DE3882727T2

DE3882727T2 - Mycoplasma-Membran-Antigene und ihre Verwendung.

Info

Publication number: DE3882727T2
Application number: DE19883882727
Authority: DE
Inventors: Yehudith Naot
Original assignee: Dimotech Ltd
Current assignee: Dimotech Ltd
Priority date: 1987-02-05
Filing date: 1988-01-29
Publication date: 1993-12-02
Anticipated expiration: 2008-01-30
Also published as: EP0278340A3; JPH01257264A; EP0278340A2; DE3882727D1; EP0278340B1

Description

Erfindungsgebiet

Die Erfindung betrifft ein Mycoplasma-Membran- Antigenprodukt, ein Verfahren zu seiner Herstellung und Verwendung desselben zur Diagnose von Mycoplasma- Infektionen.

Hintergrund der Erfindung

Mycoplasmen sind die Ursache vieler Erkrankungen, wie etwa bestimmter Arten von Atemwegsentzündungen, z. B. Lungenentzündung, und bestimmten Harnwegsinfektionen sowohl bei Menschen als bei nicht-menschlichen Tieren. Wegen ihrer langsamen Vermehrungs- und Wachstumsgeschwindigkeit und den hohen Kosten des benötigten Nährmediums kann die Diagnose von Mycoplasma-Infektionen routinemäßig nicht durch Kultivierungsverfahren bewerkstelligt werden. Demgemäß beruhen gegenwärtig eingesetzte Verfahren zum Nachweis von Mycoplasma-Infektionen auf dem Nachweis von Antikörpern durch immunologische Tests, wie etwa zum Beispiel Komplementfixierungstest und ELISA (Enzyme Linked Immunoabsorbent Assay), und umfassen den Nachweis von Antikörpern gegen Mycoplasma in Körperflüssigkeiten.
Immunologische Tests für den Nachweis von Mycoplasma- Antikörpern im Serum beruhen auf der Reaktion dieser Antikörper mit den Mycoplasma-Antigenen, von denen ein Hauptteil in der Zellmembran angeordnet ist. Bisher wurden, für die Durchführung solcher Tests, Mycoplasma-Zellen lysiert, und die lysierten Zellen, die die Zellmembran (einschließlich all ihrer verschiedenen Bestandteile) und damit verbundene Komponenten (wie etwa die DNA) einschlossen, wurden als das Antigen verwendet. Sogar solche Methoden, die im allgemeinen für ihre Spezifität und Genauigkeit bekannt sind, erwiesen sich jedoch als ungenau und unzuverlässig beim Nachweis von durch Mycoplasma induzierten Infektionen, unter anderem wegen Kreuzreaktivität zwischen Mycoplasma-Antigenen verschiedener Spezies und ihren Antikörpern, was zu vielen falschen Positiv- und falschen Negativ-Ergebnissen führt.
Die Beschränkungen des ELISA-Verfahrens für den Nachweis von Mycoplasma-Infektionen werden von O. Onoviran et. al. (Veterinary Record, 105: S. 165-167) im Zusammenhang mit Mycoplasma mycoides wie folgt zusammengefaßt:
"ELISA ist nicht vollständig spezifisch, da es eine geringe Kreuzreaktion zwischen positiven ansteckenden Rinder-Pleuoropneumonin-Seren und anderem Mycoplasma als Mycoplasma mycoides gab".
Von ELISA ist bekannt, daß er ein sehr genauer immunologischer Test ist. Die obige Beschränkung trifft demgemäß in verstärktem Maße auf andere immunologische Tests zu, wie etwa Radioimmuntest, Immunofluoreszenz, Immunodiffusion, Komplementfixierung, indirekte Hämagglutinierung und Chemolumineszenz.

Aufgabe der Erfindung

Es ist eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, spezifischere Mycoplasma-Membran-Antigene zur Verwendung in immunologischen Verfahren zur Diagnose von Mycoplasma- Infektionen zur Verfügung zu stellen, um dadurch Diagnoseverfahren bereitzustellen, die im wesentlichen frei sind von falschen Positiv- und falschen Negativ-Ergebnissen zur Verwendung sowohl in der Human- als auch in der Veterinärmedizin.
Weitere Aufgaben der vorliegenden Erfindung werden aus der folgenden Beschreibung und den angefügten Ansprüchen deutlich werden.

