DE4122688A1 - Amidierte fibrinolytische enzyme und ihre vorlaeufer und verfahren zu ihrer herstellung - Google Patents

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft C-terminal amidierte Derivate des menschliches fibrinolytischen Enzyms Pro-urokinase, Vorläufer davon und Verfahren zu ihrer Herstellung, einschließlich rekombinante DNA-Technologien für die Herstellung dieser Vorläufer.

Als C-terminal amidierte Derivate von menschlicher Pro-urokinase sind entweder das natürliche Protein oder Modifikationen davon, wie Deletions-, Insertions- und Substitutionsmutanten davon mit einem amidierten Carboxyende in der Polypeptidkette in der Erfindung enthalten.

Solche amidierten Derivate können durch enzymatische Behandlung eines geeigneten Vorläufers erhalten werden, wobei ein zusätzlicher Glycinrest, beliebig gefolgt von einer kurzen Strecke von basischen Aminosäureresten am COOH-Ende vorhanden ist.

Die Erfindung umfaßt auch strukturelle Gene, die für diese Vorläufer kodieren, Vektoren, die diese Gene enthalten und geeignete Wirte, die durch diese Vektoren transformiert sind.

Die anwachsende Kenntnis der molekularen Wechselwirkungen, die die physiologische Fibrinolyse regulieren, hat zu wichtigen Folgerungen im Verständnis der Mechanismen, die Blutgerinnsel lösen, und in der Entwicklung neuer thrombolytischer Mittel geführt.

Im menschlichen fibrinolytischen System kann ein Proenzym, Plasminogen, durch verschiedene Arten von Plasminogenaktivatoren zum aktiven Enzym, Plasmin, aktiviert werden (Collen D. et al (1986) CRC Critical Reviews in oncology/hematology, 4 (3) 249; Verstraete M. et al (1986) Blood, 67 (6) 1529). Plasmin ist die Hauptprotease, die für den Abbau der Fibrinkomponente eines Blutgerinnsels verantwortlich ist (Rakoczi I. et al (1978) Biochim. Biophys. Acta. 540, 295; Robbins K.C. et al (1967) J. Biol. Chem. 242, 2333; Wiman B. (1977) Eur. J. Biochem. 76, 129).

Jedoch kann Plasmin auch seine proteolytische Wirkung auf einige Plasmaproteine, unter ihnen die Komponenten des Koagulationsweges Fibrinogen, Faktor V und VIII, ausüben und kann deshalb empfänglich für die Blutung sein (Collen D. et al (1986) CRC Critical Reviews on oncology/hematology, 4 (3) 249; Verstraete M. et al (1986) Blood, 67 (6) 1529; Wiman B. et al (1979) Biochim. Biophys. Acta 579, 142).

Die Aktivierung des Plasminogens kann auf systemischem Niveau stattfinden, was dazu führt, daß Plasmin, das schnell durch alpha2-Antiplasmin neutralisiert wird, zirkuliert und somit nicht für die Fibrinolyse verfügbar ist (Collen D. et al (1986) CRC Critical Reviews in oncology/hematology, 4 (3) 249; Verstraete M. et al (1986) Blood, 67 (6) 1529). Wenn das alpha2-Antiplasminniveau merklich reduziert ist, wird Plasmin weniger schnell neutralisiert und kann seine proteolytischen Wirkungen nicht nur auf Fibrin ausüben, sondern auch auf die Blutkoagulationsproteine, wie zuvor beschrieben. Übermäßiges Verringern von Fibrinogen, Faktor V und VIII in den Plasmakonzentrationen zusammen mit den inhibierenden Wirkungen, die von einigen der Fibrinogenabbauprodukte auf das Koagulationsverfahren, die Thrombocytenaggregation und Fibrinpolymerisation ausgeübt werden, führt zu einem hämostatischen Defizit und nachfolgend zu einem vergrößerten Blutungsrisiko (Latallo Z. S. et al (1973) Thrombos. Diath. Haemouh 56, 253; Totty W. G. et al (1982) Radiology 143, 59). Andererseits kann die Aktivierung des Plasminogens auf Fibrinniveau (fibringebundene Plasminogenaktivierung) stattfinden, und dies führt zu fibringebundenem Plasmin (Collen D. et al (1986) CRC Critical Reviews in oncology/hematology 4 (3) 249; Verstraete M. et al (1986) Blood, 67 (6) 1529), das stattdessen in wesentlich geringerem Ausmaß durch alpha2-Antiplasmin neutralisiert wird und systemische Fibrinogenolyse nicht induzieren kann.

Urokinase und Streptokinase, die in der konventionellen thrombolytischen Therapie beim Menschen am häufigsten verwendeten Plasminogenaktivatoren, haben keine spezifische Affinität für Fibrin. Beide Verbindungen aktivieren relativ unterschiedslos entweder zirkulierendes oder fibringebundenes Plasminogen (Zamarron C. et al (1984) Thromb. Haemostas. 52, 19; Samama M. et al (1985) Sem. Hop. Paris 61 (20), 1423). Deshalb trat systemisches hämostatisches Versagen oft während der Behandlung mit Streptokinase und Urokinase auf, und folglich hat das erhöhte Blutungsrisiko oft die weit verbreitete klinische Anwendung dieser thrombolytischen Mittel trotz ihrer nachgewiesenen klinischen Wirksamkeit gehemmt (Samama M. et al (1985) Sem. Hop. Paris 61 (20), 1423; Maizel A. S. et al (1986) Cardiovasc. Intervent. Radiol, 9, 236; Bell W. R. (1976) Thromb. Haemostas. 35, 57; Acar J. et al (1987) Seminars in Thromb. and Haemost. 13 (2) 186: Gruppo ltaliano per lo studio della Streptochinasi nell′infarto miocardico (GISSI) (1986) Lancet 1, 397).

