DE3855762T2

DE3855762T2 - Direkte Methode zum Nachweis von sehr niedrigerem Grad der Coliform-Kontamination

Info

Publication number: DE3855762T2
Application number: DE3855762T
Authority: DE
Inventors: James D Berg
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1987-11-05
Filing date: 1988-11-03
Publication date: 1997-05-07
Anticipated expiration: 2008-11-04
Also published as: US5292644A; ATE117378T1; DE3852825T2; WO1989004372A1; DE3852825D1; ATE147790T1; EP0386051A1; EP0574977B1; DE3855762D1; EP0574977A1; AU2602488A; EP0386051B1

Description

Diese Erfindung bezieht sich auf Verfahren zum Nachweis von coliformen Bakterien, und spezifischer hat sie mit Verfahren für einen solchen Nachweis in Produkten für den menschlichen Verzehr zu tun, die in einer ausreichend schnellen Zeit arbeiten, um eine Behandlung des Produkts vor einem solchen Verzehr, falls notwendig, zu ermöglichen.
Es wurde seit langem erkannt, daß die Qualität von Produkten für den menschlichen Verzehr signifikant beeinflußt werden kann durch die Anwesenheit von pathogenen Mikroorganismen. Solche Produkte schließen Trinkwasser, Badewasser, Nahrung, Ausrüstung zur Herstellung von Nahrung ein und im allgemeinen jeden Vektor, den die Mikroorganismen benutzen können, um in den menschlichen Körper einzudringen. Wenn in ausreichender Anzahl vor handen, können solche Mikroorganismen Produktverderb oder Ausschuß, Krankheiten und signifikanten wirtschaftlichen Verlust verursachen. Jedoch erfordern konventionelle Verfahren zum Nachweis solcher Mikroorganismen in solchen Produkten im allgemeinen 24 bis 72 Stunden bis zum Abschluß. Diese vergangene Zeit ist im allgemeinen zu lang, um Informationen über die Verminderung in der Produktqualität rechtzeitig bereitzustellen, um Abhilfemaßnahmen zu ergreifen.
Gesamtcoliforme (TC) Bakterien sind die, die normalerweise im Dickdarm oder den Eingeweiden von Menschen oder Tieren vorhanden sind. Fäkalcoliforme (FC) Bakterien sind die TC-Bakterien, die im allgemeinen in den Fäkalien von Menschen oder Tieren vorhanden sind.
Die zwei vorhergenannten Gruppen (TC und FC) sind Indikatoren für den Hygienestandard. Ein Verfahren zu ihrem Nachweis wird im allgemeinen als "schnell" betrachtet, wenn es weniger als 24 Stunden zur Durchführung in Anspruch nimmt.
Eine jüngere Entwicklung in den Schnellverfahren zur Benutzung in Wasseranalysen wurde in Part 919, Seiten 1031-1033, "Standard Methods for the Examination of Water and Wastewater" (APHA, 1985) gezeigt. Diese sind im allgemeinen nicht schnell genug, um eine in hygienischer Hinsicht signifikante Konzentration von Mikroorganismen innerhalb einer gewöhnlichen Arbeitszeit von 8 Stunden nachzuweisen.
Der Stand der Technik enthält Verfahren zum Nachweis von Mikroorganismen und zur Quantifizierung ihrer Konzentration durch Nachweis und Quantifizierung der Enzyme, die die Mikroorganismen bei ihrem Stoffwechsel abgeben. Das Enzym wiederum wird durch seine Fähigkeit nachgewiesen und quantifiziert, bestimmte Chemikalien, bekannt als fluoreszenzerzeugende Substrate, in Produkte abzubauen. Wenigstens eines dieser Produkte, der fluoreszierende Teil, fluoresziert; das bedeutet, daß er Licht von einer Wellenlänge aussendet, wenn er mit Licht einer unterschiedlichen Wellenlänge bestrahlt wurde. Das fluoreszenzerzeugende Substrat jedoch fluoresziert nicht. Die Anwesenheit von Fluoreszenz zeigt daher die Anwesenheit von Bakterien an. Siehe z.B. Findl et al, US-Patent 4 242 447.
