DE3888425T2

DE3888425T2 - Virale Expressionsinhibitoren.

Info

Publication number: DE3888425T2
Application number: DE3888425T
Authority: DE
Inventors: Elliot J Androphy; Douglas R Lowy; John T Schiller
Original assignee: New England Medical Center Hospitals Inc
Current assignee: Tufts Medical Center Inc
Priority date: 1987-08-07
Filing date: 1988-08-08
Publication date: 1994-06-23
Anticipated expiration: 2008-08-09
Also published as: US5674835A; EP0302758B1; EP0302758A1; JPH01137970A; DE3888425D1; ES2061661T3; ATE102993T1; CA1339596C

Description

Diese Erfindung betrifft DNA Viren.
Papillomaviren sind eine Gruppe von kleinen DNA Viren, die Warzen und andere Erkrankungen bei Menschen und anderen Tieren verursachen. Eine Art von Papillomavirus ist der Rinderpapillomavirus (BPV).
Die stromaufwärts liegende Regulationsregion (URR), die unmittelbar den frühen Genen von BPV vorangeht, enthält wichtige cis-wirkende Regulationssignale, einschließlich eines Ursprungs der DNA-Replikation (Lusky et al., 36 Cell 391 (1984)) und mehreren Promotoren, die in der frühen Gentranskription wirken (Stenlund et al., 182 J. Mol. Bio. 541(1985)). Jüngste Studien haben gezeigt, daß die URR auch ein Verstärkerelement enthält, das die Transkription dieser Promotoren und heterologer Promotoren in einer Weise aktivieren kann, die von der Position des Verstärkers und seiner Ausrichtung in bezug auf den Promotor, den es aktiviert, unabhängig ist. Dieser Verstärker ist in dem Sinne abhängig, daß er die Transkription stimuliert, wenn er von einem Genprodukt des BPV E2 offenen Leserasters (ORF) aktiviert wird (Spalholz et al. 42 Cell 183 (1985)).
Gemaß einem ersten Aspekt der vorliegenden Erfindung wird eine Zusammensetzung zur Hemmung des Wachstums eines Virus geschaffen, wobei die DNA des Virus die Nucleinsäuresequenz 5'ACCXNNNPyCGGTXY3' umfaßt, worin jedes N, X und Y unabhängig irgendein Nucleotid darstellt und Py C oder T darstellt, wobei die Nucleinsäuresequenz imstande ist, an ein Protein zu binden, das von der DNA des Virus kodiert wird, wobei das Protein nach der Bindung an die Nucleinsäuresequenz imstande ist, eine Verstarkung der Transkription der DNA des Virus zu bewirken, wobei die Zusammensetzung eine Substanz zur Hemmung der Bindung des Proteins an die Nucleinsäuresequenz umfaßt um die Transkription der DNA des Virus zur Hemmung des Viruswachstums zu unterdrucken.
In einem bevorzugten Ausführungsbeispiel umfaßt die Substanz eine Nucleinsäure mit zumindest 14 Basenpaaren, die eine 14 Basenpaar-Region mit zumindest 80-prozentiger Homologie mit der Nucleinsäuresequenz besitzt wobei das Nucleinsäurefragment zur Bindung an das Protein imstande ist und dadurch verhindert, daß das Protein an die Nucleinsäuresequenz bindet.
Vorzugseise umfaßt die Nucleinsäure die Sequenz 5'ACCXNNNPyCGGTXY3', worin jedes N, X und Y unabhängig irgendein Nucleotid darstellt und Py C oder T darstellt.
Es wird ebenso bevorzugt, daß die Nucleinsäure die Sequenz 3'TGGVNNNPuGCCAVW5' umfaßt, worin jedes N V und W unabhängig irgendein Nucleotid darstellt und Pu G oder A darstellt.
Die Nucleinsäure umfaßt vorzugsweise 200 Basenpaare oder weniger.
Vorzugsweise stellt X C und Y stellt G dar, und es wird ebenso bevorzugt, daß V G darstellt und W C darstellt.
Das Virus ist vorzugsweise ein Papillomavirus, und das Protein ist vorzugsweise ein Papillomavirus E2 Protein.
Ein besonders bevorzugtes Virus ist ein menschliches Papillomavirus oder ein Rinderpapillomavirus.
In einem weiteren bevorzugten Ausführungsbeispiel umfaßt die Substanz ein blockierendes Protein, das imstande ist, an die Nucleinsäuresequenz zu binden, ohne eine Verstärkung der Transkription zu bewirken, wodurch eine Bindung des von der DNA des Virus kodierten Proteins verhindert wird.
Vorzugsweise umfaßt das Protein eine Aminosäuresequenz, die im wesentlichen gleich der Aminosäuresequenz ist, welche lie DNA-Bindungsdomäne eines E2 Proteins umfaßt.
Die DNABindungsdomäne ist vorzugsweise bei den 135 Aminosäuren des C-terminalen Endes eines E2 Proteins angeordnet, insbesondere innerhalb der 110 Aminosäuren des C-terminalen Endes eines E2 Proteins.
