DE4322570C1 - Stromale Zellinien aus menschlichem Knochenmark - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft stromale Zellinien nach dem Oberbegriff des Patentanspruchs 1.

Menschliches Knochenmark kann in vitro maximal 20 Wochen kul­ tiviert werden. Es ist dabei auf die Funktion von Feederzellen angewiesen, die gleichfalls aus dem Knochenmark gewonnen wer­ den. Die Interaktion zwischen Knochenmarkzellen und Feederzel­ len ist weitgehend unerforscht, stellt aber mit großer Wahr­ scheinlichkeit den Schlüssel zu einer erfolgreichen Langzeit­ kultivierung dar. Sowohl die Gewinnung als auch die Analyse primärer Feederzellen aus Knochenmark stellt hierbei ein be­ trächtliches technisches Problem dar, da diese Zellen

• - aufgrund ihrer langen Verdoppelungszeit und des folglich extrem langsamen Wachstums nur in begrenzter Menge zur Ver­ fügung stehen;
• - aufgrund ihrer begrenzten Lebensdauer (Zelltod nach ca. 30 Zellteilungen) für Langzeitversuche und Versuchsreihen un­ tauglich sind;
• - ein Gemisch aus unterschiedlichen Zelltypen darstellen, so daß eine Einzelkomponentenanalyse nicht durchgeführt werden kann;
• - keine Kontaktinhibition zeigen, also zum Wachstumsarrest bestrahlt werden müssen.

Aus Harigaya K, Hiroshi H: Proc. Natl. Acad. Sci., USA 82: 3477-3480, 1985 ist bekannt die Transfektion von menschli­ chen Knochenmarkzellen mit einem Replikationskompetenten SV-40 Konstrukt mit Hilfe der Ca-Phosphat-Präzipitation durchzufüh­ ren.

Wegen des intakten Replikationsursprungs und der intakten spä­ ten Gene besteht eine erhöhte Wahrscheinlichkeit störender spontaner Virusproduktion.

Des weiteren ist aus Singer Jw, Charbord P, Keating A, Nemu­ naitis J, Raugi G, Wight TN, Lopez JA, Roth GJ, Dow LW, Fial­ kow PJ: Blood 70: 464-474, 1987, bekannt die DNA eines Wild­ typ SV-40-Virus durch Infektion in das zelluläre Genom der Knochenmarkzellen einzuschleusen. Aus den so veränderten Zel­ len lassen sich jedoch keine permanenten Zellinien ableiten.

Aufgabe der Erfindung ist es, Zellinien der e. g. Art bereit­ zustellen, wobei spontane Veränderungen der Zellinien durch Virusproduktion ausgeschlossen sind.

Gelöst wird diese Aufgabe durch die Merkmale des Pa­ tentanspruchs 1.

Die Unteransprüche 2 bis 5 beschreiben vorteilhafte Ausgestal­ tungen der Erfindung. Die übrigen Ansprüche zeigen wichtige Verwendungen der beanspruchten Zellinien auf.

Die beanspruchten Zellinien weisen im Gegensatz zu allen bis­ her beschriebenen humanen Knochenmarkstromazellinien folgende Vorteile auf.

a) Homogenität

Die Zellinien bestehen im Unterschied zu primärem Stroma aus einer genau definierten einheitlichen Zellpopulation. Experimentelle Schwankungen, die bei Verwendung von primä­ ren Zellen aus wechselnden Probanden auftreten, sind somit ausgeschlossen;

b) Permanenz

Primäre stromale Zellen und die meisten SV-40-immortali­ sierten Zellinien sterben nach einer begrenzten Anzahl von Teilungen ab. Die beanspruchten stromalen Linien sind unbe­ grenzt teilungsfähig.

c) Wachstumsarrest durch Bestrahlung

Für Experimente, in denen die stromalen Zellen als "Feeder- Layer" (=Fütterzellen) für hämopoetische Progenitoren ver­ wendet werden, müssen sie in ihrem Wachstum arretiert wer­ den und gleichzeitig an der Zellkulturschale haften blei­ ben. Bislang beschriebene SV-40-immortalisierte Linien lö­ sen sich nach Bestrahlung von ihrer Unterlage ab, während die beanspruchten Zellinien sowohl das Wachstum einstellen als auch adhärent bleiben.

d) Produktion von hämopoetischen Wachstumsfakturen

Feederzellen für hämopoetische Vorläuferzellen steuern de­ ren Wachstum und Differenzierung u. a. durch die Produktion von Wachstumsfaktoren. Die beanspruchten Zellinien sind in der Lage, große Mengen dieser Wachstumsfaktoren zu produ­ zieren, wobei die Faktorproduktion sowohl durch Bestrahlung als auch durch Stimulation mit Interleukin 1 beeinflußt werden kann.

