DE521126C

DE521126C - Verfahren zur Reinigung von Biokatalysatoren, wie Co-Enzymen und Hormonen sowie wasserloeslichen Vitaminen

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Publication number: DE521126C
Application number: DEK100492D
Authority: DE
Original assignee: Knoll GmbH
Current assignee: Abbott GmbH and Co KG
Priority date: 1926-08-29
Filing date: 1926-08-29
Publication date: 1931-03-23

Description

Verfahren zur.Reinigung von Biokatalysatoren, wie Co-Enzymen und Hormonen sowie wasserlöslichen Vitaminen Die zur Reinigung von Biokatalysatoren bisher verwendeten Verfahren sind Fällungs-und Adsorptionsmethoden. Es hat sich nun gezeigt, daß die Verwendung der Diffusion oder der Dialyse in den verschiedenen Stadien des Reinigungsprozesses rascher zu hochaktiven Präparaten führt.
Die noch unerforschten Biokatalysatoren, welche Co-Enzyme, Hormone und wasserlösliche Vitamine, nicht aber die Enzyme umfassen (vgl. E u 1 e r , Chemie der Enzyme, I. Teil, 1925, S. 176 ff.), wurden bisher als so hochmolekulare Stoffe angesehen, daß es nicht vorauszusehen war, daß sie in Lösung ausreichende Beweglichkeit (Diffusionsfähig-]zeit) besitzen würden, um darauf ein Verfahren zu ihrer Abtrennung von hochmolekularen Verunreinigungen zu gründen. Die Entdeckung der verhältnismäßig hohen Diffusionsfähigkeit, beruhend auf dem mittleren Molekulargewicht solcher Stoffe, hat nur. die Ausarbeitung von Reinigungsmethoden ermöglicht, durch welche die hochmolekularen, schwer diffundierenden Verunreinigungen abgetrennt werden können. Eine durch solche Diffusion gereinigte Lösung enthält neben dem aktiven Körper noch Salze und andere sehr leicht diffundierbare Stoffe. Diese können durch weitere Diffusion gleichzeitig größtenteils entfernt werden, da sie erheblich größere Diffusionsgeschwindigkeit aufweisen als die zu reinigenden Stoffe.
Die bereits erwähnten Enzyme entziehen sich wegen ihres durchweg sehr hohen Molekulargewichtes diesen Reinigungsverfahren; auch Ultrafiltration ist auf Enzyme nicht immer anwendbar (vgl. E u 1 er, Chemie der Eiizyiiie, 1925, I. Teil, S. i16, und E u 1 e r , Chemie der Enzyme", 192o, I. Teil, S. 92. und 93).
Eine erhebliche Reinigung der Biokatalysatoren wird schon mit einer Membran allein erzielt, welche in je einem Versuch die Trennung einerseits von den hochmolekularen und andererseits von den niedrig molekularen Begleitstoffen ermöglicht (vgl. z. B. Berichte über die gesamte Physiologie, Band 33 [19261, S. 9i, und S t a u b , Insulin, 1925, S. 43). Als geeignete Membran hat sich z. B. eine Kollodiummembran erwiesen.
Biokatalysatoren sind nun aber meist mehr oder weniger labile Substanzen, für deren Isolierung aus verschiedenen Gründen ein rasches Arbeiten von Vorteil ist. Deswegen hat es sich besonders in den Fällen, wo die Durchführung der oben beschriebenen Diffusionsreinigung ohne Verwendung von Membranen praktisch Schwierigkeiten macht, als vorteilhaft erwiesen, die oben erwähnten Methoden wiederholter Dialyse in eine einzige fraktionierte Diffusion unter Verwendung von wenigstens zwei Membranen zusammenzuziehen. Die erste (untere) Membran hält die hochmolekularen Begleitstoffe zurück und läßt die zu reinigenden Biokatalysatoren mit den leichter diffundierenden Begleitstoffen hindurchtreten, während die zweite Membran nur die am leichtesten diffundierenden Stoffe (Salze usw.) hindurchläßt.
Die Membranen können von gleichartigem oder auch von ungleichartigem Material gewählt werden. Die Dialyse ist in einem für jeden Fall festzustellenden Zeitpunkt abzubrechen, in welchem die zwischen den Diaphragmen befindliche Lösung das Höchstmaß des Biokatalysators enthält. Abgesehen von der hierdurch erreichten Beschleunigung des Reinigungsverfahrens ist es wesentlich, die Lösungen des Biokatalvsators stets innerhalb gewisser Aziditätsgrenzen zu halten, was nach anfänglicher Einstellung der geeigneten Wasserstoffionenkonzentration durch Zusatz von Puffersalzen, wie z. B. Alkaliphosphaten, geschieht.
Im Gegensatz zu den vorstehenden Ausführungen bezieht sich die Patentschrift 183 211 der Klasse 3o h auf ein ganz bestimmtes Material, nämlich auf Schilddrüsen und andere Organe, während es sich in dem vorliegenden Verfahren um Lösungen handelt, welche von gewissen Stoffen bzw. Stoffgruppen befreit werden sollen. Demgemäß ist das Verfahren der Patentschrift 183 211 der Klasse 3oh eine Extraktion, wie sie im vorliegenden Falle überhaupt nicht zur Verwendung kommen kann. Ebenso ist das in der Patentschrift 19¢ 77-j. der Klasse 3oh beschriebene Verfahren ein Extraktionsverfahren, wobei das feste Organ offenbar durch Filtermassen hindurch extrahiert wird.

