DE4344211A1 - Verfahren zur Erhöhung der Aktivität von hydrolytischen Enzymen - Google Patents

Description

Die vorliegende Erfindung beschreibt ein Verfahren zur Erhöhung der Aktivität von hydrolytischen Enzymen in organischen Lösungs­ mitteln.

Enzymkatalysierte Reaktionen in organischen Lösungsmitteln haben sich in den letzten Jahren zu einer Standardmethode der organi­ schen Synthese entwickelt (K. Faber, Biotransformations in Organic Chemistry, Springer Verlag, 1992). Verglichen mit den Reaktionen in wäßrigen Lösung bietet der Einsatz organischer Lösungsmittel einige Vorteile wie erhöhte Enzymstabilität, verän­ derte Enzymselektivität, gute Substratlöslichkeit, leichte Ab­ trennbarkeit des unlöslichen Enzyms oder Verschiebung von Reak­ tionsgleichgewichten.

Ein bedeutender Nachteil beim Einsatz von Enzymen in organischen Lösungsmitteln ist, daß das Enzym eine um Größenordnungen gerin­ gere Aktivität als in wäßriger Umgebung aufweist.

Monot et al. (Appl. Mirobiol. Biotechnol. 39, 483, 1993) berich­ ten, daß sich die Aktivität einer Lipase in organischen Lösungs­ mitteln steigern läßt, wenn man zu einer Lösung der Lipase in Wasser das entsprechende Substrats zusetzt und die Lösung an­ schließend gefriertrocknet.

Dabulis und Klibanov (Biotechnology and Bioengineering 41,566-571, 1993) beschreiben die Erhöhung der Aktivität von Enzymen in organischen Lösungsmitteln durch Zusatz sogenannter Lyoprotectanten zur Lösung des Enzyms in Wasser vor der Gefrier­ trocknung. Als Lyoprotectanten werden N-Actetyl-phenylalaninamid, Sorbitol, Zucker sowie Polyethylenglykol genannt.

Akita et al. (Chem. Pharm. Bull. 41, 12-20, 1993 sowie dort zitierte ältere Arbeiten) beschreiben die Herstellung, Struktur und Verwendung von Phospholipid-Lipase Aggregaten. Das Phospholi­ pid-Lipase Aggregat wird hergestellt durch Zusatz eines Phospho­ lipids zu einer Lipaselösung in Wasser und anschließende Aufar­ beitung einschließlich Lyophilisation. Sowohl bei einer enantio­ selektiven Hydrolyse eines Esters als auch bei der enantioselek­ tiven Acylierung eines Alkohols ist die durch Phospholipid-Lipase Aggregate katalysierte Reaktion maximal um den Faktor 2 schneller gegenüber der durch unbehandelte Lipase katalysierten Reaktion.

Da diese Reaktionen mit einem Enzym- zu Substratgewichtsverhält­ nis von 1 : 1 (Reaktionszeit 3 Tage bei 33°C) durchgeführt werden, sind sie für einen Prozeß im technischen Maßstab völlig ungeeig­ net.

Aufgabe der vorliegenden Erfindung war es, ein Verfahren zur Erhöhung der Aktivität von hydrolytischen Enzymen in organischen Lösungsmitteln bereitzustellen.

Demgemäß wurde gefunden, daß sich die Aktivität von hydrolyti­ schen Enzymen in organischen Lösungsmitteln dadurch steigern läßt, daß das in wäßrigem Medium gelöste hydrolytische Enzym mit einer oberflächenaktiven Substanz, die nicht aus einem Phospholi­ pid besteht, vermischt wird, die erhaltene Mischung anschließend entwässert wird und das so erhaltene Enzypräparat als Katalysa­ tor in organischen Lösungsmitteln eingesetzt wird.

Das erfindungsgemäße Verfahren eignet sich für alle hydrolyti­ schen Enzyme (Hydrolasen), insbesondere für Proteasen und Esterasen (Lipasen). Besonders geeignet sind bakterielle Lipasen, beispielsweise solche aus Pseudomonaden.

