DE4437604A1

DE4437604A1 - Konjugate aus einem Poly- oder Oligopeptid und einer niedermolekularen lipophilen Verbindung

Info

Publication number: DE4437604A1
Application number: DE19944437604
Authority: DE
Inventors: Juergen Dr Schweden; Wilfried Dr Hornberger
Original assignee: BASF SE
Current assignee: BASF SE
Priority date: 1994-10-21
Filing date: 1994-10-21
Publication date: 1996-04-25
Also published as: WO1996012505A1

Description

Die Bedeutung von Proteinen als Wirkstoffe zur Entwicklung von Medikamenten ist in den letzten Jahren durch die Fortschritte auf dem Gebiet der Gentechnik enorm gestiegen. Durch den Einsatz die ser Technik sind Proteine nun in großen Mengen verfügbar, die na türlicherweise im Organismus nur in Spuren vorkommen.

Häufig beobachtet man bei solchen rekombinant hergestellten Pro teine, daß sie nach Injektion in einen tierischen Organismus schnell durch Abbau zerstört oder durch Ausscheidung aus der Blutzirkulation eliminiert werden. Dieses Problem führt zu einer starken Einschränkung der Anwendbarkeit von Proteinen, besonders dann, wenn eine längere Behandlungsdauer gewünscht ist.

Durch Derivatisierung mit hochmolekularen Polymeren kann die Halbwertszeit eines Proteins modifiziert werden. Als Polymere werden in EP 236 987 und EP 345 616 lösliche und unlösliche Poly mere wie Dextrane, Sepharose, Heparin, Laevan, Gelatinepartialhy drolysate sowie Polyalkylenglykole beschrieben. Die polymer modifizierten Proteine sollen eine verlängerte Zirkulationsdauer im Blut aufweisen.

In der EP 502 962A sind mit Polyethylenglykol modifizierte Hirudine beschrieben, die ebenfalls eine verlängerte Halbwerts zeit aufweisen.

In den oben genannten Offenlegungsschriften wird die Verlängerung der Halbwertszeit durch Modifikation mit einem hochmolekularen Polymeren erreicht.

Die Molmasse des Polymeren beträgt dabei einige Kilodalton, so daß die Molmasse des Polypeptids erheblich vergrößert wird. Sol che hochmolekularen Polymere sind jedoch chemisch nicht exakt de finiert; sie bilden vielmehr eine Population verschiedener Mole küle, die sich um einen Molmassenbereich verteilt. Demzufolge be stehen auch die damit hergestellten Protein-Kopplungsprodukte nicht aus einer einzigen chemischen Verbindung, sondern aus Molekülpopulationen, die sich bezüglich ihrer Molmasse und damit in ihrem pharmako-kinetischen Eigenschaften voneinander unter scheiden.

Es ist jedoch wünschenswert, Wirkstoffe, die als Arzneimittel eingesetzt werden, chemisch möglichst exakt zu definieren, um ihr Verhalten im Organismus besser kontrollieren zu können.

Aus Annal Review of Biochemistry, Vol. 61, 1992, S. 355-387 und Vol. 63, 1994, S. 869-915 sind Verbindungen bekannt, deren Pep tidteil während ihrer Biosynthese, d. h. durch in der Natur zwangsläufig ablaufende Prozesse, bereits hydrophob modifiziert wurden.

Es bestand daher die Aufgabe, Protein-Derivate mit gegenüber dem normalen Protein verbesserten pharmakologischen Eigenschaften be reitzustellen, die die obengenannten Nachteile der mit hochmole kularen Polymeren modifizierten Proteine nicht besitzen.

Diese Aufgabe wird gelöst durch Konjugate bestehend aus einem Poly- oder Oligopeptid und einer niedermolekularen lipophilen Verbindung, wobei das Peptid und der lipophile Rest unmittelbar oder über ein Verbindungsglied kovalent miteinander verknüpft sind, ausgenommen a) Konjugate, in denen der Peptidteil aus Hirudin oder einem von Hirudin strukturell abgeleiteten Peptid oder Peptidderivat mit Hirudinaktivität besteht und b) Konjugate, deren Peptidteil während ihrer Biosynthese bereits hydrophob mo difiziert wurde.

Insbesondere geeignet sind Konjugate, gebildet aus einem Protein und einer oder mehreren niedermolekularen lipophilen Verbindungen, wobei die lipophile Verbindung einen Octanol-Was ser-Verteilungskoeffizienten von mehr als 1,8 aufweist und kovalent mit dem Protein verknüpft ist. Der Verteilungskoeffi zient wird nach E. Nürnberg, Hagens Handbuch der pharmazeutischen Praxis, Bd. 2, Springer Verlag, 1991, S. 403, bestimmt.