Allgemeine Beschreibung der Erfindung

Gemäß der vorliegenden Erfindung wurde festgestellt, daß eine fragmentierte Mycoplasma-Membran, die im wesentlichen frei von DNA und RNA ist, mit Vorteil zur Diagnose von Mycoplasma-Infektionen mit im wesentlichen keinen falschen Positiv- und falschen Negativ-Ergebnissen verwendet werden kann
Gemäß einem Aspekt der vorliegenden Erfindung wird somit Mycoplasma-Antigenmaterial zur Verfügung gestellt, das ein fragmentiertes Mycoplasma-Membranmaterial ist, das in wesentlichen frei von DNA und RNA ist (im weiteren "Mycoplasna-Antigen").
Überraschenderweise und aus Gründen, die noch nicht vollständig aufgeklärt sind, ist eine Antigen-Antikörper- Reaktion, die mit einem Mycoplasma-Antigen gemäß der Erfindung durchgeführt wird, spezifisch mit praktisch keinerlei Kreuzreaktionen, im Gegensatz zu den Kreuzreaktionen und der daraus folgenden unzulänglichen Spezifität der bekannten Zubereitungen aus vollständigen Mycoplasma-Zellen und lysierten Mycoplasma-Zellen.
Gemäß einer Ausführungsform dieses Aspekts der Erfindung liegt das Mycoplasma-Antigen in wäßriger Suspension vor. Eine solche Suspension kann in einigen immunologischen Verfahren zum Nachweis von Mycoplasma-Antikörpern, wie etwa bei der Immunodiffusion und der Komplementfixierung, verwendet werden.
Gemäß einer anderen Ausführungsform dieses Aspekts der Erfindung sind die Mycoplasma-Antigene an einen festen Träger gebunden, wie etwa zum Beispiel eine Platte mit einer Vielzahl von Vertiefungen (wells), Kunststoffstreifen, Perlen und der- gleichen, die sie für immunologische Techniken, wie etwa ELISA und Radioimmuntests, geeignet machen.
Das Mycoplasma-Antigen gemäß der Erfindung kann hergestellt werden, indem eine Suspension von gereinigten Mycoplasma- Membranen einer Verdauung durch DNAse (Desoxyribonuklease) und RNAse (Ribonuklease) und einer Beschallung unterworfen wird.
Vorzugsweise geht die DNAse- und RNAse-Verdauung der Beschallung voraus, wobei die letztere sowohl zur Fragmentierung der Mycoplasma-Zellmembranen als auch zur Zerstörung der DNAse und RNAse in der Suspension dient.
Typischerweise werden 100-500 K-Einheiten DNAse pro 1 mg Membranprotein im Verdauungsverfahren verwendet. Es wurde festgestellt, daß die bevorzugte RNAse-Menge im Verdauungsverfahren bei 10-50 K-Einheiten pro 1 mg Membranprotein liegt.
Um beste Ergebnisse zu erzielen, muß Sorgfalt darauf verwandt werden, daß die verwendete DNAse und RNAse im wesentlichen frei von Proteasen ist, da diese die Proteine der Antigen-Stellen der Membrane verdauen kann, was die letztere weniger antigenisch und soinit weniger geeignet für den Nachweis von Mycoplasma-Antikörpern in Körperflüssigkeiten macht.
Vorzugsweise ist die Beschallung intermittierend und wird über mehrere Zeitspannen durchgeführt, wobei jede etwa 40-90 Sekunden dauert, z. B. dreimal für jeweils etwa 60 Sekunden. Es wurde festgestellt, daß ein aus solch einer Beschallung erhaltenes Mycoplasma-Antigen zur Verwendung bei der Diagnose von Mycoplasma-Infektionen gegenüber einem Antigen, das zum Beispiel durch drei Minuten kontinuierliche Beschallung erhalten wird, überlegen ist.
Es wurde festgestellt, daß das im wesentlichen DNA- und RNA- freie Mycoplasma-Antigen gemäß der Erfindung in seiner Bindung an Antikörper gegen Mycoplasna spezifisch ist, im Gegensatz zu den vollständigen lysierten Mycoplasma-Zellen, die gemäß dem Stand der Technik verwendet wurden. Zur Diagnose kann das Mycoplasma-Antigen gemäß der Erfindung in entweder nativer Form oder konjugiert mit einem geeigneten Marker verwendet werden.
Es wurde festgestellt, daß Mycoplasma-Antigene (wie hier definiert), die mit einen geeigneten Marker konjugiert sind, besonders geeignet zum Nachweis von Mycoplasma-Antikörpern in Körperflüssigkeiten durch verschiedene immunologische Verfahren sind, wie etwa Radioimmuntest, ein modifiziertes ELISA-Verfahren und dergleichen, wobei ELISA besonders bevorzugt ist.
Daher wird gemäß einem zweiten Aspekt der vorliegenden Erfindung ein Mycoplasma-Antigen/Marker-Konjugat (im weiteren "Konjugat") zur Verfügung gestellt, das aus einem im wesentlichen von DNA und RNA freien, fragmentierten Membranmaterial besteht, das an einen geeigneten Marker gebunden ist. Die Marker-Einheit kann zum Beispiel ein Enzym sein und solch ein Konjugat ist für Tests nach dem ELISA- Verfahren geeignet.
Beispiele für Enzym-Marker, die gemäß diesem zweiten Aspekt der vorliegenden Erfindung zu verwenden sind, sind alkalische Phosphatase, Merrettich-Peroxidase, - Galactosidase, Glucose-6-phosphat-Dehydrogenase, Glucose- Oxidase, Lysosym, Glucoamylase und Maleat-Dehydrogenase, die in der Technik in verschiedenen Enzymimmuntests verwendet werden (Brian Wisdom Clin. Chemistry 22(8); 1243-1255, 1976). Unter den obigen werden alkalische Phosphatase, Meerrettich-Peroxidase und Galactosidase am häufigsten verwendet und sind somit auch zur Verwendung als Enzym- Markierungen gemäß der vorliegenden Erfindung bevorzugt.
Zusätzlich zu Enzym-Markern können auch andere Marker verwendet werden, wie etwa radioaktive Substanzen, fluoreszierende Farbstoffe, Biotin-Avidin-Komplexe und Chemilumineszenz, was das Konjugart entsprechend dem verwendeten Marker geeignet für verschiedene immunologische Verfahren macht.
Ein Konjugat (wie hier definiert) gemäß der Erfindung wird aus einer Ausgangssuspension, die ein Mycoplasma-Antigen (wie hier definiert) und den damit zu verbindenden Marker umfaßt, hergestellt und die Verknüpfung mit Verfahren durchgeführt, die zur Bindung von Markern an Membranproteine in der Technik bekannt sind. Wo zum Beispiel ein Enzym- Marker mit dem Mycoplasma-Antigen verbunden wird, kann das Konjugat durch die Zugabe von Glutaraldehyd zur Suspension zur Bildung induziert werden. Andere Agenzien, die zur Konjugation eines Enzyms an einem Mycoplasma-Antigen verwendet werden können, sind zum Beispiel Periodat und S.P.D. P. [N-Succinimidyl 3-(2-pyridyldithio)propionat].
Gemäß dem zweiten Aspekt der vorliegenden Erfindung wurde überraschenderweise festgestellt, daß, wenn der besagte Marker das Enzym alkalische Phosphatase ist, die höchste Aktivität von Konjugat aus einer Ausgangssuspension erhalten wird, die etwa 800-1200 Einheiten [Einheit definiert als die Enzymmenge, die 1,0 uMol p-Nitrophenylphosphat pro Minute bei einem pH von 10,4 (eingestellt mit Glycin-Puffer) bei 37ºC hydrolysieren wird] Enzym pro 1 mg Protein im Mycoplasma-Antigen, umfaßt.
Mit einem dritten Aspekt stellt die Erfindung ein in-vitro- Verfahren zur Diagnose von Mycoplasma-Infektionen durch den Nachweis von Antikörpern gegen Mycoplasma in einer Körperflüssigkeit mit Hilfe eines Mycoplasma-Antigens oder - Konjugats (beide wie hier definiert) zur Verfügung.
Das Verfahren, das diesen dritten Aspekt der Erfindung darstellt, ist sowohl in der Human- als auch in der Veterinärmedizin anwendbar.
Beispielsweise wird eine zu testenden Körperflüssigkeitsprobe, die, falls erwünscht, verdünnt werden kann, mit einer Matrix, wie etwa einer Mikro-ELISA- Vertiefung, die mit wenigstens einer Art von Anti-Isotyp- Antikörpern vorbeschichtet worden ist, die ausgewählt ist aus der Gruppe von Anti-IgM, Anti-IgG, Anti-IgA, Anti-IgD und Anti-IgE, für einen Zeitraum inkubiert, der zur Bindung von Immunglobulin-Isotypen, die in der Körperflüssigkeitsprobe vorliegen, an die Anti-Isotyp- Antikörper, die an die Matrix gebunden sind, ausreicht. Nach Entfernung des Überschusses, nicht-gebundene Körperflüssigkeitskomponenten, wird die Matrix mit einer Suspension eines Mycoplasma-Antigen Marker-Konjugats inkubiert und die Menge an besagtem Marker-Konjugat auf der Matrix wird bestimmt.
Das Vorhandensein und der Gehalt an Antikörpern gegen eine spezifische Mycoplasma-Spezies in besagter Körperflüssigkeit wird bestimmt, indem die Konjugatmenge auf der Matrix, erhalten aus der getesteten Körperflüssigkeit, mit der Menge, die aus einen ähnlichen Test erhalten wird, in dem Kontrollproben (kontrollpositiv und kontrollnegativ) von Anti-Mycoplasma-Antikörpern verwendet werden, verglichen wird, und auf diese Weise wird eine Mycoplasma-Infektion diagnostiziert.
Wenn die Marker-Einheit des Konjugats ein Enzym ist, wie etwa alkalische Phosphatase, wird die Bestimmung des Konjugats auf der Matrix den Schritt umfassen, daß ein Substrat für das konjugierte Enzym zu der inkubierten Mischung zugegeben wird, und nach einer angemessenen Inkubationszeit wird die Konzentration eines solchen Substrats oder des Abbauproduktes desselben bestimmt. Im Falle alkalischer Phosphatase ist es zum Beispiel möglich, optisch den Gehalt des Abbauproduktes durch Messung des Extinktion der Lösung zu bestimmen,
Diagnose auf der Basis anderer Marker, wie etwa fluoreszierender Farbstoffe, radioaktiver Substanzen, Biotin-Avidin-Komplexen und Chemilumineszenz, kann durch per se bekannte herkömmliche Verfahren durchgeführt werden.
Mit einem vierten Aspekt stellt die Erfindung auch ein Kit zur Durchführung des in-vitro-Verfahrens zur Diagnose von Mycoplasma-Infektionen gemäß der Erfindung zur Verfügung, wobei der Kit umfaßt:
(a) eine Matrix, die einen oder mehrere Typen von Anti- Isotyp-Antikörpern trägt, ausgewählt aus der Gruppe, die aus Anti-IgM, Anti-IgG, Anti-IgE, Anti-IgD und Anti-IgA besteht;
(b) eine Menge an Konjugat (wie hier definiert);
und, wo die Markereinheit besagten Konjugats ein Enzym ist,
(c) ein Substrat für eine enzymatische Reaktion.
Der Kit gemäß der Erfindung kann auch eine oder mehrere Standard-Kontrollseren (kontrollpositiv und/oder kontrollnegativ) umfassen, mit denen die aus einem Testserum erhaltenen Ergebnisse verglichen werden können.
Die Kits gemäß der Erfindung sind zur Verwendung in der Human- und Veterinärmedizin geeignet.
Die Mycoplasma-Antigene der vorliegenden Erfindung erfüllen ein lang gehegtes Bedürfnis, indem sie zum ersten Mal ermöglichen, Mycoplasma-Infektionen im wesentlichen ohne falsche Positiv- und falsche Negativergebnisse zu diagnostizieren.

