DE3879171T2

DE3879171T2 - Verfahren und vorrichtung zur quantitativen bestimmung von mikroorganismen oder pyrogenen.

Info

Publication number: DE3879171T2
Application number: DE8888119687T
Authority: DE
Inventors: Shigeru Fukushima; Nariyoshi Kawabata; Akira Kojima; Shu Tahara
Original assignee: Shimadzu Corp
Current assignee: Shimadzu Corp
Priority date: 1988-02-19
Filing date: 1988-11-25
Publication date: 1993-07-15
Anticipated expiration: 2008-11-26
Also published as: US5116736A; EP0328749A3; EP0328749A2; EP0328749B1; DE3879171D1

Description

HINTERGRUND DER ERFINDUNG

1. Gebiet der Erfindung

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren und eine Vorrichtung zur quantitativen Bestimmung von Mikroorganismen oder dergleichen. Insbesondere betrifft sie ein Verfahren und eine Vorrichtung zur quantitativen Bestimmung von Mikroorganismen oder Pyrogenen in einer Flüssigkeit, welche einfach und zuverlässig sind.

2. Beschreibung des Stands der Technik

Die Bestimmung (quantitative Bestimmung) der Menge an Mikroorganismen in verschiedenen Medien ist wichtig für die öffentliche Hygiene oder die Qualitätskontrolle, nicht nur auf den Gebieten der positiven Verwendung von Mikroorganismen, wie der Fermentation, des Brauens, etc., sondern auch auf verschiedenen anderen Gebieten, wie der medizinischen Behandlung, Lebensmittel, Analyse, etc.
Als Verfahren zur quantitativen Bestimmung von solchen Mikroorganismen waren bisher die folgenden Verfahren allgemein bekannt:
1. Verfahren der visuellen Abschätzung (sogenanntes Kolonieverfahren); ein Verfahren zur quantitativen Bestimmung von Mikroorganismen, wobei eine mikroorganismenhaltige Testflüssigkeit nach einer Trocknungsbehandlung auf einen Objektträger aus Glas gegeben wird, die Anzahl der Mikroorganismen in dem Gesichtsfeld mittels eines Mikroskops gezählt wird und die Menge der Mikroorganismen auf der Grundlage der Zahl bestimmt wird.
2. Verfahren der optischen Abschätzung (sogenanntes OD-Verfahren); ein Verfahren zur quantitativen Bestimmung von Mikroorganismen, bei dem eine mikroorganismenhaltige Testflüssigkeit der Bestrahlung mittels Licht unterworfen wird, um dessen Trübheit herauszufinden, und die Menge der Mikroorganismen auf der Grundlage dieser Trübung bestimmt wird.
Kulturverdünnungsverfahren; ein Verfahren zur quantitativen Bestimmung von Mikroorganismen, bei dem eine vorgeschriebene Verdünnungsreihe einer Probenflüssigkeit, die die Mikroorganismen enthält, hergestellt wird, jede verdünnte Flüssigkeit in ein Kulturröhrchen inokuliert und darin bebrütet wird, und die Menge der Mikroorganismen statistisch auf der Grundlage ihres Wachstumszustands bestimmt wird.
Andererseits sind Pyrogene als Substanzen bekannt, die in verschiedenen Medien, wie Mikroorganismen, Schwierigkeiten verursachen, obwohl sie keine Mikroorganismen sind, und die quantitative Bestimmung von solchen Pyrogenen ist für die öffentliche Hygiene oder Qualitätskontrolle ebenfalls wünschenswert. Insbesondere ist die quantitative Bestimmung von Pyrogenen in destilliertem Wasser, wie destilliertem Wasser zur Injektion, destilliertem Wasser zur Dialyse, etc., für die öffentliche Hygiene wichtig.
Als Verfahren zur quantitativen Bestimmung oder Testverfahren auf solche Pyrogene ist ein Verfahren, das auf der Erhöhung der Körpertemperatur von Kaninchen, was durch Injektion einer Testprobe in die Kaninchen verursacht wird (Japanische Pharmakopöe: Testverfahren auf Pyrogene), beruht, weithin in Anwendung. Jedoch ist dieses Verfahren mit den Unannehmlichkeiten verbunden, daß die Ergebnisse oft durch den individuellen Unterschied in der Empfindlichkeit unter den Kaninchen beeinflußt werden, und ferner die Beobachtung der Veränderungen in der Körpertemperatur und die Züchtung von Tieren über eine lange Zeitspanne notwendig sind. Folglich wurde der sogenannte Limulus-Test jüngst als Verfahren zur quantitativen Bestimmung und Bewertung von Pyrogenen entwickelt, bei dem die selektive Reaktion zwischen einem Blutteilchenextrakt von Limulus und einem Pyrogen verwendet wird, und die Menge des Pyrogens auf der Grundlage des Gelierungsgrads durch diese Reaktion oder die Absorption nach Diazotierung mit p-Nitroanilin, das durch diese Reaktion in Gegenwart eines farbbildenden synthetischen Substrats gebildet wird, bestimmt wird (vergleiche Japanese Journal "Kan-Tan-Sui" 12(4): 523 - 528, 1986, etc.).
Jedoch sind die bisher bekannten Verfahren zur quantitativen Bestimmung von Mikroorganismen, wie vorstehend erwähnt, mit verschiedenen Problemen verbunden, so daß die Arbeitsschritte zur Bestimmung eine lange Zeit benötigen und ebenso aufwendig sind, und Erfahrung und Fertigkeit zur Durchführung benötigen, der Bereich der Menge an Mikroorganismen, die quantitativ bestimmt werden können, eng ist und die Ergebnisse der Bestimmung nicht notwendigerweise zuverlässig sind und auch für kontinuierliche Bestimmung nicht geeignet sind.
Andererseits sind die vorstehend erwähnten, bisher verwendeten Verfahren zur quantitativen Bestimmung und Bewertung von Pyrogenen auch mit Problemen dahingehend verbunden, daß die Arbeitsschritte eine lange Zeit benötigen und ebenso aufwendig sind und Fertigkeit und Erfahrung zur Durchführung benötigen, daß sie einen teuren Limulusextrakt benötigen und auch daß sie für die kontinuierliche Bestimmung nicht geeignet sind.
Die vorliegende Erfindung wurde angesichts dieser Umstände mit dem Ziel, ein Verfahren und eine Vorrichtung zur quantitativen Bestimmung der Menge an Mikroorganismen oder Pyrogenen bereitzustellen, die einfach und zuverlässig und ebenso für die kontinuierliche Bestimmung geeignet sind, ausgeführt.

ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG

Somit wird erfindungsgemäß ein Verfahren zur quantitativen Bestimmung von Mikroorganismen oder Pyrogenen bereitgestellt, bei dem man eine vorgeschriebene Menge der Testflüssigkeit, die Mikroorganismen oder Pyrogene enthält, in einen Analysator für Gesamtkohlenstoff einbringt, um einen Wert für den Gesamtkohlenstoff A zu erhalten, während man die Mikroorganismen oder Pyrogene aus der vorgeschriebenen Menge der gleichen Testflüssigkeit entfernt und die so erhaltene Flüssigkeit in einen Analysator für Gesamtkohlenstoff einbringt, um einen Wert für Gesamtkohlenstoff B zu erhalten, den Wert für Gesamtkohlenstoff B von dem Wert für Gesamtkohlenstoff A abzieht und auf der Grundlage des so erhaltenen Werts die Mikroorganismen oder Pyrogene bestimmt.
Ferner wird erfindungsgemäß eine Vorrichtung zur quantitativen Bestimmung von Mikroorganismen oder Pyrogenen bereitgestellt, die einen Lagerteil für die Testflüssigkeit, einen Speisekanal I und einen Speisekanal II, die Mittel zur Entfernung der Mikroorganismen oder Pyrogene bereitstellen und mit dem Lagerteil verbunden sind, eine Meßpassage, die Vorrichtungen zur Messung einer Flüssigkeit vorsieht und die mit den Speisekanälen I und II durch eine Vorrichtung zum Schalten der Kanäle verbunden werden soll, und einen Analysator für Gesamtkohlenstoff, der mit der Meßpassage verbunden ist, umfaßt.
Nach dem erfindungsgemäßen Verfahren und mit der erfindungsgemäßen Vorrichtung kann die Menge an Mikroorganismen oder Pyrogenen schnell und einfach quantitativ bestimmt werden. Ferner ist die erfindungsgemäße quantitative Bestimmung, die auf der Grundlage der TC-Werte durchgeführt wird, zuverlässig und leicht auch auf kontinuierliche Bestimmung anwendbar.

KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN

Fig. 1 ist ein Blockdiagramm, das ein Beispiel für eine Vorrichtung zur kontinuierlichen Durchführung des erfindungsgemäßen quantitativen Bestimmungsverfahrens für Mikroorganismen oder Pyrogene zeigt. Fig. 2 ist eine graphische Darstellung, die ein Analysendiagramm zeigt, das in einem erfindungsgemäßen Beispiel erhalten worden ist. Fig. 3 ist eine graphische Darstellung, die die Analysenergebnisse, die in einem erfindungsgemäßen Beispiel erhalten wurden, zeigt. Fig. 4 ist eine graphische Darstellung, die die Korrelation zwischen den nach dem Verfahren eines Referenzbeispiels ermittelten TOC-Werten und den nach dem üblichen Verfahren bestimmten TOC-Werten zeigt. Fig. 5 ist eine graphische Darstellung, die die Korrelation zwischen den Kohlenstoffkonzentrationen und den Konzentrationen an Bierhefe, die in einem erfindungsgemäßen Beispiel erhalten wurden, zusammen mit denen, die in einem Vergleichsbeispiel erhalten wurden, zeigt. Fig. 6 ist ein Fließdiagramm des erfindungsgemäßen Verfahrens unter Verwendung einer Membranfiltrationsbehandlung.

AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER BEVORZUGTEN AUSFÜHRUNGSFORM