Es wird bevorzugt, daß die DNA-Bindungsdomäne innerhalb der Aminosäuren 10-135 des C-terminalen Endes eines E2 Proteins angeordnet ist, worin die Aminosäure 1 die carboxyterminale Aminosäure ist, insbesondere innerhalb der Aminosäuren 10-110 des C-terminalen Endes eines E2 Proteins, worin die Aminosäure 1 die carboxyterminale Aminosäure ist.
Gemäß einem zweiten Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zur Hemmung des Wachstums eines Virus geschaffen, dessen DNA die Nucleinsäuresequenz 5'ACCXNNNPyCGGTXY3' umfaßt, worin jedes N, X und Y unabhängig irgendein Nucleotid darstellt und Py C oder T ist; die Nucleinsäuresequenz ist imstande, an ein Protein zu binden, das von der DNA des Virus kodiert wird, wobei das Protein nach der Bindung an die Nucleinsäuresequenz imstande ist, eine Verstärkung der Transkription der DNA des Virus zu bewirken, wobei das Verfahren die Hemmung der Bindung des Proteins an die Nucleinsäuresequenz umfaßt, um die Transkription der DNA des Virus zur Hemmung des Viruswachstums zu unterdrücken.
Die Expression, Replikation und das Wachstum des Virus wird gehemmt, indem verhindert wird, daß das E2 Protein an die Nucleinsäuresequenz bindet (z.B. durch Einführen einer Substanz, die die Bindung blockiert), und indem die E2 Protein-vermittelte Verstärkung der Transkription verhindert wird.
In einem bevorzugten Ausführungsbeispiel umfaßt das Verfahren das In-Kontakt-Bringen der viralen DNA mit einer Nucleinsäure von zumindest 14 Basenpaaren (und vorzugsweise weniger als 200 Basenpaaren), die ein Region von 14 Basenpaaren mit zumindest 80-prozentiger Homologie (mit Ausnahme von N, Py, X oder Y) mit der Nucleinsäuresequenz aufweist; die Nucleinsäure bindet an das Protein und verhindert dadurch eine Bindung des Proteins an die Nucelinsäuresequenz.
In einem weiteren bevorzugten Ausführungsbeispiel umfaßt das Verfahren das In-Kontakt-Bringen der viralen DNA mit einem blockierenden Protein, das imstande ist, an die Nucleinsäuresequenz zu binden, aber die Transkription der DNA des Virus nicht verstärkt, wodurch verhindert wird, daß das Protein, das von der DNA des Virus kodiert wird, an die Nucleinsäuresequenz bindet. Vorzugsweise enthält das Protein eine Aminosäuresequenz, die in wesentlich ähnlich der Aminosäuresequenz ist, die die DNA-Bindungsdomäne eines E2 Proteins enthält. Im wesentlichen ähnlich, wie hierein vewendet, bedeutet, daß die Sequenzen zumindest zu 80% (besonders bevorzugt zumindest zu 90%) homolog sind. Vorzugsweise ist die DNA-Bindungsdomäne innerhalb von 135 Aminosäuren, insbesondere innerhalb von 110 Aminosäuren des C-terminalen Endes des gesamten E2 Proteins angeordnet.
Die DNA-Bindungsdomäne ist vorzugsweise innernalb der Aminosäuren 10-135, insbesondere innerhalb der Aminosäuren 10-110 des C-terminalen Endes eines E2 Proteins angeordnet, wobei die Aminosäure 1 die carboxyterminale Aminosäure ist.
In einem bevorzugten Merkmal ist das Virus ein Papillomavirus, insbesondere ein Rinderpapillomavirus oder ein menschliches Papillomavirus und vorzugsweise ist das Protein ein E2 Protein.
In einem bevorzugten Merkmal umfaßt die Nucleinsäure ein Oligonucleotid, bestehend aus 14 bis 200 Basenpaaren, von welchem vorzugsweise ein Strang die Sequenz 5'ACCXNNNPyCGGTXY3' enthält, worin jedes N, X und Y unabhängig irgendein Nucleotid darstellt und Py C oder T ist. In einem anderen bevorzugten Merkmal umfaßt die Nucleinsäure alternativ die Sequenz 3'TGGVNNNPuGCCAVW5', worin jedes N, V und W unabhängig irgendein Nucleotid darstellt und Pu gleich G oder A ist.
Vorzugsweise ist X gleich C und Y gleich G. Es wird auch bevorzugt, daß V gleich G und W gleich C ist.