Beschreibung einer spezifischen Ausführungsform

Im folgenden wird eine detaillierte Beschreibung unter Bezugnahme auf eine spezifische Ausführungsform der verschiedenen Aspekte der vorliegenden Erfindung gegeben, nämlich die Gewinnung gereinigter Membranfragmente von Mycoplasma pneumoniae (im weiteren M. pneumoniae"); Herstellung eines Konjugats aus gereinigtem M. pneumoniae- Antigen mit dem Enzym alkalische Phosphatase; und Verwendung des Konjugats zur Diagnose einer M. pneumoniae-Infektion. Es sollte verstanden werden, daß dies nur beispielhaft ist und die Erfindung nicht darauf beschränkt ist.
Allgemein umfaßt die Durchführung der Erfindung die folgenden drei Schritte:

Schritt A - Herstellung von im wesentlichen DNA- und RNA- freien fragmentierten M. pneumoniae-Membranen

Die M. Pneumoniae-Zellen werden kultiviert, geerntet und lysiert, wie in der Technik bekannt [Tully, et al., Science 195: S. 892-894, (1977); Razin, S. in: Methods in Mycoplasmology, S. Razin and J. G. Tully (eds.) Academic Press New York (1983), Vol. 1, S. 225-233; Rottom, S., in: Methods in Mycoplasnology, S. Razin and J. G. Tully (eds.) Academic Press New York (1983) , Vol. 1, S. 221-223; Razin, S. and Rottom, in: Biochemical analysis of membranes, Maddy, A.H. (ed.), Chapman and Hall, London (1976) S. 3-26]. Lyse wird vorzugsweise durch Behandlung mit nicht-ionischem Tensid, wie etwa zum Beispiel Digitonin, oder mit Glyzerin, gefolgt von osmotischer Lyse, z. B. mit vorgewärmtem destillierten Wasser, durchgeführt. Die lysierte M. pneumoniae-Zellsuspension wird zentrifugiert und das Sediment (das im wesentlichen aus gereinigten M. pneumoniae- Membranen besteht) wird in einer Lösung einer phosphatgepufferten Kochsalzlösung (PBS) bei einem pH von etwa 7 resuspendiert.
Eine PBS-Lösung von DNAse und RNAse, die im wesentlichen frei von Protease ist und auch MgCl&sub2; enthält, wird mit der Suspension vermischt. Bei geeigneter Inkubation eliminiert dieser Schritt im wesentlichen Mycoplasma-Ribonuklein- und - Desoxyribonukleinsäuren und ihre Komplexe aus den Mycoplasma-Membranen. Es wurde festgestellt, daß die optimale Konzentration von DNAse und RNAse in den Bereichen von 100-500 K-Einheiten bzw. 10-50 K-Einheiten pro mg Membranprotein liegt.
Die enzymatische Reaktion wird durch die Zugabe von kalter PBS gestoppt und die Suspension wird zentrifugiert, der Überstand wird entfernt und das erhaltene Sediment wird in PBS resuspendiert und danach beschallt. Die Beschallung wird vorzugsweise für mehrere kurze Perioden von jeweils etwa 40 bis 90 Sekunden, z.B. dreimal bei 60 Sekunden, durchgeführt. Vorzugsweise nachdem die Suspension während der Beschallung, z. B. mit Hilfe eines Eisbades, abgekühlt ist.
Das resultierende Produkt wird zur weiteren Verarbeitung verwendet.