Die charakteristischte Besonderheit der vorliegenden Erfindung liegt in der Verwendung eines Analysators für Gesamtkohlenstoff zur quantitativen Bestimmung von Mikroorganismen oder Pyrogenen. Als Analysator für Gesamtkohlenstoff kann jeder beliebige Analysator für Gesamtkohlenstoff des Typs, bei dem kohlenstoffhaltige Substanzen unter Bildung von Kohlendioxid oxidiert werden, verwendet werden, und die Menge des Kohlendioxids wird mittels eines Infrarotdetektors ohne Interferenz, eines Meßgeräts für die elektrische Leitfähigkeit, eines Meßgeräts für die thermische Leitfähigkeit, oder dergleichen, detektiert. Das heißt, verschiedene Analysatoren für Gesamtkohlenstoff, die im Handel als die sogenannten TOC-Meter oder TC-Meter erhältlich sind, können verwendet werden. Als Verfahren zur Oxidation der kohlenstoffhaltigen Substanzen sind zwei Arten bekannt, das heißt Naßoxidationsverfahren durch UV-Oxidation oder durch Oxidation mit einem Oxidationsmittel, wie Kaliumperoxosulfatlösung etc., und Verbrennungsoxidationsverfahren. Jedoch ist es vorzuziehen, die Verbrennungsoxidationsverfahren zu verwenden, gemäß denen die Oxidation am stärksten und sichersten durchgeführt wird. Bei solchen Verbrennungsoxidationsverfahren kann ein Oxidationskatalysator, wie Platin auf Kohle, verwendet werden. Die Verbrennung wird geeigneterweise in einem Verbrennungsrohr, das auf 680 - 950ºC in einer Atmosphäre von hochreiner Luft oder Sauerstoffgas erhitzt wird, durchgeführt. Andererseits wird die Detektion von Kohlendioxid geeigneterweise unter Verwendung eines Infrarotdetektors ohne Interferenz (NDIR) angesichts dessen hoher Zuverlässigkeit und Leichtigkeit der Handhabung durchgeführt.
Eine weitere charakteristische Besonderheit der vorliegenden Erfindung liegt in der Verwendung einer behandelten Flüssigkeit, die von Mikroorganismen oder Pyrogenen frei ist und die durch Unterwerfen der Testflüssigkeit einer Entfernungsbehandlung erhalten worden ist, zur quantitativen Bestimmung von Mikroorganismen oder Pyrogenen. Die oben erwähnte Behandlung bedeutet eine Behandlung zur Entfernung von Mikroorganismen oder Pyrogenen aus der Testflüssigkeit.
Als Behandlung zur Entfernung von Mikroorganismen oder Pyrogenen kann ein beliebiges Verfahren, das geeignet ist, die Mikroorganismen oder Pyrogene zu entfernen, wie das Membranfiltrationsbehandlungsverfahren, das Adsorptionsbehandlungsverfahren, das Absorptionsbehandlungsverfahren, das Zentrifugationsbehandlungsverfahren, etc., verwendet werden.
Die Filtrationsbehandlung oder die Adsorptionsbehandlung werden geeigneterweise so durchgeführt, daß man eine Testflüssigkeit durch eine Einrichtung zur Entfernung durch Filtration oder eine Einrichtung zur Entfernung durch Adsorption laufen läßt.
Insbesondere wird die Filtrationsbehandlung von Mikroorganismen geeigneterweise mit einem Filter mit einer Porengröße, die die kleinsten Mikroorganismen einfangen kann und die zur Bestimmung der möglicherweise in einer Testflüssigkeit vorhandenen Mikroorganismen dient, durchgeführt. Als Filter werden üblicherweise poröse Filter, Membranfilter, etc., mit einer Porengröße im Ultrafiltrationsbereich verwendet. Als Materialien für die oben erwähnten porösen Filter sind organische Substanzen, wie organische Hochpolymere, Vitalfasern, etc., anorganische Substanzen, wie Glas, Keramik, etc., und ihre Zusammensetzungen zu erwähnen. Die Filter können verschiedene Formen haben, wie eine flache Membran, einen Zylinder, eine Faser, eine Hohlfaser, etc., und können jede beliebige Konstitution haben, wie Symmetrie, Asymmetrie, Mosaik, etc. Die Porengröße des Filters kann beispielsweise einen Grad von 0,45 um oder weniger zur Abtrennung von Mikroorganismen durch Filtration und einen Grad von 0,2 um oder weniger zur Abtrennung von Pyrogenen durch Filtration besitzen. Diese Grade sind jedoch nicht darauf beschränkt. Jedoch muß jede beliebige ausgewählte Porengröße eine sein, die organische Substanzen durch das Filter laufen läßt, mit Ausnahme derer, die bestimmt werden sollen. Ferner ist es bei der Durchführung der Filtrationsbehandlung bevorzugt, die vorstehend erwähnten Filter nach vorheriger Behandlung mit Ultraschallwellen in superreinem Wasser zu verwenden. Durch diese Ultraschallbehandlung werden organische Substanzen (Materialkomponenten), die von dem Filter selbst eluieren könnten, vorher entfernt, und als Ergebnis können Bestimmungsfehler als Folge der Verwendung des Filters verringert werden.
Als Mittel zur Adsorptionsbehandlung werden geladene Membranen oder Ionenaustauscherharze verwendet, und unlösliche Harze vom Pyridiniumtyp, wie vernetztes Poly-N-alkyl-4-vinylpyridiniumhalogenid etc., sind wirksam.
Die Zentrifugationsbehandlung kann mit einer üblicherweise verwendeten Zentrifuge durchgeführt werden. Bei der Zentrifugationsbehandlung würde eine zu niedrige Rotationsgeschwindigkeit eine unzureichende Abtrennung von Mikroorganismen oder Pyrogenen aus der Testflüssigkeit verursachen und Schwierigkeiten bezüglich des Erhalts einer, von den Mikroorganismen oder den Pyrogenen freien, behandelten Flüssigkeit als Überstand mit sich bringen, während eine zu hohe Rotationsgeschwindigkeit eine Zerstörung der Mikroorganismenzellen oder Pyrogene verursachen würde und eine Erniedrigung der Zuverlässigkeit der quantitativen Bestimmung herbeiführen würde. Von einem solchen Gesichtspunkt aus wird die Zentrifugation zur Entfernung der Mikroorganismen bei einer Rotationsgeschwindigkeit von geeigneterweise 2000 - 5000 UpM und bevorzugt von 3000 - 4500 UpM durchgeführt.
