DE3786918T2

DE3786918T2 - Expression des klonierten lysostaphingens.

Info

Publication number: DE3786918T2
Application number: DE87903128T
Authority: DE
Inventors: Paul Recsei
Original assignee: Applied Microbiology Inc
Current assignee: Applied Microbiology Inc
Priority date: 1986-04-16
Filing date: 1987-04-15
Publication date: 1993-11-11
Anticipated expiration: 2007-04-16
Also published as: DK174941B1; DK659287D0; EP0299978A1; DE3786918D1; FI96322B; ATE92524T1; FI884691A0; DK659287A; AU7302187A; IL82260A0; IE60769B1; WO1987006264A1; US4931390A; JP2963695B2; NZ219998A; CA1297051C; EP0299978B1; IE870980L; IL82260A; FI884691A

Description

Die vorliegende Anmeldung ist eine Fortsetzung der US-Anmeldung Nr. 852,407. Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf neuartige Plasmide, die in transformierten, Mikroben betreffenden Wirten die Gene für Lysostaphin ausdrücken. Die Erfindung bezieht sich auch auf das so hergestellte Lysostaphin.
Lysostaphin ist ein Bakteriozin, das durch einen einzelnen bekannten Stamm von Staphylococcus simulans ausgeschieden wird, ursprünglich durch Schindler und Schuhardt isoliert und Staphylococcus staphylolyticus genannt. Die Produktion von Lysostaphin durch Staphylococcus staphylolyticus wurde zuvor im US-Patent Nr. 3,278,378, herausgegeben am 11.10.1966, und in Proceedings of the National Academy of Sciences, Band 51, S. 414-421 (1964) beschrieben. Der einzelne Organismus S. staphylolyticus (NRRL B-2628), der Lysostaphin produziert, wurde vor kurzem als ein Biovar von S. simulans durch Sloan et al., Int. J. System. Bacteriol., Band 32, S. 170-174 (1982), erkannt. Da der Name S. staphylolyticus sich nicht auf der anerkannten Liste von bakteriologischen Namen befindet, wurde der Organismus, der Lysostaphin produziert, in S. simulans umbenannt.
Bakteriozine sind von Bakterien produzierte Proteine, die verwandte Bakterien vernichten und manchmal lysieren. Zum Beispiel vernichtet und lysiert Lysostaphin praktisch alle Staphylokokkenspezies, ist aber inaktiv gegenüber Bakterien anderer Gattungen. Obwohl seine katalytischen Eigenschaften nicht genügend charakterisiert sind, wurde nachgewiesen, daß Lysostaphin eine Endopeptidase ist, die anscheinend die Polyglycin-Querverbindungen des Peptidoglycans, das in den Zellwänden der Staphylokokken gefunden wird, spaltet.
Die Lysostaphin-Produktion erscheint während der stationären Phase der S. simulans-Kulturen, wenn sie unter bestimmten Bedingungen wachsen, und scheint mit der Produktion von anderen extrazellulären Enzymen gekoppelt zu sein. Kulturen, die Lysostaphin produzieren, scheinen resistent gegen ihre Aktivitäten zu sein, während Kulturen, die unter nichtproduzierenden Bedingungen gewachsen sind, empfindlich sind.
Vorangegangene Studien haben gezeigt, daß Lysostaphin durch Fermentationstechniken produziert werden kann, wobei S. simulans in Flüssigkeitskulturen gezüchtet wird. Solche Fermentationstechniken werden im US-Patent Nr. 3,278,378, herausgegeben am 11. Oktober 1966, und in den Proceedings of the National Academy of Science, Band 51, S. 414-421 (1964) beschrieben. Verschiedene Verbesserungen in der Produktion von Lysostaphin mit Hilfe von Fermentationstechniken werden auch in den US-Patenten Nr. 3,398,056, herausgegeben am 20. August 1968, und Nr. 3,594,284, herausgegeben am 20. Juli 1971, dokumentiert. Die beiden letzteren offenbaren Verbesserungen beim