kalbsthymus-DNR als Template für die Polymerasen. DNA-Polymerasen aus Thermus aquaticus (Taq Polymerase) und Pyrococcus woesei (Pwo Polymerase) wurden von Boehringer Mannheim bezogen. Das SDS wurde durch viermaliges Eintauchen des Gels in 50 mM Tris-HCl pH 7,2, 2,3 mM β-Mercaptoethanol, 1 mM EDTA, 5% Glycerin entfernt. Die Renaturierung der Proteine wurde bei 4°C über Nacht unter Verwendung von 1 mM MgCl₂ und 1 μM dATP, die demselben Puffer zugegeben waren, durchgeführt. Das Gel wurde dann in Aktivitätspuffer inkubiert, der 50 mM Tris-HCl pH 7,2, 2,3 mM β-Mercaptoethanol, 1 mM DTT, 1 mM MgCl₂, 5% Glycerin, 8 μM dGTP, dATP und dCTP, 4 μM dTTP und 5 μM DIG-11-dUTP enthielt und bei 70°C für 4 h inkubiert. Die DNA wurde auf eine Nylonmembran transferiert und das eingebaute DIG-11-dUTP wurde immunologisch, wie zuvor beschrieben, entdeckt.
Beispiel 7:
Analyse der Exonucleaseaktivität
Um die Exonucleaseaktivität zu analysieren, inkubierten wir 1,5 Einheiten gereinigter Polymerase mit 1 μg eines ³H-markierten DNA-Templates, das durch Ultraschall verdaut wurde. Die freigesetzten ³H-markierten Nucleotide wurden als cpm/10 min auf einem Szintillizer nach 4 h Inkubation detektiert. Die Inkubationen wurden bei 65°C und 37°C im Puffer (10 mM Tris-HCl, 1 mM DTT, 50 mM NaCl, 10 mM MgCl₂), der normalerweise bei diesem Test verwendet wurde, durchgeführt.
Beispiel 8:
Analyse der 3'-5'-Exonucleaseaktivität auf Einzelstränge
Für die 3'-5'-Exonucleaseaktivität auf Einzelstränge wurde der Abbau eines synthetischen Primers (22-mer), der mit Digoxigenin für eine immunologische Detektion 5'-markiert war, analysiert. 3'-5'-Exonucleaseaktivität an Doppelsträngen wurde unter Verwendung desselben Primers, der an einem Template (34-mer) hybridisiert war, gemessen. Die Sequenzen von Primer und Template sind in 8 illustriert. Das Analyseprinzip wurde zuvor beschrieben (Niehaus, 1997, #77). 0,6 pmol des markierten Substrats und 0,1 Einheit gereinigter DNA-Polymerase wurden in 10 μl verschiedener Puffer ohne und mit steigenden Mengen von dNTPs (bis zu 1 μM) bei 70°C für 1 h inkubiert. Um sicherzustellen, dass keine kontaminierende Exonucleaseaktivität aus E. coli gemessen wurde, wurde die Analyse weiterhin bei 37°C ausgeführt. Der optimale DNA-Polymerasepuffer, der 50 mM Tris-HCl, pH 7,3 und 0,5 mM MgCl₂ enthielt, wurde verwendet, wie auch ein Puffer, der 50 mM Tris-HCl, pH 8,6 und 0,5 mM MgCl₂ enthielt. Die Reaktion wurde auf Eis mit Formamidpuffer unterbrochen und die Proben auf einem 12% Polyacrylamidsequenzgel elektrophoriert, das 8 M Harnstoff in TBE-Puffer enthielt. Der Abbau der Polymerisationsprodukte wurde durch immunologische Detektion visualisiert. Pwo-Polymerase in einem 10 mM, pH 8,9, 25 mM KCl, 2 mM MgSO₄ und 5 mM (NH₄)₂SO₄ enthaltendem Puffer und Taq-Polymerase im zuvor beschriebenen Aktivitätspuffer wurden als Kontrollen verwendet.