Gegenstand der Erfindung sind auch Arzneimittel, die ein Konjugat wie oben definiert, gegebenenfalls zusammen mit physiologisch ak zeptablen Trägern und/oder Hilfsstoffen, enthalten.

Für die erfindungsgemäßen Protein-Konjugate sind alle Poly- oder Oligopeptide geeignet. Die erfindungsgemäßen Protein-Konjugate können z. B. mit Proteinen wie Streptokinase, Urokinase, t-PA, Faktor VIII, Faktor IX, monoklonalen oder polyklonalen Antikör pern, Superoxiddismutase, Adenosindeamidase, Katalase, Glucocere brosidase, tissue-Factor, TNF, Interferone, Interleukine, Lipa sen, Wachstumsfaktoren wie beispielsweise Macrophage colony sti mulating factor, epidermal growth factor, neurothrophe Faktoren wie z. B. GDNF, BDNF, NGF, Thrombopotein, Erythropotein oder Kal likrein, Insulin, ACTH, Glucagon, Somatostatin, Somatotropin, Thymosin, Parathyroid-Hormon, Prolactin, Thyroid stimulierendes Hormon, antidiuretisches Hormon, hergestellt werden.

Bevorzugt für die Herstellung der erfindungsgemäßen lipophilen Konjugate sind solche Proteine oder Peptide, bei denen die Anzahl von theoretischen Kopplungsstellen für die lipophilen Verbindungen gering sind, damit das entstehende Produkt möglichst homogen ist. Bevorzugte Proteine sind auch solche, bei denen durch Mutationen, z. B. durch Deletion oder durch Austausch von Lys → Arg, die Anzahl der möglichen Kopplungsstellen reduziert wurde.

Geeignet sind auch Proteine bzw. Peptide, die bereits natürli cherweise durch posttranslationale Modifikation, z. B. Farnesylie rung, Prenylierung oder auch durch Fettsäuren modifiziert sind. Solche Proteine sind z. B. fermentativ oder auch mit Hilfe von gentechnischen Methoden bzw. durch Peptid-Synthese zugänglich.

Die Anknüpfung der lipophilen Verbindung an das Poly-, Oligo-Pep tid kann direkt oder unter Verwendung eines Verbindungsglieds, z. B. eines Spacers oder Quervernetzers, erfolgen. Funktionelle Gruppen, die für die Anknüpfung am Protein verwendet werden kön nen, sind der N- oder C-Terminus des Protein/Peptids, die Hydro xy-Gruppen der Aminosäuren Serin, Threonin oder Tyrosin, die Ami dinogruppen des Arginins, die Aminogruppen des Lysins, die SH- Funktionen von Cystein oder an die Carboxyl-Funktionen von Aspa raginsäure oder Glutaminsäure. Methoden zur Anknüpfung an die o.g. funktionellen Gruppen sind dem Fachmann bekannt und sind in Standardwerken der Peptidchemie z. B. Bodanszky, "Peptide Synthe sis", John Wiley, New York, 1976 beschrieben. Erfolgt die Anknüp fung der lipophilen Verbindung über ein Verbindungsglied, so richtet sich die Auswahl nach der Art der funktionellen Gruppen. Die folgende Tabelle gibt einen Überblick über mögliche Verbin dungsglieder sowie deren Einsatzmöglichkeiten.

Als Verbindungsglieder eignen sich beispielsweise auch Aminosäu ren, Oligopeptide, Mono-, Di- oder Oligosaccharide, Amino- oder Hydroxycarbonsäuren, insbesondere solche mit einer Kettenlänge von 2 bis 10 C-Atomen, die gegebenenfalls zur Erhöhung der Hydro philie weitere Substituenten tragen können, beispielsweise C₁-C₄-Oligoalkylenglykole.

Für die Anknüpfung von lipophilen Verbindungen an das Poly-/Oli gopeptid können beistielsweise auch folgende Verbindungsglieder eingesetzt werden

wobei
X für S, O, NH, N (CH₃), N(C₂H₅)
W für H, OH, C1
Z für eine C₂-C₆-Alkylengruppe oder eine p-Phenylengruppe
steht.

Als niedermolekulare lipophile Verbindung eignen sich Verbindun gen, die einen lipophilen Rest und über eine oder mehrere funk tionelle Gruppe wie Amino-, Hydroxy-, Carboxy- oder Sulfonsäure gruppen verfügen und insbesondere solche, die einen Octanol-Was ser-Verteilungskoeffizienten von größer als 1,8 besitzen.