Obwohl keine spezielle Beschränkung hinsichtlich der Zeit zur Abtrennung durch Zentrifugation (Rotationszeit) besteht, ist eine Rotationszeit von 5 - 30 Minuten oder so üblicherweise geeignet. Gemäß einer solchen Zentrifugationsbehandlung können Fehler der quantitativen Bestimmung, die bei den vorstehend erwähnten Filtrationsbehandlungsverfahren und Adsorptionsbehandlungsverfahren wegen der Elution von Materialkomponenten auftreten könnten, vermieden werden. Daher ist es mit der Zentrifugationsbehandlung möglich, eine zuverlässige quantitative Bestimmung selbst angesichts eines niedrigen Gehalts an Mikroorganismen oder Pyrogenen in einer Probenflüssigkeit durchzuführen. So ist das Zentrifugationsbehandlungsverfahren die bevorzugteste Ausführungsform.
Es ist angesichts der Bequemlichkeit der Berechnung bei der quantitativen Bestimmung geeignet, die von Mikroorganismen (oder Pyrogenen) freie behandelte Flüssigkeit in der gleichen Menge wie die Mikroorganismen (oder Pyrogene) enthaltende Testflüssigkeit zu verwenden.
Fig. 6 ist ein Fließdiagramm des erfindungsgemäßen Verfahrens unter Verwendung einer Membranfiltrationsbehandlung, bei der eine Testflüssigkeit bei 23, eine Einrichtung zur Entfernung durch Filtration bei 24, ein Filtrat (behandelte Flüssigkeit) bei 25 und ein Analysator für Gesamtkohlenstoff bei 26 gezeigt sind. Wie in dieser Figur gezeigt, besteht das erfindungsgemäße Verfahren im wesentlichen aus Stufe (a) der Bestimmung eines TC-Werts A durch direktes Einführen einer Testflüssigkeit 23 in einen Analysator für Gesamtkohlenstoff 26, und einer Stufe (b) der Bestimmung eines TC-Werts B durch Einführen einer behandelten Flüssigkeit 25 in den Analysator 26.
In einer mikroorganismenhaltigen Testflüssigkeit können organische Substanzen (Zucker, wie Glukose) aus dem Kulturmedium, verunreinigende organische Substanzen (organische Amine und lösliche organische Hochpolymere), anorganische Kohlenstoffverbindungen (wie aufgelöstes CO&sub2;, Carbonate, Carbonationen, etc.), oder dergleichen gleichzeitig mit den Mikroorganismen vorhanden sein. Daher ist es schwierig, die Menge der Mikroorganismen exakt auf der Basis eines TC- Werts (Wert für Gesamtkohlenstoff) A, erhalten durch Einführen einer solchen Testflüssigkeit direkt in den oben erwähnten Analysator für Gesamtkohlenstoff, zu bestimmen. Es ist ebenfalls schwierig, die Menge an Pyrogenen exakt auf der Basis eines TC-Werts A, erhalten durch Einführen einer Testflüssigkeit direkt in den Analysator für Gesamtkohlenstoff, zu bestimmen, da Pyrogene üblicherweise in einer Testflüssigkeit in einer sehr kleinen Menge enthalten sind, und andere organische Komponenten oft gleichzeitig in der Testflüssigkeit zusammen damit vorkommen können.
Erfindungsgemäß wird ein TC-Wert B für eine behandelte Flüssigkeit, die von Mikroorganismen (oder Pyrogenen) frei ist, weiter bestimmt, und ein Wert, erhalten durch Subtraktion des TC-Werts B von dem TC-Wert A, wird berechnet. Obwohl die Mikroorganismen (oder Pyrogene) im wesentlichen durch die oben erwähnte Filtrationsbehandlung oder Adsorptionsbehandlung etc. entfernt werden, werden andere, gleichzeitig vorhandene, organische Substanzen und anorganische Kohlenstoffverbindungen durch eine solche Behandlung nicht entfernt, sondern bleiben in der behandelten, von Mikroorganismen (oder Pyrogenen) freien Flüssigkeit. Daher entspricht der Wert im wesentlichen der in der Testflüssigkeit enthaltenen Menge an Mikroorganismen (oder Pyrogenen). Somit kann die Menge an Mikroorganismen (oder Pyrogenen) exakt auf der Basis dieses Werts bestimmt werden.
Erfindungsgemäß kann eine quantitative Bestimmung von Mikroorganismen (oder Pyrogenen) geeigneterweise unter Verwendung einer Vorrichtung durchgeführt werden, bei der ein Speisekanal I mit keiner Einrichtung zur Entfernung von Mikroorganismen oder Pyrogenen und ein Speisekanal II mit einer Einrichtung zur Entfernung von Mikroorganismen oder Pyrogenen (sowie eine Einrichtung zur Entfernung durch Filtration oder Einrichtung zur Entfernung durch Adsorption) so eingerichtet sind, daß eine von beiden durch eine Einrichtung zum Schalten eines Kanals an eine Einrichtung zur Messung einer Flüssigkeit verbunden werden kann, von welcher eine vorgeschriebene Menge, sowohl der Testflüssigkeit, als auch der behandelten Flüssigkeit, in einen Analysator für Gesamtkohlenstoff eingeführt wird. Die Verwendung einer solchen Vorrichtung ist angesichts des automatischen Betriebs, des kontinuierlichen Betriebs und dergleichen vorzuziehen. Was die Einrichtung zur Messung der Flüssigkeit betrifft, ist es hinsichtlich des automatischen und kontinuierlichen Betriebs bevorzugt, eine Einrichtung zur Messung einer Flüssigkeit des Umschaltventiltyps zu verwenden, obwohl eine automatische Meßeinrichtung vom Typ einer Mikrospritze ebenfalls erwähnt werden kann.
Es ist auch möglich, eine kontinuierliche Bestimmung gemäß vorliegender Erfindung durchzuführen, indem man jeweils den TC-Wert A und den TC-Wert B gleichzeitig unter Verwendung von zwei NDIRs bestimmt.