Als oberflächenaktive Substanz können für das erfindungsgemäße Verfahren solche Verbindungen eingesetzt werden, die in einer Flüssigkeit gelöst oder dispergiert, an einer Grenzfläche bevor­ zugt adsorbiert werden. Solche Moleküle besitzen wenigstens eine Gruppe mit Affinität zu Substanzen starker Polarität - wodurch im allgemeinen die Löslichkeit in Wasser verursacht wird - und eine weitere Gruppe mit geringerer Affinität zu Wasser.

Solche oberflächenaktiven Substanzen sind dem Fachmann auch unter der Bezeichnung Tenside bekannt und sind beispielsweise in DIN 53900 definiert.

Geeignete oberflächenaktive Substanzen sind anionische Tenside wie Alkyl- oder Alkylarylcarboxylate, -sulfonate, insbesondere Alkylbenzolsulfonate, -sulfate, insbesondere Ethersulfate und Fettalkohol(ether)sulfate, kationische Tenside wie geradkettige oder cyclische Ammoniumverbindungen, nichtionische Tenside wie Polyether, insbesondere Alkylphenolpolyglykolether, Produkte der Ethoxylierung von Fettsäuren, Fettaminen, Fettsäureamiden und Fettalkoholen, ferner Aminoxide und Fettsäureester von Poly­ alkoholen, ampholytische Tenside, die als Zwitterionen anionen­ aktive und kationenaktive hydrophile Gruppen in sich vereinigen.

Auch Mischungen der oben genannten Verbindungen sind als ober­ flächenaktive Substanz gemäß der vorliegenden Erfindung geeignet.

Als oberflächenaktive Substanz besonders geeignet sind freie Fettsäuren oder Salze der Fettsäuren, insbesondere Alkalimetall­ salze.

Gut geeignete oberflächenaktive Substanzen sind Fettsäuren mit einer Kettenlänge von etwa 10 bis 30 Kohlenstoffatomen (C10-C30). Die Fettsäuren können gesättigt oder auch ein- oder mehrfach un­ gesättigt sein. Geeignet sind sowohl geradkettige als auch ver­ zweigte Fettsäuren. Die in natürlichen Fetten vorkommenden Fett­ säuren beispielsweise Myristinsäure, Palmitinsäure, Stearinsäure, Ölsäure, Linolsäure, Linolensäure, Arachidonsäure sind für das erfindungsgemäße Verfahren als oberflächenaktive Substanz mit gu­ tem Erfolg einsetzbar.

Besonders geeignet sind die Natrium- oder Kaliumsalze solcher Fettsäuren, da sie sich in der wäßrigen Enzymlösung lösen lassen und somit eine innige Durchmischung mit dem Enzym leicht durch­ führbar ist.

Weitere geeignete oberflächenaktive Substanzen sind Fettsäurede­ rivate, insbesondere Ester aus Fettsäuren und Alkylalkoholen, be­ vorzugt aus Alkoholen mit einer Kettenlänge von ein bis vier Kohlenstoffatomen.

Für das erfindungsgemäße Verfahren können als oberflächenaktive Substanz auch Mischungen von mehreren Fettsäuren bzw. deren Salze, wie sie beispielsweise bei der Hydrolyse natürlicher Fette oder Öle anfallen, eingesetzt werden.

Die zugesetzte Menge an oberflächenaktiver Substanz kann in wei­ ten Bereichen variiert werden. Bevorzugt ist eine Menge von 10 - 200 Gew.% oberflächenaktiver Substanz bezogen auf Enzymmenge. Bei niedriger Zugabe ist die Enzymaktivierung proportional zur zuge­ gebenen Menge an oberflächenaktiver Substanz. Die Enzymaktivie­ rung erreicht bei etwa 100-200 Gew.% ihren Maximalwert. Eine Menge von mehr als 200 Gew.% hat in der Regel keinen darüber hin­ ausgehenden Effekt auf die Enzymaktivierung.

