DE3888076T2 - Verfahren zur Herstellung von L-Threonin. - Google Patents
Verfahren zur Herstellung von L-Threonin.Info
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Description
- Diese Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von L-Threonin und ein Plasmid und einen Mikroorganismus, die bei dem Verfahren verwendet werden.
- L-Threonin ist eine Aminosäure, die eine wichtige Rolle bei der Ernährung für Mensch und Tier als essentielle Aminosäure darstellt, und seine Nachfrage für Arzneimittel, LebensmitteL und Futteranreicherungsmittel ist in den vergangenen Jahren stark angestiegen.
- Bezüglich eines industriellen Herstellungsverfahrens von L-Threonin ist aufgrund des Auftretens von Stereoisomeren, ähnlich wie bei anderen Aminosäuren, die Herstellung nur des L-Isomeren durch chemische Synthese schwierig, und primär wird es durch ein Fermentationsverfahren hergestellt. Als Verfahren zur Herstellung von Threonin durch ein Fermentationsverfahren können ein Verfahren unter Verwendung eines Aminosäure-benötigenden Stamms angeführt werden (japanische Patentveröffentlichungen Nrn. 3319/1971, 34193/1971, 34194/1971, etc.).
- Verfahren zu seiner Herstellung durch ein Vorläufer- Fermentationsverfahren schliessen ein Verfahren unter Verwendung von Homoserin als Vorläufer ein (japanische Patentveröffentlichungen Nrn. 2896/1961,.6590/1963, 8715/1968, etc.).
- Es kann jedoch nicht gesagt werden, dass solche Fermentationsverfahren industriell vorteilhafte Verfahren sind, und zwar aus den Gründen, dass umständliche Verfahrensschritte, wie die Sterilisation des Mediums etc., erforderlich sind, dass das Problem von Nebenprodukten besteht, und auch dass die Produktionskontrolle ausserst schwierig ist.
- Andererseits wurden unter enzymatischen Herstellungsverfahren, die weniger aufwendig in den Festkosten und einfacher in der Produktionskontrolle als das Fermentationsverfahren sind, ein Verfahren unter Verwendung von Glycin und Atetaldehyd als Vorläufer vorgeschlagen (japanische ungeprüfte Offenlegungsschriften Nrn. 121491/1981, 116681/1983 etc.), doch dieses Verfahren ist mit der Bildung eines Nebenprodukts verbunden, Allotyp-Threonin, und daher kein praktisches Verfahren.
- Andererseits wurde bei einem Herstellungsverfahren nach einem Enzymverfahren berichtet, dass L-Threonin mit einer Reaktionsmischung, in der man DL-Homoserin existieren lässt, unter Verwendung verschiedener Mikroorganismus- Zellen gebildet wird (Amino Acids, Bd. 1, Seiten 71 bis 74 (1959)).
- Nach diesen bekannten Verfahren ist jedoch die gebildete Menge an L-Threonin noch nicht zufriedenstellend.
- Die gegenwärtigen Erfinder haben intensive Untersuchungen vorgenommen, um L-Threonin industriell zu niedrigen Kosten mit guter Ausbeute herzustellen, und als Folge davon die vorliegende Erfindung erreicht.
- Die vorlegende Erfindung stellt ein Verfahren zur Herstellung von L-Threonin zur Verfügung, welches umfasst:
- (i) enzymatische Umsetzung von mindestens L- oder DL-Asparaginsäure oder einem Salz davon mit Ethanol und/oder Glucose in einer Biotin-freien wässrigen Lösung in Gegenwart von Zellen eines Biotin-benötigenden Mikroorganismus Brevibacterium flavum MJ-233 (FERM BP-1497), oder eines davon abgeleiteten Mutantenstamms, der in der Lage ist, L-Threonin unter diesen Bedingungen herzustelen; und
- (ii) Gewinnung von L-Threonin aus der Reaktionsmischung.
- In einer der bevorzugten Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung ist der Mikroorganismus mit einem Plasmid transformiert, das ein DNA-Fragment mit dem Gen enthält, das die Enzyme, die an der Biosynthese von Threonin teilnehmen (Threonin-Operon) codiert, die in einem zum Wachstum Biotin benötigenden Mikroorganismus, der zu den coryneformen Bakterien gehört, exprimiert werden können, und ein DNA-Fragment, mit einem Gen enthält, das die autonome Replikation in coryneformen Bakterienzellen codiert.
- Das heisst, in einer der bevorzugten Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung umfasst das Verfahren die enzymatische Umsetzung von mindestens L- oder DL-Asparaginsäure oder einem ihrer Salze in einem Reaktionssystem, wobei kein Wachstum von Mikroorganismus- Zellen begleitend auftritt, in einer wässrigen Lösung in Gegenwart eines Mikroorganismus, und Gewinnung des gebildeten L-Threonins, dadurch gekennzeichnet, dass der Mikroorganismus Biotin zu seinem Wachstum erfordert und zu den coryneformen Bakterien gehört und mit dem oben beschriebenen Plasmid transformiert wurde.
- Die vorliegende Erfindung stellt auch das oben beschriebene Plasmid und den oben beschriebenen Mikroorganismus, die im vorliegenden Verfahren eingesetzt werden, zur Verfügung.
- Erfindungsgemäss kann L-Threonin mit guter Ausbeute hergestellt werden; und da darüber hinaus die Produktionskontrolle extrem einfach wird, ohne problematische Verfahrensschritte, wie die Sterilisation des Mediums etc. zu erfordern, wie beim Fermentationsverfahren, kann L-Threonin preiswert industriell hergestellt werden.
- Darüber hinaus können besonders hervorragende Effekte erzielt werden, wenn der erfindungsgemässe Mikroorganismus, der mit dem erfindungsgemässen Plasmid transformiert wurde, im erfindungsgemässen Verfahren eingesetzt wird.
- Ausserdem können die Effekte der vorliegenden Erfindung beschleunigt werden, wenn eine Reaktionslösung, die Ethanol und/oder Glucose enthält, als wässrige Lösung zur enzymatischen Reaktion verwendet wird.