BEISPIEL

In Fig. 1 ist ein Beispiel der Vorrichtung zur quantitativen Bestimmung von Mikroorganismen oder Pyrogenen für das erfindungsgemäße Verfahren als Ziffer 1 gezeigt. In dieser Figur sind ein Speisekanal I und ein Speisekanal II in verzweigter Form mit einer Vorrichtung zum Eingeben der Testflüssigkeit 2, die aus einem Speichertank 2a zur Speicherung der Testflüssigkeit und einer Pumpe zum Transport der Flüssigkeit 2b besteht, verbunden. Der Speisekanal II ist mit einer Filtrationseinrichtung zur Entfernung von Mikroorganismen (oder Pyrogenen) 3 mit einem Ultrafilter versehen. Die stromabwärts gerichteten Ströme von den Speisekanälen I und II werden mit einem Dreiwegeventil (Vorrichtung zum Schalten von Kanälen) 4 gewonnen, und die Testflüssigkeit oder die behandelte Flüssigkeit wird durch die Speisekanäle I oder II in einen Meßkanal 5 durch Umschalten des Ventils 4 geleitet.
Mit dem Meßkanal 5 wird ein Sechswegeumschlagventil 6 mit hoher Spannung verbunden. Die Testflüssigkeit oder die behandelte Flüssigkeit wird durch Umschalten des Ventils 6 an entweder einen leeren Flüssigkeitstank 8 oder an die Einrichtung zur Messung einer Flüssigkeit 7, bestehend aus einem Rohr mit einer bestimmten Länge, transportiert. Die in die Einrichtung zur Messung einer Flüssigkeit 7 eingebrachte Flüssigkeit wird in einen Analysator für Gesamtkohlenstoff 11 durch ein Einlaßrohr 9, durch Umschalten des Ventils 6, eingebracht.
Der Analysator für Gesamtkohlenstoff 11 besteht aus einem Verbrennungsrohr 12 aus Quarzglas und trägt eine Katalysatorträgerschicht (Innendurchmesser: 12 mm, Länge: 90 mm), umfassend Quarzwolle, beschichtet mit Platin auf Kohlenstoff, einem elektrischen Heizer 13, einem Drainageseparator 14, einem elektronischen Kühler 16 und einem Infrarotdetektor 18 ohne Interferenz, welche in dieser Reihenfolge miteinander verbunden sind, und ist mit einer Bombe 21 mit hochreiner Luft zum Liefern von Trägergas versehen (reine Luft besitzt einen CH-Gehalt, CO-Gehalt und CO&sub2;-Gehalt als Verunreinigungen zu je 1 ppm oder weniger). Die Figur zeigt auch einen Speisekanal für Trägergas bei 10, Drainagegefäße bei 15 und 17, einen Flußmesser bei 19, eine Betriebsskala bei 20 und ein Ventil zur Kontrolle der Flußrate bei 22.
Die Arbeitsweise der quantitativen Bestimmung von Mikroorganismen unter Verwendung der vorstehend erwähnten Vorrichtung 1 ist im folgenden näher erläutert.
Zuerst wird eine Testflüssigkeit, die einen Mikroorganismus enthält, direkt in den Meßkanal 5 durch Schalten des Dreiwegeventils 4 an den Speisekanal I und Einschalten der Pumpe zum Transport von Flüssigkeit 2b eingebracht. Dann wird das Sechswegeumschlagventil 6 mit hoher Spannung von der Seite der festen Linie auf die Seite der gepunkteten Linie umgeschaltet, und die Testflüssigkeit wird in die Einrichtung zur Messung der Flüssigkeit 7 eingebracht, welche es nach einer bestimmten Zeit füllt. Dann wird das Ventil 6 auf die Seite der festen Linie umgeschaltet. Die Testflüssigkeit in der Einrichtung zur Messung der Flüssigkeit wird mittels Druck eines Trägergases, welches die aus der Bombe 21 zur Verfügung gestellte Luft umfaßt, in das Verbrennungsrohr 12, das auf eine hohe Temperatur aufgeheizt ist, geschickt, wo die Mikroorganismen und die organischen Verunreinigungen verbrannt und zu Kohlendioxid oxidiert werden. Die als Nebenprodukt der oxidativen Verbrennung erzeugte Feuchtigkeit wird durch Gas-Flüssig-Trennung mit dem Drainageseparator 14 und dem elektronischen Kühler 16 (gekühlt auf 2ºC) entfernt. Das durch oxidative Verbrennung erzeugte Kohlendioxid wird in den Infrarotdetektor ohne Interferenz 18 zusammen mit dem Kohlendioxid, das sich aus der thermischen Zersetzung von Carbonaten etc. ergab, transportiert, und das Kohlendioxid wird in der Flüssigkeit aufgelöst. Die Absorption von Kohlendioxid wird mittels des Detektors 18 detektiert, und auf der Grundlage des detektierten Outputs wird der TC-Wert A an der Betriebsskala 20 berechnet und aufgezeichnet.
Als nächstes wird das Dreiwegeventil 4 auf die Seite des Speisekanals II umgeschaltet und eine behandelte Flüssigkeit, die von Mikroorganismen frei ist, die erhalten wurde, indem man eine Testflüssigkeit durch die Filtrationseinrichtung 3 fließen ließ, wird in den Meßkanal 5 eingebracht. Dann wird eine vorgeschriebene Menge Flüssigkeit aus dem Kanal 5 in das Verbrennungsrohr 12, wie oben beschrieben, eingebracht. Danach liegen im wesentlichen keine Mikroorganismen mehr in der Testflüssigkeit vor. Jedoch sind die organischen Verunreinigungen aus dieser Testflüssigkeit durch die obige Filtrationseinrichtung 3 nicht entfernt. Solche organischen Substanzen werden verbrannt und zu Kohlendioxid oxidiert, und ihre Absorption wird insgesamt mit der von dem anderen Kohlendioxid detektiert. Auf der Grundlage der somit detektierten Gesamtabsorption wird der TC-Wert B an der Betriebsskala 20 berechnet und aufgezeichnet.
Der Wert, der durch Abziehen des TC-Werts B von dem TC-Wert A erhalten wird, entspricht der Menge der Mikroorganismen. Daher können anhand dieses Wertes die Mikroorganismen quantitativ als Kohlenstoffmenge direkt bestimmt werden, und durch vorherige Erstellung einer Kalibrationskurve der Kohlenstoffmengen gegen die Mikroorganismenkonzentrationen (wie Gewichtskonzentrationen, Populationskonzentrationen etc.) kann die Menge der Mikroorganismen in verschiedenen Einheiten auf der Grundlage dieses Wertes bestimmt werden.

