DE3872621T2

DE3872621T2 - Nachweis von umgebenden konzentrationen mehrerer analyten.

Info

Publication number: DE3872621T2
Application number: DE8888307273T
Authority: DE
Inventors: Roger Philip Ekins
Original assignee: Multilyte Ltd
Current assignee: Multilyte Ltd
Priority date: 1987-08-06
Filing date: 1988-08-05
Publication date: 1993-02-18
Anticipated expiration: 2008-08-06
Also published as: NO900534D0; ES2034245T3; CA1334278C; EP0304202A1; DK29390D0; DK29390A; NO177205C; DK164944B; GR3005905T3; WO1989001157A1; GB8803000D0; JPH03503081A; ZA885825B; NO177205B; ATE78101T1; FI900557A0; NO900534L; DK164944C; DE3872621D1; BR8807644A

Description

Technisches Gebiet der Erfindung

Die vorliegende Erfindung betrifft die Bestimmung der umgebenden Analytkonzentrationen in Flüssigkeiten, z.B. die Bestimmung von Analyten wie Hormone, Proteine und andere in biologischen Flüssigkeiten wie Körperflüssigkeiten natürlich vorkommenden oder künstlich vorhandenen Substanzen.

Stand der Technik

In der internationalen patentanmeldung WO84/01031 hat die Anmelderin vorgeschlagen, die Analytkonzentration in einer Flüssigkeit dadurch zu messen, daß die Flüssigkeit mit Spuren eines Bindemittels, wie einem für den Analyten insofern spezifischen Antikörper, als er den Analyten, jedoch keine anderen Komponenten in der Flüssigkeit reversibel bindet, in Berührung gebracht, daß eine der proportionalen Besetzung der Bindestellen in dem Bindemittel entsprechende Menge bestimmt, und daß aus dieser Menge die Analytkonzentration ermittelt wird. In jener Anmeldung wurde darauf hingewiesen, daß unter der Voraussetzung, daß die Menge an Bindemittel so gering ist, daß bei seiner Einbringung in die Flüssigkeit keine nennenswerte Verringerung der Konzentration des umgebenden (ungebundenen) Analyten erfolgt, die Teilbesetzung der Bindestellen in dem Bindemittel durch den Analyten von der Absolutmenge der Flüssigkeit und der Absolutmenge des Bindemittels praktisch unabhängig ist, d.h. unabhängig innerhalb der Fehlergrenzen Messungen, die gewöhnlich bei der Teilbesetzung auftreten. Unter solchen, und nur unter solchen Umständen läßt sich eine Beziehung zwischen der Anfangsanalytkonzentration [H] in der Flüssigkeit und dem Anteil (Ab/Abo) der in dem Bindemittel durch den Analyten besetzten Bindestellen durch folgende Gleichung beschreiben:
Ab/Abo = Kab[H]/1 + Kab[H]
wo Kab (im folgenden K genannt) die Gleichgewichtskonstante zur Bindung des Analyten an die Bindestellen und eine Konstante für einen bestimmten Analyten und Bindemittel bei der jeweiligen Temperatur darstellt. Diese Konstante ist normalerweise als Affinitätskonstante bekannt, insbesondere, wenn es sich bei dem Bindemittel um einen Antikörper, z.B. einen monoklonalen Antikörper, handelt.
Die Auffassung, daß lediglich Spuren des Bindemittels verwendet werden sollten, steht im Gegensatz zu der allgemein empfohlenen Praxis auf dem Gebiet der Immuntest- und Immunmeßmethoden. So wird z.B. in einem so bekannten Werk wie "Methods in Investigative and Diagnostic Endocrinology" (Methoden der untersuchenden und diagnostischen Endokrinologie), Herausg. S.A. Berson und R.S. Yalow, 1973, auf Seiten 111-116 vorgeschlagen, daß bei der Durchführung eines kompetitiven Immuntests dann maximale Empfindlichkeit erreicht wird, wenn der Anteil an gebundenem Marker"-Analyten annähernd 50% beträgt. Damit solch ein hoher Bindungsgrad des Analyten erzielt wird, ist es gemäß der von Berson und Yalow aufgestellten, bis auf den heutigen Tag von anderen Forschern auf diesem Gebiet allgemein anerkannten Theorie erforderlich, daß die Konzentration an Bindemittel (oder genau genommen an Bindestellen, da jedes Bindemittelmolekül üblicherweise eine oder höchstens zwei Bindestellen aufweist) größer oder gleich dem reziproken Wert der Gleichgewichtskonstante (K) des Bindemittels für den Analyten ist, d.h. [Ab] ≥ 1/K. Für eine Probe mit einem Volumen V muß die Gesamtmenge an Bindemittel (oder Bindestellen) daher größer oder gleich V/K sein. Im Falle eines monoklonalen Antikörpers als Bindemittel kann dieses z.B. eine Gleichgewichtskonstante (K) in der Größenordung von 10¹¹ Liter/Mol für das spezifische zu bindende Antigen aufweisen. Somit ist gemäß der obigen allgemein anerkannten Praxis eine Bindemittelkonzentration (oder Bindestellenkonzentration) in der Größenordnung von 10&supmin;¹¹ Mol/Liter oder mehr für Bindemittel mit einer derartigen Gleichgewichtskonstante erforderlich, und bei einem Volumen der Flüssigprobe in der Größenordnung von 1 Milliliter wird es üblicherweise für notwendig erachtet, 10&supmin;¹&sup4; oder mehr Mol des Bindemittels (oder der Bindestellen) einzusetzen. Avogadros Zahl beträgt etwa 6 x 10²³, so daß 10&supmin;¹&sup4; Mol Bindestellen mehr als 10&sup9; Bindemittelmolekülen entspricht, auch wenn man annimmt, daß das Bindemittel zwei Bindestellen pro Molekül besitzt. Im Falle von spezifischen Bindemitteln mit höchster Af finität beträgt K weniger als 10¹³ Liter/Mol, so daß nach üblicher Praxis mehr als 10&sup7; Bindemittelmoleküle erforderlich sind, wohingegen bei Bindemitteln mit geringerer Affinität in der Größenordnung von 10&sup8; Liter/Mol nach üblicher Praxis mehr als 10¹² Moleküle eingesetzt werden müssen. In der Tat entsprechen alle derzeit im Handel erhältlichen Immuntestbestecke diesen Vorstellungen, wobei die zum Einsatz kommende Bindestellenmenge annähernd V/K beträgt oder, noch öfter, weit darüber liegt; in der Tat ist es bei manchen Bestecken, die auf dem Einsatz von markierten Antikörpern beruhen, üblich, möglichst viel Bindemittel einzusetzen, wobei die gebundenen Analytanteile weit über 50% liegen.
Da in solchen Systemen hohe Anteile, z.B. 50%, des Analyten in den getesteten Flüssigproben gebunden vorliegen, ist die Teilbesetzung der Bindestellen des Bindemittels von dem Volumen der Flüssigprobe nicht unabhängig, so daß für genaue quantitative Tests das Volumen der Probe genau geregelt und in allen Tests konstant gehalten werden muß, ob es sich nun um Proben unbekannter Konzentration oder um Standardproben bekannter Konzentration handelt, die zum Aufstellen der Dosis-Wirkungs-Kurve herangezogen werden. Weiterhin muß in solchen Systemen ebenfalls die Menge des in den Standard- und Kontrollinkubationsröhrchen vorhandenen Bindemittels sorgfältig geregelt werden. Diese Beschränkungen der gegenwärtigen Tests sind weltweit anerkannt und akzeptiert.
Aus der GB-Patentanmeldung 2099578A ist eine Vorrichtung für Immuntests bekannt, die aus einem porösen festen Träger besteht, an den an mehreren voneinander beabstandeten Stellen Antigene oder weniger häufig Immunoglobuline gebunden sind, wobei jene Vorrichtung die Durchführung einer großen Anzahl von qualitativen oder quantitativen Immuntests auf demselben Träger ermöglicht, um z.B. das Antikörperprofil einer Probe menschlichen Blutserums zu erstellen. Zwar können die einzelnen Stellen in Form sogenannter Mikropunkte vorliegen, die durch Zuführung von antigenhaltigen Lösungen oder Suspensionen in Form von Tröpfchen erhalten wurden, doch die Molzahl des an jeder Stelle vorhandenen Antigens soll anscheinend immer noch so hoch sein, daß im wesentlichen der gesamte in der zu testenden Flüssigprobe vorhandene Analyt (d.h. Antikörper), dessen Konzentration gemessen werden soll, gebunden vorliegt. Dies ist daraus ersichtlich, daß die in jener Anmeldung (Seite 3, Zeilen 21-28) verwendete quantitative Meßmethode unter Eichung mit bekannten Mengen des auf den Träger aufgebrachten Immunoglobulins erfolgt; dies bedeutet jedoch, daß in den getesteten Proben für einen echten Vergleich praktisch jedes Molekül aus der Probe extrahiert werden muß und folglich große Mengen an Antigen (d.h. Bindemittel in diesem Fall) in jedem Mikropunkt notwendig sind, und zwar in viel größerer Menge als der in der Probe vorhandenen Gesamtmenge an Analyt (d.h. Antikörper in diesem Fall) entspricht.