- Der in der vorliegenden Erfindung verwendete, zu seinem Wachstum Biotin benötigende Mikroorganismus, der zu den coryneformen Bakterien gehört, kann einschliessen: Brevibacterium flavum oder einen davon abgeleiteten Stamm, und vorzugsweise Brevibacterium flavum MJ-233, wie beispielhaft darstellt durch einen Mikroorganismus, der Ethanol verwerten kann, wie Brevibacterium flavum MJ-233 (FERM BP-1497), Brevibacterium flavum MJ-233-AB-41 (FERM BP-1498, Brevibacterium flavum MJ-233-ABT-11 (FERM BP-1500) und Brevibacterium flavum MJ-233-ABD-21 (FERM BP-1499). Zusätzlich zu den oben beschriebenen können beispielhaft Brevibacterium ammoniagenes ATCC 6871, ATCC 13745, ATCC 13746, und Brevbacterium divaricatum ATCC 14020 ebenfalls angeführt werden.
- Unter den oben beschriebenen Mikroorganismen sind solche, die Ethanol verwerten können, bevorzugt, und Brevibacterium flavum MJ-233 (FERM BP-1497), Brevibacterium flavum MJ-233-AB-41 (FERM BP-1498) Brevibacterium flavum MJ-233-ABT-11 (FERM BP-1500) und Brevibacterium flavum MJ-233-ABD-21 (FERM BP-1499) sind besonders bevorzugt.
- Das Brevibacterium flavum MJ-233-AB-41 (FERM BP-1498) ist ein Mikroorganismus, der Ethanol verwerten kann und dem DL-α-Aminobuttersäure-Resistenz durch Verwendung von Brevibacterium flavum MJ-233 (FERM BP-1497) als Elternstamm positiv verliehen wurde (siehe japanische Patentanmeldung Nr. 28398/1984, Spalten 3 bis 4). Das Brevibacterium flavum MJ-233-AST-11 (FERM BP-1500) ist eine L-α-Aminobuttersäure-Transaminasemutante mit hoher Aktivität durch Verwendung von Brevibacterium flavum MJ-233 (FERM BP-1497) als Elternstamm (siehe japanische ungeprüfte Offenlegungsschrift Nr. 51998/1987). Ausserdem ist das Brevibacterium flavum MJ-233-ABD-21 (FERM BP-1499) eine Mutante mit hoher Aktivität von D-α-Aminobuttersäure- Deaminase durch Verwendung von Brevibacterium flavum MJ-233 (FERM BP-1497) als Elternstamm (siehe japanische ungeprüfte Offenlegungsschrift Nr. 177993/1986).
- Im allgemeinen beginnen Mikroorganismen-Stämme ein Lyse- Phänomen zu zeigen, wenn inre Zellteilung inhibiert werden kann.
- Beim Herstellungsverfahren der vorliegenden Erfindung ist zur Herstellung von L-Threonin mit guter Ausbeute es bevorzugt, dass die Zellreaktion während langer Zeit fortgesetzt werden kann. Im obigen Brevibacterium flavum MJ-233 oder Mikroorganismen-Stämmen, die davon abgeleitet sind, wird selbst unter den Bedingungen, bei denen die Zellteilung inhibiert wird, kein Lysephänomen beobachtet, und daher wird es besonders bevorzugt beim Herstellungsverfahren der vorliegenden Erfindung verwendet.
- Beim erfindungsgemässen Herstellungsverfahren können die obigen Mikroorganismen-Stämme auch immobilisiert sein. Eine solche Immobilisierung der obigen Mikroorganismen- Stämme kann nach bekannten Immobilisierungsverfahren durchgeführt werden, die beispielsweise geeignet ausgewählt werden aus dem Einschlussverfahren mit Acrylamid, Alginat, Caragheenan etc., dem Ionenbindungsverfahren mit DEAE-Sephadex, DEAE-Cellulose etc..
- Das Herstellungsverfahren der vorliegenden Erfindung kann in einer wässrigen Lösung ausgeführt werden, und als wässrige Lösung können Wasser oder eine Pufferlösung, wie Phosphat- oder Trishydrochlcrid etc., gewöhnlich verwendet werden, und vorzugsweise können darin Ethanol oder Glucose entweder allein oder in Kombination enthalten sein.
- Die wässrige Lösung kann weterhin Stickstoffquellen, anorganische Salze etc. enthalten. Als solche Stickstoffquellen können beispielsweise Ammoniak, Ammoniumsulfat, Ammoniumchlorid, Ammoniumnitrat, Harnstoff etc., angeführt werden. Als anorganisches Salz kann beispielsweise Kaliummonohydrogenphosphat, Kaliumdihydrogenphosphat, Magnesiumsulfat, Eisensulfat, Mangansulfat etc. angeführt werden. Wenn eine Stickstoffquelle oder ein anorganisches Salz enthalten ist, ist es zur Inhibierung des Wachstums der obigen Mikroorganismen-Stämme notwendig, Biotin, das der essentielle Wachstumsfaktor ist, aus der wässrigen Lösung zu entfernen.
- Die Konzentrationen von Ethanol und Glucose, die der wässrigen Lösung zugegeben werden, sind im allgemeinen 1 bis 20 Vol.% im Fall von Ethanol, im allgemeinen 0,5 bis 20 Vol.% im Fall von Glucose, und wenn beide in Kombination verwendet werden, können beide in den jeweiligen Konzentrationen innerhalb der obigen Bereiche verwendet werden.
- Die Konzentration von L- oder DL-Asparaginsäure oder einem ihrer Salze während der Reaktion kann im allgemeinen 0,1 bis 20 % (G/V) betragen. Als hier verwendbares Salz von Asparaginsäure kann beispielsweise Natriumaspartat, Calciumaspartat, Kaliumaspartat etc. angeführt werden.
- Die Menge des verwendeten Biotin-benötigenden Mikroorganismus ist nicht besonders beschränkt, beträgt aber im allgemeinen 1 bis 50 % (G/V).
- Die enzymatische Reaktion im Reaktionssystem, mit der kein Mikroorganismen-Zellwachstum einhergeht, wird im allgemeinen bei etwa 20 bis etwa 50ºC, vorzugsweise etwa 30 bis etwa 40ºC, im allgemeinen während etwa 10 bis etwa 72 Stunden ausgeführt.
- Abtrennung und Reinigung des in der Reaktionsmischung nach dem oben beschriebenen Reaktionsverfahren gebildeten L-Threonin kann leicht durch Ionenaustauscherharz- Behandlungsverfahren oder Ausfällungsverfahren etc. ausgeführt werden.