Andererseits ist gezeigt worden, daß der Gewebetyp Plasminogenaktivator (t-PA) (Hoylaerts M. et al (1982) J. Biol. Chem. 257 (6) 2912) und kürzlich Pro-urokinase (proUK) (Husain S. S. et al (1983) Arch. Biochem. Biophys. 220, 31), die beide natürliche Proteine sind, schwache Aktivatoren des zirkulierenden Plasminogens sind und, entgegengesetzt hierzu, starke Aktivatoren des fibringebundenen Plasminogens sind.

Es wurde deshalb gezeigt, daß systemischer Plasminogen- und alpha2-Antiplasmin-Verbrauch wie auch Fibrinogenabbau in geringem Ausmaß bei "in vitro" und "in vivo" Experimenten mit Labortieren auftreten.

Beide Proteine sind deshalb dazu bestimmt, bei Patienten mit thrombolytischer Krankheit eine effizientere thrombolytische Wirkung über Streptokinase und Urokinase mit einem geringeren Blutungsvorkommen zu induzieren.

Die fibrinspezifische thrombolytische Aktivität von t-PA ist durch seine Fähigkeit, Fibrin durch spezifische Lysinbindungsstellen zu binden, wobei diese in den dreifach-Disulfid-gebundenen "Kringeldomainen" ("kringle domains") des Moleküls lokalisiert sind, erklärt worden. Folglich konnte das fibringebundene Plasminogen ohne signifikantes hämostatisches Versagen aktiviert werden (Collen D. et al (1986) Haemostasis, 16 (3), 25).

Andererseits bindet proUK (auch als einzelkettiger Urokinasetyp Plasminogenaktivator scu-PA bezeichnet) nicht an Fibrin, jedoch zeigt es fibrinspezifische thrombolytische Aktivität ohne systemischen hämostatischen Verbrauch (Pannell R. et al (1986) Blood 67, 1215; Gurewich V. et al (1987) Seminars in Thromb. and Haemost. 13 (2), 146; Lÿnen H. R. et al (1986) J. Biol. Chem. 261, 1253).

Umfassende Forschung ist im Hinblick auf Isolierung und Charakterisierung von menschlichen Genen, die diese Proteine kodieren und anschließende Produktion mittels rekombinanter DNA-Technologie durchgeführt worden (Collen D. et al (1984) J. Pharmacol. Exp. Ther. 231 (1), 146; Holmes W. E. et al (1985) Biotechnology 3, 923). Rekombinantes t-PA wurde zahlreichen klinischen Versuchen mit Patienten mit akutem myokardischen lnfarkt ausgesetzt und es zeigte sich, daß es beträchtlich effektiver als Streptokinase bei der Rekanalisation von verstopften Koronararterien ist (The European Cooperative Study Group for Recombinant Tissue-type Plasminogen Activator (1985) Lancet 1, 842; Sheehan F. H. et al (1987) Circulation 75, (4), 817).

Pro-urokinase befindet sich augenblicklich in den Phase II klinischen Versuchen und ist mindestens ebenso effektiv wie t-PA im Hinblick auf thrombolytische Aktivität und Sicherheit (Van de Werf F. et al (1986) Annals of Internal Medicine, 104, 345; Van de Werf F. et al (1986) Circulation 74 (5), 1066).

Viele biologisch aktive Peptide sind an ihrem COOH-Ende durch Amidierung geschützt, und für die meisten von ihnen ist die Amidbildung für die Rezeptorerkennung und/oder Bioaktivität wesentlich (J. H. Rehfeld (1981) Am. J. Physiol. 240, 6251-6266). COOH-terminale Amidierung (oder α-Amidierung) verleiht Stabilität gegenüber den meisten Carboxypeptidasen und kann möglicherweise eine verlängerte Halbwertzeit, eine Veränderung der biologischen Aktivität, Rezeptorselektivität, Zellpermeabilität, Gewebeverteilung etc. bewirken (G. S. Wand et al (1985) Neuroendocrinol. 41, 482-489).

α-Amidierung stellt eine der Posttranslations-Modifikationen von Sekretpeptiden in eukaryontischen Organismen dar. Sie kann mittels eines Enzyms, bezeichnet als Peptidylglycin α-amidierende Monooxygenase (PAM), das COOH-terminal glycinverlängerte Peptide in die entsprechenden des-Glycin α-amidierten Peptide unter gleichzeitiger Bildung von Glyoxalsäure umwandelt, durchgeführt werden (A. F. Bradbury et al (1982), Nature 289, 686-688). Die katalytische Reaktion tritt in Anwesenheit von Sauerstoff auf und benötigt Kupferkation und Ascorbat als Kofaktoren (B. Eipper et al (1983), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80, 5144-5148) .

Bei dem biosynthetischen Verfahren wird das Gly-verlängerte Peptid (Substrat für das α-amidierende Enzym) aus Vorläufermolekülen durch proteolytische Spaltung, vermittelt durch eine spezifische, Carboxypeptidase B-ähnliche Protease, erzeugt. Solche Vorläufer bieten 1 bis 4 zusätzliche basische Aminosäurereste unmittelbar im Anschluß an das Gly-verlängerte Ende des Peptids (R. E. Mains et al (1983) T. I. N. S. 229-235). Es ist vorgeschlagen worden, daß diese basischen Reste in die Erkennung durch spezifisches α-amidierendes Enzym (spezifische α-amidierende Enzyme) verwickelt sind und/oder an dem Amidierungsmechanismus teilnehmen (S. Gomez et al (1984) FEBS Lett. 167, 160-164).

