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Trennung eines in mindestens zwei Komponenten trennbaren flüssigen Gemisches
Die Erfindung bezieht sich auf die Trennung von Gemischen, z. B. von Aminosäure-Gemischen, mit
Hilfe von Adsorbentien, die aus Derivaten von Cellulose-Kristallit-Aggregaten zusammengesetzt sind, besonders aus solchen Derivaten, die ionisierbare Gruppen enthalten und fähig sind, als Ionenaustauscher zu wirken.
Die Herstellung von Aminosäuren aus Protein-Hydrolysaten ist eine an sich gut bekannte Arbeitsme- thode, mit Hilfe deren man diese technisch wichtigen Verbindungen aus verhältnismässig wohlfeilen Aus- gangsmaterialien gewinnen kann. Indessen ist ihre Trennung, ihre Isolierung und ihre Reinigung ein anderes Problem, und diese letzten Stufen bilden insbesondere den Gegenstand der Erfindung, daneben natürlich auch die Trennung und bzw. oder die Reinigung von vielen andern trennbaren Gemischen. Mit
Hilfe der adsorbierenden Materialien der Erfindung können komplexe Gemische von Aminosäuren, wie sie z. B. in Protein-Hydrolysaten vorhanden sind, in die einzelnen Aminosäuren oder in kleine Gruppen derselben getrennt werden, welch letztere ihrerseits mit Hilfe einer oder mehrerer zusätzlicher Arbeitsstufen weiter getrennt werden können.
Diese erfindungsgemässen Trennungsstufen lassen sich wesentlich vorteilhafter durchführen als diejenigen, welche mit Hilfe der bekannten Ionenaustauscher, einschliesslich der Austauscher auf Kunstharzbasis und der Austauscher, die aus den bekannten Cellulosematerialien aufgebaut sind, durchgeführt werden.
Ionenaustauscher auf der Basis von Cellulose-Kristallit-Aggregat-Derivaten weisen eine Reihe von erwünschten charakteristischen physikalischen und mechanischen Eigenschaften auf, durch welche sie den bekannten Austausch-Materialien überlegen sind. Sie sind z. B. frei von dunklen Verfärbungen und von Gerüchen, wie sie die Kunstharz-Materialien häufig aufweisen, und ihre Teilchengrössen können wesentlich leichter eingestellt werden als vergleichsweise die der bekannten Materialien.
Was die bekannten Cellulosederivate anbelangt, so gestattet ihre faserartige Natur nur eine lockere Packung innerhalb der Trennsäule, was die Bildung von luftgefüllten Hohlräumen zur Folge hat, die zur Ausbildung von Kanälen führen. Auf der andern Seite sind die Derivate der Aggregate von einer nicht faserartigen Partikel-Form, lassen sich demzufolge dicht packen und zeigen keine Kanalbildung.
Man kann die Derivate der Aggregate auch aussieben, um zu Fraktionen von genau festgelegter und einheitlicher Teilchengrösse zu gelangen, und die Teilchengrösse selbst kann so klein gewählt werden, dass man zu einem völlig andern Grössenordnungs-Bereich gelangt, wenn man sie mit jener der bekannten Cellulosederivate in Vergleich setzt. Bekanntlich wird die Schärfe der Trennung eines BeschickungsGemisches im allgemeinen umso besser, je kleiner die Teilchengrösse des Austauscher-Materials ist. Demzufolge kann die Oberfläche der Derivate der Aggregate gewünschtenfalls um ein Vielfaches grösser eingestellt werden, als die der faser artigen Materialien.
Das letztgenannte Material ist wegen seiner Faserstruktur durch Aussieben nur schwierig zu unterteilen, und es kommt nicht selten vor, dass man Produkte mit einer Teilchengrösse in Händen hat, deren eine Dimension sich in der Grössenordnung von 1 oder 2 Mikron bewegt, deren Länge sich jedoch bis zu 1000 Mikron oder darüber hinaus erstreckt.
Von besonderer Bedeutung ist die Tatsache, dass die Derivate der Aggregate ein höheres Schüttgewicht aufweisen als die bekannten Cellulose-Materialien ; das bedeutet, dass von gleichen Gewichtsteilen der beiden Aggregate die Derivate der Aggregate ein kleineres Volumen, vielleicht nur 501o oder weniger, des Volumens der bekannten Cellulose-Materialien einnehmen. Soll ein Beschickungsgemisch
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durch jedes dieser Materialien getrennt werden, so brauchen die Aggregat-Derivate wesentlich weniger stark benetzt werden als das bekannte Material und entsprechend sind auch die zurückbehaltenen Mengen bzw. die Zurückhaltungs-Verluste kleiner.
Der technische Vorteil, der mit den Derivaten der Aggregate verbunden ist, ist ganz augenfällig und er wirkt sich besonders dann günstig aus, wenn es sich um die Trennung eines kostspieligen Beschickungs-Gemisches oder um die Trennung von dessen Komponenten handelt. Auch die Menge des zur Eluierung notwendigen Lösungsmittels kann geringer bemessen werden, und es braucht folglich auch nur eine kleinere Menge des Lösungsmittels aus der eluierten Verbindung abgedampft zu werden.
Die Derivate der Aggregate weisen den besonders erwünschten Vorteil auf, dass sie in reproduzier-
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gungen empfindlich sind, sondern sie begründen zugleich eine Überlegenheit gegenüber den bekannten Cellulose-Derivaten, deren eigenschaftsmässige Reproduzierbarkeit von Charge zu Charge schwankt. Es ist bekannt, dass die handelsübliche Cellulose amorphe Regionen durch die Celluloseketten hindurch verteilt enthält, deren Gehalt unter anderem aus Xylanen und Mannanen besteht. Die Menge der letztgenannten Materialien schwankt von Cellulose zu Cellulose ebenso wie auch die Cellulose selbst von Fabrik zu Fabrik und von Saison zu Saison verschieden ist, und demzufolge sind auch die Derivate, die aus dieser Cellulose hergestellt werden, in gleicher Weise von Ansatz zu Ansatz mit verschiedenen Eigenschaften ausgestattet.