Ein Reinigungsverfahren. wie es sowohl in der vorstehenden Beschreibung als auch in den Beispielen und Ansprüchen gekennzeichnet ist, wurde früher bei keinem Co-Enzym, Hormon oder wasserlöslichen Vitamin durchgeführt oder beschrieben. Es ist also durchaus neu und schließt einen wesentlichen technischen Fortschritt in sich. Beispiel 1 In ein zylindrisches Glasgefäß von 1o cm Durchmesser, welches unten mit Abflußrohr und Glashahn versehen ist und bis zum Beginn des zylindrischen Teiles mit Quecksilber gefüllt wird, werden 300 ccm x'@"o :HIol. Monokaliumphosphatlösung eingefüllt. 'Nach Einstellung konstanter Temperatur «-erden mittels von oben eingesetzter Pipette zwischen Quecksilber und Phosphatlösung roo ccm der zu reinigenden Biokatalvsatorlösung möglichst ohne Erschütterung geschichtet. :Nach 14stündiger Diffusion wird der Versuch dadurch unterbrochen, daß langsam und möglichst ohne Mischung der Flüssigkeit zuerst das Quecksilber und dann je Zoo ccm der Füllung abgelassen werden. Die Co-Zymase ist in dem zweiten und dritten Viertel der in vier gleiche Teile geteilten Füllung angereichert, während sich in dem untersten (ersten) Anteile im wesentlichen die hochmolekularen Begleitstoffe, in dem obersten (vierten) im wesentlichen die Salze befinden. Die Wirksamkeit des Verfahrens wird erhöht, wenn die Anteile 2 und 3 nach Eindunsten auf '-/4 ihres Volumens zur Ausgangslösung eines zweiten Diffusionsversuches gemacht werden. Nach zwei solchen Diffusionen erweist sich die Wirksamkeit des aus der Lösung zu gewinnenden Co-Zymase-Präparates auf das Acht- bis Zwölffache des Ausgangswertes gesteigert. Bei einem Versuch betrug z. B. A Co. (-Aktivität der Co-Zymase) in der Ausgangslösung des Versuches: 27o, nach zwei Diffusionen in den mittleren Schichten: 3600. Beispiel e Reinigung durch Diffusion. Das erschütterungsfrei aufgestellte zylindrische Gefäß hat einen Durchmesser von etwa 5 cm, ist unten mit Abflußrohr und Glashahn versehen und so gradiert, daß gleiche Raumteile abgelassen werden können. Nachdem drei Raumteile sterilen und mit Toluol gesättigten Wassers eingeführt worden waren, wurde die Lösung des Hormons der Pankreasdrüse vorsichtig darunter geschichtet. \Tach r62 Stunden wurden vier gleiche Raumteile einzeln abgelassen. Man untersucht in einem Teil jeder Abteilung die Wirksamkeit, in einem anderen Teil stellt man das Gewicht des Trockenrückstandes fest. Der Ouotient aus Wirksamkeit und Gewicht .des Trockenrückstandes gibt den relativen Reinheitsgrad an. Das Ergebnis geht z. B. aus den folgenden Zahlen hervor:

Gewicht des

Ver- Anzahl Konvul- Intern. Trocken- Wirk- Wirk-

Raumteil injiziert Einheiten rückstandes

dünnung Mäuse sionen_ in 5 ccm samlceit

ccm er ccm

I o,2 8000 1o - - 0,03= -

0,2 2500 12 1 - - -

0,2 iooo 25 8 17 - 550

II 0,2 . 500 20 12 12 0,013 920

III 0,2 Ioo 20 18 - - -

0,2 200 io 7 4,5 0,0080 560

IV 0,2 I00 i0 i 2,5 - -

0,2 50 20 13 - 0,0041 250

Aus den Zahlen geht Hervor, daß im zweiten Raumteile die wirksame Substanz durch die Diffusion stark angereichert ist. Die entsprechenden Werte des Ausgangsmaterials Waren: 38 Internationale Einheiten in jedem Kubilczentimeter bei o,oi i g Trockenrückstand in einem Kubikzentimeter. Beispiel 3 Das entfettete Ausgangsmaterial, getrocknete frische oder geeignete konservierte Ovarien, wurde mit der fünfzehnfachen Menge eines 30 °/oigen Alkohol-Wasser-Gemisches, das durch Zusatz von Natronlauge auf eine Wasserstoffionenkonzentration von 12 bis 13 gebracht war, verrieben. Die dadurch entstandene Suspension bzw. kolloide Lösung wurde der freien Diffusion unterworfen, und zwar in der gleichen Weise, wie in Beispiel 2 bei der Reinigung des Hormons der Pankreasdrüse beschrieben wurde.

