DE3874019T2

DE3874019T2 - Verfahren zur konservierung von transplantierbaren, in vitro kultivierten epithelgeweben.

Info

Publication number: DE3874019T2
Application number: DE8888109528T
Authority: DE
Inventors: Ranieri Cancedda; Luca Michele De
Original assignee: Istituto Nazionale per la Ricerca Sul Cancro
Current assignee: Istituto Nazionale per la Ricerca Sul Cancro
Priority date: 1987-06-23
Filing date: 1988-06-15
Publication date: 1993-01-21
Anticipated expiration: 2008-06-16
Also published as: FI94147B; FI890821L; NO890715L; OA09038A; DK81789A; ZA884455B; EP0296475A1; AR240061A1; FI94147C; EP0296475B1; MX11997A; KR960009482B1; DK81789D0; HU203827B; AU618012B2; AU1995788A; PT87789A; PT87789B; IE61449B1; FI890821A0

Description

HINTERGRUND DER ERFINDUNG

1. Anwendungsgebiet der Erfindung

Die vorliegende Erfindung bezieht sich allgemein auf die kryologe Konservierung von Zellgewebe. Die vorliegende Erfindung bezieht sich insbesondere auf die kryologe Konservierung von Epithel-Schichten, die durch Zellkultivierung erhalten wurden.