- Der obige Biotin-benötigende Mikroorganismus, der in der Lage ist, L-Threonin aus Asparaginsäure herzustellen, kann, wie nachstehend beschrieben, kultiviert werden.
- Als Kohlenstoffquelle können beispielsweise Glucose, Ethanol, Methanol, Molassenabfälle etc., verwendet werden, als Stickstoffquelle beispielsweise Ammoniak, Ammoniumsulfat, Ammoniumchlorid, Ammoniumnitrat, Harnstoff etc., jeweils individuell oder als Mischung. Als anorganisches Salz können beispielsweise Kaliummonohydrogenphosphat, Kaliumdihydrogenphosphat, Magnesiumsulfat, Eisensulfat, Mangansulfat etc., verwendet werden.
- Darüber hinaus können Nährstoffbestandteile, wie Pepton, Fleischextrakt, Hefeextrakt, eingeweichter Maisextrakt, Casaminosäure und verschiedene Vitamine, wie Biotin etc., ebenfalls zum Medium zugesetzt werden.
- Die Kultivierung wird unter aeroben Bedingungen, wie belüftetem Rühren, Schütteln etc., ausgeführt, und die Kulturtemperatur kann im allgemeinen 20 bis 40ºC, vorzugsweise 25 bis 35ºC, betragen. Der pH kann im Verlauf der Kultivierung im allgemeinen 5 bis 10, vorzugsweise um 7 bis 8 betragen, und der pH während der Kultivierung kann durch Zugabe einer Säure oder Alkalie eingestellt werden. Wenn Ethanol als Kohlenstoffquelle verwendet wird, kann die Konzentation zu Beginn der Kultivierung vorzugsweise 1 bis 5 Vol.%, besonders bevorzugt 2 bis 3 Vol.%, betragen. Die Kultivierungsperiode kann im allgemeinen 2 bis 9 Tage, vorzugsweise 4 bis 7 Tage, dauern.
- Die Mikroorganismus-Zellen werden aus dem so erhaltenen kultivierten Produkt gesammelt, mit Wasser oder einem geeignete Puffer gewaschen, und die gewaschenen Zellen können beim Herstellungsverfahren der vorliegenden Erfindung verwendet werden.
- Als nächstes wird das erfindungsgemässe Plasmid und der erfindungsgemässe Mikroorganismus, der mit dem Plasmid transformiert wurde, beschrieben.
- Das Plasmid der vorliegenden Erfindung umfasst ein DNA- Fragment, das das Gen, das die Enzyme, die an der Biosynthese von Threonin teilhaben, codiert (Threonin- Operon), das in einem Mikroorganismus, der Biotin zu seinem Wachstum benötigt und zu den coryneformen Bakterien gehört, exprimiert werden kann, und die ein DNA-Fragment, das ein Gen enthält, das die autonome Replikation in coryneformen Bakterienzellen, wie oben beschrieben, codiert.
- Das DNA-Fragment, das das Gen enthält, das die Enzyme, die an der Biosynthese von Threonin teilnehmen, codiert (Threonin-Operon), und das in einem zu seinem Wachstum Biotin-benötigenden Mikroorganismus, der zu coryneformen Bakterien gehört, wie oben erwähnt, exprimiert werden kann, ist beispielsweise enthalten im Chromosom von Escherichia coli K12-Typ-Stämmen (z.B. ATCC 27325, ATCC 23282, ATCC 23437 etc.).
- Das DNA-Fragment, das ein Gen enthält, das die autonome Replikation in coryneformen Bakterienzellen codiert, wie oben erwähnt, ist beispielsweise in Plasmid pBY502, enthalten in Brevibacterium flavum MJ-233 (FERM BP-1497) (siehe japanische ungeprüfte Offenlegungsschrift Nr. 36787/1988), oder Plasmid pBY503 in Brevibacterium stationis IFO 12144 (FERN BP-2515) (siehe japanische ungeprüfte Offenlegungsschrift Nr. 95785/1989) enthalten. Das erfindungsgemässe Plasmid kann beispielsweise wie folgt hergestellt werden.
- Zuerst wird das DNA-Fragment, das die Gene enthält, die die Enzyme, die an der Threonin-Biosynthese teilnehmen, codiert (Threonin-Operon-DNA-Fragment) erhalten, indem man eine chromosomale DNA aus Escherichia coli K12-Typ-Stämmen (ATCC 27325, ATCC 23282, ATCC 23437) etc. präpariert, das Threonin-Operon-DNA-Fragment aus der chromosomalen DNA unter Verwendung eines Restriktionsendonuclease, wie BamHI, HindIII etc. ausschneidet, das Fragment mit den BamHI und HindIII-Stellen des Plasmids pBR325, abgeleitet von Escherichia coli, ligiert, wodurch es als Plasmid pB325-thr erhalten wird. Das DNA-Fragment, das ein Gel enthält, das die autonome Replikation in coryneformen Bakterienzellen codiert, wird beispielsweise erhalten aus dem Plasmid pBY502 als DNA-Fragment mit einem Molekulargewicht von etwa 4,1 Kb unter Verwendung einer Restriktionsendonuclease HindIII.
- Durch Ligierung des DNA-Fragments von etwa 4,1 Kb, das wie oben präpariert wurde, und des DNA-Fragments des obigen Plasmiden pBR325-thr, das in ähnlicher Weise mit Restriktionsendonuclease HindIII behandelt wurde, kann das gewünschte Plasmid pCRY21thr-1 erhalten werden.
- Durch Transformation eines zum Wachstum Biotinbenötigenden Mikroorganismus, der zu coryneformen Bakterien gehört, mit dem erfindungsgemässen Plasmid, das, wie oben beschrieben, erhalten wurde, kann der Mikroorganismus der vorliegenden Erfindung erhalten werden. Als zum Wachstum Biotin-benötigender Mikroorganismus, der zu coryneformen Bakterien gehört, werden Brevibacterium flavum MJ-233 (FERM BP-1497) oder daraus abgeleitete Stämme bevorzugt, wie oben beschrieben wurde.
- Die vorliegende Erfindung wird in grösserem Detail unter Bezug auf die folgenden Beispiele beschrieben, wodurch der Umfang der vorliegenden Erfindung in keiner Weise beschränkt wird.