Gemäß einem dritten Aspekt der vorliegenden Erfindung wird die Verwendung einer Substanz vorgesehen, die ein Protein an der Bindung an eine Nucleinsäuresequenz hemmt, um zur Hemmung des Viruswachstums die Transkription einer DNA des Virus zu unterdrücken, in der Herstellung eines Mittels zur Wachstumshemmung eines Virus, wobei die DNA des Virus die Nucleinsäuresequenz 5'ACCXNNNPyCGGTXY3' umfaßt, worin jedes N, X und Y unabhängig irgendein Nucleotid darstellt und Py C oder T darstellt, wobei die Nucleinsäuresequenz imstande ist, an ein Protein zu binden, das von der DNA des Virus kodiert wird, wobei das Protein nach der Bindung an die Nucleinsäuresequenz imstande ist, eine Verstärkung der Transkription der DNA des Virus zu bewirken. Bevorzugte Merkmale des dritten Aspekts sind wie bei dem ersten Aspekt und dem zweiten Aspekt. Die Erfindung schafft eine einfache Methode zur Behandlung von Warzen beim Menschen und einer Reihe von Erkrankungen bei anderen Tieren mit Verbindungen, die kostengünstig und leicht herzustellen sind. Die E2 Bindungsstelle ist in allen bekannten Papillomaviren vorhanden und somit kann jede Erkrankung, die von einem Papillomavirus verursacht wird, nach den Methoden der Erfindung behandelt werden. Da die Wechselwirkung des Proteinverstärkers, welche von den Verbindungen blockiert wird, für die behandelten Viren spezifisch ist, sollten die Verbindungen ferner Zellen nicht nachteilig beeinträchtigen, die nicht mit einem Papillomavirus infiziert sind.
Andere Merkmale und Vorteile der Erfindung gehen aus der folgenden Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen, die nur als Beispiel angeführt sind, und aus den Ansprüchen hervor.
Zunächst werden die Zeichnungen kurz beschrieben.
Fig. 1 ist eine schematische Darstellung des BPV-1 Genoms und des Vektors pCOE2-1.
Fig. 2 ist eine Restriktionsendonucleasenkarte der Verstärkerregion von BPV-1.
Fig. 3 sind DNA-Sequenzen, die von dem E2 Protein von BPV-1 gebunden werden.
Fig. 4 ist eine schematische Darstellung von E2 Proteinen.
Die E2 Bindungssequenz 5'ACCXNNNPyCGGTXY3', worin jedes X, N und Y wie oben in den Aussagen der Erfindung definiert ist, ist in allen bekannten Papillomaviren vorhanden. Jede Art von Papillomavirus, z.B. BPV-1, H(menschliches)PV-1 HPV-5 usw., enthält ein Gen (das E2 Gen), das für ein Protein (das E2 Protein) kodiert, das an die E2 Bindungssequenz bindet und als das transaktivierende Protein des E2 Verstärkers wirkt. E2 Proteine der verschiedenen Stamme von Papillomaviren haben sehr homologe Amonisäuresequenzen.
Mit Bezugnahme auf Fig. 1A ist ein Beispiel eines Papillomavirusgenoms, des 8 kb BPV-1 Genoms (an der HindIII-Stelle linearisiert) in Nucleotidkoordinaten dargestellt, wobei sich die HpaI Stelle bei Nucleotid 1 befindet. E1-8 sind die offenen Leseraster (ORF) "früher Region" (exprimiert in gezüchtete Zellen). URR ist die stromaufwärtige Regulationsregion.
Die E2 Bindungstelle (oder Sequenz) ist an mehreren Stellen in der URR und an anderen Stellen in dem Genom von BPV-1 und anderen Papillomaviren angeordnet. E2 Proteine binden an die Bindungsstellen und verstärken die Transkription der DNA. Die Hemmung dieser Bindung unterdrückt die Transkription der DNA und hemmt somit das Viruswachstum.
Es gibt zwei bevorzugte Methoden, die Bindung eines E2 Proteins zu hemmen.
In der ersten bevorzugten Methode wird eine Nucleinsäure, die die DNA-Sequenz der E2 Bindungsstelle enthält, in Zellen transferiert, die die virale DNA enthalten. Die Nucleinsäure bindet an das E2 Protein, das in der Papillomavirus-infizierten Zelle vorhanden ist, und verhindert somit, daß das Protein an die Nucleinsäuresequenz in dem viralen Genom bindet.
In der zweiten bevorzugten Methode wird ein Protein, das zur Bindung an die obengeannte Nucleinsäuresequenz imstande ist, aber die Transkription nicht verstärkt, in die Zellen eingeführt. Das Protein bindet an die Sequenz, wodurch verhindert wird, daß das E2 Protein, das von der viralen DNA kodiert wird, bindet, und somit die Verstärkung der Transkription verhindert wird.
Die Struktur, Herstellungsmethode und Charakterisierung der E2 Proteine, E2 Protein-Bindungsnucleinsäuren und Proteine, die zur Bindung an die Nucleinsäuresequenz in der E2 DNA-Bindungsstelle ohne Verstärkung der Transkription imstande sind, werden in der Folge beschrieben.