Ein Beispiel der vorher genannten fluoreszenzerzeugenden Substanzen sind 4-Methylumbelliferon (4-MU) Verbindungen. Das 4-Methylumbelliferon Produkt fluoresziert auf eine Anregung mit einem Licht mit einer Wellenlänge von ungefähr 365 nm, um ein Licht mit einer Wellenlänge von ungefähr 465 nm zu emittieren. MU-Derivate wurden im Stand der Technik benutzt. Snyder et al., Appl. Environ. Microbiol., 51 (5): 969-977 (1986); Feng et al, App. Environ. Microbiol., 43 (6): 1320-1329 (1982); und Koumura et al., US-Patent Nr. 4 591 554.
Das Koumura et al. Patent offenbart eine Methode zum Nachweis von Mikroorganismen in einer Probe mit Hilfe einer Fluoreszenzanalyse von Umbelliferon Derivaten. Bei dieser Methode wurden Mikroorganismen mit einer Lösung, die Lactose und ein nichtfluoreszierendes Umbelliferon Derivat enthielt, inkubiert, bis ein fluoreszierendes Umbelliferon Derivat freigesetzt wurde, das seinerseits gemessen wurde und auf die Anzahl von Mikroorganismen in Lösung bezogen wurde. Die offenbarte mikrobiologische Untersuchung konnte innerhalb einer bis zwölf Stunden ausgeführt werden (Zeile 44, Spalte 2), wenn die Lösung 10&sup4; Mikroorganismen pro ml (Zeilen 44-49 und 62-64, Spalte 3) enthält. Die Zellen können zerstört werden, um den fluoreszierenden Anteil freizu setzen. Für Lösungen, die weniger als 10&sup4; Organismen pro ml enthalten, schlägt die Veröffentlichung vor, die Lösung mit einem Nährmedium eine bis zwölf Stunden lang zu kultivieren, um die Organismenkonzentration über 10&sup4; Zellen pro ml zu steigern. Zusätzlich kann die Lösung auf 10&sup4; Zellen pro ml im Minimum durch eine Konzentrierung der Lösung gesteigert werden.
Die Veröffentlichung von Koumura et al zitiert einen weiten Bereich an Temperaturen (10º bis 60ºC) und Zeiten (10 Minuten bis 6 Stunden), während denen die Mischung inkubiert wird. Jedoch war in keinem der Beispiele, die in der Veröffentlichung von Koumura et al. zitiert wurden, die Umbelliferon-Inkubationszeit geringer als eine Stunde. In einem Beispiel (Beispiel 5), repräsentativ für diejenigen, bei denen coliforme Bakterien involviert waren, enthielt nacheiner Inkubationsstunde mit einem Umbelliferon Derivat die einzige Probe, die nachweisbare Mengen von 4-MU produzierte, 4 x 10&sup4; Zellen/10ml, d.h. 4 x 10³ Zellen/ml (Tabelle 6; eine Stunde Kultivierungsdauer).
Die Veröffentlichung von Koumura et al. zählt auf intrazellulare Enzyme, aber lehrt, daß die Sensitivität der Methode mehrmals durch Zerstörung (Lysierung) der mikrobialen Zellen vor der Aussetzung an Umbelliferon gesteigert werden kann (Zeilen 65-68, Spalte 3; Zeilen 1-5, Spalte 4). Die Veröffentlichung von Koumura et al offenbart auch eine Methode, in der die Zellzahl als ein inhärenter Aspekt der Methode gezüchtet wurde, z.B. eine Steigerung um das Vierfache nach einer Stunde Inkubation (Tabelle 6).