Die lipophilen Verbindungen können Naturstoffe sein, z. B. gesät tigte oder ungesättigte Fettsäuren, Fettsäure-Diketone, Terpene, Prostaglandine, fettlösliche Vitamine, Carotinoide oder Steroide, aber auch synthetische Carbonsäuren, Alkohole, Amine und Sulfon säuren mit einem oder mehreren Alkyl-, Aryl-, Alkenyl oder auch mehrfach ungesättigten Verbindungen, die sowohl linear als auch verzweigt sein können und gegebenenfalls mit Halogen-, Nitro-, Cyano-, Alkoxy-, Alkylthio- oder Halogenalkylgruppen substituiert sind.

Weitere Beispiele für lipophile Verbindungen sind die Carotinoide Zeaxanthin, Rhodovibrin oder Asthaxanthin, die Steroide Choleste rin, Desmosterol, Coprosterol, Cerebrosterol, Lathosterol, Erge sterol, Sitosterol, Stigmasterol, Cholansäure, Cholinsäure, Dehydrocorticosterol, Aldosteron, Androsteron, Testosteron, Ta chysterol, Lanosterol oder Lumisterol, die terpene Geraniol, Ne rol, Linalool, Menthol, Carveol, Borneol, Farnesol, Nerolidol oder Sclareol, die Prostaglandine Brefeldin, PGE₂ oder PGF₂, die Vitamine A₁ oder D, aber auch synthetische Verbindungen wie Oxo alkohole, Hexylamin, Ethylhexansäure, Ethylhexanol, Ethylhexyl amin oder Alkylbenzolsulfonsäuren.

Weitere geeignete lipophile Reste leiten sich von Verbindungen der allgemeinen Formel

H-Y-R¹

ab, worin
R¹ (CH₂)_m-C(R²)(R³)-(CH₂)_n-(CH=CH-CH₂)₀-CH₃ mit m = 0-28, n = 3-6, o = 0-6, und
Y -C(O₂)-, -N(R⁴)-, -O- mit
R², R³, R⁴ H, C_1-18-Alkyl, C_3-18-Alkenyl, C_3-6-Cycloalkyl, Aryl oder Benzyl, jeweils gegebenenfalls substituiert durch Halo gen-, Nitro-, Cyano-, Alkyl-, Alkoxy-, Alkylthio-, Halogenalkylgruppen.

Für die Erfindung gut geeignete lipophile Verbindungen sind die gesättigten oder ungesättigten Fettsäuren der Kettenlänge C₆-C₂₄, sowie die daraus abzuleitender Fettalkohole oder Fettamine sowie Mischungen von Fettsäuren, Fettalkoholen und Fettaminen.

Besonders gut geeignet sind die gesättigten Fettsäuren Myristin säure, Palmitinsäure, Stearinsäure, Arachinsäure, Behensäure und Lignocerinsäure.

Ebenfalls gut geeignete hydrophobe Verbindungen sind Sterole, be sonders gut geeignet ist Cholesterin.

Die niedermolekularen lipophilen Verbindungen weisen bevorzugt ein Molekulargewicht M_w von unter 1500 auf, insbesondere unter 1000.

Am Poly- oder Oligopeptid können ein oder auch mehrere lipophile Reste angeknüpft werden. Die Anzahl richtet sich dabei nach der Größe des Proteins und nach den lipophilen Eigenschaften der lipophilen Verbindung. Je nach angestrebter Wirkung bzw. Anwen dung kann die Anzahl der konjugierten lipophilen Reste z. B. zwi schen 1 und 10 variieren.

Die Herstellung der erfindungsgemäßen Protein-Konjugate erfolgt, indem man das Protein/Peptid entweder direkt oder mittels eines Spacers/Quervernetzers bei 0° bis 40°C in Puffer, enthaltend bis zu 80% eines mit Wasser mischbaren organischen Lösungsmittels wie z. B. Alkohole, THF, Acetonitril, Aceton, DMSO, DMF bei pH- Werten zwischen 4 bis 10 bevorzugt bei pH 7 bis 9 zur Reaktion bringt.

Mit den erfindungsgemäßen Protein-Konjugaten können z. B. die fol genden vorteilhaften Wirkungen und Anwendungen erzielt werden:

- Verlängerung der biologischen Halbwertszeit nach parenteraler Applikation,
- Beschichtung von natürlichen oder auch künstlichen Oberflä chen, z. B. Zellmembranen, Polymere
- Modifikation der Lösungseigenschaften von Proteinen
- Verbesserung der Resorptionseigenschaften bei z. B. transder maler, oraler Applikation.