E2 Proteine

Das E2 Gen wurde in den Genomen einer Reihe von Papillomaviren identifiziert, so auch in den menschlichen Stämmen wie HPV-1, HPV-5, HPV-6, HPV-8, HPV-16, HPV-18 und HPV-31. Die DNA Sequenzen vieler dieser Papillomaviren sind leicht zugänglich, z.B. in der Genbank; die DNA Sequenz für BPV-1 wird in Chen et al. 7 Nature 529 (1982), beschrieben. Wenn die DNA Sequenz eines E2 Gens bekannt ist, kann die Struktur des kodierten E2 Proteins leicht identifiziert werden und das Protein oder ein Teil davon kann durch Standardmethoden synthetisiert werden.
Das E2 Protein eines bestimmten Papillomaiiirus, dessen DNA nicht sequenziert ist, kann von dem Fachmann ebenso leicht erhalten werden. Im allgemeinen wird die DNA eines bestimmten Papillomavirus fragmentiert und ein Standard-Southern Blot durchgeführt, um das Fragment zu finden, das zu dem in der Folge beschriebenen E2 Gensegment von BPV-1 (oder einem anderen passenden Papillomavirus E2 Gensegment) homolog ist. Wenn das Fragment, das an das BPV-1 E2 Gensegment bindet, groß ist, z.B. 2000 Basenpaare, kann das Fragment mit Restriktionsenzymen weiter aufgespalten werden, bis ein kleineres Fragment isoliert wird, das die richtige Homologie besitzt. Die Fragmente werden in einen Expressionsvektor subkloniert, und die Klone werden gescreent um zu bestimmen, welche ein Protein erzeugen, das an die E2 Bindungssequenz bindet (siehe unten).
Ein Segment des E2 Proteins von BPV-1, das die DNA-Bindungsdomäne enthält, wurde wie folgt hergestellt und charakterisiert.
Mit Bezugnahme auf Fig. 1 wurden die 3'-Dreiviertel des BPV-1 E2 ORF in pCO-5, einen Expressionsvektor, der den Phage Lambda PL Promotor enthält, geklont und an das aminoterminale Ende des Lambda cII Proteins aufgeschmolzen, wie von Androphy et al., 230 Science 442 (1985), beschrieben wird. Das NarI bis BamHI Fragment (Nucleotide (nt) 2944-4450) von BPV-1 wurde in die ClaI/BamHI Stelle von pCO-5 inseriert, wobei der P&sub1; Promotor, eine Ribosombindungsstelle, und 13 Aminosäuren des Phage cII N-Terminus an die DNA aufgeschmolzen wurden, die das E2 Proteinsegment kodiert. Der erhaltene Vektor pCOE2-1 steuert die Synthese der 13 N-terminalen Aminosäuren von cII auf die im Raster 297 carboxyterminale Aminosäuren des BPV-1 E2 Proteins folgen (der erste im Raster liegende Stoppkodon ist bei nt 3838).
Der obige Klon wurde in einen E. coli Stamm N6405 eingeführt (230 Science 442; es können auch viele andere, gut bekannte Stämme verwendet werden), der den Lambda cI³&sup5;&sup7;ts Repressor von PL enthält. Die Bakterien wurden in einem Minimalmedium bei 32ºC gezüchtet, bei 42º 15 Minuten induziert und mit ³&sup5;S-Methionin 15 Minuten markiert. Nach der sequentiellen Behandlung der Bakterien mit Lysozym und DNAase I wurden die Proteine mit 4 M Harnstoff/1mM Dithiothreitol (DTT) löslich gemacht. Zu diesem Zeitpunkt sind ungefähr zwei Prozent des gesamten Bakterienproteins das 37 Kilodalton (kDa) E2 Fusionsproteinsegment.
Zur Herstellung von Antikörpern zu dem E2 Proteinsegment wurde die 37 kDa Bande von SDS-Polyacrylamidgelen extrahiert und mit Freund'schem Adjuvans zur Immunisierung von Kaninchen in Intervallen von 3 bis 4 Wochen verwendet. Dies ergab Kaninchenseren mit Antikörpern, die das E2 Fusionsproteinsegment erkannten, aber nicht mit den bakteriell synthetisierten BPV 6 oder H-ras Fusionsproteinen kreuzreagierten, die denselben cII Aminoterminus besaßen. Dieses Ergebnis zeigt, daß die Seren E2-spezifische Epitope und nicht den cII Teil des Proteins erkannten.
Eine Bande mit demselben Molekulargewicht wurde auch mit Antiseren immungefällt, die gegen ein in vitro synthetisiertes Peptid, abgeleitet von der vorhergesagten BPV-1 E2 Proteinsequenz, gebildet worden waren, wodurch bestätigt wurde, daß die 37 kDA Bande ein BPV-1 E2 Fusionsproteinsegment war.