Die Veröffentlichung von Koumura et al. offenbart nicht eine Methode, in der coliforme Bakterien fluorometrisch quantitativ in Suspensionen nachgewiesen werden können, die weniger als ungefähr 10&sup4; Zellen/ml haben (Spalte 3, Zeilen 62-64 und Spalte 4, Zeilen 10-12). Die Veröffentlichung von Koumura et al. offenbart nicht eine Methode, die in weniger als eine Stunde effektiv ist.
Dorn offenbart in US-Patent 3 928 139 eine Methode zum schnellen quantitativen Nachweis von pathogenen Mikroben in einer flüssigen Probe durch Konzentrierung der Pathogenen in der Flüssigkeit in einem flüssigen Filtrierungsmedium mit Zentrifugation. Das flüssige Futermedium, in das die Pathogene übergehen, kann zu einem Nährmedium zur Kultivierung zugefügt werden.
"Fluoreszenz" kann durch die Messung der Menge an Fluoreszenz nach einer vorgegebenen Inkubationszeit gemessen werden oder durch Messung der Inkubationszeit, die benötigt wird, um eine gegebene Menge an Fluoreszenz zu erhalten. Verfahren, die dies tun, geben den Mikroorganismen im allgemeinen genug Zeit, sich exponentiell über mehrere Generationen zu vermehren. Daher gibt es eine exponentiell größere Menge an verfügbarer Fluoreszenz, die am Ende der Inkubationsdauer gemessen wird, ob diese Dauer fixiert oder variabel ist.
"Fluoreszenz" kann auch durch häufige Bestimmung der Menge an Fluoreszenz während des ersten Teils der Inkubationsdauer gemessen werden und daraus die Fluoreszenzgeschwindigkeit errechnet werden; d.h. die Zeitrate der Änderung in der Menge an Fluoreszenz. Verfahren, die dies tun, geben den Mikroorganismen im allgemeinen nicht genug Zeit, sich exponentiell über mehrere Generationen zu vermehren. Demgegenüber bauen solche Verfahren auf die Tendenz der Mikroorganismen, die ursprünglich vorhanden waren, die gleiche Menge an Enzym während jeder Probendauer zu produzieren, um damit einen linearen Anstieg der Menge an Fluoreszenz hervorzurufen, siehe oben, Snyder et al.
Solche Schnellverfahren haben viele Vorteile. Erstens sind sie durch die Definition schneller als diejenigen, die mehrere Generationen abwarten. Zweitens ist ihre Genauigkeit aus zwei Gründen gut. Einmal messen sie die laufende Aktivität der ursprünglich vorhandenen Mikroorganismen, statt Abzüge von den Messungen der Aktivität der Mikroorganismen mehrerer Generationen später machen zu müssen. Zweitens erzeugen sie mehrfache Datenpunkte, eine Situation, die sich gut für die lineare Regressionsanalyse eignet, besser als einen einzigen Meßwert, der durch die langsameren Verfahren produziert wurde, zu erzeugen. Drittens ist die Linearität der Datenpunkte (oder ihr Fehlen) ein Indikator für die Genauigkeit der Messung.
Solche Schnellverfahren haben auch einen Nachteil. Die Mikroorganismen müssen genug konzentriert sein, um eine meßbare Menge an Fluoreszenzgeschwindigkeit in weniger als einer Generation zu erzeugen. Wenn eine weitere Konzentration nicht durchführbar ist, müssen Mittel gefunden werden, die die Per-Organismus Fluoreszenzgeschwindigkeit erhöhen.