Kulturmedium und für die Beimpfungstechniken, wodurch die Produktion von Lysostaphin durch Fermentation beschleunigt und verbessert werden kann. Produktion und Reinigung von Lysostaphin durch bekannte Techniken jedoch führen zu einem Produkt, das bis zu einem bestimmten Grad durch andere Staphylokokken-Produkte kontaminiert ist. Die Immunisierung von Tieren oder Menschen mit Lysostaphin, das durch nicht-lysostaphines, immunogenes Material von Staphylokokken kontaminiert ist, kann zu einer unerwünschten und potentiell gegenteiligen immunologischen Antwort führen.
Lysostaphin, isoliert aus Kulturfiltraten von S. simulans, wird durch ein Zink enthaltendes Protein charakterisiert, das aus einer einzelnen Polypeptidkette mit einem Molekulargewicht von ungefähr 25.000 Daltons besteht. Es ist hitzelabil, nicht dialysierbar und hat einen isoelektrischen Punkt von ungefähr pH 11. Weiterhin wird die Fähigkeit des Lysostaphins, Lebensfähige und hitzeabgetötete Staphylokokken und Staphylokokkenzellwände zu lysieren, durch Behandlung mit dem Enzym Trypsin zerstört.
Rekombinante DNA-Techniken, wodurch Gene für verschiedene Proteine durch Insertion in ein Plasmid, Kosmid oder Phagenvektor kloniert werden können, die dann benutzbar sind, um einen Mikroorganismus zu transformieren, werden weitreichend benutzt, um die Struktur und die Expression von Genen zu untersuchen und um eine fertige Quelle für verschiedene reine Proteine für verschiedene Zwecke zu produzieren. Es gab bisher jedoch keine Berichte, die sich auf solche Klonierungstechniken bezogen, die benutzt werden, um Lysostaphin codierende Gene in einen Klonierungsvektor einzufügen, um neue Vektoren zu konstruieren, die einen anderen Mikroorganismus als S. simulans (NRRL B-2628) transformieren können, um die Produktion von großen Mengen an Lysostaphin zu ermöglichen.
Gemäß vorliegender Erfindung werden rekombinante Plasmide beschrieben, die DNA enthalten, welche Lysostaphin von S. simulans (NRRL B-2628) codieren, und die in transformierten Mikrobenwirten ein Gen ausdrücken werden, das Lysostaphin codiert. Die rekombinanten Plasmide können durch Insertion in eine identifizierte DNA-Sequenz (nach der Formel 1), die für Lysostaphin in passende Klonierungsvektoren codiert, abgeleitet werden.
Passende Klonierungsvektoren beinhalten solche, die sich in Bakterien replizieren, dazu gehören inter alia, E. coli, Bacillus spp., und Streptomyces, und Hefe. Wirtsmikroorganismen beinhalten E. coli, Bacillus spp., Streptomyces und Hefe. Die Erfindung jedoch ist nicht auf die oben genannten Vektoren und Mikrobenwirte beschränkt. Es wird für Fachleute ersichtlich sein, daß andere Vektoren und Wirte bei Anwendung der Erfindung benutzt werden können.
In einer anderen Ausführung wurde die DNA-Sequenz, die für Lysostaphin codiert ist, in ein E. coli-Plasmid pUC8, einem wohlbekannten Klonierungsvektor, eingefügt, um das rekombinannte Plasmid pRG5 zu schaffen. E. coli JM105, das durch pRG5 transformiert worden ist, produziert Lysostaphin.
Bei einer anderen Ausführung dieser Erfindung wurde das Lysostaphin-Gen von pRG5 in die Bacillusplasmide pBC16, pBD64 und pSPV1 kloniert, wobei rekombinante Plasmide pJP1, pDF8 und pRP1 produziert wurden. Mitglieder der Bacillusspezies, 8. subtilis eingeschlossen, die durch einen oder anderen dieser drei rekombinaten Bacillusplasmide, die das Gen für Lysostaphin enthalten, transformiert wurden, gaben große Mengen von Lysostaphin in das Kulturmedium ab. Die Erfindung bereitet weiterhin den B. sphaericus-Stamm OO vor, der, wenn er durch das rekombinante Plasmid pJP1 transformiert worden ist, Lysostaphin produziert, dessen Menge ungefähr fünfmal größer ist als die der Kulturen von S. simulans, (NRRL 8-2628), dem natürlichen Produzenten.