2. Kurze Beschreibung des Standes der Technik

Trotz der jüngsten Fortschritte bei der Behandlung von verbranntem Gewebe (d.h. von Gewebe, das charakterisiert ist durch ausreichende Mengen an denaturiertem Protein, die zu einer Zellschädigung oder zum Tode führen) bleibt die Todesrate von verbrennungsopfern immer noch unakzeptabel hoch. Diese Todesfallraten sind natürlich stark abhängig vom Alter des patienten und vom Prozentsatz der verbrannten Körperfläche. Die Todesraten sind in der Tat dramatisch hoch für Verbrennungen dritten Grades (d.h. solchen, bei denen die Haut (Dermis) in ihrer vollen Dicke zerstört ist) auf 50 bis 60 % oder mehr der Körperfläche. Insbesondere in diesen Fällen tritt zusätzlich zu den unmittelbaren Problemen eines fortgeschrittenen kardiovaskulären Schocks und den Bedrohungen einer etwas weniger imminenten Sepsis oder hydroelektrolytischen Beeinträchtigung noch ein weiteres (geringfügig verzögertes) Problem, das verursacht wird durch das Fehlen eines Hautüberzugs auf einer großen Körperfläche. Die Schwierigkeit, die mit diesen fehlenden Überzügen oder offenen Flächen verbunden ist, besteht darin, daß sie die Neigung haben, sich nicht spontan wieder zu verschließen, da sie über ihre gesamte Dicke vollständig beschädigt oder zerstört sind.
Wenn die normalerweise geschlosene Epithelsperrschicht gegenüber der äußeren Umgebung geöffnet wird, entsteht ein chronisch pathologischer Zustand, der zusammen mit den obengenannten Infektions- und Stoffwechsel-Komplikationen die lokalen und systemischen Zustände des Patienten zunehmend verschlechtert. Die Gesamtsumme dieser Probleme überwältigt häufig das Verbrennungsopfer, das häufig stirbt.
Es ist deshalb offensichtlich, daß wenn einmal die Notfallphase der Behandlung überwunden worden ist, das medizinische Hauptproblem darin besteht, das Hautdefizit so schnell und so wirksam wie möglich abzudecken. Nach der üblicherweise akzeptierten medizinischen Praxis werden Wundflächen abgedeckt durch Transplantieren von Gewebestücken mit gespaltener Dicke, die aus gesunden unverbrannten Bereichen entnommen worden sind (Autoplastiken). Wenn jedoch die verbrannte Fläche beispielsweise 60 bis 70 % übersteigt, gibt es in der Regel nicht genügend Donorgewebe, das für die Transplantation zur Verfügung steht. Darüber hinaus entsteht an der Autoplastik-Donorstelle selbst eine weitere Fläche, der die Gesamthaut-Abdeckung fehlt. Diese Nachteile müssen zusammen mit der Tatsache berücksichtigt werden, daß die Autoplastik-Donorstellen ebenfalls die Neigung haben, sich nur langsam wieder zu schließen und zu nachteiligen Heilungsverzögerungen führen können.
Es ist auch medizinisch akzeptabel, das Hautdefizit abzudecken durch die Transplantation einer homologen Haut einer Leiche, einer lyophilisierten heterologen Haut (von beispielsweise einem Schwein), einer synthetischen künstlichen Cutis und dgl. Diese alternativen Materialien, die allogen sind, werden innerhalb von 1 bis 6 Monaten spontan abgestoßen und sie müssen gegebenenfalls durch ein autologes Gewebe ersetzt werden und sind somit bestenfalls temporärer Natur.