Es ist daher die Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren bereitzustellen, das die Per-Organismus Fluoreszenzgeschwindigkeit einer enzymatischen Messung einer verdünnten Probe von coliformen Mikroorganismen in einem Produkt für den menschlichen Verzehr steigert.
Es ist auch die Aufgabe der vorliegenden Erfindung, diese Geschwindigkeit zu steigern, indem 4-Methylumbelliferon als das fluoreszierende Produkt benutzt wird.
Die Erfindung umfaßt ein Verfahren zum Nachweis lebender coliformer Bakterien in einer Flüssigkeit oder einer verflüssigten Probe eines für den menschlichen Verzehr bestimmten Produkts mit einer bakteriellen Konzen tration bis herab zu einem Bakterium pro 100 Milliliter und in einer Zeit von mindestens 6 Stunden, wobei das Verfahren umfaßt: Konzentrierung der Mikroorganismen auf einem Filter, Inkontaktbringen der Mikroorganismen mit einem Startmedium, Inkubieren und Bestrahlen der Mischung, gekennzeichnet durch
(a) Konzentrieren der Bakterien auf einem Filter, dessen Poren genügend klein sind, um die Bakterien zurückzuhalten;
(b) Legen des Filtersund der darauffestgehaltenen Bakterien gegen ein Kulturmedium in einem Behälter, wobei das Kulturmedium umfaßt:
(1) einen Nährstoff zur Unterstützung des Metabolismus und der Reproduktion der Bakterien;
(2) ein Produktionsagens für das Induzieren der Produktion eines Enzyms in den Bakterien, wenn die Bakterien metabolisieren;
(3) ein fluoreszenzerzeugendes Substrat zur Reaktion mit dem Enzym, um aus dem fluoreszenzerzeugenden Substrat 4-Methylumbelliferon freizusetzen, und
(4) Natriumlaurylsulfat, das zur Steigerung der Fluoreszenz wirksam ist;
(c) Inkubieren des Kulturmediums, des Filters und der Bakterien unter Bedingungen, die während der Inkubationsperiode ermöglichen:
(1) Metabolismus und Reproduktion der Bakterien,
(2) Produktion des Enzyms,
(3) Reaktion des Enzyms mit dem fluoreszenzerzeugenden Substrat und
(4) Freigabe von genügend 4-Methylumbelliferon aus dem fluoreszenzerzeugenden Substrat von jedem einzelnen Bakterium und seinen Abkömmlingen, um unter Fluoreszenzbedingungen eine sichtbare Mikrokolonie zu formen;
(d) Bestrahlung der Mikrokolonien mit Licht einer Wellenlänge, die ausreichend nahe derjenigen einer für den fluoreszierenden Teil charakteristischen Wellenlänge ist und genügend intensiv, um die Mikrokolonien zum Fluoreszieren zu veranlassen; und
(e) Zählen der Anzahl der fluoreszierenden Mikrokolonien.
In einer bevorzugten Ausführungsform enthält das Produktionsagenz Lactose, das Permeabilitätsagenz Natriumlaurylsulfat, und der fluoreszierende Teil 4-Methylumbelliferon wird veranlaßt, mit emittiertem Licht einer Wellenlänge von ungefähr 465 nm zu fluoreszieren, indem es mit Licht einer Wellenlänge von ungefähr 365 nm angeregt wurde.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird eine alkalische Lösung zu den Mikrokolonien am Ende der Inkubationszeit hinzugefügt, wodurch die Fluoreszenz gesteigert und das Zählen erleichtert wird; und die Substanz, gegen die der Filter und die Mikroorganismen gelegt wird, enthält Agar. Der Rest dieser bevorzugten Ausgestaltung dieser zweiten Ausgestaltung ist der gleiche wie der Rest der bevorzugten Ausgestaltung der ersten Ausgestaltung und weist die gleichen Mikroorganismen nach.

KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN

Die obere und andere wichtige Erscheinungsformen der vorliegenden Erfindung werden besser verstanden werden aus der folgenden detaillierten Beschreibung, die in bezug zu den folgenden Zeichnungen gemacht wurde, in denen
Fig. 1 eine graphische Darstellung ist, die die Fluoreszenzproduktion durch coliforme Bakterien in Trinkwasser zeigt, das mit rohem Abwasser (ausgefüllte Kreise) kontaminiert wurde, mit der Zugabe von Lactose (offene Kreise) und mit der Zugabe von Natriumlaurylsulfat (Dreiecke);
Fig. 2 eine graphische Darstellung ist, die die Fluoreszenzgeschwindigkeit mit der Gesamtcoliformkonzentration korreliert, mit Fehlerbarren, die den Bereich anzeigen, in dem Wiederholungsproben (offene Kreise) von einer originalen Probe inkubiert wurden;
Fig. 3 eine graphische Darstellung ist ähnlich zu Fig. 2, ausgenommen, daß sie die Fluoreszenzgeschwindigkeit eher mit der Fäkalcoliformkonzentration korreliert als mit der Gesamtcoliformkonzentration;
Fig. 4 ist eine Fotografie eines Agars der zweiten Ausgestaltung, der einzelne fluoreszierende Mikrokolonien zeigt;
Fig. 5 ist eine grafische Darstellung, die Messungen, die von dem Agar-Verfahren mit vergleichbaren Messungen korreliert, die mit dem konventionellen M 7h FC Verfahren erhalten wurden.
Die vorliegende Erfindung macht Gebrauch von der Enzymaktivität in der coliformen Gruppe von Bakterien, um ihre Anwesenheit nachzuweisen und sie zu quantifizieren. Enzyme, einzigartig für eine Gruppe Mikroorganismen, können weiterhin benutzt werden, die Gruppe zum Ausschluß von anderen, die in der Probe anwesend sind, zu identifizieren.
Speziell benutzt die vorliegende Erfindung die Enzymaktivität, wie sie durch den Nachweis von MU-abgeleiteten Enzymprodukten bestimmt ist, um die coliforme Gruppe der Bakterien nachzuweisen und zu quantifizieren.
Wie oben erwähnt, enthält die coliforme Gruppe die Gesamtcoliformen (TC) und die Fäkalcoliformen (FC). Diese werden als Indikatoren für die Hygienequalität von Nahrung, Wasser und Verfahrenseinrichtung betrachtet; d.h. ihre Anwesenheit gilt im allgemeinen als Anzeichen für eine Kontamination durch fäkales Material. Die Coliformgruppe besitzt das Enzym β-D-Galactosidase. Die vorliegende Erfindung weist dieses Enzym durch die Verwendung von 4-MU-β-D-Galactosid in der Anwesenheit von bekannten selektiven Ingredienzen nach, um die Aktivität und die Anwesenheit von anderen β-D-galactosidasepositiven Nichtcoliformen auszuschließen. TC und FC werden auf der Temperaturbasis differenziert: TC werden bei 35ºC und FC bei 41,5ºC nachgewiesen.
Das allgemeine Vorgehen für den Nachweis von TC- oder FC-Aktivität in der vorliegenden Erfindung ist wie folgt:
(a) die Probe wird durch Durchlassen durch einen Membranfilter (0.2 µm bis 0,80 µm Porengröße) konzentriert;
(b) die Mikroorganismen, die mit dem Filter zurückgehalten wurden, werden aseptisch mit einem sterilen Medium, das das geeignete 4-MU-Substrat enthält, in Kontakt gebracht; und
(c) die resultierende Fluoreszenz wird gemessen und ausgewertet als die Produktionsrate des fluoreszierenden Produkts in dem flüssigen Medium in Verbindung mit der Probe, die in regelmäßigen Intervallen über ungefähr 15 Minuten bestimmt wurde unter Verwendung eines Fluoreszenz-Nachweisgeräts.
TC wird in der oben beschriebenen Weise durch die Inkubation der Probe plus 4-MU-β-D-Galactosid bei 35ºC nachgewiesen, während FC durch die gleiche Inkubation bei 41,5º nachgewiesen wird.
Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele verdeutlicht.