Schritt B - Konjugation von DNA- und RNA-freier fragmentierter M. pneumoniae-Membran mit dem Enzym alkalische Phosphatase

Alkalische Phosphatase wird in einer wässrigen Lösung von Ammoniumsulfat aufbewahrt. Um reine alkalische Phosphatase zu erhalten, muß das Ammoniumsulfat entfernt werden. Dies wird vorzugsweise durch Zentrifugieren der Lösung der alkalischen Phosphatase, Entfernung des Überstands und ein falkultatives zusätzliches Zentrifugieren erreicht, wodurch ein Sediment aus reiner alkalischer Phosphatase erhalten wird.
Die durch Schritt A oben erhaltene Suspension wird dem Sediment aus alkalischer Phosphatase zugemischt, wobei die Menge der Suspension derart ist, daß sichergestellt ist, daß etwa 800-1200 Einheiten alkalische Phosphatase pro 1 mg Mycoplasma-Membranproteine in der resultierenden Suspension vorhanden sein werden, die dann vorzugsweise in der Kälte (2-8ºC) gegen große Volumina PBS dialysiert wird. Nach Dialyse wird Glutaraldehyd zu einer Endkonzentration von 0,1-0,3 % (w/v), vorzugsweise etwa 0,2 % (w/v) zugegeben. Die Suspension wird dann bei Raumtemperatur inkubiert, bei einem pH im Bereich von etwa 6,5 bis 7,5, vorzugsweise 7,2- 7,4. Die resultierende Konjugat-Suspension wird gegen große Volumenteile PBS dialysiert, vorzugsweise bei niedrigen Temperaturen (2-8ºC).
Im Anschluß an die Dialyse wird die Suspension in einer Lösung aufbewahrt, die Tris-Puffer, Magnesiumchlorid (das als Coenzym dient), Natriumazid (das als Konservierungsmittel dient) und Rinderserumalbumin (das als Suspensionsstabilisator als ein Enzymaktivitätserhaltungsstoff dient) enthält.

Schritt C - Verwendung des Konjugats von Schritt B in einem ELISA-Test zur Bestimmung von Antikörpern gegen M. pneumoniae in einem Serum

Eine modifizierte ELISA-Methodologie wurde eingesetzt. Das übliche ELISA-Verfahren ist von Engvall und Perlmann (Immunochemistry 8: 871-874, (1971)) und von Van Weemen und Schuurs (F.E.B.S. Lett. 15: 232-236, (1971)) beschrieben.
Ein geeigneter Träger, z. B. eine ELISA-Platte mit 96 Vertiefungen, wird, wie per se bekannt, mit Anti-IgM, Anti- IgG, Anti-IgA, Anti-IgD und/oder Anti-IgE beschichtet. Nach dem Waschen werden die Vertiefungen nachbeschichtet, z. B. mit Rinderserumalbumin oder Fötalkalbsserum oder irgendeinem anderen geeigneten Material, und noch einmal gewaschen.
Proben des zu testenden Serums, die falls gewünscht, verdünnt sind, werden mit einem beschichteten Träger in Kontakt gebracht. Um die Genauigkeit und Verläßlichkeit der Ergebnisse zu erhöhen, kann es vorteilhaft sein, mehrere Paralleltests für jedes Serum durchzuführen. Jede Probe wird mit einem beschichteten Träger inkubiert und nach Abschluß der Reaktion wird jeder Träger gewaschen, um nichtabsorbierte Serumkomponenten zu entfernen.
Eine Suspension von Konjugat, erhalten in Schritt B oben, wird auf jeden Träger zugegeben, der dann inkubiert wird. Konjugat wird an den Träger gebunden und nach Abschluß wird überschüssiges Konjugat abgewaschen und eine wässrige Lösung eines Substrats für alkalische Phosphatase, z. B. p- Nitrophenylphosphat, wird mit dem Träger in Kontakt gebracht und der Träger mit der Lösung wird für eine zusätzliche Zeit, z. B. 60 Minuten, bei 37ºC inkubiert. Danach wird die optische Extinktion des enzymatischen Reaktionsproduktes, z. B. p- Nitrophenyl, unter Verwendung eines Spektrophotometers bestimmt, der Licht bei 405 nm erzeugt. In dem Fall, daß der Träger eine ELISA-Vertiefungsplatte ist, kann ein Mikro- ELISA-Spektrophotometer eingesetzt werden.
Parallele Kontrolltests (positiv, negativ und Mittelbereich positiv) können falls gewünscht, durchgeführt werden, und die aus dem getesteten Serum erhaltenen Ergebnisse werden damit verglichen.
Die Erfindung wird nun in den folgenden, nichtbeschränkenden Beispielen und Tests weiter spezifisch beschrieben werden:

Beispiel 1:

Herstellung von fragmentiertem, DNA- und RNA-freiem M. pneumoniae-Antigen

M. pneumoniae wurde in einer Art und Weise kultiviert, die zu derjenigen ähnlich war, die von Tully et al. beschrieben wird (1977 Science 195: S. 892-4). Die Mycoplasma-Zellen wurden durch Zentrifugation bei 14.000 g für 50 Minuten bei einer Temperatur von 4ºC geerntet und danach dreimal mit einer Lösung von 0,25 M Natriumchlorid gewaschen und die resultierende Zellsuspension wurde schließlich 100fach mit 0,25 M Natriumchloridlösung verdünnt.
Die Suspension wurde mit Digitonin (25 ug/ml) für 30 Minuten bei 37ºC inkubiert, gefolgt von der Zugabe von 10 Volumenteilen vorgewärmtem, doppelt destilliertem Wasser und weiterer Inkubation für 30 Minuten bei 37ºC. Die Suspension so erhaltener lysierter Zellen wurde bei 45.000 g für 90 Minuten zentrifugiert und das resultierende Sediment wurde in 0,1 PBS bei einem pH von 7,0 resuspendiert. Die Suspension von Mycoplasma-Membranen wurde bis zum weiteren Gebrauch bei -20ºC gehalten.
Eine Lösung von PBS (0,1 M bei pH 7,0), die DNAse (Typ IV, hergestellt von SIGMA, Katalog Nr. R-5025) und RNAse (Typ I, hergestellt von SIGMA, Katalog Nr. R-5503),die im wesentlichen proteasefrei sind, und Magnesiumchlorid (auf eine Endkonzentration von 0,02 M) enthielt, wurde mit der obigen M. pneumoniae-Membransuspension vermischt. Die Menge an zugegebener DNAse und RNAse betrug 200 K-Einheiten bzw. 20 K-Einheiten pro mg M. pneumoniae-Membranprotein. Die enzymatische Reaktion wurde durch die Zugabe eines zusätzlichen Volumenteils von kaltem PBS gestoppt und darauf folgte Zentrifugation bei 45.000 g für etwa 90 Minuten im Kalten.
Das Sediment wurde in PBS resuspendiert, wobei das Volumen des PBS so war, daß eine endgültige Proteinkonzentration von 5-20 mg/ml sichergestellt war. Die Suspension wurde 3mal bei 12 mA, niedrige Größe jedesmal für 60 Sekunden, beschallt und während der gesamten Beschallung wurde die Suspension in einem Eisbad gehalten.
Eine Suspension von gereinigten M. pneumoniae-FH- Membranfragmenten, die in wesentlichen frei von DNA und RNA waren, wurde erhalten.

Beispiel 2:

Konjugation der M. pneumoniae-Membran-Antigene mit dem Enzym alkalische Phosphatase

Alkalische Phosphatase ist kommerziell, in einem 3,2 M Ammoniumsulfat gelöst, erhältlich (SIGMA, Typ VII, Katalog Nr. P-5521 oder p-5526 mit einer Aktivität von etwa 1000 U/mg). Um das Ammoniumsulfat zu entfernen, wird die Lösung in 4ºC bei 1000 g für etwa 15 Minuten zentrifugiert, der Überstand wird entfernt und das Sediment wird einer zusätzlichen Zentrifugation wie oben unterworfen.
Der aus der Zentrifugation erhaltene Pellet aus alkalischer Phosphatase wurde mit der Suspension der M. pneumoniae- Membranfragmente vermischt, wobei die Mischsuspension etwa gleiche Mengen (gewichtsbezogen) von alkalischer Phosphatase und M. pneumoniae-Membranproteinen enthielt. Die Mischsuspension wurde in ein Dialyserohr überführt und Dialyse wurde über Nacht bei einer Temperatur von 2-8ºC gegen 500-1.000 Volumenteile PBS durchgeführt. Der Dialyse folgte die Zugabe vom Glutaraldehyd auf eine Endkonzentration von 0,2% w/v und Inkubation für zwei Stunden bei Raumtemperatur. PBS wurde in die resultierende Suspension zugegeben, die dann noch einmal bei einer Temperatur von 2-8ºC über Nacht gegen 500-1000 Volumenteile PBS dialysiert wurde.
Im Anschluß an die letzte Dialyse wurde die Suspension in eine Tris-Pufferlösung pH 8, die 0,05 M Tris, 0,001 M Magnesiumchlorid, 0,02% w/v Natriumazid und 5% w/v Rinderserumalbumin enthielt, überführt.
Eine Konjugatsuspension wurde so erhalten.

Beispiel 3:

Herstellung von DNA- und RNA-freien fragmentierten Mycoplasma-Membranen aus anderen Mycoplasma-Spezies

In ähnlicher Weise wie in Beispiel 1 wurden fragmentierte Membranprodukte, die im wesentlichen von DNA und RNA frei waren, aus den folgenden Mycoplasma-Spezies hergestellt:
M. pneumoniae PI 1428, M. hominis, M. fermentans, Ureaplasma urealyticum, M. orale, M. pulmonis, M. salivarium und Acholeoplasma laidlawii.

Beispiel 4:

Konjugation von M. pulmonis-Membran-Antigenen mit den Enzym alkalische Phosphatase

In einer ähnlichen Weise wie in Beispiel 2 wurden Konjugate von M. pulmonis-Antigenen von Beispiel 3 mit dem Enzym alkalische Phosphatase hergestellt.

Beispiel 5:

Verwendung des Konjugats von Beispiel 2 für den Nachweis spezifischer Antikörper in Serum durch das ELISA-Verfahren

Eine ELISA-Platte mit 96 Vertiefungen wurde mit per se bekannten Verfahren mit Anti-IgM-Antikörpern beschichtet und mit Rinderserumalbumin nachbeschichtet (Naot Y. and Remington J S., J. Infect. Dis. 142: 757-766, 1980).
Serum wurde auf Antikörper gegen M. pneumoniae in der folgenden Art und Weise getestet:
(a) Drei 100 ul-Proben Serum oder mit PBS verdünntes Serum wurden in drei vorbeschichtete Vertiefungen zugegeben und für 1 h bei 37ºC inkubiert.
(b) Überschüssiges Serum wurde entfernt und die Vertiefungen wurden dreimal mit einer PBS-Lösung mit pH 7,4, die auch 0,05% TWEEN 20 enthielt, mit einer 5minütigen Inkubationsperiode zwischen aufeinanderfolgenden Waschungen, gewaschen.
(c) Eine Suspension des Konjugats von Beispiel 2 wurde in die Vertiefungen zugegeben und für 1 h bei 37ºC inkubiert.
(d) Überschüssiges Konjugat wurde mit einer Vorgehensweise, die zu derjenigen von Schritt (b) ähnlich ist, abgewaschen.
(e) Eine Lösung, die 1 mg/ml p-Nitrophenylphosphat, 1 mM MgCl&sub2; und 0,05 M eines Carbonatpuffers enthielt und einen pH von 9,8 besaß, wurde in die Vertiefungen zugegeben und darin für zusätzliche 1 h bei 37ºC inkubiert.
(f) Die optische Dichte des enzymatischen Reaktionsproduktes wurde in den Vertiefungen unter Verwendung von Spektrophotometern mit einer Lichtwellenlänge von 405 nm bestimmt.
Zum Vergleich wurden Antikörper gegen M. pneumoniae in einer ähnlichen Weise mit nicht-erfindungsgemäßen Konjugaten (in Schritt (c)) getestet.
Die nach diesem Verfahren erhaltenen Ergebnisse sind in den Tests unten belegt:

Test Nr. 1:

Vergleich der Spezifität eines Konjugats mit alkalischer Phosphatase, hergestellt aus nicht-beschallten Membranen von M. pneumoniae-Zellen mit einem ähnlichen Konjugat aus beschallten Membranen von M. pneumoniae

Kontrollpositive und kontrollnegative Seren verschiedener Verdünnungsraten wurden gemäß dem Verfahren von Beispiel 1 getestet, wobei die in Stufe (c) desselben zugegebene Suspension entweder nicht-beschallte oder beschallte Membranen von Konjugat aus M. pneumoniae und alkalische Phosphatase umfaßte. Jede der Suspensionen umfaßte Membranproteine bei einer Konzentration von 10 ug/ml.
In jedem Fall wurde die optische Dichte des positiven (P) Kontrollserums und des negativen (N) Kontrollserums gemessen und das Verhältnis P/N wurde berechnet.
Die erhaltenen Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle 1 dargestellt und belegen, daß Fragmentation durch Beschallung die Empfindlichkeit des Testverfahrens signifikant erhöht. Tabelle 1 Alkalische Phosphatase, konjugiert an: Serumtyp EXTINKTION bei einer Serumverdünnung von: M. pneumoniae-Membranen beschallte M. pneumoniae-Membranen positives Serum negatives Serum

Test Nr. 2

Vergleich der Spezifität von Konjugat mit alkalischer Phosphatase, hergestellt aus beschallten Membranen von M. pneumoniae, mit einem ähnlichen Konjugat von DNA- und RNA- freier, beschallter M. pneumoniae-Membran gemäß der Erfindung (Mycoplasma-Antigen)

Kontrollpositive und kontrollnegatives Seren verschiedener Verdünnungsraten wurden gemäß dem Verfahren von Beispiel 5 getestet, wobei die in Stufe (c) desselben zugegebene Suspension entweder Konjugate mit alkalischer Phosphatase von beschallten Membranen von M. Pneumoniae oder von DNA - und RNA- freien beschallten Membranen von M. Pneumoniae gemäß der Erfindung umfaßte.
Verschiedene Konzentrationen der Konjugate wurden verwendet und die Ergebnisse der in jedem Fall gemessenen optischen Dichte, dargestellt in der folgenden Tabelle 2, belegt den merkbaren Anstieg in der Empfindlichkeit des erfindungsgemäßen Verfahrens gegenüber dem ähnlichen Verfahren, das Konjugate verwendet, die aus beschallten Membranen erhalten wurden. Tabelle 2 Alkalische Phosphatase, konjugiert an: Konjugat-Protein Konzentration Seren EXTINKTION bei einer Serumverdünnung von: M. pneumoniae-Antigene, beschallt M. pneumoniae-Antigene, verdaut mit DNAse & RNAse und beschallt positiv negativ

Test Nr. 3

Vergleich der Spezifität von Konjugaten mit alkalischer Phosphatase gemäß der vorliegenden Erfindung, erhalten bei verschiedenen Gewichtsverhältnissen von M. pneumoniae- Membranproteinen zu alkalischer Phosphatase.

Konjugation von beschallten, im wesentlichen DNA- und RNA- freien Membranen von M. pneumoniae mit alkalischer Phosphatase wurde, wie beschrieben, in einer Suspension durchgeführt, in der die Gewichtsverhältnisse von Membranprotein:alkalischer Phosphatase (SIGMA Typ VII) 4:1, 2:1 und 1:1 waren.
Vergleiche der Leistung dieser drei verschiedenen Konjugate wurden mit dem Verfahren gemäß Beispiel 5 durchgeführt, unter Verwendung eines positiven Kontrollserums, eines gering positiven Kontrollserums und eines negativen Kontrollserums als Kontrolle, alle 50fach gegenüber der ursprünglichen Konzentration verdünnt. Verschiedene Konzentrationen von Konjugaten wurden verwendet und in jeden Fall wurde die optische Dichte gemessen und das Verhältnis P/N wurde berechnet.
Die in der folgenden Tabelle 3 dargestellten Ergebnisse belegen, daß die höchste Empfindlichkeit erhalten wurde, wenn Konjugate verwendet wurden, die aus einem Membranproteine: alkalische Phosphatase-Verhältnis von 1: 1 hergestellt wurden. Da die Aktivität der alkalischen Phosphatase etwa 1000 U/mg beträgt, kann geschlossen werden, daß das beste Verhältnis von Enzym zu Membranproteinen 1000 U Enzym:1 mg Membranprotein ist. Tabelle 3 Konjugat, hergestellt bei einem Verhältnis von Mycoplasma-Antigenproteinen zu Enzym von: Konzentration der M. pneumoniae-Antigenproteine negatives Serum positives Serum gering positives Serum mittlere

Test Nr. 4:

Nachweis von Antikörpern gegen M. pulmonis in einem Rattenserum.

Eine ELISA-Platte mit 96 Vertiefungen wurde in einer ähnlichen Art und Weise wie Beispiel 5 mit Kaninchen- Antikörpern gegen Ratten-Immunglobuline beschichtet und dann mit Rinderserumalbumin nachbeschichtet.
Rattenpositive und -negative Seren, verdünnt bei verschiedenen Gehalt, wurden zu den Vertiefungen zugegeben und der Nachweis von Antikörpern wurden in einer zu Beispiel 5 ähnlichen Weise durchgeführt, wobei in Stufe (c) die Konjugate von Beispiel 4 verwendet wurden.
Die in Tabelle 4 dargestellten Ergebnisse belegen, daß negative Seren zu PBS ähnliche Ergebnisse zeigten und daß Antikörper gegen M. pulmonis sogar bei hohen Graden von Serumverdünnung klar nachgewiesen können. Tabelle 4 EXTINKTION 405 mm bei einer Serumverdünnung von: positives Serum negatives Serum

Test Nr. 5:

Spezifität des Verfahrens von Beispiel 4 beim klinischen Testen auf spezifische M. pneumoniae-Antikörper in Seren.