- In den folgenden Beispielen wurden qualitative Charakteristika von L-Threonin durch den Rf-Wert bei der Dünnschichtchromatografie, der elektrophoretische Mobilität und biologische Aktivitätswerte aufgrund von mikrobiologischer quantitativer Bestimmung bestätigt. Die quantitative Analyse wurde durchgeführt, indem man in Kombination die Mikrobioassay-Methode unter Verwendung von Leuconostoc Mesenteroides ATCC 8042 und Hochleistungs- Flüssigchromatografie (Shimedzu LC-5A) verwendete. In den folgenden Beispielen bedeutet % Gew.%.
- 100 ml eines Mediums (Harnstoff 0,4 %, Ammoniumsulfat 1,4 %, KH&sub2;PO&sub4; 0,05 %, K&sub2;HPO&sub4; 0,05 %, MgSO&sub4; 7H&sub2;0 0,05 %, CaCl&sub2; 2H&sub2;O 2 ppm, FeSO&sub4; 7H&sub2;O 2 ppm, MnSO&sub4; 4-6H&sub2;O 2 ppm, ZnSO&sub4; 7H&sub2;O 2 ppm, NaCl 2 ppm, Biotin 200 ug/l, Thiaminhydrochlorid 100 ug/l, Casaminosäure 0,1 %, Hefeextrakt 0,1 %) wurden in einen Erlenmeyer-Kolben mit 500 ml Volumen geben und nach Sterilisierung (PH 7,0 nach Sterilisierung) wurde Brevibacterium flavum MJ-233 (FERM BP-1497) inokuliert und 2 ml Ethanol aseptisch zugegeben, gefolgt von Schüttelkultivierung bei 30ºC während 2 Tagen.
- Danach wurden 1000 ml des Hauptkulturmediums (Ammoniumsulfat 2,3 %, KH&sub2;PO&sub4; 0,05 %, K&sub2;HPO&sub4; 0,05 %, MgSO&sub4; 7H&sub2;O) 0,05 %, FeSO&sub4; 7H&sub2;O 20 ppm, MnSO&sub4; nH&sub2;O 20 ppm, Biotin 200 ug/l, Thiamin-hydrochlorid 100 ug/l, Casaminosäure 0,3 %, Hefeextrakt 0,3 %) in einen 2 Liter- Belüftungsrührtank gegeben und nach Sterilisation (120ºC, 20 Minuten) wurden 20 ml Ethanol und 20 ml des obigen Vorkulturprodukts zugegeben und die Kultivierung bei 1000 U/min unter einer Belüftung von 1 vvm, einer Temperatur von 33ºC und pH 7,6 48 Stunden durchgeführt.
- Ethanol wurde portionsweise alle 1 bis 2 Stunden zugegeben, so dass die Ethanolkonzentration im Medium 2 Vol.% während der Kultivierung nicht überstieg.
- Nach Beendigung der Kultivierung wurden die Zellen durch Zentrifugation aus 300 ml des kultivierten Produkts gesammelt und zweimal mit destilliertem Wasser gewaschen und in 1000 ml einer Reaktionsmischung (DL-Asparaginsäure 2 mg, Pyridoxalphosphorsäure 5 ug, Phosphatpuffer 100 umol, Ethanol 10 mg, pH 7,6, enthalten in 1 ml Reaktionsmischung) suspendiert und dann diese Suspension in einen 2-Liter-Belüftungsrührtank eingebracht. Dann wurden 20 ml Ethanol zugegeben und die Reaktion bei 300 U/min, einer Belüftun von 0,1 vvm, einer Temperatur von 33ºC und pH 7,6 10 Stunden ausgeführt.
- Nach Beendigung der Reaktion wurde L-Threonin im Überstand, der durch Zentrifugation von Mikroorganismen befreit wurde (4000 U/min, 15 Minuten, 4ºC) quantitativ bestimmt. Auch wurden 500 ml der Reaktionsmischung nach Beendigung der Reaktion durch eine Säule mit einem stark sauren Kationenaustauscherharz (H&spplus;-Form) geleitet, um darauf L-Threonin zu adsorbieren, mit Wasser gewaschen und dann mit 0,5 N Ammoniakwasser eluiert. Dann wurden die L-Threonin-Fraktionen konzentriert und L-Threonin- Kristalle mit kaltem Ethanol ausgefällt. Die Ergebnisse werden in der nachstehenden Tabelle 1 gezeigt. TABELLE 1 Menge an gebildetem L-Threonin (mg/l) Menge an gereinigtem L-Threonin (mg)
- Brevibacterium flavum MJ-233-A3-41 (FERM BP-1498) wurde unter denselben Bedingungen wie in Beispiel 1 kultiviert, und nachdem die Reaktion unter denselben Bedingungen wie in Beispiel 1 ausgeführt worden war, wurde L-Threonin im Überstand quantifiziert. Darüber hinaus wurden Kristalle von L-Threonin nach demselben Verfahren wie in Beispiel 1 ausgefällt. Die Ergebnisse werden in Tabelle 2 gezeigt. TABELLE 2 Menge an gebildetem L-Threonin (mg/l) Menge an gereinigtem L-Threonin (mg)
- Brevibacterium flavum MJ-233-ABT-11 (FEBM BP-1500) wurde unter denselben Bedingungen wie in Beispiel 1 kultiviert, und nachdem die Reaktion unter denselben Bedingungen wie in Beispiel 1 ausgeführt worden war, wurde L-Threonin im Überstand quantifiziert. Darüber hinaus wurden Kristalle von L-Threonin nach demselben Verfahren wie in Beispiel 1 ausgefällt. Die Ergebnisse werden in Tabelle 3 gezeigt. TABELLE 3 Menge an gebildetem L-Threonin (mg/l) Menge an gereinigtem L-Threonin (mg)
- Brevibacterium flavum MJ-233-ABD-21 (FERM BP-1499) wurde unter denselben Bedingungen wie in Beispiel 1 kultiviert, und nachdem die Reaktion unter denselben Bedingungen wie in Beispiel 1 ausgeführt worden war, wurde L-Threonin im Überstand quantifiziert. Darüber hinaus wurden Kristalle von L-Threonin nach demselben Verfahren wie in Beispiel 1 ausgefällt. Die Ergebnisse werden in Tabelle 4 gezeigt. TABELLE 4 Menge an gebildetem L-Threonin (mg/l) Menge an gereinigtem L-Threonin (mg)