Verfahren, wie sie kürzlich in den US-PS 4 016 036, 4 304 866 und 4 456 657 beschrieben worden sind, lehren die Kultivierung von Human-Epithel-Filmen, die aus Keratinocyten der Haut erhalten werden. Diese Filme können natürlich autolog sein und sie erlauben deshalb die Abdeckung verbrannter Flächen, ohne daß sie später zurückgewiesen oder abgestoßen werden. Diese in diesen US-Patentschriften beschriebenen Verfahren beruhen darauf, daß ein kleines (2-3 cm² großes) Stück aus einem gesunden Donor-Bereich entnommen wird. Eine unter Verwendung des Donorgewebes erhaltene Epithelzellen-Suspension wird dann kultiviert und durch anschließende Inokulationen der Primärkultur expandiert. Wenn die sekundären und tertiären Kulturen zusammenwachsen, können mehrschichtige Epithel-Lagen erhalten werden.
Damit werden mehrere ernsthafte Probleme potentiell überwunden, wie z.B. die geringe Verfügbarkeit von restlicher gesunder Haut bei einem Patienten mit starken Verbrennungen oder die Notwendigkeit der Verwendung teurer Schweine-, Leichen- oder künstlicher Cutis, die jeweils nicht leicht verfügbar sein können und deren Verwendung wegen der Antikörperreaktion streng geregelt sein kann.
Andererseits benötigen die nach den obigen Verfahren erhaltenen Keratinocyten-Kulturen 3 bis 4 Wochen, bis sie ausreichend expandiert sind, so daß Filmlagen erhalten werden können. Das heißt mit anderen Worten, der Patient mit Verbrennungen muß für die ersten 3 bis 4 Wochen ohne Schutz der verbrannten Flächen verbleiben. Diese Anfangsperiode ist natürlich die kritischste und deshalb wäre die Transplantation von gesunder Haut (Cutis) während dieser Periode am vorteilhaftesten.
Außerdem müssen die kultivierten Epithel-Schichten, die in diesen US-Patentschriften beschrieben sind, innerhalb weniger Stunden nach dem Ernten verwendet werden, da es bisher nicht möglich war, eine Konservierungsmethode zu entwickeln, welche die expandierte Epidermis ausreichend lange konservieren kann, um ihren Transport zu entfernten Anwendungszentren zu erlauben. Die Literatur enthält viele Berichte von Versuchen zur Kryokonservierung von Hautproben: vgl. z.B. May et al., "Cryopreservation of Skin Using An Insulated Heat Sink Box Stored at -70ºC", in "Cryobiology", 22:205-14 (1985); May et al., "Recent Developments in Skin Banking and The Clinical Use of Cryopreserved Skin" in 73(4), "J. Med. Assoc. Ga.", 75:233-36 (1984); Yang et al. "Growth of Human Mammary Epithelial Cells on Collagen Cell Surfaces" in "Cancer Research", 41 (10) 4093-4100 (1981; Biagini et al. "Skin Storage in Liguid Nitrogen, An Ultrastructural Investigationt" in "Journal of Cutaneous Pathology", 6:5-17 (1979); Taylor, "Cryopreservation of Skin: Discussion und Comments" in "Cryobiology", 3 (2) 1966; and Baxter et al., "Cryopreservation of Skin: A Review in "Transplantation Proceedings", Vol. 17 (6) Suppl 4, 112-120 (1985). Diese und weitere Literatur zeigt, daß ein wesentlicher Bruchteil der Zellen in gefrorenem Epithelgewebe nach dem Auftauen zu einem fortschreitenden Stoffwechsel in der Lage ist. Die für die Verwendung als Autoplastiken oder Alloplastiken vorgesehenen Epithelschichten, die als Verband für Verbrennungen fungieren sollen, müssen jedoch einen verhältnismäßig hohen Gehalt an mitotisch aktiven Zellen nach der Kryokonservierung aufweisen. Die Bereitstellung von Schichten mit konsistenten Bioeigenschaften erfordert, daß sie zur Mitosis und zur schichtenförmigen Differenzierung fähig sein müssen. Diese Fähigkeit wurde bisher nicht nachgewiesen für eingefrorene und wiederaufgetaute kultivierte Epithelproben.