Die Erfindung wird im folgenden anhand zweier Ausführungsbei­ spiele mit Hilfe der Fig. 1 und 2 näher erläutert. Dabei zeigen die beiden Figuren die Clone Charts der verwendeten SV- 40 Plasmidvektoren.

Andere Vektoren, welche mindestens die viralen DNA Sequenzen des Simian Virus 40 enthalten, die für das T Antigen kodieren und für die der Replikationsursprung des SV-40 Virus defekt ist, können ebenfalls benutzt werden. Geeignet sind auch sol­ che Vektoren, bei denen zusätzlich die späte Gene des SV-40 Virus, welche für die Hüllproteine kodieren deletiert sind.

Primäre adhärente Zellen aus menschlichem Knochenmark wurden mit Hilfe eines solchen SV-40-Plasmidvektors transfiziert. Die Transfektion erfolgte mit Liposomen. Die im Verlauf der Lipofektion transfizierte DNA gelangt in den Zellkern der Kno­ chenmarkzellen und integriert dort in die chromosomale DNA. Die Integrationsstelle des Vektors ist hierbei nicht vorher­ sehbar, geschieht also zufällig. Die Expression des in das zelluläre Genom integrierten SV-40 T Antigens bewirkt eine Im­ motalisierung dieser Zellen.

Die so etablierten Linien sind immortalisiert, zeigen sehr kurze Verdoppelungszeiten und bilden eine homogene Zellpopula­ tion.

Die Fig. 1 zeigt einen benutzten Transfektionsvektor (pSV IN- 1), wie er aus Cohen et al., 1984 J. Virol. 51 5.91-96 bekannt ist.

Die Fig. 2 zeigt einen daraus ableitbaren zweiten Vektor (pUC IN-1 wt). Dabei wurde SV40-DNA aus pSVIN-1 an den Schnittstel­ len Bam/Pst geschnitten und die Nukleotidsequenzen von bp 1988-2533 entfernt. Dann die deletierte SV4O-DNA in pUC 12 Bam/Pst Schnittstelle einkloniert.

Die benutzten Vektoren pUC 12 und pBR 322 sowie die viralen DNA Sequenzen des Simian Virus 40 sind kommerziell erhältlich.

Bei der Transfektion der Knochenmarkszellen wurde wie folgt verfahren:

Knochenmarkzellen wurden für 2-3 Wochen in Langzeitkulturme­ dium [McCoy′s 5a angereichert mit 12,5% fötalem Kälberserum, 12,5% Pferdeserum, 1% Natriumbicarbonat, 1% MEM nicht­ essentielle Aminosäurelösung, 1% L-Glutamin (200 mM), 1% Penicillin/Streptomycinlösung - 10⁻⁴M α-Thiogloycerol, 10^-6M Hydrocortison] gezüchtet ( 5 CO₂; 37°C) bis der stromale Layer subkonfluent war. Einen Tag vor der Transfektion wurden die adhärenten stromalen Zellen durch Trypsinbehandlung abgelöst und in 25 cm² Kulturflaschen mit einer Zelldichte von 5×10⁵ Zellen/ml ausplattiert. Die Transfektion wurde mit cäsiumchloridgereinigter Plasmid DNA [pSV-IN1 und pUCIN-1wt] durchgeführt.

Die Transfektion wurde wie folgt entsprechend dem Transfekti­ onsprotokoll der Firma Serva [IBF instruction sheet No. 294210] durchgeführt.

Die semikonfluenten Zellen wurden einmal mit PBS, einmal mit Mccoy′s 5a-Medium gewaschen und fünf bis 18 Stunden mit einer frisch hergestellten PlasmidlTransfectam-Mischung in 8 ml se­ rumfreiem Langzeitkultur-Medium in 25 cm² Kulturflaschen inku­ biert. Nach der Transfektion wurden die Zellen 2× mit PBS/10% FCS gewaschen und in LTC-Medium kultiviert bis sie konfluent waren. Die transfizierten Zellen wurden durch wiederholtes Passagieren des stromalen Layers im Verhältnis 1 : 2 selektio­ niert. Nach ca. 25-30 Passagen erreichten die immortalisier­ ten Zellen eine sog. Wachstumskrise. Diese Krise wurde über­ wunden indem Zellen, die sich sehr langsam bzw. gar nicht teilten, von ihrer Unterlage durch Trypsinbehandlung abgelöst und in eine neue Kulturflasche überführt wurden. Derart behan­ delte Zellen erholten sich spontan aus der Krise und zeigten einen immortalisierten Phänotyp.