Für das erfindungsgemäße Verfahren wird das hydrolytische Enzym in einem wäßrigen Medium, in der Regel in einem wäßrigen Puffer gelöst. Zu dieser Lösung wird die oberflächenaktive Substanz zu­ gegeben. Löst sich die oberflächenaktive Substanz ebenfalls in dem wäßrigen Medium, so genügt für die Mischung des Enzyms mit der oberflächenaktiven Substanz Rühren der homogenen Lösung.

Die Temperatur bei dieser Reaktion ist in der Regel Raumtempera­ tur. Je nach thermischer Stabilität des Enzyms sind jedoch auch höhere bzw. niedrigere Reaktionstemperaturen angezeigt.

Falls sich die oberflächenaktive Substanz nicht in dem wäßrigen Medium lösen läßt, ist eine starke Durchmischung bis zur Emul­ sionsbildung vorteilhaft. Dies läßt sich beispielsweise durch starkes Schütteln, Schlagen, Rühren, turbulentes Mischen, Homoge­ nisation oder Schwingungserzeugung erreichen. Hierfür gut geei­ gnet ist die Verwendung eines Dispergiergeräts, z. B. Ultra-Tur­ rax.

Nach dem Mischen des hydrolytischen Enzyms mit der oberflächen­ aktiven Substanz wird die entstandene Mischung entwässert. Dies läßt sich mit allen dem Fachmann geläufigen Methoden durch­ führen. Gut geeignet ist hierfür die Sprühtrocknung und die Ge­ friertrocknung. Bei hydrolytischen Enzymen, die leicht thermisch inaktiviert werden, empfiehlt sich die Gefriertrocknung als scho­ nende Entwässerungsmethode.

Die vom wäßrigen Medium befreite Mischung aus Enzym und ober­ flächenaktiver Substanz, die in der Regel als trockenes Pulver vorliegt, ist anschließend als Katalysator in organischen Lösungsmitteln einsatzfähig.

Das erfindungsgemäße Verfahren eignet sich auch zur Verwendung bei immobilisierten Enzymen.

Die mit diesem erfindungsgemäßen Verfahren hergestellten Enzyme lassen sich auch hervorragend rezyklisieren.

Nachdem die enzymkatalysierte Reaktion beendet ist, lassen sich die Enzyme leicht, z. B. durch Filtration, aus dem organischen Lösungsmittel isolieren. Aus den so isolierten Enzyme können mit Hilfe des erfindungsgemäßen Verfahrens wieder hochaktive Katalysatoren hergestellt werden.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung sind Mittel, enthaltend ein hydrolytisches Enzym und ein oder mehrere Fettsäurederivate, die nach dem oben beschriebenen Verfahren erhältlich sind.

Die erfindungsgemäßen Mittel eignen sich hervorragend als Katalysatoren für chemische Synthesen in organischen Lösungs­ mitteln wie Veresterungen, Umesterungen, Amidierungen, Hydrolyse von Carbonsäurederivaten und ähnliche Reaktionen.

Die folgenden Beispiele dienen der weiteren Veranschaulichung der Erfindung.

Beispiel 1

Lipase-katalysierte Acylierung eines Alkohols mit Vinylpropionat

10 mMol (1,57 g) Chlorhydrin (1) und 10 mMol (1,086 ml) Vinyl­ propionat wurden in 30 ml Methyl-tert.-butylether (MTBE) gelöst. Durch Zusatz der Enzympräparation wurde die Reaktion gestartet. Der Fortschritt der Reaktion wurde per GC ermittelt.

Herstellung der Enzympräparation

50 mg Lipase wurden in 5 ml Wasser gelöst und mit der entspre­ chenden Fettsäure (Tab. 1) versetzt. Anschließend wurde intensiv durchmischt, eingefroren und über Nacht lyophilisiert.