Man kann nicht mit Sicherheit den Einfluß des Einfrierens und Auftauens auf das Schicksal der Zellen in kultivierten zusammengewachsenen Lagen bzw. Schichten, denen es an einem Träger für das Hautmaterial mangelt, vorhersagen. Die Schicht bzw. Lage umfaßt Zellen, die durch Oberflächenprotein miteinander verbunden sind und nur einige wenige Zellen dick ist. Sie sind nicht differenziert in Form einer vollständig schichtenförmigen Epidermis. Das Einfrieren und Auftauen bringt mit sich die intrazellulare und interzellulare Eiskristallbildung, eine Expansion und eine Kontraktion, die jeweils unvorhersehbare Effekte auf die einzelnen kultivierten Zellen und auf die Schicht bzw. Lage als Ganzes haben.
Die Verfügbarkeit von eingefrorenen kultivierten Hauttransplantationsmaterialien hätte den Vorteil, daß sie die Lagerung und den Transport erlauben und auch für solche Patienten geeignet wären, die mehrere Transplantationen erfordern, da sie eine bessere Koordination zwischen den Kultivierungs- und Operations-Plänen erleichtern würden. Wenn solche Produkte entwickelt würden, wäre es möglich, "Gewebebänke" oder andere Hinterlegungsstellen für eine allogene expandierte Epidermis einzurichten, auf die im Notfalle zurückgegriffen werden könnte.
Leicht verfügbare kultivierte Alloplastiken in einem gefrorenen Zustand sind für verschiedene klinische Anwendungen geeignet. So haben beispielsweise die Erfinder der vorliegenden Erfindung gefunden, daß tiefe Verbrennungen zweiten Grades viel schneller heilen, wenn ihnen kultivierte Alloplastiken transplantiert werden. Begrenzte Verletzungen über die volle Dicke, die klinisch wie Verbrennungen dritten Grades aussehen, wurden durch die Empfänger-Keratinocyten reepithelisiert, deren Wachstum und wahrscheinliche Wanderung durch kultivierte Alloplastiken stark stimuliert wurden.
Kultivierte Alloplastiken könnten auch auf die meisten Donorstellen aufgebracht werden, die für die Entnahme von Netz-Transplantaten mit gespaltener Dicke verwendet werden. Dies führt zu einer schönen Abheilung dieser Flächen schon nach 4 Tagen.
Das hier beschriebene Verfahren kann auch mit Erfolg für kryologe Konservierungen von in vitro expandierter Mucosa (Schleimhaut) angewendet werden. Diesbezüglich wurde von den Erfindern der vorliegenden Erfindung festgestellt, daß expandierte Mucosa in vitro erhalten werden kann, indem man von einer Stanz-Biopsie ausgeht, an die sich die für die Herstellung von Epithelfilmen aus Keratinocyten der Haut beschriebene Methode anschließt. Die Erfinder der vorliegenden Erfindung haben außerdem gefunden, daß die in vitro expandierte Mucosa erfolgreich auf patienten transplantiert werden kann, die ein Oralmucosa-Transplantat benötigen.
Ein Ziel dieser Erfindung ist es, ein Verfahren zur Herstellung von kultivierten, kryokonservierten Epithelschichten bzw. -lagen, die nach dem Auftauen als permanente Autoplastik oder temporäre Wundheilungs-Alloplastik fungieren; sowie ein Verfahren zu schaffen, mit dessen Hilfe es möglich ist, kultivierte Epidermis-Schichten bzw. -Lagen in einer Hautbank zu hinterlegen, zu verteilen und anschließend bestimmungsgemäß zu verwenden, in einer Form, welche die Handhabung durch den Chirurgen erleichtert, und das auch nützlich ist für die Behandlung von Hautverbrennungen, Geschwüren und anderen Wunden. Ein weiteres Ziel besteht darin, lagerbeständige Epithelwundverbände zu schaffen, die zu einer Mitosis und zu einer schichtenförmigen Differenzierung zur Herstellung einer permanenten Autoplastik oder einer temporären Alloplastik in der Lage sind. Diese und weitere Ziele und Merkmale der Erfindung gehen aus der nachfolgenden Beschreibung, den beiliegenden Zeichnungen und den nachfolgenden Ansprüchen hervor.

ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Konservierung von transplantierbaren Schichten bzw. Lagen von zusammengewachsenen Epithelzellen, die in vitro kultiviert worden sind. Die bevorzugten Schichten bzw. Lagen umfassen kultivierte, zusammengewachsene Keratinocyten- Zellen, am meisten bevorzugt Keratinocyten der Epidermis.
Die vorliegende Erfindung ermöglicht auch den Transport von konservierter kultivierter Epidermis und damit die Einrichtung einer Bank für kryokonservierte expandierte allogene Epidermis.
Gemäß der vorliegenden Erfindung werden kultivierte Epithelschichten bzw. -lagen, die im übrigen für die Transplantation fertig sind, in Medien inkubiert, die übliche Nährstoffe und ein Kryokonservierungsmittel enthalten. Die Schichten bzw. Lagen werden für eine vorgegebene Zeitspanne inkubiert und danach bis auf eine Endtemperatur von etwa -100ºC eingefroren. Der angewendete Abkühlungsgradient ist charakterisiert durch eine langsamere Anfangsphase und eine schnellere Endphase.
Das Verfahren führt zu einem lagerbeständigen Epithelwund-Verband, der besteht aus einer eingefrorenen zusammengewachsenen Lage bzw. Schicht von kultivierten Epithelzellen, die auf einer nicht-haftenden Trägerunterlage angeordnet sind. Nach dem Auftauen und Auflegen auf die Oberfläche einer Wunde ist die Schicht bzw. Lage von Zellen zu einem Stoffwechsel und zu einer Mitose und einer schichtenförmigen Differenzierung fähig unter Bildung einer permanenten Autoplastik oder einer temporären Alloplastik. Das heißt, weiin die Schichten bzw. Lagen aus Epithelzellen gebildet werden, die aus einem Patienten entnommen wurden, führt die Verwendung zu einer permanenten Autoplastik. schichten bzw. Lagen, die aus Human-Epithelzellen kultiviert worden sind, ergeben eine ausgezeichnete, zu einem Stoffwechsel fähige temporäre Wundheilungs- Alloplastik, wenn sie bei anderen Humanpatienten angewendet werden.

KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN

Fig. 1a zeigt eine optische Mikrophotographie einer kultivierten Human-Epithel-Schicht vor der erfindungsgemäßen Behandlung;
Fig. 1b stellt eine optische Mikrophotographie der kultivierten Epithel-Schicht gemäß Fig. 1 dar, die erfindungsgemäß behandelt und dann aufgetaut worden ist; und
Fig. 2 stellt eine Elektronenmikrophotographie der kultivierten Epithel-Schicht gemäß Fig. 1b dar.

DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG

Erfindungsgemäß werden schichten bzw. Lagen aus Epithel-Filmen und dgl. verwendet, beispielsweise solche, die nach den oben diskutierten US-Patentschriften 4 016 036, 4 304 866 und 4 456 657, auf die hier ausdrücklich Bezug genommen wird, hergestellt werden. Die Schichten bzw. Lagen werden zuerst durch Inkubieren in Medien, vorzugsweise Nährmedien, die ein Kryokonservierungsmittel enthalten, stabilisiert.
Die intrazelluläre Konzentration des Kryokonservierungsmittels ist ein wichtiger Faktor für den Erfolg des Verfahrens. Das Kryokonservierungsmittel ist vorzugsweise in einer Menge von 8 bis 15 Gew.-% enthalten und dabei handelt es sich vorzugsweise um Glycerin oder Dimethylsulfoxid. Am meisten bevorzugt wird als Kryokonservierungsmittel Glycerin in einer Menge von etwa 10 Gew.-% verwendet. Die Schichten bzw. Lagen werden bei etwa Raumtemperatur, vorzugsweise nicht mehr als 15 Minuten lang inkubiert. In dieser Hinsicht wurde die Inkubationszeit als etwas kritisch gefunden, da die Erfinder der vorliegenden Erfindung festgestellt haben, daß die Länge dieser Perioden die Lebensfähigkeit der Zellen und die Fähigkeit der transplantierten Keratinocyten zur Bildung von Kolonien dramatisch beeinflußt. Insbesondere haben Tests, die unter Variieren der Inkubationszeit durchgeführt wurden, eine ziemlich deutliche Abnahme der Fähigkeit der Keratinocyten zur Bildung von Kolonien nach sowohl sehr kurzen Inkubationszeiten (von weniger als etwa 2 Minuten) als auch ziemlich langen Inkubationszeiten (von mehr als etwa 15 Minuten) gezeigt, während die Fähigkeit zur Bildung von Kolonien stark ansteigt bei Inkubationszeiten von etwa 4 bis 7 Minuten und maximal ist bei Inkubationszeiten von etwa 5 bis 7 Minuten. Äquivalente intrazelluläre Konzentrationen des Kryokonservierungsmittels können in die Zellen eingeführt werden unter Anwendung höherer Konzentrationen und kürzerer Inkubationszeiten oder unter Anwendung niedrigerer Konzentrationen und längerer Inkubationszeiten.
Nach der Inkubation werden die Epithelschichten einem Einfrierverfahren unterzogen, wobei die Temperatur genau kontrolliert wird, so daß die Geschwindigkeit der Temperaturabnahme beim Beginn des Verfahrens niedriger ist als am Ende des Verfahrens. Innerhalb des Temperaturbereiches von unmittelbar oberhalb, bei und unmittelbar unterhalb 0ºC wird ein langsamer Abkühlungsgradient von beispielsweise nicht mehr als -2ºC/min und vorzugsweise von etwa -1ºC/min angewendet. Die weitere Abkühlung unterhalb des Gefrierpunktes kann schneller erfolgen. Es ist bevorzugt, das Abkühlen für einige Minuten auszusetzen, bevor die Zellen unter den Gefrierpunkt abgekühlt werden. Bei der Kulminierung des Einfrierens erreichen die eingefrorenen Schichten bzw. Lagen vorzugsweise höchstens -80ºC und besonders bevorzugt höchstens -100ºC. In diesem Zustand kann die behandelte Epithel-Schicht bzw. -Lage mindestens etwa 3 Minuten lang gelagert werden, ohne daß eine wesentliche Änderung ihrer morphologischen und funktionellen Eigenschaften auftritt. Stücke von Epithel-Schichten, die durch Behandlung gemäß der vorliegenden Erfindung erhalten worden sind, sind nämlich vergleichbar in bezug sowohl auf ihre Morphologie als auch in bezug auf ihre Transplantierbarkeit mit denjenigen, die auf andere Weise erhältlich sind aus frischen Kulturen, die keiner Kryokonservierung unterworfen worden sind.
Die Schichten bzw. Lagen werden vor dem Einfrieren vorzugsweise so angeordnet, daß ihre Oberflächen einander gegenüberliegen im Kontakt mit einem nicht-haftenden Trägermaterial dazwischen. Konventionelle sterile Gaze, die mit Rohvaseline behandelt worden ist, ist gut geeignet. Der Träger wirkt als Hilfsmittel bei der Handhabung der empfindlichen Schichten bzw. Lagen in gefrorenem Zustand und nachdem sie aufgetaut worden sind. Der Träger dient auch als geeignete temporäre Abdeckung für die Schicht bzw. Lage nach dem Aufbringen auf die Oberfläche einer Hautwunde.
In dieser Hinsicht erläutert die Fig. 1a eine Schicht bzw. Lage vor Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens, während die Fig. 1b eine Schicht bzw. Lage zeigt, die dem erfindungsgemäßen Einfrierverfahren unterworfen worden ist und die auch aufgetaut worden ist. Die Schicht bzw. Lage der Fig. 1b ist deshalb bereit für die Verwendung als Transplantat. Beide Schichten bzw. Lagen der Fig. la und 1b wurden fixiert, inkorporiert, zugeschnitten und angefärbt mit Hämatoxylineosin. Die Fig. 2 zeigt eine Elektronenmikrophotographie der in vitro kultivierten Epidermis-Schicht bzw. -Lage der Fig. 1b. Aus diesen Mikrophotographien geht hervor, daß die vorliegende Erfindung zu einer guten Zellkonservierung der Basalschicht sowie zu einer guten Konservierung der interzellulären Struktur führt.
Wenn die behandelten Schichten bzw. Lagen verwendet werden sollen, ist es ausreichend, sie einige wenige Minuten lang bei etwa 37ºC zu inkubieren und anschließend in einer physiologischen Kochsalzlösung oder in einem geeigneten Kulturmedium zu waschen.
Außer zum Abdecken von verbrannten Flächen können die konservierten Epidermis-Schichten bzw. -Lagen auch auf anderen Gebieten nutzbringend eingesetzt werden, beispielsweise in der onkologischen Plastik- oder Wiederherstellungs-Chirurgie. Die konservierte in vitro-expandierte Mucosa kann auch in der Oral-Chirurgie verwendet werden.
Die folgenden Beispiele erläutern eine bevorzugte Ausführungsform der Erfindung, ohne daß die Erfindung jedoch darauf beschränkt ist.