Darstellung der Erfindung

Die vorliegende Erfindung beruht auf der Erkenntnis, daß der Einsatz großer Mengen an Bindemittel zur Erzielung guter Empfindlichkeit in Immuntests weder notwendig noch allgemein wünschenswert ist. Wird die Menge an Bindemittel, anstatt möglichst hoch gehalten zu werden, reduziert, so daß lediglich ein unwesentlicher Teil des Analyten, im allgemeinen weniger als 10%, normalerweise weniger als 5%, und für optimale Ergebnisse lediglich 1% oder 2% oder weniger, reversibel an jenes Mittel gebunden ist, so ist es nicht nur jetzt nötig, ein genau geregeltes, konstantes Volumen für alle Flüssigproben (Standardproben sowie unbekannte Proben) in einem bestimmten Test einzusetzen, sondern es ist auch möglich, unter Verwendung von viel weniger als V/K Mol Bindemittel-bindestellen, z.B. nicht mehr als 0,1 V/K und vorzugsweise weniger als 0,01 V/K verläßliche Ergebnisse und in manchen Fällen sogar eine bessere Bestimmung der Analytkonzentration zu erzielen. Bei einem Bindemittel mit einer Gleichgewichtskonstante (K) für den Analyten in der Größenordnung von 10¹¹ Liter/Mol und Probengrößen von etwa 1 ml entspricht dies in etwa nicht mehr als 10&sup8;, vorzugsweise weniger als 10&sup7;, an jeder Stelle einer Einzelanordnung vorhandenen Bindemittelmolekülen. Beträgt der Wert von K 10¹³ Liter/Mol, so ergeben sich für diese Zahlen jeweils 10&sup6; und 10&sup5; Moleküle, und liegt K in der Größenordnung von 10&sup8;, so ergeben sich jeweils 10¹¹ und 10¹&sup0; Moleküle. Bei weniger als 10² Bindemittelmolekülen an einer Stelle würde die Meßgenauigkeit immer mehr abnehmen, da die Teilbesetzung der Bindemittelstellen durch den Analyten nur schrittweise erfolgen könnte, je nachdem, ob die einzelnen Stellen besetzt würden oder unbesetzt blieben, aber zumindest im Prinzip wäre es zulässig, lediglich 10 Moleküle zu verwenden, falls eine Meßgenauigkeit von nur 10% annehmbar ist. Unter praktischen Gesichtspunkten kann es bevorzugt sein, mehr als 10&sup4; Moleküle einzusetzen.
Es wurde gefunden, daß im Falle von Antikörpern mit einer Affinitätskonstante von K Liter/Mol für ein Antigen im allgemeinen die Beziehung zwischen der Antikörperkonzentration und der Teilbesetzung der Bindestellen bei jeder beliebigen Antigenkonzentration und die Beziehung zwischen der Antikörperkonzentration und dem Prozentsatz an an die Bindestellen gebundenem Antigen bei jeder beliebigen Antigenkonzentration den gleichen Kurvenverlauf zeigen, vorausgesetzt, d&13 die Antikörperkonzentrationen und die Antigenkonzentrationen jeweils in Bruchteilen oder als ein Mehrfaches von 1/K ausgedrückt werden. Dies ist in der beiliegenden Zeichnung dargestellt, bei der es sich um ein Schaubild handelt, in dem diese Beziehungen in zwei Reihen von Kurven aufgetragen sind. Jede Kurve bezieht sich auf die als 1/K ausgedrückte Antikörperkonzentration [Ab], die entlang der x-Achse aufgetragen ist. Im Falle der Reihe von Kurven, die konstant bleiben oder mit zunehmender [Ab] abnehmen, stellt die y-Achse die Teilbesetzung (F) der Bindestellen des Antikörpers durch das Antigen dar; im Falle der zweiten Reihe stellt die y-Achse den Prozentsatz (b%) an an jene Bindestellen gebundenem Antigen dar. Die einzelnen Kurven in jeder Reihe stellen die Beziehungen dar, die vier verschiedenen als K ausgedrückten Antigenkonzentrationen [An], und zwar 10/K, 1,0/K, 0,1/K und 0,01/K, entsprechen. Aus den Kurven ergibt sich, daß bei Abnahme von [Ab], F einen im wesentlichen konstanten Wert erreicht, der von [An] abhängt.
Aus diesem Grunde ist es verständlich, daß die obenerwähnte GB-Patentanmeldung 2099578A, in der zur quantitativen Bestimmung große Mengen an Bindemittel und im wesentlichen vollständige Komplexierung des gesamten Analyten erforderlich sind, nicht in der Lage ist, den durch die vorliegende Erfindung erzielten Fortschritt zu erkennen, die statt dessen auf einem anderen Meßprinzip beruht, bei dem die Messung der Teilbesetzung des Bindemittels erforderlich ist und das daher nur einen geringen Anteil der gesamten vorhandenen, aus der Probe durch Komplexierung zu entfernenden Analytmoleküle benötigt.
Ausgehend von der Erkenntnis, daß es zulässig ist, solche geringe Mengen an Bindemittel einzusetzen, wird es möglich, das für eine einzelne Konzentrationsmessung benötigte Bindemittel auf einer sehr kleinen Fläche eines festen Trägers aufzubringen und folglich die unterschiedlichsten für verschiedene Analyten spezifischen Bindemittel, die gegebenenfalls gleichzeitig in einer zu analysierden Flüssigkeit vorhanden sind, nebeneinander, jedoch an räumlich voneinander getrennten Punkten, auf einem einzigen festen Träger aufzubringen. Durch die gleichzeitige Einwirkung der zu analysierenden Flüssigkeit auf jeden der verschiedenen Punkte wird erreicht, daß jeder Bindemittelfleck den für ihn spezifischen Analyten absorbiert, und zwar in solchem Maße (d.h. gemäß der Teilbesetzung der Bindestellen), wie es der Analytkonzentration in der Flüssigkeit entspricht, unter der einzigen Voraussetzung, daß das Lösungsvolumen und deren Analytkonzentration so groß sind, daß lediglich ein unbedeutender Bruchteil (im allgemeinen weniger als 10%, normalerweise weniger als 5%) des Analyten an den Punkt gebunden ist. Die Teilbesetzung der Bindestellen für jedes Bindemittel läßt sich sodann mit getrennten stellenspezifischen Reagenzien ermitteln, die entweder die unbesetzten Bindestellen oder die besetzten Bindestellen der verschiedenen Bindemittel erkennen und mit einem Marker markiert sind, z.B. Fluoreszenzmarker, wodurch die Messung der Konzentrationswerte der getrennten, an die verschiedenen zu messenden Bindemittel gebundenen Reagenzien ermöglicht wird. Solche Messungen lassen sich je nach Art der Markierungen entweder nacheinander ausführen, z.B. mit einem Laser, der den Träger abtastet, oder gleichzeitig, z.B. mit einer Fotoplatte. Andere Bildaufzeichnungsvorrichtungen wie z.B. eine Fernsehkamera lassen sich gegebenenfalls auch verwenden. Da die Bindemittel räumlich voneinander getrennt sind, ist es möglich, lediglich eine geringe Anzahl von verschiedenen Markierungen oder sogar dieselbe Markierung während des gesamten Experiments zu verwenden und jede Bindemittelstelle getrennt abzutasten, um so die Anwesenheit und Konzentration des Markers zu bestimmen. Durch Anwendung der Erfindung lassen sich mit einer einzigen Einwirkung der zu analysierenden Flüssigkeit auf den Feststoffträger bedeutend mehr als 3 Analysen durchführen, z.B. 10, 20, 30, 50 oder sogar bis zu 100 oder mehrere hundert Analysen.
Somit stellt die vorliegende Erfindung insgesamt ein Verfahren zur Bestimmung der umgebenden Konzentrationen mehrerer Analyten in einer flüssigen Probe mit einem Volumen von V Litern zur Verfügung, das darin besteht, daß man:
ein Trägermittel mit mehreren unterschiedlichen Bindemitteln, von denen jedes zur reversiblen Bindung eines gegebenenfalls in der Probe vorhandenen Analyten fähig und für jenen Analyten im Vergleich mit den anderen Komponenten der flüssigen Probe spezifisch ist, an mehreren voneinander beabstandeten Stellen derart belädt, daß jede Stelle nicht mehr als 0,1 V/K Mol eines einzelnen Bindemittels aufweist, wobei K Liter/Mol die Gleichgewichtskonstante des Bindemittels bezüglich des Analyten darstellt;
das beladene Trägermittel mit der zu analysierenden flüssigen Probe derart in Berührung bringt, daß jede der voneinander beabstandeten Stellen im gleichen Arbeitsgang mit der flüssigen Probe in Berührung gebracht wird, wobei die Menge der in der Probe eingesetzten Flüssigkeit derart ist, daß lediglich ein unwesentlicher Anteil an evtl. in der flüssigen Probe vorhandenem Analyten an das dafür spezifische Bindemittel gebunden wird, sowie
eine die Teilbesetzung der Bindemittel durch die Analyten an den voneinander beabstandeten Stellen darstellende Größe mittels einer kompetitiven oder nichtkompetitiven Testmethode unter Verwendung eines für jedes Bindemittel stellenspezifischen Reagens mißt, das dazu in der Lage ist, entweder die nichtbesetzten Bindestellen oder die besetzten Bindestellen an dem Bindemittel zu erkennen, wobei jenes stellenspezifische Reagens mit einem Marker markiert ist, wodurch sich die Menge jenes Reagens an der entsprechenden Stelle messen läßt.
Die Erfindung stellt ebenfalls eine bei der Bestimmung der umgebenden Konzentrationen mehrerer Analyten in einer flüssigen Probe mit einem Volumen von V Litern verwendbare Vorrichtung zur Verfügung, die aus einem festen Trägermittel mit einer Vielzahl von an mehreren voneinander beabstandeten Stellen darauf befindlichen unterschiedlichen Bindemitteln besteht, von denen jedes zur reversiblen Bindung eines gegebenenfalls in der Probe vorhandenen Analyten fähig und für jenen Analyten im Vergleich mit den anderen Komponenten der flüssigen Probe spezifisch ist, wobei jede Stelle nicht mehr als 0,1 V/K, vorzugsweise weniger als 0,01 V/K Mol, eines einzelnen Bindemittels aufweist, wobei K Liter/Mol die Gleichgewichtskonstante jenes Bindemittels zur Reaktion mit dem dafür spezifischen Analyten darstellt.
Ein Besteck zur Verwendung bei dem erfindungsgemäßen Verfahren besteht aus einer erfindungsgemäßen Vorrichtung, mehreren Standardproben mit bekannten Konzentrationen der Analyten, deren Konzentrationen in der flüssigen Probe bestimmt werden sollen, sowie einen Satz markierter regiospezifischer Reagenzien zur Reaktion mit besetzten oder unbesetzten Bindestellen an den Bindemitteln.