BEISPIEL I

Die gesamtcoliformen (TC) Bakterien werden in der folgenden Weise analysiert. Natürliche Populationen von Coliformen werden aus einem Fluß (Nidelven, Trondheim, Norwegen) erhalten, der Abwasser enthält und aus frischem rohen Haushaltsabwasser. Proben werden täglich für Versuche entnommen und mit Leitungswasser verdünnt, in dem die Konzentrationen variiert werden, um Trinkwasser mit Fäkalcoliformer (FC) und nicht spezifischer heterotrophe Plate Count (HPC) Bakterienkontamination herzustellen. Die Konzentration der Coliformen reichte von 1/100 ml bis 10000/100 ml, wie in Fig. 2 dargestellt.
500 ml einer Wasserprobe werden durch einen Membranfilter mit 0,45 µm Porengröße, 47 mm Durchmesser (Millipore) gefiltert und aseptisch in einen 250-ml-Glaskolben gelegt, der 18 ml eines sterilen gepufferten Startmedium enthält. (Die 500 ml Probengröße wurde als maximales Volumen des Oberflächenwassers einer Trübung < 5 NTU gewählt, das in einer kurzen Zeitspanne gefiltert werden kann). Das Medium bestand aus phosphatgepuffertem Salz (PBS; pH 7,3), 0,02% Natriumlaurylsulfat (Sigma Chemical Co., St. Louis, Missouri), 0,56% Nährbrühe (Difco Laboratories, Detroit, Michigan) und 0,35% Lactose. Eines der fluoreszenzerzeugenden Substrate wurde zu jedem Glaskolben und zu einem sterilen Kontroll- Glaskolben, der ein steriles Medium enthielt, gegeben, dann in ein Schüttelwasserbad gestellt. 4-Methylumbelliferon-β-D-Galactosid (4-MU-β-D-Galactosid) wurde in einer Konzentration gleichwertig zu 0,05 mg/ml zugefügt.
Die Proben wurden bei 35ºC zum Nachweis der TC-Aktivität inkubiert, und bei 41,5ºC zum Nachweis von FC-Aktivität. Die Glaskolben wurden aus dem Bad entfernt und in ein Fluorimeter (Turner Model 111) alle 5 Minuten für 30 Minuten gestellt, um die ursprüngliche Fluoreszenzgeschwindigkeit zu messen. Die Anregung und Emissionswellenlängen für Methylumbelliferon sind ungefähr 365 und 465 nm bei Verwendung von Lichtfiltern 7-60 bzw. 2A+47B. Die Fluoreszenzgeschwindigkeit wurde durch die lineare Regression der kleinsten Quadrate bestimmt.
Die Schnell-Fluoreszenzverfahren wurden mit den konven tionellen Zähltechniken, die unten beschrieben sind, verglichen. Heterotrophe Plate Count (HPC) Bakterien werden auf SPC (Difco) oder R2A Agar gewonnen und nach drei Tagen Inkubation bei 20ºC gezählt. Gesamtcoliforme (TC) Bakterien werden mit der Membranfiltrationstechnik unter Verwendung von m-ENDO Agar (Difco) analysiert und 24 Stunden bei 35ºC inkubiert. Die Sieben-Stunden- und Standard-Vierundzwanzig-Stunden-Membranfiltrationsverfahren (APHA, 1985) wurden verwendet, um fäkale Coliforme (FC) bei 41,5º zu gewinnen bzw. TC bei 35ºC. Peptone (0,1%) wurde für alle Serienverdünnungen verwendet. Alle Analysen wurde gemäß den Standard Methods (APHA, 1985) durchgeführt.
Die Produktion von Methylumbelliferon aus 4-MU-β-D-Galactosid durch coliforme Bakterien im Trinkwasser, das mit Rohabwasser (gefüllte Kreise) kontaminiert war, ist in Fig. 1 gezeigt. Die Zugabe von Lactose steigerte die Induktion von β-D-Galactosidase (offene Kreise). Die Zugabe von Natriumlaurylsulfat, einem gebräuchlichen selektiven Ingredienz für Coliforme, erhöhte weiter die Aktivität (Dreiecke). Die Enzymversuchstemperatur war 35ºC.
Die Zugabe von Lactose und Natriumlaurylsulfat zu dem Medium verstärkte die Galactosidaseaktivität. Die Spezifität von MU-Galactosid für Mitglieder der Coliformgruppe wurde durch eine Vorbehandlung der Wasserproben mit gebräuchlichen Inhibitoren, die in coliformen Medien angewandt wurden (Standard Methods), (1985) getestet. Die meiste Aktivität wurde nach der Vorbehandlung erhalten, was nahelegt, daß die Galactosidaseaktivität der coliformen Gruppe zuzuschreiben war, wie durch die Analysenbedingungen definiert. Der Ersatz von Natriumlaurylsulfat durch selektive Agenzien, die im mT7h-Medium verwendet wurden, Polyethlenäther WU-1 und Tergitol 7 steigerten die Aktivität nicht (Daten sind nicht gezeigt). Die Linearität der Rate der Produktformation war im allgemeinen hoch, r = 0.99 für die meisten Analysen. Daher wurde die Dauer der Analyse in den verbleibenden Experimenten von 120 Minuten auf 30 Minuten gesenkt, obwohl 15 Minuten ausreichend waren.
Fig. 2 zeigt die Korrelation zwischen der anfänglichen Hydrolyserate von 4-MU-β-Galactosid, wie sie durch die ursprüngliche Fluoreszenzgeschwindigkeit gemessen wurde, und die Konzentration der gesamtcoliformen Bakterien, gewonnen aus Rohabwasser und gemischt mit Trinkwasser. Die Enzymanalysentemperatur war 35ºC. Fehlerbarren verbunden mit offenen Kreisen zeigen den Bereich der Fluoreszenzgeschwindigkeit, der erhalten wurde, wenn Wiederholungsproben (5 < n < 8) von einer Originaiprobe inkubiert wurde.