BEISPIEL

Es wurden Keratinocyten-Kulturen erhalten durch Anwendung der Verfahren der vorstehend beschriebenen US-Patentschriften, auf die hier Bezug genommen wird. Insbesondere wurden die zusammengewachsenen sekundären Keratinocyten-Kulturen, die gemäß US-PS 4 016 036 erhalten wurden, aus ihren Kultivierungsflaschen entnommen, auf mit Vaseline beschichtete Gaze übertragen und mittels metallischer chirurgischer Gefäß-Klammern nach dem in der US-PS 4 304 866 beschriebenen Verfahren darauf verankert.
Diese kultivierten Gewebestücke wurden dann unter sterilen Bedingungen in 12 x 20 große sterile Polyester/polyethylen/Aluminium-Beutel (Gambro S.A., 18, rue de Calais, 75885 Paris (3 Transplantate in jedem Beutel), eingeführt, dann wurden 100 ml Medien mit der nachstehend angegebenen Zusammensetzung in die Beutel gegeben:
Dulbecco-Modifizierung von Eagle-Medium 54 Gew. -%
Ham-F&sub1;&sub2; 27 Gew.-%
Fetales Kalbsserum (FCS) 9 Gew.-%
Glycerin 10 Gew. %
Glutamin 4mM
Adenin 1,8 x 10&supmin;&sup4; M
Insulin 5 ug/ml
Transferrin 5 ug/ml
Triiodthyronin 2 x 10&supmin;&sup9; M
Hydrocortison 0,4 ug/ml
Epidermis-Wachstumsfaktor 10 ng/ml
Penicillin-Streptomycin 50 U/ml
Die Beutel wurden dann thermisch versiegelt und 5 bis 7 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubiert. Die Beutel wurden in einen geeigneten Behälter gelegt und in eine geeignete programmierbare Einfriervorrichtung überführt (eine solche Einfriervorrichtung ist bekannt als Programmable Temperatur Controller PTC-300 und im Handel erhältlich von der Firma Planer Products, Ltd.). Die Gewebestücke wurden dann unter Anwendung des folgenden Einfrierprogramms eingefroren.
Ausgangstemperatur: +25 ºC
-5ºC/min bis auf +3ºC
Pause für 4 Minuten;
-1ºC/min bis auf -7ºC
-25ºC/min bis auf -40ºC
+15ºC/min bis auf -25ºC
-2ºC/min bis auf 40ºC und
-3ºC/min bis auf -100ºC.
Wenn die Endtemperatur von -100ºC erreicht war, wurden die Kunststoffbeutel in einen geeigneten Metallbehälter überführt, der mindestens 2 Stunden vorher auf -80ºC abgekühlt worden war. Der Metallbehälter wurde dann schnell in eine -80ºC-Einfriervorrichtung überführt.
Die die eingefrorenen Epithel-Schichten bzw. -Lagen enthaltenden Beutel können über lange Strecken versandt werden, wobei lediglich vorausgesetzt ist, daß ein Temperaturanstieg vermieden wird. Die eingefrorenen Schichten bzw. Lagen können mindestens 3 Monate lang bei -80ºC aufbewahrt werden, wobei ihre morphologischen und funktionellen Eigenschaften aufrechterhalten werden.
Wenn es erforderlich ist, die eingefrorenen Filme zu verwenden, werden die Beutel aus der Gefriereinrichtung entnommen, sofort in ein Wasserbad von +37ºC eingetaucht und etwa 10 Minuten lang inkubiert. Die Beutel werden dann einige wenige Sekunden lang in 70 %-iges Ethanol eingetaucht. Dann werden die Beutel unter sterilen Bedingungen geöffnet, die Epithel-Schichten werden entnommen, in sterile Behälter überführt, mit Kulturmedium oder einer physiologischen Kochsalzlösung gründlich gewaschen und verwendet. Die Verwendung umfaßt die konventionelle Wundbett- Präparierung, um den Zellen der aufgetauten Schicht ein Substrat zu bieten, das für den innigen Kontakt geeignet ist. Die Schichten werden aufgebracht, indem man sie im Oberflächenkontakt so auf die Wundfläche legt, daß der Träger nach außen gerichtet ist, und dann die Schicht durch den Träger hindurch leicht anpreßt, um sie an die Gestalt der wundoberfläche anzupassen. Für größere Flächen können mehrere Schichten verwendet werden.
Es ist natürlich klar, daß verschiedene Modifikationen der vorstehend beschriebenen Verfahrens innerhalb des Rahmens des Fachwissens des Fachmannes auf diesem Gebiet liegen und daß diese Modifikationen und dgl. ebenfalls unter die folgenden Ansprüche fallen.

Claims

1. Verfahren zur Konservierung von Epithelschichten, umfassend die Stufen:

a) des Inkubierens der Epithelschichten bei Raumtemperatur in Medien, die ein Kryokonservierungsmittel enthalten, während eines Zeitraums von 2 Minuten bis 15 Minuten;

b) des Einfrierens dieser Epithelschichten unter Anwendung einer Kühlgeschwindigkeit von nicht mehr als -2ºC/min durch den Temperaturbereich unmittelbar über und unmittelbar unter 0ºC.