Auf Grund dieser Schwankungen ist es praktisch unmöglich, aus der im Handel befindlichen Cellulose gleichmässige oder reine Derivate herzustellen.'Was den Aschegehalt anbelangt, so können die Derivate der Kristallit-Aggregate einen Aschegehalt von weniger als 500 Teilen pro Million Teile, ja sogar weniger als 100 Teilen pro Million Teile aufweisen, wohingegen die bekannten Cellulosederivate Aschegehalte von 800 Teilen pro Million Teile aufwärts besitzen.
Bei der Behandlung von trennbaren Beschickungs-Gemischen, wie z. B. Aminosäuren und Proteinen, können die Aggregat-Derivate eine höhere Adsorptions-Kapazität aufweisen als dieKunstharz-Austauscher und auch als die Austauscher auf der Basis der bekannten Cellulosederivate. Darüber hinaus können diese Beschickungs-Gemische bzw. einzelne Komponenten derselben von der Derivaten der Aggregate unter milden Bedingungen desorbiert werden. das bedeutet, dass als Desorptions- oder Eluierungsmittel schwach reagierende chemische Stoffe, welche die Beschickungs-Komponenten oder das Derivat nicht angreifen, verwendet werden können.
Auf Grund dieser technischen Vorteile und von weiter unten noch beschriebenen Vorteilen zeichnen sich die Derivate der Kristallit-Aggregate bei vielen Beschickungs-Gemischen durch eine überlegene Trennwirkung aus.
Die Ionenaustauscher-Derivate der Aggregate können sowohl Kationenaustauscher als auch Anionenaustauscher sein.
Zu den geeigneten Kationenaustauschern gehören die Carbonsäure-Derivate der Cellulose-KristallitAggregate, einschliesslich der 6-Carboxyl-und der 2, 3-Dicarboxyl-Derivate ; die gemischten Carboxylund Aldehyd-Gruppen enthaltenden Derivate der Aggregate ; und dieCarboxyäther-Derivate der Aggregate, wie z. B. die Carboxymethyl-, Carboxyäthyl-und andere Carboxyalkyl-Derivate. Weitere brauchbare Materialien sind die Esterderivate anorganischer Säuren, z. B. die Phosphate und Sulfate der Aggregate ; ferner Äther-Derivate der Phosphonoalkyl-, Sulfoalkyl- und Sulfinoalkyl-Reihe, z.
B. die Phosphonomethyl-, Sulfomethyl-, Sulfoäthyl-und Sulfinomethyl-Derivate. Die Sulfoalkyl-Derivate enthalten Sulfonsäuregruppen ; weitere geeignete Derivate sind die Phosphorigsäureester, die Borsäureester und dieSchwe-
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stellen können.
Zu den Anionenaustauschern gehören die Alkylaminoalkyläther der Aggregate, bei denen die Alkyl-
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bei der Umsetzung von Epichlorhydrin und Triäthanolamin mit den Aggregaten in Gegenwart von Ätznatron gebildet wird. Hiezu gehören weiter die Mono- und Diharnstoff-Derivate der Aggregate. Andere basische Gruppen enthaltende Derivate werden durch die Alkylaminoalkyl- und Alkylamino-dialkylester der Aggregate dargestellt.
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Wie aus der beispielhaft angeführten Zusammenstellung erkennbar ist, enthalten einige der Deri- vate die ionisierbare Gruppe direkt an die Anhydroglukose-Einheiten der Kristallit-Aggregate gebunden, während andere wieder derartige Gruppen an das Ende einer Kette gebunden enthalten, die selbst mit ihrem andern Ende an die Anhydroglukose-Einheiten gebunden ist.
Bei den Aggregaten der Cellulose-Kristallite, aus denen die verschiedenartigen Derivate hergestellt werden, handelt es sich um kleine, vorzugsweise zermahlene Aggregate einer Cellulose mit "einem auf einen annähernd einheitlichen Wert eingestellten Polymerisationsgrad" (level-off Degree of Polymerization cellulose). Diese kleinen, zermahlenen Aggregate, ihre Eigenschaften und ein Verfahren zur Zerkleine- rung der "Cellulose mit einam auf einen annähernd einheitlichen Wert eingestellten Polymerisationsgrad" sind in der USA-Patentschrift Nr. 2, 978, 446 beschrieben. Sie stellen säureunlösliche Produkte dar, die durch die gesteuerte saure Hydrolyse von Cellulose gewonnen werden, und der Wert des annähernd ein- heitlich eingestellten Polymerisationsgrades" (level-off D.
P. value) spiegelt die Zerstörung der ur- sprunglichen Faserstruktur des cellulosehaltigen Ausgangsmaterials wieder. Der Ausdruck auf einen an- nähernd einheitlichen Wert eingestellter Polymerisationsgrad"soll sich auf den durchschnittlichen Wert eines solchen annähernd einheitlich eingestellten Polymerisationsgrades des Celluloseproduktes beziehen, und er wird nach der Methode bestimmt, die in der Arbeit von O. A. Battista"Hydrolysis and Crystalliza- tion of Cellulose"in"Industrial and Engineering Chemistry", Band 42 [1950}, S. 502-507 beschrieben ist.
Die Ausgangs-Aggregate sollen vorzugsweise eine Teilchengrösse von 5 Mikron oder weniger aufwei- sen, gleichgültig, ob sie durch Zermahlen zerkleinert worden sind oder nicht. Da die Gewinnung von
Produkten mit einer Teilchengrösse von 5 Mikron oder weniger durch das Zermahlen begünstigt wird, ist es empfehlenswert, eine solche Arbeitsstufe einzuschalten und erforderlichenfalls von der Fraktionierung
Gebrauch zu machen, um Produkte mit der gewünschten Teilchengrösse zu erhalten. Zu Produkten mit einer Teilchengrösse von 5 Mikron oder weniger kann man durch Ausfraktionieren der nicht zermahlenen
Aggregate gelangen, wenngleich hiemit auch eine Herabsetzung der Ausbeute verbunden sein kann.