Genaue Beschreibung der Erfindung

Die Wahl des festen Trägers sollte dem Anwender überlassen werden. Vorzugsweise ist das Substrat nichtporös, so daß das Bindemittel auf dessen Oberfläche z.B. in Form einer Monoschicht angeordnet ist. Bei Verwendung eines porösen Trägers kann es dazu kommen, daß das Bindemittel in die Poren des Trägers eindringt, wo es durch Einwirkung des Analyten, dessen Konzentration bestimmt werden soll, ebenfalls durch die Geometrie der Poren beeinflußt wird, wodurch evtl. ein falscher Wert wird. Poröse Träger wie Zellulosenitratpapier mit punktförmig aufgetragenem Bindemittel sind daher weniger bevorzugt. Im Gegensatz zu den in GB-2099578A eingesetzten Trägern, die aufgrund der großen Anzahl der darauf aufzubringenden Moleküle scheinbar porös sein müssen, werden bei den in der vorliegenden Erfindung eingesetzten Trägern viel geringere Mengen eingesetzt, so daß diese nicht porös zu sein brauchen. Die nichtporösen Träger können z.B. aus Kunststoffmaterial oder Glas bestehen, wobei beliebige Hartkunststoffmaterialien zum Einsatz kommen können. Polystyrol ist als Kunststoffmaterial bevorzugt, doch lassen sich auch andere Polyolefine oder Acryl- oder Vinylpolymere verwenden.
Der Träger kann aus Mikrokügelchen bestehen, z.B. aus solch einem Kunststoffmaterial, das sich mit gleichmäßigen Bindemittelschichten beschichten läßt, wobei diese an bestimmten Bereichen, z.B. Vertiefungen, auf einer Trägerplatte festgehalten werden. Wahlweise kann das Material in Form einer Folie oder Platte mit punktförmig aufgetragener Anordnung des Bindemittels vorliegen. Für die Struktur des Trägermittels kann es von Vorteil sein, wenn es so strukturiert ist, daß Flüssigproben, die einfach/gut in Berührung gehalten werden mit der Vielzahl von beabstandeten, mit verschiedenen Bindemitteln markierten Bereichen. So können die beabstandeten Bereichen z.B. in Vertiefungen in dem Tragermittel angeordnet sein und mehrere Vertiefungen, die jeweils mit der gleichen Gruppe von verschiedenen, an beabstandeten Bereichen vorhandenen Bindemitteln versehen sind, können zur Bildung einer Mikrotitrationsplatte zwecks Verwendung für mehrere Proben miteinander verknüpft sein.
Soll das Trägermittel zusammen mit einem Meßsystem mit Lichtabtastung eingesetzt werden, so ist das Trägermaterial, z.B. Kunststoff, vorzugsweise lichtundurchlässig, z.B. kann es mit einem lichtundurchlässig Material gefüllt sein, das u.a. weiß oder schwarz sein kann, wie z.B. Ruß, wenn es sich bei den zu messenden, von dem Bindemittel oder regiospezifischen Reagens emittierten Signalen um Lichtsignale wie z.B. von Fluoreszenz- oder Lumineszenzmarkern handelt. Im allgemeinen wird dabei reflektierenden Materialien der Vorzug gegeben, um die auf den Detektor oder die fotografischen Platte auftreffende Lichtintensität zu erhöhen. Die endgültige Wahl des optimalen Materials wird bestimmt durch seine Fähigkeit, das Bindemittel an seiner Oberfläche zu binden, durch seine fehlende Emission von Hintergrundsignalen und das Vorhandensein anderer Eigenschaften, die zum höchstmöglichen Signal-Rausch-Verhältnis für den oder die jeweiligen Marker führen, die an das auf der Oberfläche des Materials vorhandene Bindemittel gebunden sind. Höchst zufriedenstellende Ergebnisse wurden in den im folgenden beschriebenen Beispielen durch Verwendung einer weißen lichtundurchlässigen Mikrotitrationsplatte aus Polystyrol erzielt, die unter dem Namen White-Microfluor-Mikrotitrationsvertiefungen von der Firma Dynatech im Handel erhältlich ist.
Als Bindemittel lassen sich Bindemittel unterschiedlicher Spezifizität einsetzen, d.h. Mittel, die für verschiedene Analyten spezifisch sind, oder zwei oder mehr von ihnen können Bindemittel gleicher Spezifität aber verschiedener Affinität darstellen, d.h. Mittel, die für den gleichen Analyt spezifisch sind, aber unterschliedliche Gleichgewichtskonstanten K für die Reaktion mit diesem aufweisen. Die letztere Möglichkeit ist von besonderem Wert, wenn die zu testende Analytkonzentration in der unbekannten Probe über einen größeren Bereich variabel ist, zum Beispiel 2 oder 3 Größenordnungen, wie es z.B. bei der HCG-Messung im Urin schwangerer Frauen der Fall ist, wo diese zwischen 0,1 und 100 oder mehr IE/ml schwanken kann.
Bei den Bindemitteln handelt es sich bevorzugt um Antikörper, besonders bevorzugt um monoklonale Antikörper. Monoklonale Antikörper für die verschiedensten Bestandteile biologischer Flüssigkeiten sind im Handel erhältlich oder lassen sich mit Hilfe bekannter Methoden herstellen. Die eingesetzten Antikörper können herkömmliche Affinitätskonstanten aufweisen, zum Beispiel von 10&sup8; oder 10&sup9; Liter/Mol an, so etwa in der Größenordnung von 10¹&sup0; oder 10¹¹ Liter/Mol, wobei jedoch auch hochaffine Antikörper mit Affinitätskonstanten von 10¹²-10¹³ Liter/Mol verwendet werden können. Die Erfindung läßt sich mit solchen Bindemitteln durchführen, die selbst nicht markiert sind. Es ist jedoch ebenso möglich und oft wünschenswert, markierte Bindemittel zu verwenden, so daß das System aus Bindemittel/Analyt/regiospezifischem Reagens zwei verschiedene Markierungen des gleichen Typs aufweist, z.B. Fluorenszenz-, Chemilumineszenz, Enzym - oder Radioisotopenmarkierung, eine an dem Bindemittel und eine an dem regiospezifischen Reagens. Durch den Meßvorgang wird dann das Verhältnis der Intensität der beiden Signale gemessen, wodurch es nicht mehr erforderlich ist, bei Messung der Signale von Standardproben für Eichzwecke und bei Messung von Signalen von den unbekannten Proben die gleiche Menge an markiertem Bindemittel auf den Träger aufzubringen. Da das System nur auf der Messung eines der Bindestellenbesetzung entsprechenden Verhältnisses beruht, ist es auch nicht mehr nötig, das von dem gesamten Flecken emittierte Signal zu messen, sondern es ist ausreichend, nur einen Teil davon abzutasten. Vorzugsweise ist jedes Bindemittel mit der gleichen Markierung versehen, doch können auch unterschiedliche Markierungen verwendet werden.