Die vorliegende Erfindung betrifft COOH-terminal amidierte Derivate des menschlichen fibrinolytischen Enzyms Pro-urokinase, Vorläufer davon und Verfahren zu ihrer Herstellung, einschließlich rekombinanter DNA-Technologien für die Herstellung dieser Vorläufer. Auch strukturelle Gene, die für diese Vorläufer kodieren, Vektoren, die diese Gene enthalten, und geeignete Wirte, transformiert durch diese Vektoren, sind im Umfang der Erfindung enthalten.

Eine erste Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, ein COOH-terminal amidiertes Derivat von menschlicher Pro-urokinase mit der Formel (I)

P-CONH₂ (I)

in der P den Teil der menschlichen Pro-urokinase oder einer Modifikation davon darstellt, der dem Carboxyende des Moleküls vorangeht, zur Verfügung zu stellen.

Eine Modifikation von Pro-urokinase kann beispielsweise eine Deletions-, Insertions- oder Substitutionsmutante davon sein.

Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht darin, Vorläufer von COOH-terminal amidierten Derivaten der Formel (I) zur Verfügung zu stellen, die die Formel (II)

P-Gly-Yn (II)

in der P wie zuvor definiert ist, Gly der Glycinrest ist, Y ein basischer Aminosäurerest und n Null oder eine ganze Zahl von 1 bis 4 ist, haben.

Wenn n eine ganze Zahl von 2 bis 4 ist, können die Y-Reste gleich oder unterschiedlich sein.

Beispielsweise kann, wenn n gleich 2 ist, Yn beispielsweise entweder Lys-Arg oder Arg-Arg sein.

Eine weitere Aufgabe der Erfindung besteht darin, ein Verfahren zum Erhalten eines COOH-terminal amidierten Derivats der Formel (I) zur Verfügung zu stellen, das die enzymatische Umwandlung der in Formel (II) definierten Vorläufer umfaßt.

Diese können in die entsprechend amidierten Polypeptide durch Einwirkung eines amidierenden Enzyms, wie beispielsweise natürliche oder rekombinante Peptidyl-glycin α-amidierende Monooxygenase (PAM) umgewandelt werden, eingeleitet (wenn n verschieden von Null ist) durch proteolytische Spaltung der Yn-verlängerten Vorläufer mit beispielsweise Carboxypeptidase B, um Yn-basische Aminosäurereste zu eliminieren.

Darüber hinaus umfaßt die Erfindung ein rekombinantes DNA-Verfahren zum Herstellen der Verbindungen der Formel (II) als mögliche Vorläufer für die in vivo Amidierung (G. Gafvelin et al (1984) FEBS. Lett. 184, 347-352).

Gemäß diesem Verfahren sind die Vorläufer durch Oligonucleotid gesteuerte Mutagenese des Pro-urokinase Gens und anschließender Einführung der mutierten Gene in einen geeigneten Expressionsvektor, der die Synthese der neuen Vorläufer in einem passenden Wirtsorganismen lenken könnte, konstruiert.

Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist durch die Gene konstituiert, die die chemisch synthetisierten Polynucleotide enthalten, die für die durch Formel (II) dargestellten Aminosäuresequenzen kodieren.

In einem weiteren Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung Expressionsvektoren, die diese Gene tragen und geeignet sind, die Synthese der in Formel (II) definierten Pro-urokinase Vorläufer zu lenken.

Die Erfindung betrifft auch die Wirtsmikroorganismen, die durch die Expressionsvektoren transformiert sind und somit die Vorläufer der Formel (II) produzieren.

Die pharmazeutischen Zusammensetzungen, die eine Verbindung der Formel (I) oder eine Verbindung der Formel (II) und einen oder mehrere pharmazeutisch geeignete Träger und/oder Verdünnungsmittel und/oder Bindemittel enthalten, liegen auch im Umfang der Erfindung.

Diese Zusammensetzungen können auf konventionelle Art unter Verwendung konventioneller Bestandteile und konventioneller Verfahren hergestellt werden. Pro-urokinase (proUK) ist eine Serinprotease aus 411 Aminosäureresten, die, wie die meisten Proteine, mit einer freien Carbonsäure endet (Holmes W. E. et al (1985) Biotechnology 3, 923). Gemäß der Erfindung ist die Pro-urokinase vorzugsweise die rekombinant hergestellte Verbindung. Weil der letzte Aminosäurerest Leucin ist, kann er nicht durch PAM-Enzym amidiert werden. Um proUK in amidierter Form durch dieses Verfahren zu erhalten, ist es deshalb notwendig, einen Glycinrest an das C-Ende anzufügen.

a) Herstellung der Amidierungsvorläufer der Formel (II) mittels rekombinanten DNA-Verfahren

Die Vorläufer der amidierten Pro-urokinase Derivate der Formel (I), d. h. Verbindungen der Formel (II), wurden durch Oligonucleotid gesteuerte Mutagenese des Pro-urokinase Gens konstruiert.

Alternativ können Gene, die für Deletions-, Insertions- oder Substitutionsmutanten der Pro-urokinase kodieren, wie beispielsweise diejenigen, die in der Europäischen Patentanmeldung Nr. 3 38 409 beschrieben sind, als Ausgangsmaterial verwendet werden.

Das Prinzip des Mutageneseverfahrens bestand darin, Pro-urokinase oder das Mutantengen in einen Vektor zu subklonieren, der in einzelsträngiger Form erhalten werden kann, wie der Phagenvektor M13. Der rekombinante Einzelstrang wurde mit einem komplementären synthetischen Oligodeoxyribonucleotid, das die COOH-verlängerte Kodierungssequenz enthielt, reassoziiert. DNA Polymerase und Ligase wurden dann verwendet, um den neuen Strang zu verlängern und ihn in einer zirkulären Form zu ligasieren. Die neu geschaffene Heteroduplex DNA wurde verwendet, um eine Zellinie zu transformieren, in der sie repliziert wurde und eine Nachkommenschaft lieferte, wobei der Phage, der das ursprüngliche proUK Gen oder das Gen mit der gewünschten Insertion trug, in zwei unterschiedliche Molekulararten abgesondert wurde. Das mutagene Ausgangsoligonucleotid wurde dann als Sonde verwendet, um das neu synthetisierte Vorläufergen zu erkennen. Solch ein Verfahren ist in der Literatur, aus der mehr experimentelle Details erhalten werden können, häufig beschrieben (Zoller M. J. et al (1982) Nucleic Acid Research 101, 6487).