Beispiel 1: Quantitative Bestimmung von Mikroorganismen

Unter Verwendung der obigen Vorrichtung wurde die quantitative Bestimmung eines Mikroorganismus (Milchsäurebakterien) unter den folgenden Bedingungen durchgeführt:

(Bedingungen für die oxidative Verbrennung)

Flußrate des Trägergases 150 ml/Minute
Erhitzungstemperatur 680ºC

(Testflüssigkeit)

Die Testflüssigkeit wurde durch Vermischen von etwa 5,0 mg Milchsäurebakterien und 1 l physiologischer Salzlösung (enthaltend Glukose, entsprechend etwa 1000 ppm TC) hergestellt. Die Testflüssigkeit war nicht pyrogenfrei.

(Ultrafilter)

Ein Ultrafilter mit einer Ultrafiltrationsmembran aus einem Membranfilter aus Cellulose (Porendurchmesser: 0,2 um, Außendurchmesser: 2,5 mm) wurde nach Sterilisation verwendet. Der Filtrationsdruck betrug etwa 0,1 kg/cm².
Die Menge der zur Bestimmung von TC-injizierter Flüssigkeit betrug 5 ul. Die Kalibration des TC-Werts wurde durch Verwendung eines Standardwerts für Caliumhydrogenphthalat von 640 ppm durchgeführt.
Die Ergebnisse sind in Fig. 2 gezeigt. Der TC-Wert A war einer entsprechend 603,0 ppm TC, und der TC-Wert B war einer entsprechend 107,7 ppm TC. Daher folgt, daß die Milchsäurebakterien in der Testflüssigkeit 495,3 ppm TC entsprechen. Ferner zeigte der TC-Wert B, der dem Untergrund (physiologische Salzlösung) von etwa 100 ppm gut entsprach, daß das Verhältnis der Entfernung von Milchsäurebakterien durch das Ultrafilter gut war.

Beispiel 2: Quantitative Bestimmung von Pyrogenen

Unter Verwendung der obigen Vorrichtung nach Fig. 1 wurde die quantitative Bestimmung eines Pyrogens durchgeführt. Die verwendete Testflüssigkeit war eine Flüssigkeit, die eine vorgeschriebene Menge eines Endotoxins als Pyrogen enthielt, und wurde durch Auflösen einer vorgeschriebenen Menge eines Standardpyrogens (USP Reference endotoxin, EC- 5) in einer endotoxinfreien Standardlösung hergestellt.
Hinsichtlich der pyrogenhaltigen Flüssigkeiten verschiedener Konzentrationen wurden der TC-Wert A und der TC-Wert B, wie oben für die quantitative Bestimmung von Mikroorganismen beschrieben, bestimmt und in Endotoxinkonzentrationen umgerechnet. Die Zeit, die für jede Bestimmung benötigt wurde, betrug 5 Minuten.
Die Ergebnisse sind in Fig. 3 im Kontrast zu Werten, die nach dem herkömmlichen Limulus-Test erhalten wurden, gezeigt.
Es geht somit aus Fig. 3 hervor, daß die quantitative Bestimmung gemäß vorliegender Erfindung mit guter Linearität im Ansprechen und mit der gleichen Genauigkeit wie der Limulus-Test hinsichtlich Pyrogenen durchgeführt werden kann. In der Figur zeigt die Graphik -o- die Ergebnisse des erfindungsgemäßen Verfahrens und die Graphik -Δ- die Ergebnisse des Limulus-Tests.
Die gleichen Ergebnisse wie oben erwähnt wurden hinsichtlich des Pyrogens erhalten, wenn eine Membran für die Umkehrosmose (Cellulosetriacetat-Membran; Außendurchmesser: 90 mm, Länge: 420 mm, permeierende Menge an Wasser: 0,018 m³/hr) oder eine Ultrafiltrationsmembran der Polysulfonserie (Außendurchmesser: 40 mm, Länge: 350 mm, geeichte Molekulargewichtsfraktion: 6000, permeierende Menge an Wasser: 0,035 m³/hr) anstelle des Membranfilters in dem Ultrafilter verwendet wurde.

Referenzbeispiel 1: Quantitative Bestimmung von Mikroorganismen

Die Proben wurden durch Vermischen und Suspendieren einer geeigneten Menge jeweils der folgenden Mikroorganismen (12 Arten von Bakterien und 2 Arten von Hefen) in 1 l physiologischer Salzlösung hergestellt.
Mikroorganismen: Alcaligenes faecalis (a),
Achromobacter polymorph (b),
Arthrobacter atrocyaneus (c),
Bacillus subtilis (d),
Escherichia coli B (e),
Escherichia coli K-12 (f),
Escherichia coli Najjar (g),
Pseudomonas aeruginosa (h),
Klebsiella pneumoniae (i),
Salmonella typhimurium (j),
Staphylococcus aureus (k),
Streptcoccus sp. (l),
Candida utilis (m),
Saccharomyces cerevisiae (n).

(Herstellung einer Testflüssigkeit zur Bestimmung von TC)

Jede der, wie vorstehend beschrieben, hergestellten Proben wurde mittels der folgenden Ultrafiltrationseinrichtung filtriert und die filtrierte Substanz wurde mit superreinem Wasser unter Herstellung einer mikroorganismenhaltigen Testflüssigkeit gewonnen.

(Ultrafiltrationseinrichtung)

Ein Einwegfilter aus Polytetrafluorethylen mit einem Außendurchmesser von 25 mm und einem Porendurchmesser von 0,45 um wurde verwendet, nachdem er einer Ultraschallbehandlung in superreinem Wasser für 10 Minuten oder länger vor jeder Bestimmung unterworfen worden war.
Hinsichtlich der so hergestellten Testflüssigkeiten für die TC-Bestimmung wurde die quantitative Bestimmung von Mikroorganismen mittels eines Analysators für Gesamtkohlenstoff (entsprechend 11 in der Figur) unter den folgenden Bedingungen durchgeführt.