Die Bindemittel lassen sich auf jede für das Beschichten von Trägern, wie z.B. Röhrchen, mit Bindemitteln bekannte oder üblicherweise verwendete Art auf den Träger auftragen, zum Beispiel, indem man jede beabstandete Stelle auf dem Träger mit einer Lösung des Bindemittels in Form eines Tröpfchens, z.B. von 0,5 Mikroliter, auf einem 1 mm²-Flecken in Berührung bringt und die Berührung eine Zeitlang aufrechterhält, bevor man die Tröpfchen abwäscht. Dieses Vorgehen führt dazu, daß ein in etwa konstanter geringer Bruchteil des in dem Tröpfchen vorhandenen Bindemittels von dem Träger adsorbiert wird. Es ist darauf hinzuweisen, daß die Bindemittelbeschichtungsdichte auf dem Mikroflecken nicht geringer als die Bindungsdichte in konventionellen mit Antikörpern beschichteten Röhrchen sein muß; die verringerte Zahl der Moleküle auf jedem Flecken läßt sich allein durch die verringerte Größe des Fleckens und nicht durch die Beschichtungsdichte erreichen. Zur Erzielung möglichst hoher Signal-Rausch-Verhältnisse ist im allgemeinen eine hohe Beschichtungsdichte wünschenswert. Die Fleckengröße beträgt zweckmäßig weniger als 10 mm², vorzugsweise weniger als 1 mm². Der Abstand zwischen ihnen soll, aber muß nicht, das 2- bis 3-fache des Fleckenradius oder mehr betragen. Dieser Vorschlag bezüglich der Geometrie kann jedoch nach Bedarf geändert werden und hängt allein von der begrenzten Anzahl von Bindemittelmolekülen in jedem Flecken, dem Mindestvolumen der Probe, das auf die Fleckenanordnung einwirken soll und den an Ort und Stelle vorhandenen Mitteln zur nichtaufwendigen Herstellung einer Fleckenanordnung auf die beschriebene Art und Weise ab.
Nach Vollendung der Beschichtung des Trägers mit den Bindemitteln ist es üblich, den Träger, bei Verwendung von Antikörpern als Bindemitteln, mit einer Albumin oder ein anderes Protein enthaltenden Lösung zu waschen, damit alle auf dem Träger und anderswo verbliebenen nichtspezifischen Adsorptionsstellen abgesättigt werden. Um sicherzustellen, daß die in einem einzelnen Flecken vorhandene Menge an Bindemittel weniger als die Maximalmenge (0,1 V/K) beträgt, die dem Prinzip der vorliegenden Erfindung entsprechend erforderlich ist, läßt sich die an jeder einzelnen Stelle vorhandene Menge an Bindemittel durch Markierung des Bindemittels mit einem nachweisbaren Markierer bekannter spezifischer Aktivität (d.h. einer bekannten Menge Marker pro Gewichtseinheit an Bindemittel) und Messung der vorhandenen Menge des Markers überprüfen. Soll z.B. auf dem in dem Verfahren der Erfindung verwendeten festen Träger kein markiertes Bindemittel verwendet werden, so kann das Bindemittel dennoch in einem Testversuch markiert werden, und können die Bedingungen ermittelt werden, unter denen korrekte Beladung mit Bindemittel erfolgt, um anschließend das Auftragen unmarkierten Bindemittels auf die in Wirklichkeit zu verwendendenden Träger unter identischen Bedingungen durchzuführen.
Die Mindestgröße der Flüssigprobe (V Liter) hängt mit der Molzahl an Bindemittel (weniger als 0,1 V/K) zusammen, so daß lediglich ein unwesentlicher Teil des in der Flüssigprobe vorhandenen Analyten an das Bindemittel gebunden wird. Dieser Anteil beträgt in der Regel weniger als 10%, üblicherweise weniger als 5% und wünschenswerterweise 1 oder 2% oder weniger, je nach der für den Test erwünschten Genauigkeit (wobei größere Genauigkeit bei Konstanthaltung aller übrigen Größen dann erreicht wird, wenn geringere Analytanteile gebunden werden) und nach der Größe der vorhandenen anderen, zu Fehlern führenden Faktoren. Probengrößen in der Größenordnung eines oder einiger ml oder weniger, z.B. von nur 100 Mikroliter oder weniger, sind oft bevorzugt; es können jedoch auch Umstände auftreten, wobei es zweckmäßiger ist, größere Volumina zu testen, wobei dann die Geometrie entsprechend angepaßt werden kann. Die Probe kann entweder in ihrer natürlichen Konzentration verwendet werden, oder gegebenenfalls kann sie auf einen bekannten Verdünnungsgrad gebracht werden.
Die bei den erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten regiospezifischen Reagenzien können selbst Antikörper darstellen, z.B. monoklonale Antikörper, und können antiidiotypische oder Anti-Analyt-Antikörper darstellen, wobei die letzteren besetzte Stellen erkennen. Wahlweise können auch unbesetzte Stellen, z.B. im Falle von Analyten geringer Molekulargröße wie z.B. Thyroxin (T4), erkannt werden, indem man entweder den entsprechend markierten Analyten selbst oder den an ein anderes Molekül (z.B. ein Proteinmolekül, das direkt oder indirekt markiert ist, kovalent gekoppelten Analyten verwendet. Die regiospezifischen Reagenzien lassen sich mit konventionellen Fluoreszenzmarkierungen wie Fluoreszein, Rhodamin Texas Red oder in zeitaufgelöster pulsierter Fluoreszenz einsetzbaren Materialien wie Europium und anderen Lanthaniden-Chelatkomplexen direkt oder indirekt auf übliche Art und Weise markieren. Gegebenenfalls lassen sich andere Markierungen wie Chemilumineszenz-, Enzym- oder Radioisotopenmarkierungen verwenden. Jedes regiospezifische Reagens wird vorzugsweise mit der gleichen Markierung versehen, wobei sich jedoch unterschiedliche Markierungen bei verschiedenen Reagenzien verwenden lassen. Die regiospezifischen Reagenzien können für einen einzigen der Bindemittel-Analyt-Flecken in jeder Gruppe von Flecken spezifisch sein, oder unter gewissen Umständen wie z.B. im Falle von Glykoproteinhormonen wie HCG und FSH, die eine gemeinsame Bindestelle aufweisen, können sie kreuzreagierende Reagenzien darstellen, die in der Lage sind, mit besetzten Bindestellen in mehr als einem der vorhandenen Flecken zu reagieren.