BEISPIEL 2

Fäkale coliforme (FC) Bakterien wurden in der gleichen Weise wie im Beispiel 1 bestimmt, ausgenommen, daß eine Inkubationstemperatur gleich 41,5ºC verwendet wurde.
Die Resultate sind in Fig. 3 gezeigt. Die anfängliche Hydrolysenrate von 4-MU-β-D-Galactosid durch fäkale coliforme Bakterien, die aus Rohabwasser erhalten und mit Trinkwasser gemischt wurden, wie gemessen durch die ursprüngliche Fluoreszenzgeschwindigkeit, wird verglichen mit der Fäkalcoliformen Bakterienkonzentration. Die Enzymanalysentemperatur war 41,5º C. Fehlerbarren in Verbindung mit offenen Kreisen haben die gleiche Bedeutung wie in Fig. 2.

BEISPIEL 3

Dieses Beispiel zeigt die direkte Zählung von FC. Konzentrationen von FC < 100/100 ml wurden durch die Direktzählung analysiert. Wasserproben wurden gefiltert und auf eine feste oder zumindest halbfeste Substanz aufgelegt, nämlich M 7h FC Agar (Standard Methods, 1985) ohne die pH-Indikatoren und d-Mannitol, aber die 4-MU-β-D-Galactosid enthält. Fluoreszierende Galactosi dase positive Mikrokolonien waren nach sechs Stunden Inkubation bei 41,5ºC mit einer 366 nm langwellenultravioletten Lichtquelle (UVL-56, Ultraviolet Products, San Gabriel, Kalifornien) sichtbar. Die Zugabe von 0,2 ml einer alkalischen Lösung, nämlich 0,1 N NaOH, nach der Inkubationsperiode, steigerte die Fluoreszenz und erleichterte das Zählen.
Fig. 4 zeigt ein Beispiel der Erscheinungsform der Mikrokolonien nach sechs Stunden Inkubation. Fig. 5 vergleicht die Konzentrationen, wie sie mit Hilfe des Agardirektzählverfahrens gemessen wurden, mit Konzentrationen, wie sie mit Hilfe des konventionellen M 7h FC Verfahren gemessen wurden. Pluszeichen zeigen mit rohem Abwasser kontaminiertes Trinkwasser, das bei 15ºC aufbewahrt wurde und von dem nach 24 bis 72 Stunden Proben für die Coliformen genommen wurden, und gefüllte Kreise zeigen, die Flußwasserproben. Die strichlierte Linie zeigt die ideale Korrelation, und ist nicht an die Daten angepaßt. Das durchschnittliche Verhältnis von MU 6h MF zu M 7h FC war 1,21 zu 1 für die 34 Proben.
Zweiundsechzig fluoreszierende Kolonien, die zufällig ausgewählt wurden von drei Experimenten, zeigten 100 % Übereinstimmung wie FC durch Gasproduktion in Lauryltryptosebrühe, die bei 35ºC für 24 Stunden inkubiert wurde und in EC-Brühe, die bei 44ºC für 24 Stunden inkubiert wurde. In allen Experimenten reichte die HPC- Konzentrationen von 300/ml bis zu 50.000/ml.