(Bedingungen für die oxidative Verbrennung)

Flußrate des Trägergases 150 ml/Minute
Erhitzungstemperatur 680ºC
Die zur Bestimmung von TC injizierte Flüssigkeitsmenge betrug 10 ml. Die Kalibration des TC-Werts wurde mittels einer Standardflüssigkeit, die 200 ppm Caliumhydrogenphthalat enthielt, durchgeführt.
Das Verhältnis zwischen den Werten für den gesamtorganischen Kohlenstoff (nachstehend als TOC abgekürzt) und denjenigen, die mittels des konventionellen optischen Abschätzungsverfahrens (Absorptionen bei 610 nm) erhalten wurden, wurde hinsichtlich jeder Flüssigkeit untersucht und ist in Fig. 4 gezeigt. Obwohl ein Proportionalverhältnis zwischen den beiden Arten von Werten erkannt wurde, war die Proportionalkonstante beträchtlich unterschiedlich zwischen den Mikroorganismen. Somit wurde gefunden, daß die TOC-Werte als bequemes Mittel zur Bestimmung der Konzentrationen an Mikroorganismen wie die Absorptionswerte verwendet werden können. Ferner besaß der bei dem Versuch verwendete TC-Analysator eine Nachweisgrenze von 10 ppb C, obwohl eine Nachweisgrenze der optischen Dichte gemäß dem vorstehend erwähnten optischen Abschätzungsverfahren etwa 0,006 betrug (der entsprechende TOC-Wert betrug etwa 750 ppb C). Somit ist offensichtlich, daß die quantitative Bestimmung erfindungsgemäß mit einer höheren Empfindlichkeit als die des herkömmlichen Verfahrens durchgeführt wird.

Beispiel 3: Einfluß von gleichzeitig vorhandenen Substanzen auf TOC-Werte

Die quantitative Bestimmung von Mikroorganismen wurde in Anwesenheit von Glukose und Glutaminsäure, die als Kulturmedium gemeinsam vorkommen können, durchgeführt. Eine Testflüssigkeit wurde durch Zugabe von Glukose (A) und Glutaminsäure (B), als gleichzeitig vorhandene organische Substanzen zu einer E. coli-Suspension bekannter Konzentration hergestellt. Hinsichtlich der so hergestellten Testflüssigkeit wurde ein TOC-Wert entsprechend dem TC-Wert A mittels eines Analysators für Gesamtkohlenstoff bestimmt und als TOCT bestimmt und ein TOC-Wert entsprechend einem TC-Wert B wurde bestimmt und als TOCB bezeichnet. Aus dem Unterschied zwischen diesen zwei Werten wurde ein TOC-Wert entsprechend der Mikroorganismenkonzentration nach der folgenden Formel berechnet:
TOCZelle = TOCT - TOCB.
Das Verhältnis zwischen den Bakterienkonzentrationen, die nach der obigen Formel berechnet wurden und der bekannten Konzentrationen ist in Tabelle 1 gezeigt. Der Bestimmungsfehler lag in der Größenordnung von mehreren mg C/L. Tabelle-1 TOC (mg C/L) TOCZelle Berechneter Wert1) Fehler 1) Berechnet aus der bekannten Konzentration.
Ferner wurden die gleichen Versuche hinsichtlich der Fälle, in denen Fleischextrakt (x) und Pepton (y), die üblicherweise als Komponenten eines Kulturmediums verwendet werden, zugesetzt wurden, oder lösliche Stärke (z) als ein Beispiel für Substanzen mit stark lichtbrechenden Eigenschaften der oben erwähnten E. coli-Suspension einer bekannten Konzentration zugesetzt wurde, durchgeführt. Die erhaltenen Ergebnisse sind in Tabelle 2 gezeigt. Somit wurde bestätigt, daß durch die Verwendung eines Filtrationsverfahrens, bei dem eine Ultrafiltrationseinrichtung verwendet wird, ein Einfluß von gleichzeitig vorhandenen organischen Substanzen auf die TOC-Werte leicht bei der Durchführung der Bestimmung ausgeschlossen werden konnte. Tabelle-2 TOC (mg C/L) TOCZelle Berechneter Wert 2) Fehler 2) Berechnet aus der bekannten Konzentration

Beispiel 4: Wirkung von Ultraschall auf die Ultrafiltrationseinrichtung

Sieben Einwegfilter (Nr. 1 - 7) wie die Einwegfilter, die als Ultrafiltrationseinrichtung in Beispiel 3 verwendet wurden, wurden für diese Bewertung verwendet. Die vorstehend beschriebene Vorrichtung 1 wurde mit jeweils einem dieser sieben Filter ausgestattet, ohne daß sie irgendeiner Ultraschallbehandlung in superreinem Wasser (C) unterworfen worden waren, und nachdem sie einer Ultraschallbehandlung (10 - 60 Minuten) in superreinem Wasser (D) unterworfen worden waren. Die Filtrationsbehandlung von 10 cc Probenflüssigkeit bekannter Konzentration wurde durchgeführt, und die Elution von organischen Stoffen von den entsprechenden Filtern (C) und (D) wurde bezüglich der TOC-Werte untersucht. Die erhaltenen Ergebnisse sind in Tabelle 3 gezeigt. Tabelle 3 Filternr.
Aus den obigen Ergebnissen geht hervor, daß dadurch, daß man jeden Filter einer 10-minütigen oder längeren Ultraschallbehandlung unter Eintauchen in superreines Wasser unterwirft, die Elution von organischen Substanzen von dem Filter selbst in einem Ausmaß von etwa 0,4 ppm unterdrückt werden kann. Dies bedeutet, daß wenn diese Art von Filter verwendet wird, die Untergrenze der quantitativen Bestimmung auf 8 ppm reduziert werden kann. Das heißt, die Nachweisgrenze der herkömmlichen Verfahren kann um das Fünffache verbessert werden.

Beispiel 5: Quantitative Bestimmung von Mikroorganismen unter Verwendung der Zentrifugationsbehandlung.

(Mikroorganismenhaltige Probe)

Eine Bierhefe (Saccharomyces cerevisiae, JCM 1499) wurde gezüchtet und dann mit physiologischer Salzlösung (0,15M- NaCl) gewaschen und verdünnt, wodurch eine Bierhefesuspension von 1,4 x 10&sup7;/ml hergestellt wurde.