Das Vorläufergen wurde anschließend in einen geeigneten Expressionsvektor eingefügt, der die Synthese des neuen proUK Derivats in einem geeigneten Wirtsmikroorganismus wie einem Prokaryonten, beispielsweise E. coli und B. subfilis, oder einem Eukaryonten, beispielsweise S. cerevesiae, Insekt- oder Säugerzellinie steuern konnte.

Die sich ergebenden Transformanten, die das Vorläufergen trugen, wurden kultiviert, und somit die Expression der Mutante bewirkt. Unter Verwendung eines Standardverfahrens wurde die proUK Mutante, die als Substrat für die Amidierungsreaktion verwendet worden ist, extrahiert und gereinigt.

Bakterien, insbesondere beispielsweise E. coli, sind bevorzugt als Wirtsmikroorganismus. Für die Expression in E. coli wurde das schon in der internationalen Patentanmeldung Nr. PCT/WO 90/04 023 beschriebene Plasmid pFC 44 verwendet, dessen Konstruierung unter Beispiel I im nachfolgenden beschrieben ist. Dieses Plasmid ist in Fig. 7 gezeigt. Unter Verwendung traditioneller Genmanipulationstechniken (Maniatis T. et al (1982) Molecular cloning; A laboratory manual; Cold Spring Harbour) wurde das in pFC44 eingefügte proUK Wildtypgen durch ein mutiertes, das für die COOH-verlängerte Pro-urokinase kodierte, ersetzt.

In einer spezifischen Ausführungsform stellt die Erfindung ein neues Plasmid, genannt pPUK-Gly, zur Verfügung, wobei das Pro-urokinase Wildtypgen oder dessen Mutante, die für ein Deletions-, Insertions- oder Substitutions-Pro-urokinase Derivat kodiert, durch eine neue ersetzt worden ist, die für eine glycinverlängerte Mutante kodiert.

Im Anschluß an die Insertion in E. coli Wirtszellen und die Kultivierung der sich ergebenden Transformanten wurde eine hohe Expressionsstärke der Mutante erhalten. Die Bedingungen für die Transformation und Kultivierung entsprechend den zuvor in der internationalen Patentanmeldung Nr. PCT/WO 90/04 023 veröffentlichten und den unter Beispiel II nachfolgend beschriebenen.

Unter Verwendung von Standardtechniken wurde anschließend die proUK Mutante, die als Substrat für das amidierende Enzym verwendet worden ist, extrahiert und gereinigt.

Mittels der gleichen Techniken, die für das Herstellen des Gly-verlängerten Pro-urokinase Vorläufers (Formel (II), n=Null) verwendet worden sind, konnten auch Vorläufer, die zusätzliche basische Reste am C-Ende (Formel (II), n=1-4) tragen, hergestellt werden.

Beispielsweise wurden die folgenden spezifischen Moleküle erhalten: proUK-Gly-Lys-Arg und proUK-Gly-Arg-Arg.

Auch in diesem Fall wurden für die Expression in E. coli Zellen die Gene, die für diese Vorläufer kodieren, in das Plasmid pFC44 eingefügt, wobei das proUK Wildtypgen ersetzt wurde.

b) Enzymatische Umwandlung von pro-UK-Gly-Y_n in pro-UK-NH₂

Der pro-UK-Gly-Y_n-OH Vorläufer wurde mit einer semigereinigten proteasefreien Herstellung von PAM-Enzym, wie derjenigen von Rattenmark-Schilddrüsenkarziniom (rat medullary thyroid carcinoma) (N.M. Mehta et al (1988) Arch. Biochem. Biophys. 261, 44-54) oder der aus konditioniertem Medium aus Zellen, abgeleitet von diesem Tumor (J. P. Gilligan et al (1989) Endocrinol. 124, 2729-2736) in Anwesenheit (für n verschieden von Null) oder in Abwesenheit (für n gleich Null) von Carboxypeptidase B (Boehringer Mannheim) (E/S, 1 : 2000 bezogen auf das Gewicht) inkubiert.

Die enzymatische Reaktion wurde in einem wäßrigen Puffer wie TES bei pH 7, der Kupferion, Ascorbat, Katalase, Kaliumjodid, SDS und Tween 20 enthielt, durchgeführt.

Alternativ wurde die Amidierung auf S-sulphoniertem pro-UK-Gly-Y_n durchgeführt, und es war keine Hinzugabe von SDS erforderlich.

In allen Fällen wurde das Ausmaß der Amidierung mit Hilfe des Corbett und Corbett-Verfahrens (J. Org. Chem. (1980), 45, 2834-2839), bezogen auf die Bestimmung von Glyoxalsäure nach Derivatisierung mit Nitrosobenzol, berechnet.

Das amidierte Produkt wurde anschließend mittels traditioneller Verfahren gereinigt.

Die Genauigkeit des C-Endes wurde mit Carboxypeptidase Y (CP-Y) Behandlung (Freigabe von Leu, Ala, Gly und Asn) überprüft. Es wurde keine Aminosäurefreigabe nach Behandlung mit CP-A beobachtet und somit bestätigt, daß das gesamte Produkt in amidierter Form vorlag.