E2 Protein-Bindungs-DNA

Zur Testung der Fähigkeit eines E2 Proteins, spezifisch an eine Papillomavirus DNA zu binden, wurde ein stringenter DNA-Immunopräzipitationstest verwendet (145 J. Mol. Biol. 471 (1981); Androphy et al., 325 Nature 70 (1987)). Markierte DNA Fragmente werden zunächst mit Protein-Antikörperkomplexen, die an unlösliche Sepharose-Kügelchen gebunden sind, in Gegenwart einer überschüssigen nichtmarkierten Konkurrenz-DNA inkubiert. Nachdem die Komplexe mehrere Male zur Entfernung nichtgebundener Fragmente gewaschen worden sind, werden die gebundenen Fragmente aufgespalten und durch Gelelektrophorese analysiert. In der Folge ist ein Beispiel des zuvor beschriebenen Tests angeführt.
Fünfzig ng des teilweise zuvor gereinigten BPV-1 E2 Proteinsegments (50% durch Acrylamidgelanalyse) wurden mit DIB (20 mM HEPEs, pH 7,2, 150 mM KCl, 0,05% NP 40, 1 mM EDTA, 1 mM DTT, 1% Aprotinin) verdünnt und bei 4ºC mit E2-spezifischen Antiseren inkubiert. Die Komplexe wurden mit Protein A-Sepharose gesammelt und mit DIB gewaschen. Nach der Digestion mit Restriktionsendonuclease und Endmarkierung mit ³²P-dNTPs unter Verwendung des Klenow Fragments von DNA Polymerase I, wurden 20 ng DNA in 0,2 ml DIB, das 400 ng nichtmarkiertes pML2d enthielt, eingebracht (Lusky et al., 293 Nature 79 (1981)). Nach 1 Stunde bei 37ºC wurden die Komplexe pelletiert und viermal mit DIB gewaschen, in 1% SDS bei 65ºC aufgespalten, mit Phenol-Chloroform extrahiert und die freigesetzte DNA nach der Zugabe von Träger-DNA mit Ethanol ausgefällt. Die resuspendierte DNA wurde denaturiert und auf Standard-Acrylamidsequenzierungsgelen oder auf einem Gradientensequenzierungsgel analysiert.
In dem anfänglichen DNA-Bindungsexperiment wurde das 8 Kilobasen (kb) BPV-Genom in voller Länge mit einer Kombination von BamHI HindIII und Sau96I Endonucleasen aufgespalten und dann mit ³²P endmarkiert. Zwei Fragmente waren spezifisch durch die BPV-1 E2 Proteinsegment-Antikörper-Komplexe gebunden. Ein Fragment hatte 498 bp (nt 6958-7456), und das andere hatte 233 bp (nt 7586-7816). Beide Fragmente sind in dem Segment der URR, das eine Verstärkeraktivität besitzt. Die spezifische Bindung trat in einem pH-Bereich von 6,8 bis 7,4, einem Temperaturbereich von 4ºC bis 37ºC und bei Konzentrationen des Detergens NP40 von 0,05 bis 0,5 Prozent ein. In Kontrollexperimenten wurde keine DNA Bindung nachgewiesen, wenn präimmune Seren in dem Test verwendet wurden, oder wenn dasselbe cII Peptid an das BPV E6 Protein oder das H-ras Protein gebunden wurde und der Test entweder mit den E2 Antiseren oder Antiseren, die die E6 oder H-ras Peptide erkennen, durchgeführt wurde. Daher ist die Bindung der beiden Fragmente auf eine sequenzspezifische Wechselwirkung mit dem E2 Fusionsproteinsegment zurückzuführen. Das BPV E2 Fusionsproteinsegment reagiert auch spezifisch mit der HPV16 URR (Seedorf et al., 145 Virology 181 (1985)), mit einer Bindung an ein einziges 88 bp Fragment (nt 24-112). Weder das SV40 Genom noch das Harvey Maus-Sarkomavirus LTR, die beide Verstärker enthalten, besitzen Sequenzen, die von dem E2 Proteinsegment in diesem Test spezifisch erkannt werden, was darauf hinweist, daß DNA Sequenzen, die von dem Peptid erkannt werden, mit anderen Verstärkerelementen nicht gemeinsam sind.
Wenn die BPV Fragmente vor der Inkubation mit den E2-Antikörperkomplexen thermisch denaturiert werden, werden alle der Einzelstrangfragmente über 100 nt gebunden, was darauf hinweist, daß das E2 Proteinsegment an die einzelsträngige DNA nichtspezifisch bindet.
Da andere sequenzspezifische DNA-Bindungsproteine DNA nichtspezifisch binden können, wenn sie unter Proteinüberschuß-Bedingungen getestet werden, wurden die obengenannten Experimenten mit geringen Konzentrationen des E2 Proteinsegments durchgeführt. Wenn mehr E2 Proteinsegment in dem Test verwendet wurde, zeigten sich zwei zusätzliche Bindungsstellen in dem BPV-1 Genom. Eine ist in einem 219 bp Fragment, das weiter stromaufwärts in der URR angeordnet ist (nt 7819-93), und die andere ist in einem 355 bp Fragment, das in dem E2 ORF angeordnet ist (nt 2904-3259). Daher gibt es mehrere E2 Bindungsstellen in dem BPV Genom, von welchen die meisten in der URR angeordnet sind, und es gibt eine Hierarchie in den Affinitäten dieser Stellen für das Peptid. Zumindest eine zusätzliche Bindungsstelle wurde auch in dem HPV16 Genom nachgewiesen, wenn die Konzentration des E2 Proteinsegments erhöht wurde.
Zur genaueren Bestimmung der Anzahl und Anordnung der Hochaffinitäts-E2 Bindungsstellen wurde das 987 bp HindIII bis HpaI (nt 6958-7945) URR Fragment isoliert und die Fähigkeit des E2 Proteinsegments, dieses Segment nach der Aufspaltung mit verschiedenen Restriktionsendonucleasen zu erkennen, getestet (Fig. 2). Drei Fragmente mit 395, 275 und 60 bp wurden nach der FokI Aufspaltung immungefallt; DdeI und TagI zeigten zwei Bindungsfragmente mit 317 und 70 bp; und die Aufspaltung mit HpaII und Sau96I erzeugte zwei Bindungsfragmente mit 179 und 56 Basenpaaren. Da die 56, 60 und 70 bp Fragmente, die von den Peptid gebunden wurden, nicht überlappen, erkennt das E2 Proteinsegment zumindest drei Hochaffinitätselemente in der URR, die zwischen nt 7366-7406, nt 7624-7683 und nt 7767-7822 angeordnet sind (Fig. 2). Die Ergebnisse zeigen auch die Fähigkeit der E2 Komplexe, spezifisch und effizient kleine DNA Fragmente zu binden.
Die DNA Sequenzen der Fragmente, an welche das Peptid band, wurden für die Bestimmung verglichen, ob sie gemeinsame Sequenz enthalten (Fig. 3). Alle Fragmente, die das E2 Proteinsegmente spezifisch banden, enthalten ein ähnliches Motiv, das die Consensus-Sequenz 5' ACC(G)NNNPyCGGT(GC)3' aufweist (die Nucleotide in der Klammer werden bevorzugt, sind aber nicht unveränderlich; N kann jedes Nucleotid sein, und Py kann C oder T sein). Dieses Motiv wird an jedem Strang der DNA gefunden, und in zwei Beispielen liegen zwei Kopien sehr nahe beieinander (Stellen I-IV in Fig. 2). Die Stelle I wird in dem HpaII-Sau96I Aufschluß nicht gebunden, und HpaII spaltet die vermeintliche E2 Erkennungssequenz dieser Stellensegmente. Die Sequenzanalyse von BPV und HPV16 zeigte, daß das Motiv auf jene Segmente beschränkt ist, die von dem E2 Proteinsegment erkannt werden. Sequenzen, die diesem Motiv ähnlich sind, werden in den URRs aller anderen Papillomaviren berichtet, die sequenziert wurden (Dartman et al., 151 Viro]ogy 124 (1986)). Die Sequenzen sind jedoch in den anderen viralen Genomen nicht vorhanden, die in einer Computerdurchmusterung überprüft wurden, einschließlich des SV40, Polyoma, Rinderleukämievirus und Moloney-Mausleukämievirus.