Beispiel 9:
PCR-Reaktionen mit P. islandicum
PCR-Reaktionen mit P. islandicum-DNA-Polymerase wurden mit 1 Einheit Enzym im folgenden Puffer ausgeführt: 15 mM Tris-HCl, pH 8,6, 12,5 mM KCl, 2, 5 mM (NH₄)₂SO₄, 1,25 mM MgCl₂, 20 μg/ml BSA. 10 ng λ-DNA wurden als Template verwendet. Der Vorwärts-Primer 5'-GATGAGTTCGTGTCCGTACAACT-3' wurde mit den folgenden reversen Primern 5'-GGTTATCGAAATCAGCCACAGCG-3' zur Amplifikation von 500 bp, 5'-GTTAACTTTGATTCTGGCCTGCG-3' zur Amplifikation von 1000 bp und 5'-GTGAGATAAACGGCAACTGCCGG-3' zur Amplifikation von 1500 bp kombiniert. Die PCR-Zyklen wurden wie zuvor beschrieben mit einem Temperaturprofil von 10 s bei 94°C, 30 s bei 56°C und 1,5 min bei 75°C ausgeführt. Expand High Fidelity-Enzym wurde als Kontrolle unter PCR-Bedingungen wie vom Hersteller empfohlen verwendet.
Figurenlegende:
1: Nucleotidsequenz des Polymerasegens und abgeleitete Aminosäuresequenz der Familie B DNA Polymerase aus P. islandicum
Die Nucleotide sind vom 5'-Ort aus numeriert. Der Translationsstartort ist bei Nr. 131, der Stopport bei Nr. 2486.
2: SDS PAGE (10 %) enzymatischer Fraktionen während der Reinigung von rekombinanter DNA-Polymerase aus P. islandicum
Spuren: 1, Rohextrakt; 2, Rohextrakt nach Hitzebehandlung (20'80°C); 3, Molekulargewichtmarker (breiter Bereich, BioRad); 4, Enzympräparation nach Chromatographie auf Streptactin. Die Molekulargewichte sind angegeben.
3: DNA-Polymeraseaktivitätsgel
Spuren: 1, Taq-Polymerase (5 Einheiten); 2, P. islandicum DNA-Polymeraseenzympräparation nach Chromatographie auf Streptactin (2 Einheiten); 3, Rohextrakt aus P. islandicum; 4, Pwo-Polymerase (2,5 Einheiten).
4: Optimaler pH für die DNA-Polymeraseaktivität
Das pH-Optimum wurde in einer Standard-Analyse bei 75°C mit 0,5 mM MgCl₂ detektiert.
5: Optimale Konzentration an KCl, (NH₄)₂SO₄ und MgCl₂ für die DNA-Polymeraseaktivität
Die optimale Konzentration an MgCl₂ wurde in einer Standardanalyse bei 75°C und pH 7,3 gemessen. Die Standardanalyse wurde mit 0,2 Einheiten gereinigter DNA-Polymerase in Anwesenheit verschiedenen Konzentrationen von KCl, (NH₄)₂SO₄ und MgCl₂ ausgeführt.
6: Einfluss von KCl auf die DNA-Polymeraseaktivität
Der Einfluss von einwertigen Kaliumionen wurde in einer Standardanalyse bei 75°C, pH 7,3 und mit 0,5 mM MgCl₂ festgestellt.
7: Thermostabilität der rekombinanten DNA-Polymerase
Um die Thermostabilität der DNA-Polymerase abzuschätzen, wurde das Enzym ohne BSA, Nucleotide und Template DNA bei 90 und 100°C vorinkubiert, woraufhin die Zugabe aller fehlenden Verbindungen und eine Standardinkubation bei 75°C, pH 7,3 und mit 0,5 mM MgCl₂ folgte.
8: Einzel- und Doppelstrang-abhängige 3'-5'-Exonucleaseaktivität von DNA-Polymerasen aus Pyrobaculum islandicum (P. isl. Pol), Thermus aquaticus (Taq pol) und Pyrococcus woesei (Pwo pol). Die Analyse wurde, wie in Materialien und Methoden beschrieben, bei 70°C für 1 h mit 0,1 Einheiten jeder Polymerase ausgeführt. Ein Digoxigeninmarkierter Primer als ein einzelsträngiges Substrat (ss) und ein Primer/Template-Komplex als ein doppelsträngiges Substrat (ds) wurden verwendet. Konzentrationen von dNTP (μM) in jeder Reaktion werden angegeben. Die Reaktionsprodukte wurden auf einem 12% Polyacrylamidgel, das 8 M Harnstoff enthielt, getrennt und durch immunologische Detektion visualisiert. Die Größen (Nucleotide, nt) des nicht-abgebauten Primers und der Reaktionsprodukte sind angegeben. In Spur P, Digoxigeninmarkierter Primer in Puffer ohne dNTPs; Puffer 1:40 mM Tris-HCl pH 7,3, 0,5 mM MgCl₂; Puffer 2:50 mM Tris-HCl, pH 8,6, 0,5 mM MgCl₂. Taq- und Pwo-Polymerase wurden unter Verwendung von Puffern gemäß Materialien und Methoden getestet. Rechts sind Primer und Templatesequenzen illustriert.