Die technisch brauchbaren Derivate sind durch ihre allgemeine Unlöslichkeit ausgezeichnet, u. zw. einschliesslich der Unlöslichkeit in Wasser, in zahlreichen trennbaren Beschickungsgemischen und in zahlreichen
Eluierungsmitteln und Regenerierungsmitteln. Die Derivate sind weiter dadurch charakterisiert, dass sie in Form diskreter, nicht faserartiger Teilchen mit einer Grösse von vorzugsweise 30 bis 70 Mikron vorliegen, obwohl ihre Grösse auch unter 30 Mikron bzw. unter 10 oder 5 Mikron, ja gewünschtenfalls auch zwischen 0, 1 oder 0, 2 und 1 Mikron oder mehr liegen kann. Diese Derivate sind im wesentlichen topochemische Derivate, u. zw. insofern, als die Celluloseketten, die in der Oberfläche der Aggregate liegen, zu einem erheblich grösseren Anteil in Derivate übergeführt sind als sämtliche andern Ketten der Aggregate.
In Form des Substitutionsgrades (D. S.) ausgedrückt, kann man sagen, dass die Derivate einen Substitutionsgrad von unter 1, 0 vorzugsweise zwischen 0, 01 und etwa 0, 85 aufweisen.
Carbonsäurederivate, Derivate, die sowohl Carbonsäuregruppen als auch Aldehydgruppen enthalten, Esterderivate, Ätherderivate und kombinierte Derivate der Aggregate der Cellulose-Kristallite sowie Arbeitsweisen zu ihrer Herstellung sind in der belgischen Patentschrift Nr. 616198 beschrieben worden. Wie in dieser Patentschrift gleichfalls ausgeführt worden ist, enthalten die Celluloseketten der KristallitAggregate an einem Ende eine potentielle Aldehydgruppe, die zu einer Hydroxylgruppe reduziert oder zu einer Carbonsäuregruppe oxydiert werden kann, bevor man das gewünschte Derivat der Aggregate bildet.
Die Erfindung ist von besonderer technischer Bedeutung bei der Trennung und Reinigung von Beschickungs-Gemischen, die Komponenten aufweisen, welche Aminogruppen enthalten, besonders von Gemischen von Aminosäuren aus beliebigen Ausgangsmaterialien, und ganz besonders von Gemischen, wie sie durch saure, alkalische oder enzymatische Hydrolyse von verschiedenen Protein-Materialien, die sowohl tierischer als auch pflanzlicher Herkunft sein können, erhalten werden, und auch bei der Trennung und Reinigung von Gemischen aus biologischen Extrakten.
Zu den Proteinen, die hydrolysiert werden können, gehören Casein, Hefe, Ei-Albumin und auch Albumine aus Milch, Fischen, Elastin, Keratin ; pflanzliche Proteine, wie Soja, Edestin, Zein, Gliadin ; ferner Proteinen aus Leim, Gelatine, Seidenfibroin, Seidengummi, Hämoglobin, Serum-Albumin, Serum - Globulin, Blut-Fibrin ; Rinderplasma-Albumin und Gemische hieraus mit Hämoglobin, Menschenserum und Pferdeserum.
Um das komplexe Gemisch der Aminosäuren, die in einem Protein-Hydrolysat vorhanden sind, zu trennen, ist es empfehlenswert, es zunächst in eine Serie von Aminosäuregruppen zu trennen, u. zw. beispielsweise mit Hilfe eines Kationenaustauschers. In diesem Zusammenhang ist der Hinweis von Interesse, dass man die Aminosäuren in vier Gruppen unterteilen kann :
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möglicherweise den Assoziierungsgrad der verschiedenen Komponenten der Beschickungsgemische mit dem Material der Austauschersäule variieren und auf diese Weise die Geschwindigkeit, mit der sie in der
Säule von oben nach unten wandern, beeinflussen.
Es können bevorzugt anzuwendende pH-Werte für eine wirksame Trennung von Gemischen, wie Protein-und Aminosäuregemische, existieren, und diese Werte können für jedes bestimmte Gemisch ermittelt werden.
Will man die Trennung absatzweise durchführen, so kann man das Material der Austauschersäule aus der Säule in Form eines feuchten Zylinders herausnehmen und in einzelne Abschnitte zerschneiden, wo- bei jeder Zylinderabschnitt einem Band aus dem Material plus den absorbierten Komponenten entspricht, und die letztgenannten können dann mit Hilfe eines geeigneten Lösungsmittels hieraus entfernt werden.
Die Anwendung der Derivate der Aggregate bei dieser letztgenannten Trennungsmethode bringt gegen- über den bekannten Cellulosederivaten den Vorteil mit sich, dass sich die Aggregatderivate beim Zer- schneiden in einzelne Bänder scharf und sauber zerschneiden lassen, wohingegen die bekannten Derivate, welche bekanntlich faserartig sind, sich nicht scharf und sauber zerschneiden lassen, vielmehr zum Aus- einanderreissen neigen. Es ist weiter darauf hinzuweisen, dass die bekannten Derivate auf Grund ihrer
Faserstruktur die Neigung zeigen, in der Längsrichtung der Austauschersäule Bänder zu liefern, die un- genaue Begrenzungen aufweisen.
Das Material der Austauschersäule kann dadurch regeneriert werden, dass man ein eine Regenerie- rung bewirkendes Lösungsmittel oder eine entsprechend wirkende Lösung durch die Kolonne schickt, die jede Substanz, die etwa noch in der Säule anwesend ist, verdrängt. Das zu verwendende Lösungsmittel wird natürlich je nach der Substanz, welche in der Säule adsorbiert worden war, und je nach dem Aus- tauschermaterial variiert werden müssen. Hiezu sei beispielsweise auf die Regenerierung der Säule im nachfolgenden Beispiel 3 verwiesen, bei welchem nach der Reinigung der Laurinsäure Äthanol als Eluie- rungsmittel verwendet wird. Zur Regenerierung der Austauschersäule kann diese mit 0,5n-äthanolischer
Salzsäure gewaschen werden.
Nach der Regeneration kann die regenerierende Lösung durch das Lösungs- mittel verdrängt werden, welches beim nächsten Ansatz zur Eluierung verwendet wird. In der Regel gehören zu den in Frage kommenden Regenerierungsmitteln äthanolische Salzsäure, Äthanol selbst, wässe- rige Natriumchlorid-Lösungen, basische Alkohollösungen, wie z. B. O. 1n-äthanolische Natronlauge, wässerige Säurelösungen, wie 0, 5n-Salzsäure, Chloroform u. dgl. m Weitere geeignete Regenerierungsmittel können aus der weiter oben angeführten Zusammenstellung der Eluierungsmittel entnommen werden.