Hemmung der E2 Proteinbindung

Die Fähigkeit eines 23 bp URR Fragments, das die Consensus-Sequenz enthält, die spezifische Bindung des BPV-1 E2 Proteinsegments an BPV DNA zu hemmen, wurde in einem Konkurrenzhemmungstest geprüft. Ebenso wurde die Fähigkeit eines 23 bp URR Fragments, das die Consensus-Sequenz nicht enthält, die Bindung zu hemmen, geprüft.
Die Tests wurden unter Verwendung von 25 mg des BPV-1 E2 Proteinsegments in dem zuvor beschriebenen DNA-Präzipitationsverfahren durchgeführt, mit der Ausnahme, daß 1-1000 ng des konkurrierenden nichtmarkierten Fragments zu der markierten BPV DNA vor deren Inkubation mit den Antikörper-E2-Komplexen zugegeben wurden. Das konkurrierende doppelsträngige DNA-Fragment enthielt entweder die Sequenz 5'CGTCAAACCGTTCGGTGC TC3' (die E2 Bindungsstellensequenz IIIb ist unterstrichen) oder 5'GCGCATAATCAGCTTAATTGGTG3' (keine E2 Bindungsstellensequenz).
Das Fragment, das die E2 Bindungsstellensequenz enthält, blockierte die Immunpräzipitation der BPV Fragmente effektiv; es war ungefähr um das Tausendfache wirksamer als das 23 bp Fragment, das die Consensus-Sequenz nicht enthielt.
Einzelsträngige Oligonucleotide, welche die Sequenzen enthielten, blockierten die Immunpräzipitation der doppelsträngigen BPV DNA Fragmente nicht.

E2 spezifische DNA Bindungsaktivität in BPV transformierten Zellen

Proteinfraktionen von isolierten Kernen von BPV transformierten C127 Zellen (ID14) und Kontroll-C127-Zellen wurden auf das Vorhandensein spezifischer DNA-Bindungsaktivität getestet, die durch die E2 Antiseren in dem DNA-Immunpräzipitationstest wie oben beschrieben immungefällt werden konnten. Das 233 bp Sau96I BPV URR Fragment, das vier der Bindungsmotive enthält, wurde spezifisch gebunden und mit dem ID14 Extrakt, aber nicht mit dem C127 Extrakt, immungefällt. Das DNA Fragment wurde durch die Anti-E2 Seren immungefällt, aber nicht durch die präimmunen Seren, was darauf hinweist, daß das Bindungsprotein E2 spezifische Epitope besitzt.
Die Immunpräzipitation des 233 bp Fragments wurde durch das 23 bp Fragment, das die E2 Bindungsstellensequenz enthielt, kompetitiv blockiert, aber nicht durch das Fragment, dem eine Sequenz fehlte, was darauf hinweist, daß die BPV transformierten Zellen ein E2 Protein synthetisieren, und daß das E2 Protein in BPV transformierten Zellen dieselbe DNA-Bindungspezifität aufweist, wie das bakteriell synthetisierte E2 Protein.