Mittels analoger Verfahren konnte die Amidierung bei den zuvor unter a) erwähnten Deletions-, Insertions- und Substitutionsmutanten der Pro-urokinase durchgeführt werden.

c) Biologische Aktivität

Entweder die in Formel (I) definierten Verbindungen oder diejenigen der Formel (II) können eine geeignete Anwendung in dem gleichen therapeutischen Bereich finden, in dem die Pro-urokinase aktiv ist, beispielsweise bei der Behandlung von akutem myokardialem Infarkt, Lungenembolismus oder tiefer venöser Thrombose. Ähnlich der natürlichen Pro-urokinase haben die erfindungsgemäßen amidierten Derivate und ihre Vorläufer eine größere Affinität gegenüber plasminogengebundenem Fibrin in Blutgerinnseln als gegenüber zirkulierendem Plasminogen und sind deshalb durch eine mit der Behandlung verbundene hohe Thromboseselektivität und reduziertem Blutungsrisiko charakterisiert. Zusätzlich konnten die COOH-terminal amidierten Verbindungen verbesserte Eigenschaften gegenüber den entsprechenden nichtamidierten Enzymen aufweisen, beispielsweise eine vergrößerte Stabilität gegenüber den meisten Carboxypeptidasen und eine verlängerte Halbwertzeit.

Die in Formel (II) definierten Verbindungen, insbesondere die Verbindungen der Formel (II), in der n eine ganze Zahl von 1 bis 4 ist, können potentielle Vorläufer für die in vivo Amidierung sein.

Beispiel I - Konstruktion des Plasmids pFC44

Um das Expressionsplasmid pFC44 zu erhalten, ist es notwendig, die folgenden Verfahrensschritte durchzuführen:

1) Klonen des menschlichen cDNA Gens, das für Pro-urokinase kodiert

Um den cDNA Klon, der für menschliche Pro-urokinase kodiert, zu erhalten, haben die Autoren die in der Literatur veröffentlichten Proteinsequenzdaten verwendet (Günzler W. A., Steffens G. J., Oetting F., Kim SM. A., Frankus E. und Flohe L.: Hoppe-Seyler′s Z. Physiol. Chem. 363, S. 1155, 1982; Günzler W. A., Steffens G. J., Oetting F., Buze G. und Flohe L.: Hoppe-Seyler′s Z. Physiol. Chem. 363, S. 133, 1982; Steffens G. J., Günzler W. A., Oetting F., Frankus E. und Flohe L.: Hoppe-Seyler′s Z. Physiol. Chem. 363, S. 1043, 1982). Es sind entsprechend spezifische Sonden hergestellt worden und eine geeignete cDNA Bibliothek ist überprüft worden. Oligonucleotide, die für ausgewählte Peptide des einzelkettigen Urokinasetyp Plasminogenaktivators (proUK) kodieren, wurden chemisch synthetisiert (Caruthers M. H., Gassen H. G. und Lang J. A. (eds) Verlag-Chemie, Weinheim, Deefield Beach, Basel, S. 71, 1982), um als spezifische Sonden zu dienen, die die Anreicherung von proUK mRNA anzeigen und um Klone, die Pro-urokinase cDNA aus einer angereicherten cDNA Bibliothek enthalten, auszuwählen. Die Oligomere hatten eine Länge von 14 bis 17 Monomereinheiten (mer) und jedes wurde entweder als einzige Sequenz (bezeichnet p7) oder in Poolen, enthaltend zwei (bezeichnet p1, p2, p3) oder 16 (bezeichnet p16) Oligonucleotide, wie in Fig. 1 angegeben, synthetisiert. Die Oligomere wurden auf ihre Spezifität gegenüber proUK mittels Northern Hybridisierung untersucht. Für diese Analyse wurde polyA-haltige RNA aus HEp-3 epidermoidem Karzinom extrahiert (Miskin R., Haemostasis (Schweiz), 11, Nr. suppl 1, S. 63, 1982). Für jedes Oligomer wurde die Temperatur des Waschens, das auf die Hybridisierungsreaktion folgte, so eingestellt, daß sie 2 bis 5°C unterhalb der minimalen Schmelztemperatur lag, die gemäß Suggs et al für die Hybridisierung von Southern Blots berechnet worden war (Suggs S. V., Hirose T., Miyake T., Kawashima E. G., Johnson M. Y., Itakura K. und Wallach R. B.: Developmental Biology Using Purified Genes; Brown D. D. und Fox C. F. (eds) Academic Press, New York, S. 638, 1981). Die in Fig. 1 gezeigten fünf proUK Sonden reagierten mit einer gemeinsamen Hauptkarzinom mRNA Bande von 2,3 kb, welches der für proUK mRNA erwarteten Größe entspricht.

Die Klonierung fand unter Verwendung angereicherter mRNA Fraktionen aus HEp-3 epidermoidem Karzinom statt. Die RNA Herstellungen wurden extrahiert und um ungefähr das 3fache auf zwei aufeinanderfolgenden Sucrosegradienten angereichert. cDNA wurde gemäß den veröffentlichten Verfahren (Efstratiadis A., Kafatos F. C., Maxam A. M. und Maniatis T.: Cell, 7, S. 279, 1976; Buell G. N., Wickens M. P., Payvar F. und Schimke R. T. J.: Biol. Chem. 253, S. 2471, 1978) unter Verwendung von oligo-dT als Primer synthetisiert. Längere Moleküle wurden unter Verwendung von Polyacrylamidgel-Elektrophorese und anschließender Elektroelution der entsprechenden Gelfraktionen isoliert. Die cDNA wurde dann unter Verwendung von Standard-Phenol/Chloroform-Extraktion gefolgt von Ethanolfällung extrahiert.