Die Erfindung soll durch die folgenden Beispiele näher erläutert werden.
Beispiel l : DurchDispergieren einesCarboxymethyl-Derivats der Cellulose-Kristallit-Aggregate, das einen Substitutionsgrad von etwa 0, 5 aufweist, in einem Lösungsmittel, das aus einem Volumen Butanol, zwei Volumina Isopropanol und einem Volumen Wasser bestand, wurde eine breiartige Masse hergestellt. Diese breiartige Masse (die eine geeignete Form darstellte, um das Derivat in die Austauschersäule zu füllen, wenngleich dieses Material natürlich auch in trockener Form eingefüllt werden könnte), wurde vorsichtig längs der Wand einer Glaskolonne von 62 cm Länge und 1, 5 cm Innendurchmesser heruntergegossen. Ein vorher eingefüllter Glasstöpsel trug das Deriva : in der Säule. Nach Massgabe des aus der Säule abfliessenden Lösungsmittels wurden weitere Mengen der breiartigen Masse von obel1 eingefüllt.
Setzte sich das Derivat nicht weiter ab, so liess man das Lösungsmittel ablaufen, achtete aber sorgfältig darauf, dass das Derivat nicht austrocknete.
Nun wurde ein Gemisch von Aminosäuren technischer Reinheit hergestellt, das aus 20 mg d-Aspara- ginsäure. 20 mg d, l-Alanin und 20 mg 1-Histidin bestand. Dieses Gemisch wurde in einem Lösungsmittel gelöst, das aus einem Volumen Butanol, zwei Volumina Isopropanol und einem Volumen 0, 1n-Salzsäure bestand. Das Gesamtvolumen der Lösung betrug 10 ml. Es wurde auf den Kopf der Säule aufgegeben und durch die Säule hindurchlaufen gelassen, wobei man sorgfältig darauf achtete, dass das Flüssigkeitsniveau oberhalb der Oberkante der aus den Derivaten bestehenden Füllung lag. Nach Einfüllung der Charge und ohne die Oberkante der Derivat-Füllung freizulegen, wurde das eluierende Lösungsmittel auf die Säule aufgegeben, u. zw. mit einer Durchsatzgeschwindigkeit von 3 ml in 25 min.
Das Lösungsmittel hatte die gleiche Zusammensetzung wie dasjenige, das zur Herstellung der breiartigen Masse verwendet worden war, und es diente nun dazu, die Wanderung der Aminosäuren durch die Säule mit verschiedenen Wanderungsgeschwindigkeiten zu bewirken und auf diese Weise das Chromatogramm zu entwickeln. Die aus der Säule austretende Flüssigkeit wurde in Fraktionen von je 3 ml unter Anwendung eines Standard-Fraktionssammlers aufgefangen.
Die Fraktionen wurden in folgender Weise analysiert. Es wurde zunächst ein Ninhydrin-Reagenz in Form einer 0, 1%igen Lösung in einem Citrat-Puffer hergestellt. Der Citrat-Puffer wurde in der Weise
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dass das Gemisch einen pH-Wert von 5,0 aufwies. Jede aufgefangene 3 ml-Fraktion wurde mit 1 ml des Ninhydrin-Reagenzes vermischt, und das Gemisch wurde 20 min lang in siedendes Wasser gestellt. Das Auftreten einer blauen Färbung zeigte die Anwesenheit der Aminosäure an, während das Fehlen der blauen Färbung die Abwesenheit einer derartigen Säure erkennen liess.
Die so ermittelten qualitativen Werte sind in der folgenden Tabelle zusammengestellt :
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<tb>
<tb> Fraktion <SEP> Nr. <SEP> Versuchsergebnisse
<tb> 1-30 <SEP> negativ
<tb> 31-81 <SEP> blau
<tb> 82-89 <SEP> negativ
<tb> 90 <SEP> - <SEP> 119 <SEP> blau
<tb> 120 <SEP> - <SEP> 150 <SEP> negativ
<tb> 151 <SEP> - <SEP> 179 <SEP> blau
<tb> 180 <SEP> - <SEP> 200 <SEP> negativ
<tb>
Bezüglich der Fraktionsgruppen Nr. 31 - 81 sei darauf hingewiesen, dass die blaue Färbung in den Anfangsfraktionen dieser Gruppe weniger intensiv war, nach und nach aber intensiver wurde und dann wieder weniger intensiv blieb, wobei die mittleren Fraktionen die intensivste Färbung aufwiesen. Das gleiche Phänomen wurde auch bei den Fraktionsgruppen Nr. 90 - 119 und 151-179 festgestellt.
Es wurde angenommen, dass die Intensität der Färbung einer Fraktion proportional der Konzentration der darin enthaltenen Aminosäure war. Der Versuch zeigte an. dass die Fraktionen der Nr. 31 - 81 die d-Asparagin-
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enthielten.
Die oben beschriebene Versuchsreihe wurde unter Verwendung bekannter Carboxymethyicellulose als Adsorptionsmittel in der Säule wiederholt mit der Abweichung, dass nur 10 mg anstatt 20 mg von jeder Aminosäure verwendet wurden. Der Gehalt an Aminos ure wurde absichtlich niedriger eingestellt, da angenommen wurde, dass hiedurch die Empfindlichkeit des Gemisches für das Trennvermögen des Adsorptionsmittel erhöht würde. Ausserdem wurde bei dem bekannten Derivat eine höhere Durchflussgeschwindigkeit, nämlich 3 ml in 5 min, eingehalten. Es trat jedoch keine Trennung der Aminosäure ein, sondern es wurden die folgenden qualitativen Versuchsergebnisse erhalten :
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<tb>
<tb> Fraktions <SEP> Nr. <SEP> Versuchsergebnis
<tb> 1-20 <SEP> negativ <SEP>
<tb> 21-39 <SEP> blau
<tb> 40 <SEP> - <SEP> 200 <SEP> negativ <SEP>
<tb>
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Wie bereits erwähnt, wurde die Austauschersäule des vorangehenden Beispieles für die Trennung benutzt. Die Säule wurde zunächst mit einem Gemisch gespült, das aus einem Volumen Butanol, zwei Volumina Isopropanol und einem Volumen 0, In-Salzsäure bestand. Nach einer derartigen Spülung wurde die Spülflüssigkeit aus der Kolonne dadurch verdrängt, dass man auf sie ein Gemisch aufgab, das aus einem Volumen Butanol, zwei Volumina Isopropanol und einem Volumen Wasser bestand, eine Stufe, die man als"Gleichgewichtseinstellung"der Säule bezeichnen kann.