(Bedingungen für die oxidative Verbrennung)

Flußrate hochreiner Luft 150 ml/Minute
Erhitzungstemperatur 680ºC
Die Probe wurde mit einer physiologischen Salzlösung mit einer Kohlenstoffkonzentration von etwa 150 ppb verdünnt, wodurch 6 schrittweise verdünnte Testflüssigkeiten hergestellt wurden. Jede der verdünnten Testflüssigkeiten wurde in einen Analysator für Gesamtkohlenstoff gegeben, und ihr TC-Wert A wurde berechnet (Injektionsmenge: 10 ul).
Als nächstes wurde jede der sechs Arten von verdünnten Flüssigkeiten (2 ml) einer Zentrifugationsbehandlung mittels einer Zentrifuge mit einer Rotationsgeschwindigkeit von 3500 UpM für etwa 15 Minuten unterworfen, und dann wurde die überstehende Flüssigkeit in einen Analysator für Gesamtkohlenstoff eingebracht, um ihren TC-Wert B zu berechnen (Injektionsmenge: 10 ul).
Von dem Wert, der durch Abziehen des TC-Werts B von dem entsprechenden TC-Wert A erhalten worden war, wurde die Kohlenstoffkonzentration berechnet, und ihre Korrelation mit der Konzentration der Bierhefe wurde untersucht.
Ferner wurde zum Vergleich die obige Bestimmung des TC- Werts B unter Verwendung einer von Mikroorganismen befreiten, behandelten Flüssigkeit durchgeführt. Diese Flüssigkeit wurde aus der Testflüssigkeit durch eine Filtrationsbehandlung mit Unterdruck, anstelle der Zentrifugationsbehandlung, erhalten. Der Injektor hatte einen Einwegfilter (Außendurchmesser: 25 mm, Porendurchmesser: 0,22 um) aus Polytetrafluorethylen und wurde durch Ultraschall in reinem Wasser etwa 20 Minuten lang gewaschen und dann an seinem Punkt angebracht. Dann wurde die Kohlenstoffkonzentration von diesem TC-Wert B, wie oben beschrieben, berechnet und die Korrelation mit der Bierhefekonzentration wurde untersucht.
Die oben erhaltenen Ergebnisse sind in Fig. 5 zusammen mit den Ergebnissen der Vergleichsbeispiele gezeigt. Aus diesen Ergebnissen ist zu verstehen, daß eine gute geradlinige Relation zwischen den Bierhefekonzentrationen und den Kohlenstoffkonzentrationen in dem Beispiel selbst bei einer Kohlenstoffkonzentration von 5 ppm oder weniger erhalten wird, obwohl die geradlinige Relation in den Vergleichsbeispielen bei einer Kohlenstoffkonzentration von 5 ppm oder weniger abfällt. Somit ist zu verstehen, daß die quantitative Bestimmung mit guter Genauigkeit unter den Bedingungen dieses Beispiels hinsichtlich Testflüssigkeiten, die 5 ppm (umgewandelt in Kohlenstoffkonzentration) oder weniger an Mikroorganismen enthalten, durchgeführt werden kann.

Claims

1. Verfahren zur quantitativen Bestimmung von Mikroorganismen oder Pyrogenen, dadurch gekennzeichnet, daß man eine vorgeschriebene Menge einer Mikroorganismen oder Pyrogene enthaltenden Testflüssigkeit in einen Analysator für Gesamtkohlenstoff einbringt, um einen Wert A für Gesamtkohlenstoff zu erhalten, während man die Mikroorganismen oder Pyrogene von der vorgeschriebenen Menge der gleichen Testflüssigkeit entfernt und die so erhaltene Flüssigkeit in einen Analysator für Gesamtkohlenstoff einbringt, um einen Wert B für Gesamtkohlenstoff zu erhalten, den Wert B für Gesamtkohlenstoff von dem Wert A für Gesamtkohlenstoff abzieht und auf der Grundlage des so erhaltenen Werts die Mikroorganismen oder Pyrogene bestimmt.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Entfernung von Mikroorganismen oder Pyrogenen mittels eines Membranfiltrations-Behandlungsverfahrens, eines Absorptions-Behandlungsverfahrens oder eines Zentrifugations-Behandlungsverfahrens durchgeführt wird.

3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß das Membranfiltrations-Behandlungsverfahren mit einem Filter mit einer Porengröße im Ultrafiltrationsbereich durchgeführt wird.

4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Porengröße 0,45 um oder weniger in Eignung zur Entfernung von Mikroorganismen beträgt.

5. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Porengröße 0,2 um oder weniger in Eignung zur Entfernung von Pyrogenen beträgt.

6. Vefahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß der Filter mittels Ultraschallwellen in superreinem Wasser vorbehandelt wird.

7. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß das Zentrifugations-Behandlungsverfahren mit einer Rotationsgeschwindigkeit von 2000 bis 5000 UpM durchgeführt wird.

8. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß der Analysator für Gesamtkohlenstoff ein Verbrennungsrohr zur Oxidation und einen Infrarotdetektor ohne Interferenz besitzt.

9. Vorrichtung zur quantitativen Bestimmung von Mikroorganismen oder Pyrogenen, umfassend einen Lagerteil für die Testflüssigkeit (2a), einen Speisekanal I und einen Speisekanal II, die ein Mittel zur Entfernung von Mikroorganismen oder Pyrogenen (3) besitzen und die mit dem Lagerteil verbunden sind, eine Meßpassage (5), die eine Einrichtung zur Messung einer Flüssigkeit vorsieht, welche mit den Speisekanälen (I) und (II) über eine Einrichtung zum Schalten von Kanälen (6) verbunden werden kann, und einen Analysator (11) für Gesamtkohlenstoff, welcher mit der Meßpassage verbunden ist.