Die cDNA Moleküle wurden zuerst an EcoRI Linker gebunden und anschließend in den Phagen lambda-gt10 Vektor gemäß einer Modifikation der Technik von Davis (Maniatis T., Fritsh E. F., Sambrook J.: Molecular cloning. A laboratory manual, Cold Spring Habour Laboratory, Cold Spring Harbour, NY, 1982) geklont. Auf diese Weise wurde eine Bibliothek, die 2×10⁵ pbe (plaquebildende Einheiten) enthielt, konstruiert.

Die Hälfte der Bibliothek wurde auf Duplikatfiltern (duplicate filters) untersucht, ein Filter mit P³² markierter Sonde p1 und der Gegenfilter mit einer Mischung aus den Sonden p3 und p6. Insgesamt wurden 36 positive Klone erhalten, von denen sieben positiv in den Duplikatfiltern waren, was somit cDNA Insertionen entsprechend einem großen Teil der proUK Kodierungssequenz anzeigt.

Rekombinante Phagen, die Mit den 3 Sonden hybridisierten, waren Plaques, gereinigt unter Verwendung der Sonde p1 und weiterhin charakterisiert durch Restriktionskartierung mit EcoRI und durch DNA Sequenzierung. Der Teil der positiven Klone in der gesamten cDNA Bibliothek zeigte an, daß die Häufigkeit der Pro-urokinase mRNA in dem HEp-3 Karzinom ungefähr 0,01%; betrug.

Die Sequenzanalyse der vier proUK cDNA Klone ergab, daß drei der Klone Deletionen oder Sequenzen hatten, die nicht mit der Aminosäuresequenz des Enzym übereinstimmten. Nur ein Klon, lambda-Uc17, hatte eine Sequenz in vollständiger Ubereinstimmung mit der bekannten Aminosäuresequenz. Jedoch umfaßte lambda-Uc17 nicht das gesamte 3′ Nichtkodierungsende der mRNA und es fehlten 30 Nucleotide der Kodierungssequenz. Die volle Länge des prä-Pro-urokinase cDNA Klons wurde durch Ligasierung eines 1325 bp lambda-Uc17 SmaI-BamHI Fragments, das den 5′ nichtkodierenden Bereich und den größten Teil der Kodierungssequenz enthielt, mit einem BamHI-EcoRI Fragment, das den restlichen fehlenden 3′ Bereich aus einem anderen Klon lambda-Uc6 enthielt, konstruiert (Fig. 2).

Diese Struktur wurde in die SmaI-EcoRI Stelle des Plasmidvektors pUN121 (Nilsson B., Uhlen M., Josephson S., Gatenbeck S. und Philipson L.: Nucleic Acid Research 11, S. 8019, 1983) gebunden und somit das meiste des Cl Gens isoliert und als pcUK176 bezeichnet (Fig. 3).

Die DNA Sequenz des vollständigen cDNA Klons ist in Fig. 4 dargestellt. Sie besteht aus 2296 Nucleotiden einschließlich 69 nichtkodierenden Nucleotiden am 5′ Ende, 1296 kodierenden Nucleotiden und 9331 nichtkodierenden Nucleotiden am 3′ Ende, gefolgt von einem poly(A)-Schwanz aus mehr als 80 Resten. Die Kodierungssequenz beginnt mit 60 bp, kodierend für 20 Aminosäuren, enthaltend die "prä-Pro-urokinase" (Heyneker H. L., Holmes W. E. und Vehar G. A. (1983); Europäische Patentanmeldung Veröffentlichungsnr. 00 92 182) und daran schließt sich die Sequenz an, die für das gesamte Pro-urokinase Protein kodiert, und die in vollständiger Übereinstimmung mit der Aminosäuresequenz ist. Das vollständige Fragment ist mittels Sequenz- und Restriktionsanalyse untersucht worden. Die für die reife Pro-urokinase kodierende Sequenz ist in den für die Herstellung verwendeten Expressionsvektor eingefügt worden.

2) Konstruktion des proUK Expressionsplasmids

Die ursprüngliche cDNA voller Länge, die in pcUK176 vorhanden ist, wurde verwendet, um das Pro-urokinase Expressionsplasmid pFC44 zu konstruieren, in dem das proUK Gen unter Transkriptions- und Translationskontrolle des Promotors Ptrp bzw. der "Shine-Dalgarno" Sequenz MS-2 ist. Das Plasmid pFC44 ist in Fig. 7 dargestellt.

Um pFC44 zu erhalten, wurden verschiedene Intermediärplasmide konstruiert. Beginnend mit pDS20 (Fig. 5) (Duester G., Helfard R. M. und Holmes W. M.: Cell 30, S. 855, 1982) wurde zuerst das EcoRI-HindIII Fragment, das für den Galactoseoperonpromotor Pgal kodiert, durch die EcoRI-HindIII Polylinkersequenz aus dem M13 mp8 Vektor ersetzt (Vieira J. und Messing I.: Gene, 19, S. 259, 1982), wobei ein neues Plasmid erhalten wurde, das als pAB1 bezeichnet wurde (Fig. 5).

Der Promotor Ptrp ist aus dem Plasmid pDR720 (gekauft von Pharmacia) als ein EcoRI-SalI Restriktionsfragment erhalten worden. Dieses Fragment ist in den Polylinkerbereich von pABl zwischen der EcoRI und SalI Stelle eingefügt worden. Dadurch wurde ein neues Plasmid, das als pFC10 bezeichnet wurde (Fig. 5) erhalten. pFC10 kann als Grundvektor (base vector), in den das proUK Gen wie auch die "Shine-Dalgarno" Sequenz aus dem Phagen MS-2 eingefügt worden ist, angesehen werden. Um Expression von reifer Pro-urokinase zu erreichen, ist es notwendig, die proUK Kodierungssequenz ab dem ersten Kodon des reifen Proteins an das Initiatortriplett ATG zu schmelzen. Anschließend muß dieser Fusion die "Shine-Dalgarno" Sequenz vorangestellt werden.