Proteinbindung an die E2 Bindungsstellensequenz

Mit Bezugnahme auf Fig. 4 ist die DNA-Bindungsdomäne von E2 Proteinen, d.h. der Teil des Proteins, der für die DNA Bindungsaktivität veranwortlich ist, in den 135 Aminosäuren angeordnet, die das C-terminale Segment der Moleküle umfassen (Aminosäure 1 ist die carboxyterminale Aminosäure). Insbesondere ist die DNA-Bindungsdomäne im wesentlichen zwischen den Aminosäuren 10 und 110 angeordnet. Die Transkriptionsverstärkungsaktivität-Domäne von E2 Proteinen ist zumindest teilweise in dem N-terminalen Segment (dem Segment zwischen Aminosäure 297 und der N-terminalen Aminosäure) der Moleküle angeordnet.
Das Einführen eines Protein, das die DNA-Bindungsdomäne eines E2 Proteins enthält, das aber die Transkriptionsverstärkungsdomäne nicht enthält, in eine mit Papillomavirus infizierte Zelle blockiert die E2 Proteinbindungsstellen, ohne die Transkription viraler DNA zu verstärken. Geeignete blockierenden Proteine umfassen (a) jene Segmente von E2 Proteinen, die aus der DNA-Bindungsdomäne bestehen; (b) Segment (a) plus einige oder alle der verbleibenden Aminsäuren 1-110 oder 10-110 des C-terminalen Segments; (c) Segmente (a) oder (b) plus einige oder alle der Aminosäuren 110-297 eines E2 Proteins; (d) Segment (c) plus alle oder einige der Aminosäuren in dem N-terminalen Segment eines E2 Proteins, die nicht für die Transkriptionsverstärkungsaktivitat verantwortlich sind; und (e) jedes der obengenannten Segmente mit nicht-E2 Protein-Aminosäuresequenzen, die entweder dem N oder C-terminalen Ende des Segments hinzugefügt wurden. Vorzugsweise enthält das Protein nicht mehr als 500 (bevorzugt 180, insbesondere 135) Aminosäuren.
Die obengenannten Segmente können einfach unter Anwendung von standardmäßigen rekombinanten DNA-Techniken oder Festphasen-Synthesetechniken synthetisiert werden.
Zur Bestimmung, ob ein bestimmtes Segment, z.B. eines, das aus weniger als den Aminosäuren 10-110 des C-terminalen Segments eines E2 Protein besteht, zur Verwendung als blockierendes Protein geeignet ist, wird das Segment unter Verwendung des obenbeschriebenen E2 DNA Bindungstests getestet. Wenn das Segment die E2 DNA Bindungssequenz bindet und keinen Teil des N-terminalen Segments eines E2 Protein enthält, ist es ohne weitere Durchmusterung zur Verwendung als blockierendes Protein geeignet, da das Fragment keine Transkriptionsverstärkungsaktivität besitzt.
Wenn das getestete Segment auch einen Teil des N-terminalen Segments eins E2 Proteins enthält, sollte das Segment weiter getestet werden, z.B. nach den allgemeinen Methoden, die in Spalholz et al., supra, beschrieben sind, um zu bestimmen, ob dem Segment die Transkriptionsverstärkungsaktivität fehlt. Zum Beispiel wird die DNA, die für die getesteten Segmente kodiert, an einen geeigneten Promotor gebunden, z.B. SV40 oder einer retroviralen LTR, und in eine geeignete Zellinie (z.B. CV-1 Zellen) gemeinsam mit der E2 Bindungsstelle, die an ein Indikatorgen (z.B. CAT Gen) gebunden ist, kotransfektiert. Die Zellinie erzeugt das getestete Segment, und das Segment wird an die E2 Bindungsstelle binden. Wenn das Segment den Teil des N-terminalen E2 Segmente enthält, der für die Transkriptionsverstärkungsaktivität verantwortlich ist, wird das CAT Gen exprimiert und das Segment ist zur Verwendung als blokkierendes Protein nicht geeignet. Wenn dem Segment der Teil des N-terminalen E2 Segments fehlt, der für die Verstarkungsaktivität verantwortlich ist, wird das Gen nicht exprimiert und das Segment ist zur Verwendung als blockierendes Protein geeignet.
Ein spezifisches Beispiel eines blockiereriden Proteins ist das obenbeschriebene BPV-1 E2 Proteinsegment.