2. Verfahren nach Anspruch 1, bei dem das Kryokonservierungsmittel Glycerin oder Dimethylsulfoxid ist.

3. Verfahren nach Anspruch 1, bei dem das Kryokonservierungsmittel zu dem Nährmedium in einer Konzentration von 8-15 Gew.-% gefügt wird.

4. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, bei dem die Inkubation bei Raumtemperatur während eines Zeitraums von 4 Minuten bis 7 Minuten durchgeführt wird.

5. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, bei dem die Epithelschichten aus Zellkulturen erhalten wurden.

6. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, bei dem die Schichten bei höchstens bis zu -80ºC eingefroren werden.

7. Verfahren zur Konservierung von Epithelschichten nach einem der vorhergehenden Ansprüche, bei dem das Medium im wesentlichen umfaßt:

Dulbecco Modifikation von Eagle's Medium 54 Gew.-%

Ham's fl2 27 Gew.-%

fötales Kälberserum (FCS) 9 Gew.-%

Glycerin 10 Gew.-%

Glutamin 4 mM

Adenin 1.8 x 10&supmin;&sup4; M

Insulin 5 mcg/ml

Transferrin 5 mcg/ml

Triiodthyronin 2 x 10&supmin;&sup9; M

Hydrocortison 0.4 mcg/ml

epidermaler Wachstumsfaktor 10 ng/ml

Penicillin-Streptomycin 50 U/ml

8. Verfahren zur Konservierung von Epithelschichten gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, bei dem im wesentlichen folgendes Einfrierprogramm verwendet wird:

Starttemperatur: +25ºC;

-5ºC/min. bis ... +3ºC;

Pause während 4 Min.;

-1ºC/min. bis ... -7ºC;

-25ºC/min. bis ... -40ºC;

+15ºC/min. bis ... -25ºC;

-2ºC/min. bis ... -40ºC; und

-3ºC/min. bis ... -100ºC.

9. Verfahren zur Konservierung von Epithelschichten nach einem der vorhergehenden Ansprüche, das darüber hinaus die Stufe des Auftauens der eingefrorenen Schichten umfaßt.

10. Wundverband, erhältlich nach dem Verfahren der Ansprüche 1-9, umfassend eine kryokonservierte, aufgetaute, kultivierte, zusammengewachsene Schicht, die unterscheidbare, metabolisch und mitotisch kompetente, schichtförmige Epithelzellen mit konservierter intrazellularer Struktur umfaßt.

11. Verband nach Anspruch 10, der weiter eine Rückseite umfaßt, die in Kontakt mit einer Oberfläche der Schicht angeordnet ist und zur Entfernung von der Oberfläche geeignet ist.

12. Verband nach Anspruch 10, worin die Epithelzellen Keratinozyten sind.

13. Gefrorene, kultivierte, schichtförmige Epithelschicht, erhältlich nach dem Verfahren der Ansprüche 1-9, die, aufgetaut, als Haut- Wundverband geeignet ist, eine konservierte intrazellulare Struktur aufweist und mitotisch und metabolisch kompetente Epithelzellen umfaßt.

14. Gefrorene, kultivierte Epithelschicht, erhältlich nach dem Verfahren der Ansprüche 1-9.

15. Gefrorene, kultivierte Epithelschicht nach Anspruch 14, worin die Epithelzellen Keratinozyten sind.

16. Gefrorene, kultivierte Epithelschicht nach den Ansprüchen 14 oder 15, die darüberhinaus eine Rückseite umfaßt, die in Kontakt mit einer Oberfläche der Schicht angeordnet ist.

17. Gefrorene, kultivierte Epithelschicht nach Anspruch 16, worin die Rückseite ein Material umfaßt, das zur Entfernung von der Oberfläche der Schicht geeignet ist.