Bei der Testtechnik lassen sich die der Teilbesetzung des Bindemittels in den Testproben unbekannter Konzentrationen der Analyten entsprechenden Signale durch Vergleich mit den von Standardproben mit bekannten Analytkonzentrationen erhaltenen Dosis-Wirkung-Kurven kalibrieren. Solche Standardproben müssen nicht alle Analyten zusammen enthalten, solange nur jeder Analyt in einigen der Standardproben vorhanden ist. Die Teilbesetzung läßt sich durch Bestimmung besetzter Bindestellen (wie im Falle eines Anti-Analyt-Antikörpers) oder unbesetzter Bindestellen (wie im Falle eines antiidiotypischen Antikörpers) messen, da der eine die Umkehrung des anderen darstellt. Zwecks größerer Genauigkeit ist es wünschenswert, den Bruchteil, der näher bei Null liegt, zu messen, da eine Änderung in der Teilbesetzung um 0,01 in disem Fall proportional größer ist, wobei jedoch für Teilbesetzungen im Bereich 25-75% jede der beiden Möglichkeiten im allgemeinen zufriedenstellend ist.
In jener Ausführungsform der vorliegenden Erfindung, die auf zwei Fluoreszenzmarkern beruht, läßt sich die Messung der relativen Intensität der von den zwei Markern emittierten Signale, eines am Bindemittel und das andere am regiospezifischen Reagens, mit einem Laser- Raster-Konfokalmikroskop wie z.B. dem von der Firma Bio-Rad Laboratories Ltd. erhältlichen Bio-Rad Lasersharp MRC 500, der ein Zweikanaldetektionssystem aufweist, durchführen. Dieses Gerät benutzt zur Abtastung der Flecken oder ähnlichem auf dem Träger einen Laserstrahl, wodurch es zu Fluoreszenz der Marker kommt, und wellenlängenfilter zur Differenzierung und Messung der emittierten Fluoreszenzbeträge. Zeitaufgelöste Fluoreszenzmethoden lassen sich ebenfalls verwenden. Tritt zwischen den zwei Kanälen Interferenz (sogenannte Übersprechstörung) auf, so können diese durch Standardkorrekturen beseitigt oder durch konventionelle Maßnahmen reduziert werden. Die Unterscheidung der zwei von doppelt markierten Flecken emittierten Fluoreszenzsignale wird in der vorliegenden Bauart dieses Geräts durch Filter erreicht, die in der Lage sind, die charakteristische Wellenlänge zweier Fluoreszenzemissionen zu unterscheiden; fluoreszierende Substanzen können sich durch andere physikalische Eigenschaften wie unterschiedliche Fluoreszenz-Abklingzeiten, Bleichdauer u.a. unterscheiden, und jedes dieser Mittel läßt sich, entweder allein oder zusammen, zur Unterscheidung zweier Fluorophora verwenden und somit wird die Messung des Verhältnisses zweier fluoreszenzmarkierter in einem Einzelflecken vorhandenen Einheiten (Bindemittel und regiospezifisches Reagens) unter Verwendung von auf dem Gebiet der Fluoreszenzmessung bekannten Methoden ermöglicht. Bei Vorhandensein lediglich einer Fluoreszenzmarkierung lassen sich dieselben Methoden verwenden, sofern darauf geachtet wird, daß jeweils der gesamte Flecken abgetastet wird und die Flecken von Test zu Test bei Verwendung der unbekannten und der Standardproben im wesentlichen die gleiche Menge an Bindemittel enthalten.
Im Falle anderer Markierungen wie z.B. Radioisotopmarkierungen, Chemilumineszenzmarkierungen oder Enzymmarkierungen existieren entsprechende Verfahren zur Unterscheidung der einzelnen Signale, die von einem oder von jedem Markierungspaar emittiert werden, sind auch bekannt. Es lassen sich zum Beispiel zwei Radioisotope wie ¹²&sup5;J und ¹³¹J leicht aufgrund der unterschiedlichen Energie der jeweiligen radioaktiven Strahlung unterscheiden. In gleicher Weise lassen sich die Produkte zweier Enzymreaktionen, die sich vom doppelt enzymmarkierten Antikörperpaar ableiten, wobei diese z.B. verschiedenfarbig sind, oder zweier Chemilumineszenzreaktionen, z.B. mit unterschiedlichem Chemilumineszenz-Halbwertszeit oder Lichtemissionswellenlänge, durch wohlbekannte auf den entsprechenden Gebieten Techniken identifizieren.
Durch die Erfindung wird das Testen von in biologischen Flüssigkeiten vorhandenen Analyten, zum Beispiel menschlichen Körperflüssigkeiten wie Blut, Serum, Speichel oder Urin, ermöglicht. Dadurch lassen sich die verschiedensten Hormone, Proteine, Enzyme oder andere Analyten, die in der Flüssigprobe entweder natürlich vorkommen oder darin künstlich eingebracht wurden, wie z.B. Arzneimittel, Gifte o.ä., testen.
Durch die Erfindung wird zum Beispiel eine Vorrichtung zur quantitativen Bestimmung von verschiedenen mit Schwangerschaft und Fortpflanzung in Zusammenhang stehenden Hormonen, wie z.B. FSH, LH, HCG, Prolaktin und Steroidhormonen (z.B. Progesteron, Estradiol, Testosteron und Androstendion) oder Hormonen der Nebennieren-Hypophysenachse, wie z.B. Kortisol, ACTH und Aldosteron, oder mit der Schilddrüse in Zusammenhang stehenden Hormonen, wie z.B. T4, T3, sowie TSH und deren Bindeprotein TBG, oder Viren wie Hepatitis, AIDS oder dem Herpesvirus, oder Bakterien wie Staphylokokken, Streptokokken, Pneumokokken, Gonokokken und Enterokokken, oder mit Tumoren im Zusammenhang stehenden Peptiden wie AFP oder CEA, oder jene zur Verbesserung der Leistungsfähigkeit von Sportlern verbotenen Substanzen, oder Lebensmittelkontaminanten zur Verfügung gestellt. Die jeweils verwendeteten Bindemittel sind für die zu testenden Analyten, im Vergleich zu anderen in der Probe vorhandenen Substanzen) spezifisch und können für diese monoklonale Antikörper darstellen.
Weitere die Methodik betreffende Einzelheiten finden sich in der internationalen Patentanmeldung WO88/01058, auf deren Inhalt hiermit ausdrücklich Bezug genommen wird.
Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele erläutert.