Es wurde dann das aus dem CaseinHydrolysat bestehende Beschickungs-Material am Kopf der Kolonne aufgegeben und, wenn das Flüssigkeitsniveau der Beschickung mit der Oberkante des Adsorptionsmittels in der Säule übereinstimmt, wurde das Eluiel1Ungsmittel aufgegeben, als welches das gleiche Lösungsmittel verwendet wurde, das im vorangehenden Beispiel zur Anwendung kam. Die Durchflussgeschwindigkeit des Lösungsmittels war ebenfalls die gleiche wie im vorangehenden Beispiel, und das Eluat wurde in Form von 3 ml-Fraktionen gesammelt und auf den Gehalt an Aminosäuren unter Benutzung der Methode analysiert, die in dem Buch von Snell und Snell"Colorimetric Methods of Analysis", 3. Auflage, Verlag Van Nostrand Co., Inc. [1954], S. 107 - 108 beschrieben ist.
Diese Methode'ist eine quantitative Methode, bei welcher die Intensität der Farbe mit einem Spektrophotometer gemessen wird, und die so bestimmten Intensitäten zur Berechnung der optischen Dichte verwendet werden, wie es im einzelnen in der vorstehend angeführten Bezugsliteratur beschrieben ist. Die optische Dichte ist ein Mass für die Lichtabsorption durch die Aminosäuren ; genauer gesagt, sie ist der negative Logarithmus der Prozentwert des durchgelassenen Lichtes.
Durch Auftragen der optischen Dichte gegen die Fraktionsnummern wurde eine Kurve erhalten, die einen sehr hohen, scharfen Scheitelpunkt bei Fraktion Nr. 40 (optische Dichte 0, 61) aufwies, wobei der Schei-
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zeigte nur eine geringe, aber allmählich zunehmende optische Dichte, die in der Grössenordnung von 0, 03 bis 0. 21 lag., Die Werte für die optischen Dichten waren bei den Fraktionen der Nummern 35 - 57 die folgenden :
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<tb>
<tb> Fraktion <SEP> Nr. <SEP> optische <SEP> Dichte <SEP> Fraktion <SEP> Nr. <SEP> optische <SEP> Dichte
<tb> 35 <SEP> 0,03 <SEP> 47 <SEP> 0, <SEP> 28 <SEP>
<tb> 36 <SEP> 0, <SEP> 15 <SEP> 48 <SEP> 0, <SEP> 24 <SEP>
<tb> 37 <SEP> 0, <SEP> 31 <SEP> 49 <SEP> 0, <SEP> 22 <SEP>
<tb> 38 <SEP> 0, <SEP> 46 <SEP> 50 <SEP> 0, <SEP> 17
<tb> 39 <SEP> 0, <SEP> 57 <SEP> 51 <SEP> 0,15
<tb> 40 <SEP> 0, <SEP> 61 <SEP> 52 <SEP> 0, <SEP> 10 <SEP>
<tb> 41 <SEP> 0, <SEP> 52 <SEP> 53 <SEP> 0, <SEP> 09 <SEP>
<tb> 42 <SEP> 0, <SEP> 46 <SEP> 54 <SEP> 0,05
<tb> 43 <SEP> 0, <SEP> 41 <SEP> 55 <SEP> 0, <SEP> 04 <SEP>
<tb> 44 <SEP> 0, <SEP> 38 <SEP> 56 <SEP> 0,02
<tb> 45 <SEP> 0, <SEP> 31 <SEP> 57 <SEP> 0,01
<tb> 46 <SEP> 0,
<SEP> 30 <SEP>
<tb>
Das Material in den Fraktionen der Nummern 35 - 57 bestand hauptsächlich aus Glutaminsäure neben etwas Asparaginsäure. Genauer gesagt, die Fraktionen der Nummern 35 - 46 enthielten im wesentlichen Glutaminsäure und die Fraktionen der Nummern 46 - 57 enthielten in der Hauptsache Asparaginsäure.
Die Fraktion Nr. 40 enthielt etwa 4 Gew. -0/0 des Aminosäuregehaltes des ursprünglichen Caseins.
Beispiel 3 : 2 ml unreine Laurinsäure (Eastmans technische Qualität) in Äthanol (0, 1 g Laurin- säure auf 25 ml Äthanol) wurden in eine Säule gegeben (0, 8 X 30 cm), deren Gleichgewichtseinstellung mittels Äthanol vorgenommen wurde. Das Füllmaterial der Trennsäule bestand aus dem Reaktionsprodukt der Cellulose-Kristallit-Aggregate mit Triäthanolamin und Epichlorhydrin in Gegenwart von Ätznatron ; man kann annehmen, dass das Material basische Gruppen enthielt, die das Triäthanolamin lieferte. Das
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Muster wurde dann mit Äthanol unter einem Druck von 2, 27 kg Stickstoff eluiert. Die Durchsatzgeschwindigkeit betrug 2 ml pro 5 min. Die Konzentrationen der Fraktionen wurden mit Hilfe einer BricePhoenix-Differential-Refraktometers, Modell BP-1, 000-V messend verfolgt.
Dieses Instrument gestattete, den Unterschied der Brechungsindices einer Probe des Eluierungsmittels und einer Probe der Fraktion abzulesen. Bestanden z. B. beide Proben aus Äthanol, so zeigte das Instrument den Wert Null an. Enthielt das Muster der Fraktion eine geringe Menge einer eluierten Verunreinigung, so konnte an dem Instrument die Brechungsindex-Differenz abgelesen werden, die anzeigte, dass irgendeine Komponente, z. B. die Verunreinigung, in der Fraktion vorhanden war. Je höher dieser Brechungsindex-Unterschied war, desto grösser war der Gehalt an der Komponente in der Fraktion. Genauer gesagt, der Brechungsindex-Unterschied ist proportional der Komponenten-Konzentration in der Fraktion.