Mycoplasma-Antigene und -Konjugate wurden, wie in den Beispielen 1 und 2 beschrieben, hergestellt. Die folgenden Seren wurden auf M. pneunoniae-Antikörper gemäß dem Verfahren von Beispiel 5 getestet.
(a) 114 Serumproben, erhalten von 114 gesunden Freiwilligen;
(b) 238 Serumproben, erhalten von 204 Patienten, die an bakterieller oder viraler Lungenzündung litten;
(c) 60 Serumproben, erhalten von 60 Patienten mit hohen Titern von Rheumafaktor und Anti-Nuklear-Antikörpern oder beidem.
Es wurde mit dem IgM-ELISA-Verfahren von Beispiel 5 festgestellt, daß alle Seren für M. pneumoniae-spezifische Antikörper negativ waren, was die Spezifität des erfindungsgemäßen Verfahrens belegt.

Beschreibung der Zeichnungen

In den folgenden Tests 5 und 6 wird Bezug genommen auf die beigefügten Zeichnungen, in denen:
Fig. 1 eine graphische Dastellung ist, die Ergebnisse eines typischen Experiments zeigen, um die Spezifität von Mycoplasma-Antigen gemäß der Erfindung nachzuweisen;
Fig. 2 Elektrophoresemuster-Durchläufe von M. pneumoniae-Antigenen gemäß der Erfindung zusammen mit anderen M. pneumoniae-Antigenen und Molekulargewichtsstandards zeigt.

Test Nr. 6:

Spezifität von M. pneumoniae-Konjugaten, hergestellt gemäß der Erfindung.

Die Spezifität des Diagnoseverfahrens gemäß der vorliegenden Erfindung wurde getestet. Zu diesem Zweck wurden kontrollpositive und kontrollnegative Seren gemäß dem Verfahren von Beispiel 5 getestet. Mehrere Testreihen wurden durchgeführt. In einer Reihe wurde M. pneumoniae-FH-Konjugat zu den Mikrovertiefungen in Stufe (c) zusammen mit verschiedenen Konzentrationen von nicht-markiertem nativen M. pneumoniae- FH-Antigen zugegeben. In einer anderen Reihe wurde M. pneumoniae-FH-Konjugat zu den Mikrovertiefungen in Stufe (c) zusammen mit verschiedenen Konzentrationen von nichtmarkiertem nativen Archoleoplasma laidlawii-Antigenen zugegeben. In noch einer anderen Reihe wurde M. pneumoniae- Konjugat zu den Mikrovertiefungen in Stufe (c) zusammen mit PBS zugegeben.
Die Ergebnisse dieser Konkurrenzreaktionen sind in Fig. 1 dargestellt, in der die optische Extinktion, erhalten von entweder kontrollpositiven (volle Linien) oder kontrollnegativen (unterbrochene Linien), als eine Funktion der Mycoplasma-Antigenkonzentration aufgetragen ist. Die mit M. pneumoniae-Antigenen erhaltenen Ergebnisse sind durch leere Kreise ( ) dargestellt; die mit Acheoleoplasma laidlawii erhaltenen sind durch leere Quadrate ( ) dargestellt; die mit PBS erhaltenen sind durch Dreiecke dargestellt, entweder leer (Δ) für Ergebnisse mit kontrollpositiven Seren oder gefüllt ( ) für Ergebnisse mit kontrollnegativen Seren (die Balken zeigen die Standardabweichung des Mittelwerts). Der inhibitorische Effekt auf die Bindung des Konjugats an die Antikörper wird aus der Abnahme in der Extinktion deutlich und tritt nur mit nicht-markierten M. pneumoniae-Antigenen auf.
Eine ähnliche Bindungsinhibition wurde auch beobachtet, wenn nicht-markierte M. pneumoniae-PI-1428-Antigene von Beispiel 3 statt der nicht-markierten M. pneumoniae-Antigene zu den Microvertiefungen zugegeben wurden. Alle anderen Antigene von Beispiel 3 verhielten sich wie Acheoleoplasma laidlawii- Antigene.
Dieses Ergebnis belegt die Spezirität des Verfahrens gemäß der vorliegenden Erfindung.

Test Nr. 7:

Charakterisierung von DNA- und RNA-freien, beschallten M. pneumoniae-Antigenen der Erfindung auf SDS-Polyacrylamid- Gelelektrophorese (SDS-AGE) und Vergleich mit anderen M. pneumoniae-Antigenen

Zu testende Proben wurden in Probenpuffer gelöst (der aus 1% SDS, 7mM 2- -Mercapthoethanol, 10% Glyzerin und 50 mM Tris- HCl-Puffer bei einem pH von 6,8 bestand), auf 100ºC für 10 Minuten erhitzt, und zusammen mit Molekulargewichtstandards auf Gel beschichtet. SDS-PAGE wurde auf 7,5% Separating- Slab-Gelen mit 4% Stacking-Gel durchgeführt, wie in der Technik bekannt (vgl. Laemmli U. K., 1970, Nature, London 227: 680; Weber, K. und Osborn, M., 1969, J. Biol. Chem. 244: 4406). Elektrophorese wurde unter einem konstanten 12 uA-Strom für 16 Stunden durchgeführt.
Die Ergebnisse sind in Fig. 2 dargestellt, in der:
A und B Durchläufe von Molekulargewichtsstandards sind;
C ein Durchlauf einer Probe von M. pneumoniae-Membranen ist;
D ein Durchlauf einer Probe von beschallten M. pneumoniae- Membranen ist;
E ein Durchlauf mit durch DNAse und RNAse verdauten M. pneumoniae-Membranen ist;
F ein Durchlauf mit beschallten, mit DNAse und RNAse verdauten M. Pneumoniae-Membranen, hergestellt gemäß Beispiel 1, ist.
Es wurde so festgestellt, daß das Molekulargewicht der Proteine in den M. pneumoniae-Antigenen gemäß der Erfindung
(F) im Bereich von 10.000 bis 60.000 Daltons liegt.
Wenn verglichen mit anderen M. pneumoniae-Antigenen, die nicht erfindungsgemäß sind, ist es offensichtlich, daß das M. pneumoniae-Antigen gemäß der Erfindung aus weniger Arten von Proteinen besteht.