Beispiel 1

Ein Anti-TNF (Tumornekrosefaktor)-Antikörper mit einer Affinitätskonstante für TNF bei 25ºC von etwa 1 x 10&sup9; Liter/Mol wird mit Texas Red markiert. Eine Lösung des Antikörpers in einer Konzentration von 80 Mikrogramm/ml wird hergestellt und aliquote Teile dieser Lösung von jeweils 0,5 Mikroliter werden in Tröpfchenform in jede Vertiefung einer (mit einem lichtundurchlässig weißen Material) gefüllten Dynatech-Microfluor-Mikrotitrationsplatte aus Polystyrol mit 12 Vertiefungen gegeben.
Ein Anti-HCG (Human-Choriongonatropin)- Antikörper mit einer Affinitätskonstante für HCG bei 25ºC von etwa 6 x 10&sup8; Liter/Mol wird ebenfalls mit Texas Red markiert. Eine Lösung des Antikörpers in einer Konzentration von 80 Mikrogramm/ml wird hergestellt und aliquote Teile dieser Lösung von jeweils 0,5 Mikroliter werden in Form von Tröpfchen, eines für jede Vertiefung, in dieselbe Dynatech-Microfluor-Mikrotitrations platte gegeben.
Nach Zugabe der Tröpfchen wird die Platte einige Stunden lang in einer feuchten Atmosphäre belassen, damit die Tröpfchen nicht verdunsten. Während dieser Zeit erfolgt teilweise Adsorption der Antikörpermoleküle an die Platte. Als nächstes werden die Vertiefungen mehrmals mit einem Phosphatpuffer ausgewaschen und anschließend mit etwa 400 Mikroliter einer 1%igen Albuminlösung gefüllt und mehrere Stunden lang stehengelassen, um die Restbindstellen in den Vertiefungen abzusättigen. Danach werden sie noch einmal mit Phosphatpuffer gewaschen.
Die resultierende Platte weist in jeder iher Vertiefungen zwei Flecken mit einer Fläche von jeweils etwa 1 mm² auf. Aus der Messung der Fluoreszenzmenge geht hervor, daß in allen Vertiefungen ein Flecken jeweils etwa 5 x 10&sup9; Anti-TNF-Antikörpermoleküle und der andere jeweils etwa 5 x 10&sup9; Anti-HCG-Antikörpermoleküle enthält. Die Vertiefungen sind zur Verwendung von Flüssigproben mit einem Volumen von 400 Mikrolitern vorgesehen, so daß 0,1 V/K 4 x 10&supmin;¹&sup4; Mol sind (entsprechend 2,4 x 10¹&sup0; Moleküle) im Falle des Anti-TNF-Antikörper und 7 x 10&supmin;¹&sup4; Mol sind (entsprechend 4 x 10¹&sup0; Moleküle) im Falle des Anti- HCG-Antikörper.