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<tb>
<tb>
Fraktion <SEP> Nr. <SEP> Differenz <SEP> der <SEP> Fraktion <SEP> Nr. <SEP> Differenz <SEP> der
<tb> Brechungsindices <SEP> Brechungsindices
<tb> 1. <SEP> 0 <SEP> 11 <SEP> 0, <SEP> 094 <SEP>
<tb> 2 <SEP> 0, <SEP> 123 <SEP> 12'0, <SEP> 037 <SEP>
<tb> 3 <SEP> 0, <SEP> 046 <SEP> 13 <SEP> 0, <SEP> 025 <SEP>
<tb> 4 <SEP> 0 <SEP> 14 <SEP> 0, <SEP> 018 <SEP>
<tb> 5 <SEP> 0 <SEP> 15 <SEP> 0. <SEP> 030 <SEP>
<tb> 6 <SEP> 0, <SEP> 049 <SEP> 16 <SEP> 0, <SEP> 021 <SEP>
<tb> 7 <SEP> 0,045 <SEP> 17 <SEP> 0
<tb> 8 <SEP> 0, <SEP> 010 <SEP> 18 <SEP> 0, <SEP> 006 <SEP>
<tb> 9 <SEP> 0,133 <SEP> 19-30 <SEP> 0
<tb> 10 <SEP> 0, <SEP> 214
<tb>
Würde man die vorstehend angeführten Werte in ein Koordinaten-System eintragen, so würde man eine Kurve erhalten, welche die Variation der Fraktions-Nr. in Abhängigkeit von der Differenz der Bre- chungsindices wiedergibt ;
die ersten beiden Scheitelpunkte dieser Kurven stellen Verunreinigungen dar, die aus organischen Verbindungen bestehen, welche weniger als 12 Kohlenstoffatome je Molekül enthalten. Der dritte Scheitelpunkt, welcher der Fraktion Nr. 10 entspricht, ist der höchste, und er stellt reine Laurinsäure dar. Zwei später folgende kleinere Scheitelpunkte stellen Verunreinigungen dar, die aus organischen Verbindungen bestehen, welche mehr als 10 Kohlenstoffatome enthalten.
B eispi el 4 : 2 ml unreine Myristinsäure (Bastman) in Äthanol (0, 1 g Myristinsäure je 25 ml Äthanol) wurde auf eine Trennsäule aufgegeben (0, 8 x 30 cm), deren Gleichgewichtseinstellung mit Äthanol vorgenommen worden war. Das Füllmaterial der Trennsäule war das gleiche, das in Beispiel 3 verwendet worden war. Die Probe wurde mit Äthanol unter einem Druck von 2,27 kg (5 lbs.) Stickstoff eluiert. Die Durchsatzgeschwindigkeit betrug 2 ml in 5 min. Die Konzentrationen der Fraktionen wurden mit Hilfe des Brice-Phoenix-Differential-Refraktometers messend verfolgt.
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<tb>
<tb>
Fraktion <SEP> Nr. <SEP> Differenz <SEP> der <SEP> Fraktion <SEP> Nr. <SEP> Differenz <SEP> der
<tb> Brechungsindices <SEP> Brechungsindices
<tb> 1 <SEP> 0 <SEP> 19 <SEP> 0, <SEP> 075 <SEP>
<tb> 2 <SEP> 0 <SEP> 20 <SEP> 0. <SEP> 075 <SEP>
<tb> 3 <SEP> 0 <SEP> 21 <SEP> 0, <SEP> 075 <SEP>
<tb> 4 <SEP> 0 <SEP> 22 <SEP> 0, <SEP> 075 <SEP>
<tb> 5 <SEP> 0, <SEP> 028 <SEP> 23 <SEP> 0, <SEP> 089 <SEP>
<tb> 6 <SEP> 0 <SEP> 24 <SEP> 0, <SEP> 084 <SEP>
<tb>
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Fortsetzung
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<tb>
<tb> Fraktion <SEP> Nr. <SEP> Differenz <SEP> der <SEP> Fraktion <SEP> Nr.
<SEP> Differenz <SEP> der
<tb> Brechungsindices <SEP> Brechungsindices
<tb> 7 <SEP> 0 <SEP> 25 <SEP> 0, <SEP> 072 <SEP>
<tb> 8 <SEP> 0, <SEP> 046 <SEP> 26 <SEP> 0,079
<tb> 9 <SEP> 0,022 <SEP> 27 <SEP> 0, <SEP> 039 <SEP>
<tb> 10 <SEP> 0 <SEP> 28 <SEP> 0, <SEP> 070
<tb> 11 <SEP> 0, <SEP> 208 <SEP> 29 <SEP> 0, <SEP> 048 <SEP>
<tb> 12 <SEP> 0, <SEP> 304 <SEP> 30 <SEP> 0,075
<tb> 13 <SEP> 0,219 <SEP> 31 <SEP> 0, <SEP> 020 <SEP>
<tb> 14 <SEP> 0,060 <SEP> 32 <SEP> 0
<tb> 15 <SEP> 0, <SEP> 036 <SEP> 33 <SEP> 0
<tb> 16 <SEP> 0, <SEP> 067 <SEP> 34 <SEP> 0
<tb> 17 <SEP> 0, <SEP> 043 <SEP> 35 <SEP> 0
<tb> 18 <SEP> 0, <SEP> 099 <SEP>
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Trägt man die vorstehend angeführten Zahlenwerte in ein Koordinaten-System ein. so weist die hie- bei erhaltene Kurve ihren höchsten Scheitelwert bei Fraktion Nr. 12 auf, und dieser Scheitelwert entspricht der reinen Myristinsäure.
Kleinere Scheitelpunkte, die vor dem höchsten Maximum oder nach ihm auftreten, entsprechen organischen Verunreinigungen, die weniger als 14 Kohlenstoffatome bzw. mehr als 14 Kohlenstoffatome je Molekül enthalten.
Im ganzen gesehen haben sich die Derivate der Kristallit-Aggregate ganz allgemein als technisch hervorragend brauchbar zur Trennung, Isolierung und bzw. oder Reinigung von Gemischen und Stoffzusammensetzungen verschiedenartiger Natur erwiesen. So können sie z. B. verwendet werden, um Materialien, wie Racemate, Fette und fettähnlich Substanzen (lipids), Antihistamin-Präparate, geradkettige und verzweigtkettige Verbindungen, Seltene Erden, zu trennen. Mit ihrer Hilfe kann man auch organische Säuren, wie Citronensäure, Ascorbinsäure, Weinsäure u. dgl. Säuren aus den Ablaugen und Rückständen der Aufbereitung von Citrus-Früchten gewinnen und reinigen, ebenso auch höhermolekulare ungesättigte und gesättigte Fettsäuren, wie Linolsäure und Linolensäure, Ölsäure, Ricinolsäure, Stearinsäure, Palmitinsäure u. dgl. m.