Die folgenden Beispiele dienen zur Veranschaulichung der Erfin dung:

Beispiel 1

Herstellung von Palmitinsäure-Insulin
200 µl Insulin-Lösung (100 mg/ml H₂O) werden mit 200 µl 0.1 M Na- Borat pH 9.0 gemischt und anschließend 600 µl THF in dem 1.5 mg Palmitinsäure-N-Hydroxy-Succinimid gelöst sind, zugesetzt. Die Reaktion wird nach 12 h bei RT durch Zusatz von Ethanolamin abge stoppt und die Reaktionsmischung auf einen HiPore RP-304 Säule (10 × 250 mm) aufgetragen und unter folgenden Bedingungen ent wickelt:

Laufmittel A: 2 mM NH₄-Acetat pH 6.0
Laufmittel B: Methanol
Flow: 2,5 ml/min
Gradient:

Zeit (min)
Anteil B (%)
0
0
10	40
60	80
60.1	100

Die Palmitinsäure-Insulin Derivate eluieren bei 45%, 56% und 100% B. Die Proben werden anschließend von Methanol befreit und in Wasser resuspendiert.

Beispiel 2 Herstellung von Cholesterin-Insulin

100 mg Cholesterin-Hemisuccinat (Sigma (6013) werden in 5 ml 50% THF gelöst und zur Aktivierung mit 25 mg N-Hydroxy-Succinimid und 300 mg 1-Ethyl-3-(3-Dimethylaminopropyl) carbodiimid versetzt und bei pH 5 2 h RT inkubiert.

200 µl des aktivierten Cholesterins werden dann analog zu Bei spiel 1 mit Insulin umgesetzt und die Derivate durch RP-Chromato graphie wie beschrieben aufgetrennt. Die Cholesterin-Insulin-De rivate eluieren zwischen 80 und 100% B.

Beispiel 3 Glucosebestimmung als Maß der Insulinwirkung an der Ratte

Methode: Narkotisierten (Urethan 2 × 8 mg/kg i.p.) Ratten wurde Placebo, humanes Insulin, Palmitoyl-Insulin oder Cholesteryl-In sulin intravenös appliziert. Zu definierten Zeiten (vor und 30, 60 und 180 min nach Applikation) wurden den Tieren venöse Blut proben zur Gewinnung von Citratplasma entnommen. Dafür wurde fri sches Vollblut mit Natriumcitrat 0,11 mol/l im Verhältnis 8,5+1,5 gemischt und 10 min bei 1600 xg zentrifugiert. Als Maß der Insu linwirkung im Plasma wurde die Blutglucosekonzentration mit der Hexokinase-Methode bestimmt. Dabei wird Glucose in Anwesenheit von Hexokinase mit ATP zu Glucose-6-Phosphat phosphoryliert. Dies regiert mit NADP unter Bildung von Gphosphogluconat und NADPH₂, die Reaktion wird durch die Glucose-6-Phosphat-Dehydrogenase ka talysiert. Meßgröße ist NADPH₂, dessen Zu bis zum Stillstand der Reaktion im photometrisch gemessen wird. Die ermittelte Extink tionszunahme ist proportional der Glucosekonzentration im Test ansatz.

Ergebnis

Bei Ratten, denen 20 µg/kg humanes Insulin intravenös appliziert worden war, wurde 30 min nach Applikation ein Abfall der Blutglu cosekonzentration auf etwa ∼0% des Ausgangswertes bestimmt. 60 min nach Applikation war die Blutglucosekonzentration noch leicht vermindert und 180 min nach Applikation war der Ausgangswert wie der erreicht. Nach intravenöser Applikation von Palmitoyl-Insulin oder Cholesteryl-Insulin g Aktivität war die Blutglucosekon zentration auch nach 180 min noch stark vermindert. Bei den Placebo-Tieren blieb die Blutglucosekonzentration kon stant.

Claims

1. Konjugate aus einem Poly- oder Oligopeptid und einer nieder molekularen lipophilen Verbindung, wobei das Peptid und der lipophile Rest unmittelbar oder über ein Verbindungsglied kovalent miteinander verknüpft sind, ausgenommen

a) Konjugate, in denen der Peptidteil aus Hirudin oder einem von Hirudin strukturell abgeleiteten Peptid oder Peptid derivat mit Hirudinaktivität besteht und
b) Konjugate, deren Peptidteil während ihrer Biosynthese be reits hydrophob modifiziert wurde.

2. Arzneimittel, enthaltend ein Konjugat nach Anspruch 1, gege benenfalls zusammen mit physiologisch akzeptablen Trägern und/oder Hilfsstoffen.

3. Konjugate nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß sie aus einem Protein und einer oder mehreren niedermolekularen lipophilen Verbindungen gebildet sind, wobei die lipophile Verbindung einen Octanol-Wasser-Verteilungskoeffizienten von mehr als 1,8 aufweist.

4. Konjugate nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß sich die lipophilen Reste von gesättigten Fettsäuren mit 6 bis 24 C-Atomen und/oder von Cholesterin ableiten.