Claims

1. Fragmentiertes Mycoplasma-Membranmaterial, das hier als Mycoplasma-Antigen bezeichnet wird, dadurch gekennzeichnet, daß es im wesentlichen frei von DNA und RNA ist.

2. Mycoplasma-Antigen nach Anspruch 1, welches in einer wäßrigen Lösung suspendiert ist.

3. Mycoplasma-Antigen nach Anspruch 1, welches an einen festen Träger gebunden ist.

4. Mycoplasma-Antigen nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Mycoplasma ausgewählt ist aus der Gruppe aus M. pneumoniae FH, M. pneumoniae PI 1428, M. hominis, M. fermentans, Ureaplasma urealyticum, M. orale, M. pulmonis, M. salivarium and Acholeoplasma laidlawii.

5. M. pneumoniae-Antigen nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Proteine desselben ein Molekulargewicht iin Bereich von 10.000 bis etwa 60.000 Daltons besitzen.

6. Verfahren zur Herstellung eines Mycoplasma-Antigens nach einem der Anspruch 1 bis 5, gekennzeichnet durch die Schritte des Lysierens eines Mycoplasmas und des Unterwerfens der Membran derselben unter DNAse- und RNAse- Verdauung und Beschallung.

7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß besagte Verdauung der Beschallung vorangeht.

8. Verfahren nach Anspruch 6 oder 7, dadurch gekennzeichnet, daß die DNAse-Menge von etwa 100 bis etwa 500 K-Einheiten pro 1 mg Mycoplasma-Membranprotein beträgt.

9. Verfahren nach einem der Ansprüche 6 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß die RNAse-Menge von etwa 10 bis etwa 50 K-Einheiten pro 1 mg Mycoplasma-Membranprotein beträgt.

10. Verfahren nach einem der Ansprüche 6 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß die Beschallung intermittierend ist, wobei jede einzelne Beschallungsperiode etwa 40 bis etwa 90 Sekunden dauert.

11. Mycoplasma-Antigen nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß es nach dem Verfahren nach einem der Ansprüche 6 bis 10 hergestellt ist.

12. Konjugat, gekennzeichnet durch ein Mycoplasma-Antigen nach einem der Ansprüche 1 bis 5 und 11, welches an einen Harker gebunden ist.

13. Konjugat nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß die Marker-Einheit ein Enzym ist.

14. Konjugat nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß das Enzym ausgewählt ist aus der Gruppe aus alkalischer Phosphatase, Meerrettich-Peroxidase, -Galactosidase, Glucose-6-phosphat-Dehydrogenase, Glucose-Oxidase, Lysosym, Glucoamylase und Maleat-Dehydrogenase.

15. Konjugat nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß der Marker ausgewählt ist aus der Gruppe aus radioaktiven Substanzen, die in der Lage sind, sich mit Mycoplasma- Antigen zu konjugieren, fluoreszierenden Farbstoffen, Biotin-Avidin-Komplexen und chemilumineszenten Substanzen, die alle konventionell als Marker verwendet werden.

16. Konjugat mit alkalischer Phosphatase nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß es aus einer Ausgangssuspension hergestellt ist, die etwa 800-1200 Einheiten alkalische Phosphaüase zu 1 mg Mycoplasma-Membranproteinen umfaßt.

17. In-vitro-Verfahren zur Diagnose von Mycoplasma- Infektionen in einem Menschen oder einem nicht-menschlichen Tier, welches den in-vitro-Nachweis von Antikörpern gegen Mycoplasma in einer Körperflüssigkeit umfaßt, gekennzeichnet durch die Verwendung eines Mycoplasma-Antigens nach einem der Ansprüche 1 bis 5 und 11.

18. In-vitro-Verfahren zur Diagnose von Mycoplasma- Infektionen in einem Menschen oder einem nicht-menschlichen Tier, welches den in-vitro-Nachweis von Antikörpern gegen Mycoplasma in einer Körperflüssigkeit umfaßt, gekennzeichnet durch die Verwendung eines Mycoplasma-Antigen-Konjugats nach einem der Ansprüche 12 bis 16.

19. Verfahren nach Anspruch 18, gekennzeichnet durch:

(a) Inkubieren einer nativen oder verdünnten Körperflüssigkeitsprobe mit einer Matrix, die wenigstens eine Art von Anti-Isotyp-Antikörpern trägt, ausgewählt aus der Gruppe aus Anti-IgM, Anti-IgG, Anti- IgA, Anti-IgD und Anti-IgE;

(b) Entfernen der Flüssigkeitsprobe von der Matrix und Waschen der Matrix;

(c) Inkubieren der Matrix mit einer wäßrigen Suspension eines Konjugats nach einem der Ansprüche 13 bis 18; und

(d) Bestimmen der Menge von besagtem Konjugat auf der Matrix.

20. Verfahren nach Anspruch 19, gekennzeichnet durch die Verwendung eines Konjugats, bei dem die Marker-Einheit ein Enzym und die Bestimmung der Menge von besagtem Konjugat auf der Matrix umfaßt:

(a) Inkubation in einem wäßrigen Substratmedium für das Enzym im Konjugat;

(b) Bestimmung der Konzentration des Substrats oder eines Abbauproduktes desselben.

21. Für die Durchführung des Verfahrens der Ansprüche 19 oder 20, ein Kit, gekennzeichnet durch:

(a) eine Matrix, die wenigstens einen Typ von Anti- Isotyp-Antikörpern trägt, ausgewählt aus der Gruppe, die aus Anti-IgM, Anti-IgG, Anti-IgE, Anti-IgD und Anti-IgA besteht; und

(b) eine Menge eines Konjugats nach einem der Ansprüche 12 bis 16.

22. Kit nach Anspruch 21, in dem besagtes Konjugat eine Enzym-Marker-Einheit besitzt, gekennzeichnet durch Einbeziehen eines Substrats für eine enzymatische Reaktion.