Nach 5 Tagen wurden die beiden oberen Viertel der Füllung abgetrennt und durch neues Lösungsmittel (alkalisches 30 °/oiges Alkohol-Wasser-Gemisch) ersetzt. Nach weiterer 4tägiger Diffusion wurden die beiden oberen Viertel (die Raumteile 3 und 4 von unten gezählt) zum zweiten Male entfernt. Das erste unterste Viertel enthielt überwiegend Eiweißkörper, das zweite Viertel enthielt neben geringeren Mengen Eiweißkörpern überwiegend Substanzen von mittlerer hlolekulargröße, besonders Ovarialhormon. Bei der Prüfung auf Wirksamkeit wurde das in der Klinischen Wochenschrift, 1388; 1925 und 5, 974; 1926 sowie im Arch. f. Gynäk. 1227, 250; 1925 angegebene Verfahren mit den von E. Laqueur angeregten Verbesserungen benutzt.
B.eispiel4 1 Liter wäßrige Hefeaufschlämmung, die Zoo g frische Brauereihefe enthält, wird 18 Minuten auf 8o° C erwärmt, durch Alkaliphosphate auf die für Co-Zymase optimale Azidität (pH - 5) eingestellt und von den hierbei koagulierenden Eiweißstoffen abfiltriert. 50o ccm des Filtrates werden im Vakuum auf ioo ccm eingeengt und in zwei ineinandergestellten Kollodium-, Pergamentpapier- oder gehärteten Gelatinesäcken dialysiert. Nach 2ostündiger Dialysierdauer wird aus einem Ausgangsmaterial von A Co - 25o ein Endprodukt der Wirksamkeit A Co = 4500 erzielt.
Beispiel s Als Ausgangsmaterial wurde durch Autolyse hergestellter eingedickter Hefeextrakt verwendet. Fraktionierte Dialyse: Drei zylindrische, finit seitlichen Ansatzröhren und Hähnen versebene Gefäße, deren Durchmesser 5,2, 5,4 und S,0 cm beträgt, werden an einem Ende mit Kollodiummernbranen verschlossen und durch Gummiligaturen so aufeinander befestigt; daß die Achsen der drei Zylinder konzentrisch übereinanderliegen und der Inhalt der drei Gefäße durch je eine Kollodiummeinbran getrennt wird.
Das untere Gefäß wird mit einer io °/",igen wäßrigen Lösung von eingedicktem Hefeautolysat und jedes der oberen mit destilliertem Wasser gefüllt. , Dialysedauer: 44 Stunden.
Im Taubenversuch sind zur Aufhebung des Krampfes im Mittel erforderlich:

Ursprüngliches Präparat . . . . . . . . 36 mg

Nach der Dialyse: I. Gefäß...... 54 mg

II. - ...... 15 mg

III. - . . über 8o mg.

Die angegebenen Zahlen geben unmittelbar den Wirksamkeitsgrad an und zeigen, daß in dem zweiten Gefäß das Ausgangsmaterial auf mehr als den doppelten Reinheitsgrad gebracht worden ist.

Claims

PATENTANSPRÜCHE: i. Verfahren zur Reinigung von Biokatalysatoren, wie Co-Enzymen und Hormonen sowie wasserlöslichen Vitaminen, dadurch gekennzeichnet, daß die unreinen Ausgangslösungen unter das Lösungsmittel geschichtet werden und durch freie Hydrodiffusion von höher molekularen und niedriger molekularen Begleitstoffen getrennt werden.
2. Verfahren zur Reinigung von Biokatalysatoren, wie Co-Enzymen, Hormonen sowie wasserlöslichen Vitaminen, dadurch gekennzeichnet, daß diese Stoffe zwei oder mehrere Membranen von gleicher oder verschiedener Beschaffenheit durchwandern, welche so angeordnet sind, daß die hochmolekularen Begleitsubstanzen des Biokatalysators von der ersten Membran zurückgehalten werden, während die letzte Membran im wesentlichen nur die niedrigmolekularen Begleitsubstanzen, nicht aber den zu reinigenden Biokatalysator durchläßt.
3. Verfahren zur Reinigung der oben beschriebenen Stoffe, dadurch gekennzeichnet, daß bei der Reinigung durch Diffusion oder Dialyse die Lösung durch Zusatz geeigneter Elektrolyte auf der für die Stabilität des betreffenden Biokatalysators optimalen Azidität gehalten wird.