- Dasselbe Verfahren wie in Beispiel 1 wurde ausgeführt, mit der Ausnahme, dass das während der Reaktion zugegebene Ethanol durch Glucose ersetzt wurde. Die Glucosekonzentration wurde auf 2 % eingestellt. Die Menge an L-Threonin, die im Überstand nach Beendigung der Reaktion gebildet worden war, und die gereinigte Menge werden in Tabelle 5 gezeigt. TABELLE 5 Menge an gebildetem L-Threonin (mg/l) Menge an gereinigtem L-Threonin (mg)
- Dasselbe Verfahren wie in Beispiel 1 wurde ausgeführt, mit der Ausnahme, dass die verwendete Reaktionsmischung während der Reaktion in Beispiel 1 ersetzt wurde durch: (NH&sub4;)&sub2;SO&sub4; 2 g/l, KH&sub2;PO&sub4; 0,5 g/l, K&sub2;HPO&sub4; 0,5 g/l, MgSO&sub4; 7H&sub2;O 0,5 g/l, FeSO&sub4; 7H&sub2;0 20 ppm, MnSO&sub4; 4-6H&sub2;O 20 ppm, Thiamin-hydrochlorid 100 ug/l, DL-Asparaginsäure 2 g/l (pH 7,6). Die Menge an gebildetem L-Threonin im Überstand nach Beendigung der Reaktion und die gereinigte Menge werden in Tabelle 6 gezeigt. TABELLE 6 Menge an gebildetem L-Threonin (mg/l) Menge an gereinigtem L-Threonin (mg)
- Plasmid pBY502 ist ein Plasmid mit einem Molekulargewicht von etwa 30 Megadalton, das aus Brevibacterium flavum MJ-233 (FERM BP-1497) separiert wurde, und ein Plasmid ist, das in der japanischen ungeprüften Offenlegungsschrift Nr. 36787/1988 offenbart ist. Plasmid pBY502 wurde, wie nachstehend beschrieben, hergestellt.
- In 1 l eines halbsynthetischen Mediums (A) ((Harnstoff 2 g, (NH&sub4;)&sub2;SO&sub4; 7 g, K&sub2;HPO&sub4; 0,5 g, KH&sub2;PO&sub4; 0,5 g, MgSO&sub4; 0,5 g, FeSO&sub4; 7H&sub2;O 6 mg, MnSO&sub4; 4 bis 6 H&sub2;O 6 mg, Hefeextrakt 2,5 g, Casaminosäure 5 g, Biotin 200 ug, Thiamin-hydrochlorid 200 ug, Glucose 20 g, reines Wasser auf 1 l) wurde Brevibacterium flavum MJ-233 (FERM BP-1497) bis zum späteren Stadium der logarithmischen Wachstumsphase kultiviert und die Zellen gesammelt. Die erhaltenen Zellen wurden in 20 ml enes Puffers [25 mM ris(hydroxymethyl)aminomethan, 10 mM EDTA, 50 mM Glucose], der Lysozym enthielt (Endkonzentration 10 mg/ml) gegeben und die Reaktion bei 37ºC während 1 Stunde ausgeführt. Zu der Reaktionsmischung wurden 40 ml einer Alkali-SDS-Lösung [0,2 N NaOH, 1 % (G/V) SDS] zugegeben, gefolgt von vorsichtigem Mischen, und die Mischung wurde bei Raumtemperatur 15 Minuten stehen gelassen.
- Als nächstes wurden zu der Reaktionsmischung 30 ml einer Kaliumacetat-Lösung [Mischlösung aus 5 M Kaliumacetat- Lösung 60 ml, Essigsäure 11,5 ml, reinem Wasser 28,5 ml] zugegeben, und nach gründlichem Mischen wurde die Mischung in Eis 15 Minuten stehen gelassen. Die Gesamtmenge an lysiertem Produkt wurde in ein Zentrifugenglas übertragen und bei 15.000 x g bei 4ºC 10 Minuten unter Bildung eines Überstands zentrifugiert.
- Zu dem Überstand wurde die gleiche Menge einer Phenol Chloroform-Mischung (Phenol Chloroform 1:1- Mischung) zur Bildung einer Suspension zugegeben, die dann in ein Zentrifugenglas übertragen wurde und bei 15.000 x g bei Raumtemperatur 5 Minuten zentrifugiert wurde, gefolgt von Gewinnung der wässrigen Schicht. Zu der wässrigen Schicht wurde eine 2-fache Ethanolmenge zugegeben und nach Stehenlassen bei -20ºC während 1 Stunde wurde die Mischung bei 15.000 x g bei 4ºC 10 Minuten zentrifugiert und die Niederschläge gewonnen.
- Die Niederschläge wurden unter reduziertem Druck getrocknet und dann in 2 ml TE-Puffer gelöst (Tris 10 mM, EDTA 1 mM, eingestellt mit HCl auf pH 8,0). Zu der Lösung wurden 15 ml einer Cäsiumchlorid-Lösung (eine Lösung aus 170 g Cäsiumchlorid in 100 ml eines TE-Puffers der 5-fachen Konzentration) und 1 ml einer 10 mg/ml Ethidiumbromid-Lösung gegeben, um die Dichte auf 1,39 2 g/ml einzustellen. Die Lösung wurde bei 116.000 x g bei 12ºC 42 Stunden zentrifugiert.
- Plasmid pBY502 wird als die untere Bande im Zentrifugenglas durch UV-Langwellenbestrahlung gefunden. Durch Abziehen der Bande mit einer Spritze aus der Seite des Zentrifugenglases wurde eine Fraktion, die Plasmid pBY502 enthielt, erhalten. Anschliessend wurde die Fraktion mit der gleichen Menge Isoamylalkohol viermal behandelt, um Ethidiumbromid durch Extraktion zu entfernen und dann gegen TE-Puffer dialysiert. Zu dem so erhaltenen Dialysat, das Plasmid pBY502 enthielt, wurde eine 3 M Natriumacetat-Lösung zugegeben, so dass die Endkonzentration 30 mM betrug, dann wurde die 2-fache Menge Ethanol zugegeben und bei -20ºC 1 Stunde stehen gelassen. Die Lösung wurde bei 15.000 x g zur Ausfällung der DNA zentrifugiert und etwa 20 ug Plasmid pBY502 wurden erhalten.