Claims

1. Verfahren zum Nachweis lebender coliformer Bakterien in einer Flüssigkeit oder einer verflüssigten Probe eines für den menschlichen Verzehr bestimmten Produkts mit einer bakteriellen Konzentration bis herab zu einem Bakterium pro 100 Milliliter und in einer Zeit von mindestens 6 Stunden, wobei das Verfahren umfaßt: Konzentrierung der Mikroorganismen auf einem Filter, Inkontaktbringen der Mikroorganismen mit einem Startmedium, Inkubieren und Bestrahlen der Mischung, gekennzeichnet durch

(a) Konzentrieren der Bakterien auf einem Filter, dessen Poren genügend klein sind, um die Bakterien zurückzuhalten;

(b) Legen des Filters und der darauffestgehaltenen Bakterien gegen ein Kulturmedium in einem Behälter, wobei das Kulturmedium umfaßt:

(1) einen Nährstoff zur Unterstützung des Metabolismus und der Reproduktion der Bakterien,

(2) ein Produktionsagens für das Induzieren der Produktion eines Enzyms in den Bakterien, wenn die Bakterien metabolisieren,

(3) ein fluoreszenzerzeugendes Substrat zur Reaktion mit dem Enzym, um aus dem fluoreszenzerzeugenden Substrat 4-Methylumbelliferon freizusetzen, und

(4) Natriumlaurylsulfat, das zur Steigerung der Fluoreszenz wirksam ist;

(c) Inkubieren des Kulturmediums, des Filters und der Bakterien unter Bedingungen, die während der Inkubationsperiode ermöglichen:

(1) Metabolismus und Reproduktion der Bakterien,

(2) Produktion des Enzyms,

(3) Reaktion des Enzyms mit dem fluoreszenzerzeugenden Substrat und

(4) Freigabe von genügend 4-Methylumbelliferon aus dem fluoreszenzerzeugenden Substrat von jedem einzelnen Bakterium und seinen Abkömmlingen, um unter Fluoreszenzbedingungen eine sichtbare Mikrokolonie zu formen;

(d) Bestrahlung der Mikrokolonien mit Licht einer Wellenlänge, die ausreichend nahe derjenigen einer für den fluoreszierenden Teil charakteristischen Wellenlänge ist und genügend intensiv, um die Mikrokolonien zum Fiuoreszieren zu veranlassen; und

(e) Zählen der Anzahl der fluoreszierenden Mikrokolonien.

2. Verfahren nach Anspruch 1, bei dem das Kulturmedium einen Nährstoff zur Unterstützung des Metabolismus und der Reproduktion der Bakterien auf dem Filter aufweist.

3. Verfahren nach Anspruch 1 und/oder 2, bei dem der Inkubationsschritt des weiteren die Hinzufügung einer alkalischen Lösung zu den Mikrokolonien am Ende der Inkubationsperiode aufweist, wodurch die Fluoreszenz zur Erleichterung des Zählens weiter gesteigert wird.

4. Verfahren nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 3, bei dem beim Schritt des Legens des Filters und der Bakterien auf die Substanz das Produktionsagens Lactose ist, das Enzym B-D-Galactosidase ist, das fluoreszierende Substrat 4-Methylumbelliferon- B-D-Galactosid ist, das Kulturmedium, gegen das der Filter und die Bakterien gelegt sind, Agar ist und der fluoreszierende Teil zum Fluoreszieren mit emittiertem Licht einer Wellenlänge von etwa 465 nm veranlaßt wird, indem es mit Licht einer Wellenlänge von etwa 365 nm erregt wird.

5. Verfahren nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 4, wobei die Bakterien Gesamtcoliforme sind und die Inkubationstemperatur etwa 35ºC beträgt.

6. Verfahren nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 4, wobei die Bakterien Fäkalcoliforme sind und die Inkubationstemperatur etwa 41,5º C beträgt.

7. Verfahren nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 6, bei dem der Inkubationsschritt durch Verwendung eines Wasserbades ausgeführt wird.

8. Verfahren nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 7, bei dem während des Schritts des Konzentrieres der Bakterien auf einem Filter der Filter Porengrößen besitzt, deren Durchmesser in einem Bereich von 0,2 µm bis 0,80 µm liegen.