Zwei der so erhaltenen Zellinien wurden bei der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH hinterlegt. Dabei hat die Kultur mit der Eintragungsnummer DSM ACC2055 die interne Nummer L87/4 und die Kultur mit der Eintragungsnummer DSM ACC2056 die interne Nummer L88/5.

Die hinterlegten stromalen Zellinien L87/4 und L88/5 unter­ scheiden sich in folgenden Eigenschaften:

• - Expression des T-Antigens:
  L87/4: geringe Expression (Passage 14)
  L88/5: starke Expression (Passage 14)
• - Integrationsort der viralen DNA:
  unterschiedliche Integrationsstellen im Genom
• - Konstitutive Faktorproduktion:
  L88/4: konstitutive Produktion von G-CSF und IL-
  L88/5: geringe konstitutive Produktion von G-CSF und IL-6.

Die Produktion von G-CSF und IL-6 ist in beiden Zellinien durch Bestrahlung induzierbar.

Im folgenden werden einige wichtige Anwendungsbeispiele für die Verwendung der Zellinien genannt.

Die stromalen Zellinien L87/4 und L88/5 können für alle Expe­ rimente verwendet werden, in denen Zellen gezüchtet werden sollen, die in Abhängigkeit von einem Feeder-Layer wachsen. Dies sind sowohl alle hämopoetischen Vorläufer- bzw. Stammzel­ len als Vorläuferzellen der Knochenbildung (Osteoklasten). Po­ sitive experimentelle Ergebnisse liegen bereits für das Wachs­ tum früher feeder-abhängiger B-Tumorzellen (BL70) auf der Li­ nie L88/5 sowie der Linie L87/4 vor.

Neben der Kultivierung normaler hämopoetischer Vorläuferzel­ len können die Linien L87/4 und L88/5 auch für die Analyse ma­ ligner Konchenmarkzellen aus Leukämiepatienten (CML, AML, ALL) unter Medikamenteneinfluß verwendet werden, was im Hinblick auf die autologe Knochenmarktransplantation von besonderer Be­ deutung ist. Experimentelle Schwankungen, die bislang aufgrund der Verwendung primärer Feederzellen aus unterschiedlichen Probanden auftraten, sind hierbei auszuschließen.

Neben ihrer Eignung als Feederzellen können die Linien L87/4 und L88/5 als Producerlinien für eine Reihe von Wachstumsfak­ toren verwendet werden. Bedeutung könnte hierbei die extrem hohe konstitutive Produktion von G-CSF der Linie L87/4 bzw. IL-6 der Linie L88/5 erlangen. Gezeigt werden konnte ferner eine bislang nicht definierte stark stimulierende Aktivität auf das Zellwachstum von 7TD1- bzw. NFS60-Zellen im konditio­ nierten Medium (= Zellkulturüberstand) von L88/5-Zellen.

Die Verwendung als Expressionszellinie für Gene die in Vekto­ ren kloniert sind die unter Kontrolle des großen T-Ag von SV40 replizieren ist ebenfalls möglich. Als Beispiel seien hier COS-Zeilen genannt.

Claims (8)

1. Stromale Zellinie aus menschlichem Knochenmark, welche in ihrem Genom virale DNA Sequenzen des Simian Virus 40 (SV- 40) enthält, dadurch gekennzeichnet, daß der Replikations­ ursprung des SV-40-Virus defekt ist.

2. Stromale Zellinie nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß ein Teil der späten SV-40-Gene, welche für die Hüllpro­ teine kodieren deletiert ist.

3. Stromale Zellinie nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekenn­ zeichnet, daß die viralen DNA Sequenzen des Simian Virus 40 mindestens die Bereiche enthalten, die für das T Antigen kodieren.

4. Stromale Zellinie nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wie sie unter der Eintragungsnummer DSM ACC2055 bei der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH hinter­ legt ist.

5. Stromale Zellinie nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wie sie unter der Eintragungsnummer DSM ACC2056 bei der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH hinter­ legt ist.

6. Verwendung einer stromalen Zellinie nach einem der Ansprü­ che 1 bis 5 als Feeder Layer für hämopoetische Zellen oder Osteoklastenvorläufer.

7. Verwendung einer stromalen Zellinie nach einem der Ansprü­ che 1 bis 5 zur Produktion von Wachstumsfaktoren.

8. Verwendung einer stromalen Zellinie nach einem der Ansprü­ che 1 bis 5 als Expressionszellinie für Gene, die in Vekto­ ren kloniert sind, die unter Kontrolle des großen T-Anti­ gens von SV-40 replizieren.