- 100 ml L-Medium (Trypton 10 g, Hefeextrakt 5 g, Glucose 1 g, NaCl 5 g, destilliertes Wasser 1 l, pH 7,2) wurden in einen Erlenmeyer-Kolben mit 500 ml Volumen abgefüllt und bei 120ºC 15 Minuten sterilisiert. In das Medium wurde Escherichia coli ATCC 27325 inokuliert, und nachdem die Kultivierung bei 37ºC 15 Stunden durchgeführt worden war, wurden 2 ml Kulturbrühe entnommen und wiederum in 100 ml des obigen Kulturmediums inokuliert, wiederum gefolgt von 4-stündiger Kultivierung bei 37ºC.
- Nach Beendigung der Kultivierung wurde die gesamte Kulturbrühe zentrifugiert (8000 x g, 15 Minuten, 4ºC), um die Zellen zu sammeln, die dann in 50 ml 50 mM Tris-Puffer (pH 8,0) -10 mM EDTA 2 Na-Lösung suspendiert wurden. Dann wurde Lysozym auf eine Endkonzentration von 2 mg/ml zugegeben und nach 5-minütigem Stehenlassen wurden 6 ml einer 10 %-igen Natriumdodecylsulfat-Lösung zugegeben, gefolgt von Inkubation bei 65ºC während 30 Minuten. Zur lysierten Lösung wurden 15 ml 5 M NaCl-Lösung zugegeben, auf 0ºC 1 Stunde gekühlt und die gesamte Menge der Mischung zentrifugiert (12.000 x g, 60 Minuten, 4ºC). Die Überstandsfraktion wurde gesammelt, mit der 2-fachen Ethanolmenge verdünnt und nach dem Mischen zentrifugiert, (5.000 x g, 10 Minuten, 4ºC). Die erhaltenen Niederschläge wurden in 10 mM Tris-Puffer (pH 7,5)-1 mM EDTA 2 Na-Lösung gelöst und einer Phenolbehandlung unterworfen (Protein- Entfernungsbehandlung) und einer Behandlung mit Ribonuclease unterworfen, was schliesslich 1,5 mg DNA ergab.
- Plasmid pBR325 ist ein Plasmid mit einem Molekulargewicht von 3,4 Megadalton, das in Escherichia coli repliziert wird und Chloramphenicol-, Tetracyclin- und Ampicillin- Resistenz autweist, und im Handel von Sigma Chemical Co. erhältlich ist.
- Eine Menge von 25 ug der im obigen Schritt (A) präparierten chromosomalen DNA wurde durch Verdauung mit den Restriktionsendonucleasen HindIII und BamHI (jeweils 50 Einheiten) bei 30ºC während 1 Stunde hergestellt, so dass eine Lösung aus HindIII- und BamHI-verdauten Produkten der chromosomalen DNA hergestellt wurde. Die verdaute Produktlösung wurde mit einer verdauten Produktlösung gemischt, die durch Spaltung von 1 ug Plasmid pBR325 durch Verdauung mit den Restriktionsendonucleasen HindIII und BamHI (jeweils 1 Einheit) bei 30ºC während 1 Stunde erhalten wurde, und 1 Einheit der jeweiligen Komponenten von 50 mM Tris-Puffer (pH 7,6), 10 mM Dithiothreitol, 1 mM ATP, 10 mM MgCl&sub2; und T4-DNA-Ligase wurden zugegeben (die Konzentrationen der jeweiligen Komponenten sind die Endkonzentrationen), und die Reaktion bei 16ºC während 15 Stunden ausgeführt, um Ligierung zu bewirken.
- Unter Verwendung dieser Lösung wurde nach einem herkömmlichen Verfahren [siehe M. Mandel, A. Higa: J. Mol. Biol. 53, 159 (1970)], der Escherichia coli K12-Stamm (ATCC 23728, benötigt L-Threonin, L-Leucin, Thiamin) transformiert und auf ein selektives Medium aufgebracht (K&sub2;HPO&sub4; 7 g, KH&sub2;PO&sub4; 2 g, (NH&sub4;)&sub2;SO&sub4; 1 g, MgSO&sub4;.7H&sub2;O 0,1 g, L-Leucin 50 mg, Thiamin-hydrochlorld 50 mg, Glucose 2 g Chloramphenicol 10 mg, Agar 20 g, destilliertes Wasser 1 l). Der auf dem Kulturmedium gezüchtete Stamm wurde in ein Medium inokuliert, das 30 ug/ml als Endkonzentration Chloramphenicol in L-Medium enthielt und das Plasmid aus den gewachsenen Stämmen nach der Alkali-SDS-Methode [siehe T. Maniatis, E.F. Fritsch, J. Sambrook: "Molecular Cloning" (1982), Seiten 90 bis 91] extrahiert. Als das Plasmid mit Restrikticnsendonuclease BamHI und HindIII gespalten wurde und sein Molekulargewicht unter Verwendung von Agarosegel überprüft wurde, fand man, dass eine DNA von etwa 6,0 Kb an den HindIII- und BamHI-Stellen von Plasmid pBR325 insertiert worden war.
- Als darüber hinaus der obige Wirt mit der Plasmid-Lösung retransformiert worden war, traten Stämme, die im selektiven Medium mit einer Frequenz von etwa 105 Zellen/ug DNA wuchsen, auf.
- Der in (A) erhaltene Plasmid pBY502 (10 ug) wurde durch die Reaktion bei 37ºC während 2 Stunden unter Verwendung einer Restriktionsendonuclease HindIII (50 Einheiten) verdaut.
- Ebenfalls wurden 0,5 ug des Plasmiden pBR325thr, der in (C) erhalten wurde, durch Reaktion bei 37ºC während 1 Stunde mit einer Restriktionsendonuclease HindIII (5 Einheiten) verdaut.
- Anschliessend wurden die beiden verdauten Produkte gemischt und die Restriktionsendonuclease durch Erwärmung auf 65ºC während 10 Minuten inaktiviert und die jeweiligen Komponenten in der inaktivierten Lösung verstärkt, so dass sich Endkonzentrationen von 50 mM Tris-Puffer, pH 7,6, 10 mM MgCl&sub2;, 10 mM Dithiotreitol, 1 mM ATP und 1 Einheit T4-Ligase jeweils ergaben, gefolgt von Inkubation bei 16ºC während 15 Stunden, um eine DNA-Ligierung zu bewirken.