Beispiel 2

Eine Mikrotitrationsplatte, hergestellt wie in Beispiel 1 beschrieben, wird zum Testen einer künstlich hergestellten Lösung mit TNF und HCG verwendet. Eine Testprobe der Lösung von etwa 400 Mikroliter wird in eine der Vertiefungen gegeben und mehrere Stunden lang inkubieren gelassen. Etwa 400 Mikroliter verschiedener Standardlösungen mit bekannten Konzentrationen (0,02, 0,2, 2 und 20 ng/ml) an TNF oder HCG werden in die anderen Vertiefungen der Platte gegeben und ebenfalls mehrere Stunden inkubieren gelassen. Die Vertiefungen werden anschließend mehrmals mit Pufferlösung ausgewaschen.
Als regiospezifische Reagenzien werden für die TNF-Flecken ein Anti-TNF-Antikörper mit einer Affinitätskonstante für TNF bei 25ºC von etwa 1 x 10¹&sup0; Liter/Mol und für die HCG-Flecken ein Anti-HCG-Antikörper mit einer Affinitätskonstante für HCG bei 25ºC von etwa 1 x 10¹¹ Liter/Mol verwendet. Beide Antikörper werden mit Fluoreszin (FITC) markiert. Aliquote Teile der Lösungen dieser markierten Antikörper von 400 Mikroliter werden in die Vertiefungen gegeben und mehrere Stunden stehengelassen. Die Vertiefungen werden anschließend mit Puffer ausgewaschen.
Das resultierende Fluoreszenzverhältnis jedes Fleckens wird mit Hilfe eines Bio-Rad-Lasersharp-MRC-500- Konfokalmikroskops quantitativ bestimmt. Aus den Standardlösungen werden die Dosis-Wirkungs-Kurven für TNF und HCG erstellt, wobei die Werte für TNF wie folgt sind: FITC-Fluoreszenz TNF-Konzentration ng/ml Texas Red Fluoreszenz des TNF-Flecken
und jene für HCG wie folgt sind:
TEXT FEHLT Mengen an T4, T3 und TSH werden die Dosis-Wirkungs-Kurven nach Arbeitsmethoden gemäß Beispiel 2 erhalten und die Fluoreszenz-Verhältnisse zu den T4-, T3- und TSH-Konzentrationen in Beziehung gesetzt. Mit Hilfe der Platte lassen sich die T4-, T3- und TSH-Spiegel im Serum menschlicher Patienten messen, wobei gute Korrelation mit den Ergebnissen aus anderen Verfahren erzielt wird.

Beispiel 4

Nach einer ähnlichen Arbeitsweise wie in Beispiel 1 beschrieben, wird eine Mikrotitrationsplatte mit Flecken erstes markiertes Anti-HCG-Antikörper (Affinitätskonstante etwa 6 x 10&sup8; Liter/Mol bei 25ºC), zweites markiertes Anti-HCG-Antikörper (Affinitätskonstante etwa 1,3 x 10¹¹ Liter/Mol bei 25ºC) und markiertes Anti-FSH (Follikelstimulierendes Hormon)-Antikörper (Affinitätskonstante etwa 1,3 x 10&sup8; Liter/Mol bei 25ºC) in jeder Vertiefung hergestellt, wobei die Flecken jeweils weniger als 0,1 V/K Mol der jeweiligen Antikörpers enthalten wird als gemeinsamer Entwicklungsantikörper sowohl für den HCG- als auch für den FSH-Test verwendet.
Unter Verwendung von aliquoten Teilen von Standardlösungen von 400 Mikroliter mit verschiedenen bekannten Konzentrationen an HCG und FSH werden die Dosis- Wirkungs-Kurven nach den Arbeitsmethoden gemäß Beispiel 2 erhalten, wobei die Fluoreszenzverhältnisse zu den HCG - und FSH-Konzentrationen in Beziehung gesetzt werden und die mit dem Anti-HCG-Antikörper höherer Affinität erhaltene Kurve konzentrationsempfindlichere Ergebnisse bei den geringeren HCG-Konzentrationen liefert, wohingegen die Kurve des Anti-HCG-Antikörper geringere Affinität bei höheren HCG-Konzentrationen konzentrationsempfindlicher ist. Mit Hilfe der Platte werden die HCG- und FSH-Konzentrationen im Urin von Frauen beim Schwangerschaftstest gemessen, wobei gute Korrelationen mit auf andere Weise erhaltenen Ergebnissen erzielt werden und, durch richtige Wahl des besten HCG- Flecks und der Dosis-Wirkungs-Kurve, Messungen der tatsächlichen Konzentration für HCG über eine Konzentrationsbereich von zwei oder drei Größenordnungen durchgeführt werden können.

Herstellung markierter Antikörper

Die Markierung von Antikörpern mit Fluoreszenzmarkierungen kann nach einer bekannten und standardisierten Methode, siehe Leslie Hudson und Frank C. Hay, "Practical Immunology" [Praktische Immunologie), Blackwell Scientific Publications (1980), Seiten 11-13, z.B. wie folgt erfolgen:
Der monoklonale Antikörper Anti-FSH-3G3, ein für FSH spezifischer (beta-Untereinheit)-Antikörper mit einer Affinitätskonstante (K) von 1,3 x 10&sup8; Liter pro Mol, wurde in der Middlesex Hospital Medical School hergestellt und mit TRITC (Rhodamin-Isothiocyanat) oder Texas Red markiert, wobei sich eine rote Fluoreszenz ergab.
Der monoklonale Antikörper Anti-FSH-8D10, ein kreuzreagierender (alpha-Untereinheit) Antikörper mit einer Affinitätskonstante (K) von 1 x 10¹¹ Liter pro Mol, wurde ebenfalls in der Middlesex Hospital Medical School hergestellt und mit FITC (Fluoreszein-Isothiocyanat) markiert, wobei sich eine gelbgrüne Fluoreszenz ergab.
Die angewandte allgemeine Vorschrift umfaßt Reinigung mit Aszitesflüssigkeit (Fällung mit Ammoniumsulfat sowie T-Gelchromatografie) mit anschließender Markierung gemäß folgenden Schritten:

1.a. Reinigung mit Ammoniumsulfat

1. 5 ml des Antikörperpräparats (überstehende Kulturflüssigkeit oder auf 1:5 verdünnte Aszitesflüssigkeit) unter ständigem Rühren mit 4,1 ml gesättigter Ammoniumsulfatlösung versetzen (45% Sättigung).
2. 30-90 min. weiterrühren. 30 min. bei 2500 Upm zentrifugieren.
3. Die überstehende Flüssigkeit verwerfen und den Niederschlag in PBs auflösen (Endvolumen 5 ml). Schritt 1 und 2 wiederholen, ODER
4. 3,6 ml gesättigte Ammoniumsulfatlösung (40% Sättigung) unter ständigem Rühren zugeben. Schritt 2 wiederholen.
5. Die überstehende Lösung verwerfen und das Pellet in dem gewünschten Puffer auflösen.
6. Über Nacht in der Kälte mit dem gleichen Puffer dialysieren (unter Verwendung eines frischen, in destilliertem Wasser gekochten Dialysierschlauches).
7. Die Proteinkonzentration entweder bei A&sub2;&sub8;&sub0; oder durch Bestimmung nach Lowry ermitteln.