Die Ribosombindungsstelle (RBS) aus dem bakteriellen Phagen MS-2 war bekannt und seine Nucleotidsequenz ist schon veröffentlicht worden (Fiers W., Contreras R., Duerinck F., Haegeman G., Iserentant D., Merregaert J., Min Jou W., Molemans F., Raeymaekers Ä., Van den Berghe A., Volckaert G. und Ysebaert M.: Nature, 260, S. 500 (1976)).

Man nimmt an, daß sie ein starkes Signal für eine wirksame Translation der mRNA ist. Deshalb wurde dieser Bereich als Translationssignal für die Herstellung von proUK gewählt. Um die korrekte Nucleotidverschmelzung mit dem proUK Gen zu erhalten, wurde ein doppelsträngiger DNA Bereich des MS-2 RBS direkt an dem Beginn des proUK Gens gebunden, synthetisiert. Eine TaqI Stelle ist an dem 25. Nucleotid der reifen proUK Sequenz vorhanden. Aus dieser Stelle wurde Nutzen gezogen und mittels chemischer Synthese die folgende DNA Sequenz isoliert:

die stromaufwärts von einer HindIII Stelle und stromabwärts von einer TaqI Stelle flankiert ist. Das Initiatorkodon ATG ist hervortretend dargestellt. Die Sequenz, die für den Beginn der reifen proUK Sequenz kodiert, ist unterstrichen.

Das synthetische Fragment ist in einer Ligasierungsreaktion mit den beiden nachfolgenden Restriktionsfragmenten verwendet worden:

• - das TaqI-BgIII Fragment aus pcUK176 (Fig. 3), das die proUK Sequenz vom Nucleotid 155 bis zum Nucleotid 392 trägt (siehe Fig. 4):
• - das große BamHI-HindIII Fragment aus pFC10 (Fig. 5), das die antibiotische Resistenz gegenüber Ampicillin wie auch den Promotor Ptrp trägt.

Durch diese Konstruktion wurde ein neues Plasmid isoliert, das mit pAB8 bezeichnet wurde, dessen schematische Karte in Fig. 6 dargestellt ist. Bei diesem Plasmid sind der Promotor Ptrp und MS-2 RBS an die ersten 260 Nucleotide des reifen proUK Gens (entsprechend den Nucleotiden 131-391 in Fig. 4) geschmolzen. Zusätzlich hat pAB8 eine einzige NcoI Stelle, in die der Rest der proUK Sequenz durch ein NcoI-NcoI Restriktionsfragment aus pcUK176 eingefügt wurde, wobei das Plasmid pFcl6 erhalten wurde. Diese Ligasierung hat die Duplikation eines NcoI-BgIII Fragments stromabwärts des proUK Gens in dem nichtkodierenden Bereich bewirkt. Jedoch hat diese Duplikation keinen Einfluß auf die Plasmidstabilität. Durch diese Konstruktion können Signale jetzt die Synthese der vollständigen proUK Sequenz steuern (siehe Fig. 6).

Alle diese insoweit beschriebenen Plasmide wurden in dem E.coli K-12 Wirtsstamm C-600 galK (ATCC 33955) auf der Grundlage der Ampicillinresistenz ausgewählt. Tatsächlich tragen sie das Gen, das für ß-Lactamase, das für den Abbau des antibiotischen Ampicillins im Kulturmedium verantwortliche Enzym, kodiert. Frühe Experimente haben gezeigt, daß pFC16 erfolgreich in E.coli Typ B Stämme eingeführt werden kann und eine hohe Produktionsstärke von rekombinantem proUK bewirkt.

Um jedoch mit den internationalen Richtlinien für die Herstellung von Produkten, abgeleitet von rekombinanter DNA, übereinzustimmen, wurde pFC16 so modifiziert, daß ein Tetracyclin-resistentes Plasmid geschaffen wurde, das sich dazu eignet, das proUK Gen in hohem Maß zu exprimieren. Insbesondere wurde aus dem gut bekannten Plasmid pBR322 (Maniatis T., Fritsch E. F., Sambrook J.: Molecular cloning, A laboratory manual. Cold Spring Harbour Laboratory. Cold Spring Harbour, NY. 1982) (Fig. 6) ein EcoRI-AvaI Fragment isoliert, bei dem die klebrigen Enden unter Verwendung des Klenow-Fragments aus DNA Polymerase 1 (Perbal B., Wiley A.: Interscience Publication John Wiley and Sons, S. 231, 1984) ausgefüllt wurden. Dieses Fragment wurde an das größere AatII-PvuI Fragment aus pFC16 gebunden, dessen Enden durch DNA Polymerase 1 (Perbal B., Wiley A.: Interscience Publication John Wiley and Sons, S. 231, 1984) glatt gemacht worden waren. Somit wurde der aminoterminale Teil des β-Lactamasegens und seine Kontrollsequenz durch das Tetracyclin-Resistenz-Gen ersetzt. Nach der Ligasierung befindet sich das Tetracyclin-Resistenz-Gen in der gleichen Orientierung wie das proUK Gen.

Darüber hinaus ist eine neue EcoRI Stelle an der Verbindung zwischen den PvuI und EcoRI Stellen, zuvor eingefüllt, geschaffen worden. Das so erhaltene Plasmid ist pFC44 (Fig. 7).

Beispiel II - Transformation der E. coli Typ Stämme

Verschiedene Typ B Stämme von E. coli sind verfügbar und können für die erfolgreiche Expression des COOH-verlängerten proUK Gens verwendet werden. Bevorzugte Stämme sind ATCC 12407, ATCC 11303, NCTC 10537. Im nachfolgenden ist ein Beispiel für die Transformation des Stammes NCTC 10537 mit dem Plasmid pPUK-Gly und anschließende Kultivierung des Transformanten aufgeführt.