- Ein Plasmid BY502-behandelter Stamm von Brevibacterium flavum MJ-233 wurde in 100 ml des obigen A-Mediums bis zum anfänglichen Stadium der logarithmischen Wachstumsphase kultiviert, Penicillin G wurde auf eine Endkonzentration von 0,2 Einheiten/ml zugegeben und dann wurde 2 Stunden eine Schüttelkultur durchgeführt. Die Mikroorganismus- Zellen wurden durch Zentrifugation gesammelt, die Zellen mit 50 ml einer TSMC-Puufferlösung aus 0,5 M Natriumsuccinat, 20 mM Tris(hydroxymethylaminomethan), 20 mM Calciumchlorid, 20 mM Magnesiumchlorid (pH 7,5) gewaschen, dann suspendiert in 10 ml eines TSMC-Puffers mit 4 mg/ml Lysozym und 1000 Einheiten (Unit)/ml Achromopeptidase, um die Protoplastenbildung durch Reaktion bei 30ºC während 16 Stunden auszuführen. Nach Beendigung der Reaktion wurde das Produkt bei 3000 U/min 10 Minuten zentrifugiert und dann der Protoplast mit 20 ml TSMC-Puffer gewaschen und wiederum in 3 ml TSMC-Puffer suspendiert.
- Der in (E) erhaltene Protoplast (200 ul) und die in (D) erhaltene DNA-Ligierungsmischung wurden zusammengemischt und nach Eiskühlung wurde Polyethylenglykol 6000 auf eine Endkonzentration von 20 % zugegeben. Dann wurde die Mischung etwa 3 Minuten eisgekühlt, 5 ml TSMC-Puffer zugegeben, zentrifugiert (3100 U/min, 10 Minuten) und dann in 3 ml A-Medium, das 0,5 M Sucrose enthielt, resuspendiert, gefolgt von Inkubation bei 30ºC während 2 Stunden.
- Die Kulturbrühe wurde auf ein Regenerationsmedium aufgebracht, das 7 ug/ml (Endkonzentration) Chlorampnenicol enthielt (Harnstoff 2 g, (NH&sub4;)&sub2;SO&sub4; 7 g, KH&sub2;PO&sub4; 0,5 g, K&sub2;HPO&sub4; 0,5 g, MgSO&sub4; 7H&sub2;O 0,5 g, FeSO&sub4; 7H&sub2;O 6 mg, MnSO&sub4; 4-6H&sub2;O 6 mg, Hefeextrakt 2,5 g, Casaminosäure 7,5 g, Biotin 200 ug, Thiamin-hydrochlorid 200 ug, Sucrose 171 g, Glucose 5 g, Gelatine 15 g, Agar (DIFCO) 8 g, die Gesamtmenge wurde mit destilliertem Wasser auf 1 l aufgefüllt). Nach Inkubation bei 30ºC während 3 bis 15 Tagen wurde die aufgetretene Kolonie in A-Medium mit 7 ug/ml Chloramphenicol transformiert und der Phenotyp der Chloramphenicol-Resistenz bestätigt.
- (G) Aus dem in (F) erhaltenen Chloramphenicolresistenten Stamm wurde ein Plasmid nach dem Verfahren von (A) hergestellt. Das Molekulargewicht des Plasmids wurde mit verschiedenen Restriktionsendonucleasen bestimmt (Tabelle 7). TABELLE 7 Restriktionsendonuclease Zahl der Erkennungsstellen Molekulargewicht Megadalton (Werte in Klammern zeigen Kb) HindIII BamHI SmaI SalI PstI EcoRI
- Das durch die obigen Restriktionsendonucleasen charakterisierte Plasmid wurde als pCRY21thr-1 bezeichnet.
- Kompetitierende Zellen vom Escherichia coli K12-Typ (ATCC 23738) die nach einem herkömmlichen Verfahren hergestellt wurden (M. Mandel, H. Higa: J. Mol. Biol. 53, 159 (1970)) wurden mit dem Plasmid pCRY2thr-1 transformiert und auf das selektive Medium aufgebracht, wie in (C) beschrieben wurde, wodurch transformierte Zellen in einer Frequenz von 10&sup5; Zellen pro 1 ug pCRY2thr-1 erhalten wurden. Weiterhin wurden 10 Stämme der transformierten Zellen in ein L-Medium, das 30 ug/ml als Endkonzentration an Chloramphenicol enthielt, übertragen und das Plasmid durch die alkalische SDS-Methode extrahiert, mit verschiedenen Restriktionsendonucleasen gespalten und sein Molekulargewicht durch Agarose-Gelelektrophorese als gleich zu dem des Plasmiden pCRY2thr-1 (Tabelle 7), der aus den transformierten Brevibacterium flavum-Zellen erhalten wurde, bestimmt. Dies zeigt an, dass pCRY2thr-1 ein Plasmid ist, das in Brevibacterium flavum MJ-233, das eine coryneforme Bakterienart darstellt, und in Escherichia coli replizieren kann und zeigt weiterhin, dass das aus dem transformierten Brevibakterium flavum MJ-233 erhaltene Plasmid pCRY21thr-1 das aus Escherichia coli abgeleitete Threonin-Operon enthält.
- Das mit dem Plasmiden pCRY21thr-1 transformierte Brevibakterium flavum MJ-233GE1002 wurde hinterlegt beim Institute of Fermentation Research, Agency of Industrial Science and Technology, 1-3, Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki Prefecture, Japan, am 13. September 1988 unter der Hinterlegungs-Nr. gemäss Budapester Bertrag Nr. FERM BP-2050 (inländische Hinterlegungs-Nr. FERM P-9803).