Als Lipasen wurden die kommerziell erhältliche Amano P® Lipase (Aktivität 100 U/mg) oder eine Lipase aus Pseudomonas spec. DSM 6535 verwendet (hergestellt und gereinigt wie in WO 93/00924 be­ schrieben, Enzymgehalt ca. 60%, Aktivität 2000 U/mg).

Die Ergebnisse der Umsetzungen sind in Tab. 1 aufgeführt.

Beispiel 2

Verwendung einer weiter aufgereinigten Lipase aus Pseudomonas spec. DSM 6535 (Enzymgehalt ca. 90%, Aktivität 3000 U/mg) zur en­ zymatischen Katalyse.

Die in Beispiel 1 beschriebene Reaktion wurde mit folgenden Ver­ änderungen ausgeführt:
30 mMol (1)
30 mMol (2)
30 ml MTBE (Lösungsmittel).

Herstellung der Enzympräparation

50 mg Lipase wurden in 5 ml Wasser gelöst und mit der entspre­ chenden oberflächenaktiven Substanz (Tab. 2) versetzt. Anschlie­ ßend wurde intensiv durchmischt, eingefroren und über Nacht lyophilisiert.

Die Ergebnisse der Umsetzungen sind in Tab. 2 aufgeführt.

Beispiel 3 Bestimmung der Aktivierung des hydrolytischen Enzyms

Als Testreaktion zur Bestimmung der Aktivierung des hydrolyti­ schen Enzyms wurde folgende Reaktion gewählt:
50 mMol Benzylalkohol (3)
50 mMol Vinylpropionat (4)
50 ml MTBE.

Durch Zusatz von 10 bzw. 100 mg Lipase wurde die Reaktion gestar­ tet. Der Umsatzverlauf wurde per GC ermittelt. Aus der Anfangs­ reaktionsgeschwindigkeit (Umsatz < 10% bei Enzymsättigung) wurde die Aktivität der Enzympräparation ermittelt. Als Einheit 1U wird 1µMol gebildeter Ester pro Minute definiert.

Lipase
Aktivität (U/mg)
Amano P®
0,57
P. spec. DSM 6535 (60%)	0,50
P. spec. DSM 6535 (90%)	0,20
P. spec. DSM 6535 (aktiviert gem. Beispiel 1 und 2)	50. . .100

Die mit dem erfindungsgemäßen Verfahren aktivierten Enzyme weisen eine Aktivität im Bereich von 50 bis 100 U/mg auf und sind somit um den Faktor 87 bis 500 aktiver als die unbehandelten Enzyme.

Claims (7)

1. Verfahren zur Erhöhung der Aktivität von hydrolytischen Enzymen in organischen Lösungsmitteln, dadurch gekennzeich­ net, daß das in wäßrigem Medium gelöste hydrolytische Enzym mit einer oberflächenaktiven Substanz, die nicht aus einem Phospholipid besteht,vermischt wird, die erhaltene Mischung anschließend entwässert wird und das so erhaltene Enzymprä­ parat als Katalysator in organischen Lösungsmitteln eingesetzt wird.

2. Verfahren nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, daß als oberflächenaktive Substanz ein Fettsäurederivat eingesetzt wird.

3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß als oberflächenaktive Substanz ein Natriumsalz einer C10-C30 Fettsäure oder eines Gemisches solcher Fettsäuren eingesetzt wird.

4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als hydrolytisches Enzym eine Lipase eingesetzt wird.

5. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Entwässerung durch Lyophilisieren oder Sprühtrocknen erfolgt.

6. Mittel, enthaltend ein hydrolytisches Enzym und ein oder mehrere Fettsäurederivate, erhältlich nach einem Verfahren gemäß Anspruch 2.

7. Verwendung von Mitteln gemäß Anspruch 6 zur Katalyse in organischen Lösungsmitteln.