9: Anwendung der DNA-Polymerase aus P. islandicum in der PCR. Die Reaktionen wurden in einem Puffer ausgeführt, der 15 mM Tris-HCl, pH 8,6, 12,5 mM KCl, 2,5 mM (NH₄)₂SO₄, 1,25 mM MgCl₂ und 20 μg/ml BSA enthielt. 1 Einheit der DNA-Polymerase aus P. islandicum wurde verwendet, um 500 bp (Spur 1), 1000 bp (Spur 2) und 1500 bp (Spur 3) eines λ-DNA-Templates zu amplifizieren. Die Kontroll-PCR wurde mit 2,5 Einheiten High Fidelity Enzym (Spur 4) durchgeführt. 20 μl jedes PCR-Produktes wurden auf einen 1% Agarosegel aufgetragen. Die entsprechenden Molekulargewichte des Markers (Spur 5) sind in Kilobasenpaaren (kb) angegeben.
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Claims

DNA-Polymerase, die aus Pyrobaculum islandicum erhältlich ist, worin sechs konservierte Motive, die für die Polymerasen der Familie B indikativ sind, in der Pyrobaculum islandicum DNA-Polymerasesequenz enthalten waren und wobei diese Polymerase 3'-5'-Exonucleaseaktivität zeigt.
DNA-Polymerase nach Anspruch 1, worin das Molekulargewicht dieser Polymerase etwa 90 kDa beträgt.
DNA-Polymerase nach Anspruch 1 oder 2, worin die Polymerase die meiste Aktivität bei einem pH von 7,3 zeigt.
DNA-Polymerase nach einem der Ansprüche 1-3, wobei diese Polymerase eine schwache Empfindlichkeit gegenüber ddGTP zeigt.
Rekombinante DNA-Polymerase nach einem der Ansprüche 1-4, die aus E.coli BL21, der mit einem Vektor, der ein Gen, das für die DNA-Polymerase kodiert, enthält, transformiert ist, erhältlich ist.
DNA, die eine Polymerase nach einem der Ansprüche 1-4 kodiert.
Vektor, der ein Gen einer Polymerase nach einem der Ansprüche 1-4 enthält.
Wirt, der mit einem Vektor nach Anspruch 7 transformiert ist.
Verfahren zur Herstellung einer rekombinanten DNA-Polymerase nach Anspruch 5.
Verwendung einer DNA-Polymerase nach einem der Ansprüche 1-5 für die in vitro Amplifizierung von DNA-Fragmenten.
Verwendung einer DNA-Polymerase nach einem der Ansprüche 1-5 für die Bestimmung von DNA-Sequenzen.
Verfahren zur Klonierung einer B-DNA-Polymerase unter Verwendung von Primern mit SEQ ID Nr. 1 und SEQ ID Nr. 2 oder Varianten davon, die letzteren sind aus der folgenden Gruppe gewählt: Primer, worin ein bis drei Tripletts weggelassen sind und ein bis fünf Tripletts hinzugefügt sind, Primer, worin ein oder mehrere der in SEQ ID Nr. 1 oder SEQ ID Nr. 2 gezeigten Inosine durch eine natürlich vorkommende Base substituiert sind oder Primer, worin eine oder mehrere natürlich vorkommende Basen durch Inosin zusätzlich zu den Substitutionen nach SEQ ID Nr. 1 oder SEQ ID Nr. 2 substituiert sind, worin eine natürlich vorkommende Base durch Inosin, das sich an Position 3 des Tripletts befindet, substituiert wird.
Verfahren zur Amplifikation von Fragmenten der B-DNA-Polymerase unter Verwendung von Primern mit SEQ ID Nr. 1 und SEQ ID Nr. 2 oder Varianten davon, die letzteren sind aus der folgenden Gruppe gewählt: Primer, worin ein bis drei Tripletts weggelassen sind und eins bis fünf Tripletts hinzugefügt sind, Primer, worin ein oder mehrere der in SEQ ID Nr. 1 oder SEQ ID Nr. 2 gezeigten Inosine durch eine natürlich vorkommende Base substituiert sind oder Primer, worin eine oder mehrere natürlich vor kommende Basen durch Inosin zusätzlich zu den Substitutionen nach SEQ ID Nr. 1 oder SEQ ID Nr. 2 substituiert sind, worin eine natürlich vorkommende Base durch Inosin, das sich an Position 3 des Tripletts befindet, substituiert wird.