- Das selbe Verfahren wie in Beispiel 1 ausgeführt, mit der Ausnahme, dass Brevibakterium flavum MJ-233GE1002 (FERM BP-2050) anstelle von Brevibakterium flavum MJ-233 (FERM BP-1497) in Beispiel 1 verwendet wurde. Die Ergebnisse werden in Tabelle 8 gezeigt. TABELLE 8 Menge an gebildetem L-Threonin (mg/l) Menge an gereinigtem L-Threonin (mg)
- Dasselbe Verfahren wie in Beispiel 8 wurde ausgeführt, mit der Ausnahme, dass das während der Reaktion zugegebene Ethanol durch Glucose ersetzt wurde. Die Glucosekonzentration wurde auf 2 % eingestellt. Die Menge an im Überstand gebildetem L-Threonin nach Beendigung der Reaktion und die gereinigte Menge werden in Tabelle 9 gezeigt. TABELLE 9 Menge an gebildetem L-Threonin (mg/l) Menge an gereinigtem L-Threonin (mg)
- Dasselbe Verfahren wie in Beispiel 8 wurde ausgeführt, mit der Ausnahme, dass die während der Reaktion in Beispiel 8 verwendete Reaktionsmischung ersetzt wurde durch (NH&sub4;)&sub2;SO&sub4; 2 g/l, KH&sub2;PO&sub4; 0,5 g/l, K&sub2;HPO&sub4; 0,5 g/l, MgSO&sub4; 7H&sub2;O 0,5 g/l, FeSO&sub4; 7H&sub2;O 20 ppm, MnSO&sub4; 4-6H&sub2;O 20 ppm, Thiaminhydrochlorid 100 ug/l, DL-Asparaginsäure 2 g/l (pH 7,6). Die Menge an gebildetem- L-Threonin im Überstand nach Beendigung der Reaktion und die gereinigte Menge werden in Tabelle 10 gezeigt. TABELLE 10 Menge an gebildetem L-Threonin (mg/l) Menge an gereinigtem L-Threonin (mg)
Claims (11)
1. Verranren zur Herstellung von L-Threonin, umfassend:
(i) enzymatische Umsetzung von mindestens L-
oder DL-Asparaginsaure oder einem ihrer Salze mit
Ethanol und/oder Glucose in einer Biotin-freien
wässrigen Lösung in Gegenwart von Zellen des
Biotinbenötigenden Mikroorganismus Brevibacterium flavum
MJ-233 (FERM BP-1497) oder eines davon abgeleiteten
Mutantenstamms, die in der Lage sind, L-Threonin
unter diesen Bedingungen herzustellen; und
(ii) Gewinnung von L-Threonin aus der
Reaktionsmischung.
2. Verfahren gemäss Anspruch 1, dadurch
gekennzeichnet, dass der
Biotinbenötigende Mikroorganismus ausgewählt ist aus:
Brevibacterium flavum MJ-233 (FERM BP-1497)
Brevibacterium flavum MJ-233-AB-41 (FERM BP-1498)
Brevibacterium flavum MJ-233-ABT-11 (FERM BP-1500)
und Brevibacterium flavum MJ-233-ABD-21 (FERM
BP-1499).
3. Verfahren gemäss Anspruch 1, dadurch
gekennzeichnet, dass der
Biotinbenötigende Mikroorganismus ein Brevibacterium flavum
MJ-233 ist, das mit einem rekombinanten Plasmid
transformiert wurde, welches umfasst:
a) ein DNA-Fragment, das mindestens ein Gen
enthält, das die Biosynthese von L-Threonin aus L-
oder DL-Asparaginsäure oaer einem Salz davon codiert,
das in aen ZeLlen eines Biotin-benötigenden
Mikroorganismus, der zu den coryneformen Bakterien
gehört, exprimiert werden kann und aus einem
Chromosom eines Escherichia coli K12-Stamms isoliert
wird; und
(b) ein DNA-Fragment, das ein Gen enthält, das
die autonome Replikation in coryneformen Bakterien
codiert und aus dem Plasmid pBY502 isoliert wird.
4. Verfahren gemäss Anspruch 3, dadurch
gekennzeichnet, dass das rekombinante
Plasmid ein Molekulargewicht von 9,9 Megadalton
(15,2 Kb) hat und die Zahl der Erkennungsstellen
durch die Restriktionsendonucleasen HindIII, BamHI,
SmaI, SaII, PstI und EcoRI 2, 2, 1, 4, 1 bzw. 2
beträgt.
5. Verfahren gemäss Anspruch 4, dadurch
gekennzeichnet, dass das rekombinante
Plasmid ein Plasmid pCRY21thr-1 ist.
6. Verfahren gemäss Anspruch 3, dadurch
gekennzeichnet, dass das
Brevibacterium flavum MJ-233, das mit dem
rekombinanten Plasmid transformiert wurde,
Brevibacterium flavum MJ-233GE1002 (FERM BP-2050)
ist.
7. Verfahren zur Herstellung von L-Threonin, umfassend
die enzymatische Reaktion von mindestens L- oder
DL-Asparaginsäure oder einem ihrer Salz ein einer
Diotin-freien wässrigen Lösung in Gegenwart eines
Mikroorganismus und Gewinnung des gebildeten
L-Threonin, dadurch gekennzeichnet
dass der Mikroorganismus zu den coryneformen
Bakterien gehört, Biotin zu seinem Wachstum benötigt,
und mit einem Plasmid transformiert wurde, das ein
DNA-Fragment umfasst, das mindestens ein Gen, das die
Biosynthese von Threonin codiert, enthält, und in
einem Mikroorganismus, der zu den coryneformen
Bakterien gehört und Biotin zu seinem Wachstum
benötigt, exprimiert werden kann, und ein DNA-
Fragment umfasst, das ein Gen enthält, das die
autonome Replikation in coryneformen Bakterien
codiert.
8. Verfahren gemäss Anspruch 7, dadurch
gekennzeichnet, dass das coryneforme
Bakterium Brevibacterium flavum MJ-233 oder ein
daraus abgeleiteter Stamm ist.
9. Verfahren gemäss Anspruch 7, dadurch
gekennzeichnet, dass das Gen, das die
Biosynthese von Threonin codiert, aus dem Chromosom
eines Escherichia coli-Stamms vom K12-Typ stammt.
10. Verfahren gemäss Anspruch 7, dadurch
gekennzeichnet, dass das DNA-Fragment,
das ein Gen enthält, das die autonome Replikation in
coryneformen Bakterien codiert, ein DNA-Fragment ist,
das aus dem Plasmid pBY502 stammt.
11. Verfahren gemäss Anspruch 7, dadurch
gekennzeichnet, dass das Plasmid ein
Molekulargewicht von 9,9 Megadalton (15,2 Kb) hat und
die Zahl der Erkennungsstellen durch die
Restriktionsendonucleasen HindIII, BamHI, SmaI, SalI,
PstI bzw. EcoRI 2, 2, 1, 4, 1 bzw. 2 beträgt.
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