1.b. T-Gelchromatografie: (Puffer: 1M Tris-Cl, pH 7,6. Festes Kaliumsulfat)

1. 2 ml Aszitesflüssigkeit durch Zentrifugieren bei 4000 Upm klären.
2. 1 M Tris-Cl-Lösung zum Erreichen der Endkonzentration von 0,1 M zugeben.
3. Genügend festes Kaliumsulfat zugeben. Endkonzentration = 0,5 M.
4. Die Aszitesflüssigkeit auf die T-Gelkolonne auftragen.
5. Die Kolonne mit einer Lösung aus 0,1 Tris-Cl- Puffer und 0,5 M Kaliumsulfat waschen, bis das Proteinprof il (bei A&sub2;&sub8;&sub0;) auf null zurückgeht.
6. Das absorbierte Protein mit 0,1 M Tris-Cl- Puffer als Laufmittel eluieren.
7. Die Fraktionen mit Antikörperaktivität vereinen und mit Hilfe eines Amicon-30-Konzentrierers konzentrieren.
8. Bei Durchführung von HPHT-Reinigung den Anfangspuffer für HPHT-Chromatographie bei Schritt 7 einsetzen.

2. Markierung von Antikörpern mit FITC/TRITC Konjugation:

1. 1 g des gereinigten Proteins mit 0,25 M Karbonat/Bikarbonat-Puffer, pH 9,0, auf eine Konzentration von 20 mg/ml dialysieren.
2. FITC/TRITC bis auf ein Proteinverhältnis von 1:20 zugeben (d.h. 0,05 mg pro 1 mg Protein).
3. Vermischen und bei 4ºC 16-18 Stunden lang inkubieren.
4. Das konjugierte von unkonjugierten Protein abtrennen, und zwar durch:
a. Sephadex-G-25-Chromatographie im Falle von FITC-Markierung, oder
b. DEAE-Sephacel-Chromatographie im Falle von TRITC/FITC-Markierung.

Puffersystem:

PBS für (a).
0,005 M Phosphat, pH 8,0 und 0,18 M Phosphat, pH 8,0 für (b).
Berechnung des Kopplungsverhältnisses von FITC:Protein:
2,87 x O.D.495 nm/O.D.280 nm - 0,35 x O.D.495 nm

Claims

1. Verfahren zur Bestimmung der umgebenden Konzentrationen mehrerer Analyten in einer flüssigen Probe mit einem Volumen von V Litern, das darin besteht, daß man

ein Trägermittel mit mehreren unterschiedlichen Bindemitteln, von denen jedes zur reversiblen Bindung eines gegebenenfalls in der flüssigen Probe vorhandenen Analyten fähig und für jenen Analyten im Vergleich mit den anderen Komponenten der flussigen Probe spezifisch ist, an mehreren voneinander beabstandeten Stellen derart belädt, daß jede Stelle nicht mehr als 0,1 V/K Mol eines einzelnen Bindemittels aufweist, wobei K Liter/Mol die Gleichgewichtskonstante des Bindemittels bezüglich des Analyten darstellt;

das beladene Trägermittel mit der zu analysierenden flüssigen Probe derart in Berührung bringt, daß jede der voneinander beabstandeten Stellen im gleichen Arbeitsgang mit der flüssigen Probe in Berührung gebracht wird, wobei die Menge der in der Probe eingesetzten Flüssigkeit derart ist, daß lediglich ein unwesentlicher Anteil an eventuell in der flüssigen Probe vorhandenem Analyten an das dafür spezifische Bindemittel gebunden wird, sowie

eine die Teilbesetzung der Bindemittel durch die Analyten an den voneinander beabstandeten Stellen darstellende Größe mittels einer kompetitiven oder nichtkompetitiven Testmethode unter Verwendung eines für jedes Bindemittel regiospezifischen Reagens mißt, das dazu in der Lage ist, entweder die unbesetzten Bindestellen oder die besetzten Bindestellen an dem Bindemittel zu erkennen, wobei jenes regiospezifische Reagens mit einem Marker markiert ist, wodurch sich die Menge jenes Reagens an der entsprechenden Stelle messen läßt.

2. Verfahren nach Anspruch 1, worin jede der voneinander beabstandeten Stellen weniger als 0,01 V/K Mol eines einzelnen Bindemittels aufweist.

3. Verfahren nach Anspruch 1, worin Bindemittel mit Gleichgewichtskonstanten bezüglich der Analyten von 10&sup8; bis 10¹³ Liter pro Mol eingesetzt werden.

4. Verfahren nach Anspruch 1, worin Bindemittel mit Gleichgewichtskonstanten bezüglich der Analyten in der Größenordnung von 10¹&sup0; oder 10¹¹ Liter pro Mol eingesetzt werden.

5. Verfahren nach Anspruch 1, worin das Volumen der flüssigen Probe nicht mehr als 0,1 Liter beträgt.

6. Verfahren nach Anspruch 1, worin das Volumen der flüssigen Probe 400 bis 1000 Mikroliter beträgt.

7. Verfahren nach Anspruch 1, worin als Bindemittel, mit denen das Trägermittel beladen wird, Antikörper für die Analyten, deren Konzentrationen bestimmt werden sollen, zur Anwendung kommen.

8. Verfahren nach Anspruch 1, worin die Bindemittel mit Markern markiert werden, wodurch sich die Konzentrationswerte des Bindemittels messen lassen.

9. Verfahren nach Anspruch 8, worin die Bindemittel und die regiospezifischen Reagenzien mit Fluoreszenzmarkern markiert werden, so daß an den einzelnen voneinander beabstandeten Stellen mittels der Testmethode zur Messung der Teilbesetzung der Bindemittel die von den Fluoreszenzmarkern emittierten Signalverhältnisse gemessen werden.

10. Vorrichtung zur Verwendung bei der Bestimmung der umgebenden Konzentrationen mehrerer Analyten in einer flüssigen Probe mit einem Volumen von V Litern, bestehend aus einem festen Tragermittel mit mehreren unterschiedlichen Bindemitteln an mehreren voneinander beabstandeten Stellen darauf, von denen jedes zur reversiblen Bindung eines gegebenenfalls in der flüssigen Probe vorhandenen Analyten fähig und für jenen Analyten im Vergleich mit den anderen Komponenten der flüssigen Probe spezifisch ist, wobei jede Stelle nicht mehr als 0,1 V/K Mol eines einzelnen Bindemittels aufweist, wobei K Liter/ Mol die Gleichgewichtskonstante jenes Bindemittels zur Reaktion mit dem dafür spezifischen Analyten darstellt.

11. Besteck zur Verwendung bei der Bestimmung der umgebenden Konzentration mehrerer Analyten in einer flüssigen Probe mit einem Volumen von V Litern, bestehend aus

einem festen Trägermittel mit mehreren unterschiedlichen Bindemitteln an mehreren voneinander beabstandeten Stellen darauf, von denen jedes zur reversiblen Bindung eines gegebenenfalls in der flüssigen Probe vorhandenen Analyten fähig und für jenen Analyten im Vergleich mit den anderen Komponenten der flüssigen Probe spezifisch ist, wobei jede Stelle nicht mehr als 0,1 V/K Mol, vorzugsweise weniger als 0,01 V/K Mol, eines einzelnen Bindemittels aufweist, wobei K Liter/ Mol die Gleichgewichtskonstante jenes Bindemittels zur Reaktion mit dem dafür spezifischen Analyten darstellt,

mehreren Standardproben mit bekannten Konzentrationen der Analyten, deren Konzentrationen in der flüssigen Probe bestimmt werden sollen, sowie

einem Satz markierter regiospezifischer Reagenzien zur Reaktion mit besetzten oder unbesetzten Bindestellen an den Bindemitteln.