Entsprechende Zellen des Stammes NCTC 10537 wurden unter Verwendung des Calciumchloridverfahrens von Mandel und Higa (Mandel M. und Higa A.: J. Mol. Bio. 53, S. 154, 1970) hergestellt. Es wurden ungefähr 200 µl einer Präparation dieser Zellen mit 1×10⁹ Zellen pro Milliliter mit 2 µl Plasmid DNA (ungefähre Konzentration 5 µg/ml) transformiert. Transformanten wurden auf Platten aus L-agar, enthaltend 12,5 µg/ml Tetracyclin ausgewählt. Zwei schmale Kolonien wurden mit hölzernen Zahnstochern (jede als drei Striche von ungefähr 1 cm Länge) auf L-agar, enthaltend das gleiche Antibiotikum, ausgestrichen. Nach 12stündiger Inkubation bei 37°C wurden Teile der Striche auf Gly-verlängerte Pro-urokinase Herstellung durch Beimpfen von 10 ml LB Medium (enthaltend Tetracyclin bei einer Konzentration von 2,5 µg/ml) untersucht und über Nacht bei 37°C inkubiert. Am folgenden Tag wurden die Kulturen 1 : 100 in M9 Medium, das die gleiche Konzentration an Tetracyclin enthielt, 6 Stunden lang bei 37°C inkubiert.

Claims (22)

1. COOH-terminal amidiertes Derivat von menschlicher Pro-urokinase der Formel (I): P-CONH₂ (I)in der P den Teil der menschlichen Pro-urokinase oder einer Modifikation davon darstellt, der dem Carboxyende des Moleküls vorausgeht.

2. Derivat nach Anspruch 1, das COOH-terminal amidierte menschliche Pro-urokinase ist.

3. Derivat nach Anspruch 1, das eine COOH-terminal amidierte Deletions-, Insertions- oder Substitutionsmutante von menschlicher Pro-urokinase ist.

4. Vorläufer eines COOH-terminal amidierten Derivats von menschlicher Pro-urokinase nach Anspruch 1 mit der Formel (II): P-Gly-Yn (II)in der P wie in Anspruch 1 definiert ist, Gly ein Glycinrest ist, Y ein basischer Aminosäurerest und n Null oder eine ganze Zahl von 1 bis 4 ist.

5. Vorläufer nach Anspruch 4, bei dem P menschliche Pro-urokinase ist.

6. Vorläufer nach Anspruch 4, bei dem P eine Deletions-, Insertions- oder Substitutionsmutante von menschlicher Pro-urokinase darstellt.

7. Vorläufer nach einem der Ansprüche 4, 5 und 6, wobei Y Lysin oder Arginin ist.

8. Vorläufer nach Anspruch 4, wobei Yn Lys-Arg ist.

9. Vorläufer nach Anspruch 4, wobei Yn Arg-Arg ist.

10. Verfahren um ein COOH-terminal amidiertes Derivat der Formel (I) nach Anspruch 1 zu erhalten, das die enzymatische Umwandlung aus einem entsprechenden Vorläufer der Formel (II) nach Anspruch 4 umfaßt.

11. Verfahren nach Anspruch 10, umfassend die enzymatische Umwandlung der Verbindung der Formel (II) nach Anspruch 4, wobei n Null ist, mittels eines amidierenden Enzyms.

12. Verfahren nach Anspruch 10, umfassend die enzymatische Umwandlung einer Verbindung der Formel (II) nach Anspruch 4, wobei n eine ganze Zahl von 1 bis 4 ist, durch kombinierte Wirkung eines amidierenden Enzyms und der Carboxypeptidase B.

13. Verfahren nach Anspruch 11 oder 12, wobei das amidierende Enzym Peptidylglycin α-amidierende Monooxygenase ist.

14. Rekombinantes DNA-Verfahren zum Herstellen eines Vorläufers der Formel (II) nach Anspruch 4, umfassend die Oligonucleotid gesteuerte Mutagenese von menschlichem Pro-urokinase Gen und anschließende Insertion der mutierten Gene in einen geeigneten Expressionsvektor, der die Synthese der neuen Vorläufer in einem passenden Wirtsmikroorganismus steuern könnte.

15. Verfahren nach Anspruch 14, bei dem der Expressionsvektor das Plasmid pPUK-Gly und der Wirtsmikroorganismus E.coli ist.

16. Gen umfassend ein chemisch synthetisiertes Polynucleotid, das für einen Pro-urokinase Vorläufer, wie in Formel (II) nach Anspruch 4 definiert, kodiert.

17. Expressionsvektor, der ein Gen nach Anspruch 16 trägt und geeignet ist, die Synthese eines Pro-urokinase Vorläufers mit der Formel (II) nach Anspruch 4 zu leiten.

18. Expressionsvektor pPUK-Gly.

19. Einzelliger Organismus oder Tierzelle, transformiert mit einem Expressionsvektor nach Anspruch 17.

20. E. coli Wirtszelle, transformiert mit dem Expressionsvektor pPUK-Gly.

21. Pharmazeutische Zusammensetzung umfassend eine wirksame Menge eines COOH-terminal amidierten Derivats von menschlicher Pro-urokinase, wie in Anspruch 1 definiert, und einen pharmazeutisch geeigneten Träger und/oder Verdünnungsmittel.

22. Pharmazeutische Zusammensetzung umfassend eine wirksame Menge eines Vorläufers, wie in Anspruch 4 definiert, und einen pharmazeutisch geeigneten Träger und/oder Verdünnungsmittel.