Es können mit ihrer Hilfe auch Aminosäuren und Vitamine aus den Ablaugen der Nahrungsmittel-Aufbereitung, ferner Enzyme aus natürlichen Rohstoffen, Metalle aus Behandlungsbädern, wie z. B. Beizbädern und Eloxierungsbädern, Kupfer aus den Spinnlösungen von Kupferammoniakseide, Edelmetalle, wie Silber, aus photographischen Bädern gewonnen werden. Die Erfindung ist ferner von technischer Bedeutung für die Reinigung von Antibiotica, von chemischen Zwischenprodukten, von Tanninen, Nitriten, Hexosephosphaten, komplexen Alkoholen, Hormonen, Toxinen, von Mitteln zur Regulierung des Pflanzenwuchses, von höhermolekularen Fettalkoholen, Farbstoffen u. dgl. m. Ebenso können Alkaloide, die aus natürlichen stickstoffhaltigen organischen Basen, im allgemeinen aus tertiären Aminen, bestehen, gereinigt werden.
Pflanzenfarbstoffe können aus natürlichen Gemischen, die solche enthalten, isoliert werden ; auf diese Weise können z. B. Carotine aus andern Pflanzenfarbstoffen abgetrennt werden. Weiter können aus Schwermetallen bestehende Verunreinigungen, wie Kupfer und Eisen aus Weinen entfernt werden, und es kann der Wein darüber hinaus auch in bezug auf seine Reinheit, auf seine organoleptischen und andern Eigenschaften verbessert werden. In gleicher Weise kann auch Whisky verbessert werden. Ferner kann Wasser weichgemacht oder vollständig entionisiert werden.
Es ist natürlich selbstverständlich, dass bei diesen Arbeitsgängen ein Derivat vom Charakter eines Kationenaustauschers verwendet wird, wenn es sich darum handelt, kationische Substanzen zu adsorbieren, und dass anderseits ein Derivat vom Charakter eines Anionenaustauschers verwendet wird, wenn es sich darum handelt, anionische Substanzen zu adsorbieren. Es ist ferner zu beachten, dass in einigen der weiter oben angeführten Anwendungszwecke, wie z. B. beim Weichmachen oder Entionisieren von Was-
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ser, oder bei der entmineralisierenden Behandlung von Lösungen mit dem Ziel, diese Lösungen von Ver- unreinigungen mineralischer Natur zu befreien bzw.
Edelmetalle wiederzugewinnen, die allgemeine Ar- beitsweise darin besteht, das Beschickungsgemisch, also das Gemisch, aus welchem die Verunreinigungen entfernt werden sollen, auf die mit dem Adsorptionsmittel gefüllte Säule aufzugeben. Die aus derTrenn- säule austretende Flüssigkeit stellt dann die entmineralisierteBeschickung dar, während die mineralischen oder metallischen Verunreinigungen in der Säule zurückgehalten und in bekannter Weise hieraus gewon- nen werden können.
Von technischer Bedeutung ist auch der folgende Versuch, der mit einem Farbstoffgemisch durchgeführt wurde. Es wurden je etwa 50 mg der folgenden drei wasserlöslichen Farbstoffe in 250 ml Wasser mit- einander vermischt : Parakeet Gelb Nr. 5, Parakeet Rot Nr. 2 und ParakeetGrünNr. l. Es wurden dann zwei Trennsäulen aufgestellt, von denen die eine die bekannte Carboxymethyl-Cellulose in Faserform und die andere das Carboxymethyl-Derivat der in partikelartiger, nicht faseriger Form vorliegenden Cellu- lose-Kristallit-Aggregate enthielten. Auf jede Trennsäule wurde die gleiche Menge des Gemisches der Farbstoffe zur gleichen Zeit oben aufgegeben, und man liess die Lösung einfach durch ihre eigene Schwere nach unten durchlaufen. Die Trennsäulen wurden nach etwa 2 h untersucht.
In der Säule, welche das bekannte Cellulosederivat enthielt, war der unterste Teil der Säule, der etwa 1/5 der Länge der Säule ausmachte, nicht benetzt ; unmittelbar darüber hatte sich ein gelbes Band ausgebildet, das etwa 2/5 der Säule ausmachte und über diesem Band lag ein grünes Band, welches gleichfalls etwa 2/5 der Säule ausmachte.
In der Säule, welche das erfindungsgemässe Aggregat-Derivat enthielt, war der unterste Teil der Säule, der etwa 1/5 der Säule ausmachte, nicht benetzt ; darüber hatte sich ein breites blaues Band ausgebildet, das etwa 1/5 der Säule ausmachte ; über dem letztgenannten Band lagen drei schmale Bänder, u. zw. ein hellgrünes, ein rotstichig braunes und ein hellgrünes Band. Über dem an letzter Stelle genannten Band hatte sich ein breites hellblaues Band ausgebildet, welches etwa 1/5 der Säule ausmachte. Am Kopf der Trennsäule bestand ein grünes Band von ziemlich geringer Breite.
Hieraus ist klar erkennbar, dass das erfindungsgemässe Aggregat-Derivat in der Lage war, das Farbstoffgemisch in eine grössere Zahl von Komponenten zu trennen ; ausserdem bewirkte dieses Derivat keine Kanalbildung und die Bänder wiesen scharfe Ränder auf, während das bekannte Cellulose-Derivat Kanalbildung zuliess und nur unscharf begrenzte Bänder lieferte.