Verwendung

Ein Oligonucleotid mit einer DNA Sequenz innerhalb der obengenannten Formel kann an jedes Papillomavirus E2 Protein in vivo binden. Zellen, die mit einem Papillomavirus infiziert sind, können mit dem Oligonucleotid gesättigt werden, um das E2 Protein zu binden, das von jenem Papillomavirus erzeugt wird, und verhindern, daß das Protein mit viraler DNA in Wechselwirkung tritt und die virale Genexpression verstärkt, was zu einer Hemmung der Expression des Virus führt.
Die Oligonucleotide können zur Anwendung bei Regionen, die mit dem Papillomavirus infiziert sind, oder zur Injektion bei einem Tier in pharmazeutisch annehmbaren Medien eingebracht werden. Sie sind besonders zur Anwendung bei einer Warze beim Menschen geeignet. Die Oligonucleotide müssen eine Länge von zumindest 12-14 Nucleotidbasen aufweisen; zur äußeren Anwendung, z.B. bei einer Warze, sollten die Oligonucleotide nicht mehr als etwa 200 Basenpaare (bevorzugt nicht mehr als 100 Basenpaare, insbesondere nicht mehr als 50 Basenpaare) besitzen, da sonst die Moleküle die Haut nicht durchdringen. Die Oligonucleotide können entweder frei in Lösung oder an die DNA eines nichtpathogenen Virus ligiert zur Transfektion in eine infizierte Zelle vorhanden sein. Als Alternative kann eine kleine Menge (z.B. etwa 0,1 - 10 ug) einer 0ligonucleotidzubereitung (z.B. Oligonucleotid gelöst in DMSO und/oder Kochsalzlösung) die viral infizierten Zellen durchdringen (z.B. nach der Methode, die in 82 P. Nat. Acad. Sci. 2781 (1986) beschrieben ist), indem die Zubereitung auf dem infizierten Bereich aufgetragen wird; vorzugsweise ist in der Zubereitung EDTA enthalten, um eine Nucleaseaktivität zu verhindern.
Peptide, die eine Papillomavirus E2 Protein-Bindungsdomäne (aber keine Transkriptionsverstärkungsdomäne) besitzen, können auch zur Hemmung des Wachstums und der Expression eines Papillomavirus verwendet werden. Das Peptid kann in viral infizierte Zellen eingeführt werden, so daß es an die E2 DNA Bindungsstellen binden kann und verhindert, daß natives E2 Protein bindet. Ein Peptid, das die Bindungsdomäne irgendeines E2 Proteins enthält, kann zur Behandlung jeder Papillomavirusinfektion verwendet werden. Die Peptide können in einem pharmakologisch annehmbaren Puffer gelöst und auf die infizierten Zellen aufgetragen werden. DMSO und EDTA können zur Unterstützung der Aufnahme des Peptids und zur Hemmung des proteolytischen Abbaus verwendet werden. Das Peptid kann als Alternative chemisch oder durch Standard-Gentechniken an ein zellspezifisches Rezeptorpeptid, z.B. epidermalen Wachstumsfaktor, aufgeschmolzen werden, so daß das Peptid von den Zellen leichter aufgenommen wird. Ferner kann das Peptid auch an eine Kernzielsequenz aufgeschmolzcn werden (siehe 7 Mol. & Cell. Bio. 2451 (1987); 39 Cell 499 (1984); 46 Cell 575 (1986); 6 Mol. & Cell. Bio. 4136 (1986); 311 Nature 33 (1984)), so daß das E2-Proteinfragment zu dem Zellkern transportiert wird, wo es das virale Wachstum hemmen kann. Vorzugsweise werden die Peptide im Bereich von 1-1.000 ug pro kg Tier oder mit 1-1.000 ug/m1 bei topischer Anwendung verwendet.
Andere Ausführungsbeispiele sind im Umfang der folgenden Ansprüche.

Claims

1. Zusammensetzung zur Hemmung des Wachstums eines Virus, dessen DNA die Nucleinsäuresequenz 5'ACCXNNNPyCGGTXY3' umfaßt, worin jedes von N, X und Y unabhängig irgendein Nucleotid darstellt und Py unabhängig C oder T darstellt, wobei die Nucleinsäuresequenz imstande ist, an ein Protein zu binden, das von der DNA des Virus kodiert wird, wobei das Protein nach der Bindung an die Nucleinsäuresequenz imstande ist, eine Verstärkung der Transkription der DNA des Virus zu bewirken, wobei die Zusammensetzung eine Substanz zur Hemmung der Bindung des Proteins an die Nucleinsäuresequenz umfaßt, um die Transkription der DNA des Virus zur Hemmung des Viruswachstums zu unterdrücken.

2. Zusammensetzung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Substanz eine Nucleinsäure mit zumindest 14 Basenpaaren umfaßt, die eine Region mit 14 Basenpaaren mit zumindest 80-prozentiger Homologie mit der Nucleinsäuresequenz besitzt, wobei das Nucleinsäurefragment zur Bindung an das Protein imstande ist und dadurch verhindert, daß das Protein an die Nucleinsäuresequenz bindet.

3. Zusammensetzung nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Nucleinsäure die Sequenz 5'ACCXNNNPyCGGTXY3' umfaßt, worin jedes von N, X und Y unabhängig irgendein Nucleotid darstellt und Py unabhängig C oder T darstellt.

4. Zusammensetzung nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Nucleinsäure die Sequenz 3'TGGVNNNPuGCCAVW5' umfaßt, worin jedes von N, V und W unabhängig irgendein Nucleotid darstellt und Pu gleich G oder A ist.

5. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 2 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß die Nucleinsäure 200 Basenpaare odei weniger umfaßt.

6. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß das Virus ein Papillomavirus ist.

7. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß das Protein ein Papillomavirus E2 Protein ist.

8. Zusammensetzung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Substanz ein blockierendes Protein umfaßt, das eine Aminosäuresequenz aufweist, die zumindest zu 80% mit einem Segment der C-terminalen 135 Aminosäuren eines E2 Proteins homolog ist, wobei das blockierende Protein imstande ist, die Nucleinsäuresequenz zu binden, ohne eine Verstärkung der Transkription zu bewirken, wodurch eine Bindung des von der DNA des Virus kodierten Proteins verhindert wird.

9. Verwendung einer Substanz, die ein Protein an der Bindung an eine Nucleinsäuresequenz hemmt, um die Transkription einer DNA des Virus zur Hemmung des Viruswachstums zu unterdrücken, in der Hestellung eines Mittels zur Wachstumshemmung eines Virus, wobei die DNA des Virus die Nucleinsäuresequenz 5'ACCXNNNPyCGGTXY3' umfaßt, worin jedes von N, X und Y unabhängig irgendein Nucleotid darstellt und Py C oder T darstellt, wobei die Nucleinsäuresequenz imstande ist, an ein Protein zu binden, das von der DNA des Virus kodiert wird, wobei das Protein nach der Bindung an die Nucleinsäuresequenz imstande ist, eine Verstärkung der Transkription der DNA des Virus zu bewirken.