Wie weiter oben bereits erwähnt wurde, bietet zwar die Verwendung von solchen Derivaten der Cellulose-Kristallit-Aggregate technische Vorteile, die ein Ionenaustausch-Vermögen besitzen ; daneben existieren selbstverständlich andere Derivate der Kristallit-Aggregate, die wegen des Fehlens der ionisierenden Gruppen zwar keine Ionenaustausch-Wirkung zeigen, aber trotzdem als Adsorptionsmaterial für die Trennung, Reinigung und Isolierung oder für eine sonstige Behandlung der weiter oben beschriebenen Stoffgemische von technischer Bedeutung sind. Diese letztgenannten Derivate sind wirksam durch das eigentliche Adsorptionsvermögen, die Wasserstoff-Bindung und bzw. oder durch die Van der Waals'sehen Kräfte, und sie werden hergestellt gemäss der belgischen Patentschrift Nr. 616198.
Jedes der unter den Umfang der Erfindung fallenden Derivate der Kristallit-Aggregate kann in Gegenwart von Wasser zermahlen werden, um ein Gel zu bilden, und es ist in dieser Form brauchbar zur Anwendung bei der Gel-Elektrophorese zum Zweck der Trennung von Stoffgemischen, der Reinigung von Verunreinigungen enthaltenden Verbindungen, zur Isolierung der gewünschten Verbindungen u. dgl. m.
Ein weiterer Vorteil der Aggregat-Derivate vom Ionenaustauscher-Typ ist der Umstand, dass die austauschbaren Ionen leichter zugänglich sind als die von Ionenaustauschern vom Typ der Kunstharze und vom Typ der aus den bekannten Cellulose-Derivaten bestehenden Materialien. Bei den Materialien vom Typ der Kunstharze besteht der Austauscher für gewöhnlich nicht aus einer langen Polymerisat-Kette, sondern er stellt weit häufiger ein dreidimensionales, vernetztes Polymerisat dar, bei welchem viele austauschbare Ionen in dessen amorphen Innern örtlich so angeordnet sind, dass sie für die auszutauschenden Ionen und für das eluierende Medium nur schwer zugänglich sind. Und bei den bekannten Cellulose-Derivaten ist das Vorhandensein der ionisierbaren Gruppen im Innern der amorphen Regionen bzw. der Matrizen die Ursache dafür, dass sie weniger leicht zugänglich sind.
Im Ergebnis erfolgt also bei den Aggregat-Derivaten auf Grund des Umstandes, dass die ionisierbaren Gruppen mehr in ihrer Oberfläche angeordnet und daher leichter zugänglich sind, der Austausch mit einer grösseren Geschwindigkeit.
Weitere Vorteile ergeben sich aus der Neigung der bekannten Materialien, während des Gebrauches zu quellen, und es ist wesentlich, darauf hinzuweisen, dass die Aggregat-Derivate in Wasser weit weniger quellen als die Derivate der bekannten Cellulose-Arten. Von vielleicht noch grösserer Bedeutung ist der Umstand, dass das Quellen der letztgenannten Derivate nur schwer, ja fast überhaupt nicht zu steuern ist, eine Tatsache, die-wie man annehmen kann-mit dem Vorhandensein der amorphen Regionen in
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den Molekül-Ketten der Derivate in Beziehung steht. Der Nachteil dieses Quellens besteht darin, dass sich dann, wenn es in starkem Ausmass eintritt, ein unerwünschter Widerstand gegen den Durchfluss der Beschickung bzw. des Eluierungsmittels ausbildet.
Ist aber das Quellen nur schwierig zu steuern, so ist klar, dass der Strömungswiderstand zu einem ersten Störungsfaktor werden kann.
Im Gegensatz zu den Austauscher-Materialien vom Typ der Kunstharze sind die Aggregat-Derivate gegenüber vielen Lösungsmitteln inert, und es kann aus diesem Grunde eine Vielzahl von Eluierungsmitteln und auch von Regenerierungsmitteln verwendet werden. Da die Derivate der Aggregate dem Angriff weniger ausgesetzt sind, werden sie auch leichter regeneriert als die Materialien vom Typ der Kunstharze. Darüber hinaus können sie auf Grund der Abwesenheit von amorphen Regionen mit Hilfe einer weit grösseren Anzahl von Mitteln regeneriert werden als die bekannten Cellulose-Derivate. Die letztgenannten Derivate sind wegen des Vorhandenseins der amorphen Zonen hingegen dem Angriff durch saure Regenerierungsmittel ausgesetzt.
Von besonderer Bedeutung ist die Tatsache, dass die Derivate der Aggregate einen hydrophilen Charakter aufweisen. Dies erklärt sich aus dem Umstand, dass die Cellulose-Kristallit-Aggregate. aus denen die Derivate gewonnen werden, eine grosse Zahl von Hydroxylgruppen enthalten, von denen mindestens einige die Umwandlung der Aggregate überstehen. Auf Grund dieses hydrophilen Charakters sind die Derivate von besonderem Wert für die Trennung von Beschickungs-Gemischen, deren Komponenten Aminogruppen enthalten.
Der in dieser Erfindungs-Beschreibung gebrauchte Ausdruck "Adsorptions-Material" soll sowohl solche Derivate bezeichnen, die ionisierbare Gruppen enthalten, als auch solche, die derartige Gruppen nicht enthalten.
Unter den Ausdrücken"flüssiges Gemisch"bzw."fliessfahiges Gemisch"sollen trennbare Beschickungs-Gemische verstanden werden, die in einem flüssigen oder verflüssigten bzw. fliessfähigen Zustand vorliegen. Zu ihnen gehören Lösungen, kolloidale Lösungen, kolloidale Suspensionen und breiartige Massen. Unter diese Bezeichnungen fallen auch geschmolzene Gemische, falls derartige Gemische bei normalen Temperaturen nicht flüssig sind. Zu den kolloidalen Suspensionen gehören auch Suspensionen eines trennbaren Virus, Enzyms, Proteins, Polypeptids u. dgl. m. Darüber hinaus können auch manche flüssigen Beschickungs-Gemische in die Trennsäule eingeführt werden, ohne dass sie vorher mit Hilfe eines Lösungsmittels in eine Lösung umgewandelt wurden.
PATENTANSPRÜCHE :
1. Verwendung von Derivaten von Cellulose-Kristallit-Aggregaten eines auf einen annähernd einheitlichen Wert eingestellten Polymerisationsgrades, die einen Substitutionsgrad von unter 1,0, vorzugweise von 0, 01 bis 0,85 aufweisen, als Adsorbentien zur Trennung von wenigstens aus zwei Komponenten bestehenden flüssigen bzw. in Lösung vorliegenden Stoffgemischen.