Das Lysostaphin von S. simulans (NRRL 8-2628), ausgedrückt durch ein Ergebnis der Transformation von Mikrobenwirten durch die oben erwähnten Plasmide und andere Plasmide, die das Lysostaphingen enthalten, ist gänzlich frei von Nicht- Lysostaphin und immunogenen Staphylokokken-Verunreinigungen.
Die Erfindung umfaßt weiterhin ein 1,5-Kilobasen-Paar (kbp)- DNA-Teilstück, das Lysostaphin codiert, die Sequenz für solch ein Gen und ein 389-Aminosäuren-Protein, ein Präprolysostaphin, das ein Molekulargewicht von ungefähr 42.200 Daltons hat, welches durch das DNA-Teilstück codiert wird. Die terminale Aminosequenz des Präprolysostaphins enthält eine Häufung von vier positiv geladenen Aminosäureresten, gefolgt von einer ungeladenen, weitgehendst hydrophoben Sequenz, und hat daher die Eigenschaften eines Signalpeptids. Angrenzend an das Lysostaphin-Signalpeptid befindet sich die Prolysostaphin-Aminosäuresequenz. Die "Prosequenz enthält sieben Tandemwiederholungen einer homologen 13-Aminosäurensequenz, die während des Verfahrens zum reifen Enzym entfernt wird.
Das 1,5 kbp-DNA-Teilstück, das das Lysostaphinstruktur-Gen enthält, codiert daher für ein Präproenzymprotein (Präprolysostaphin), welches darauf zu einem reifen, aktiven Lysostaphin hergestellt wird, das ein Molekulargewicht von ungefähr 26.920 Daltons besitzt. Es war bisher unbekannt, daß Lysostaphin in einer Vorläuferform synthetisiert worden ist, die darauf zu einem aktiven Enzym hergestellt worden ist.
Die DNA-Sequenz der Formel I ist durch einen offenen Lesebereich gekennzeichnet, der sich von einem TTG-Initiations- Codon ab den Nukleotiden 245-247 bis zu einem TGA-Terminations-Codon ab den Nukleotiden 1412 bis 1414 erstreckt, der das 389-Aminosäuren-Präprolysostaphin codiert.
Zum Bereich der Erfindung gehören auch DNA-Teilstücke, die zu jedem 1,5 kbp-DNA-Teilstück homolog sind, welches für Lysostaphin in der Formel I codiert und welches für funktionell äquivalente Proteine codiert.
Die Erfindung ist auch für Präprolysostaphin, Prolysostaphin und Lysostaphin vorgesehen, von denen jedes substantiell frei von nicht-Lysostaphin-immunogenen Staphylokokkenverunreinigungen ist. Die Erfindung umfaßt weiterhin solche Teile des 1,5 kbp-DNA-Teilstücks, die für das Lysostaphinsignalpeptid, die Prolysostaphinsequenzen und das reife aktive Lysostaphin codieren. Die DNA-Teilstücke, die homolog zu diesen drei Teilen des 1,5 kbp-DNA-Teilstücks sind, das Lysostaphin codiert und welches funktionell äquivalente Peptide codiert, gehören ebenso zur Erfindung.
Die vorliegende Erfindung wird jetzt, Bezug nehmend auf die folgende detaillierte Beschreibung, auf die Beispiele und Zeichnungen, erläutert, wobei die
Figur 1 ein immunoblotted Elektropherogramm ist, das die Produktion von Lysostaphin und Prolysostaphin durch die transformierte E. coli/pRG5 und S. simulans darstellt.
Die vorliegende Erfindung sorgt für rekombinante Plasmide, die durch Insertion des 1,5-DNA-Teilstücks, das für Lysostaphin codiert ist, in Klonierungsvektoren geschaffen wurden, die sich in verschiedenen Wirtsorganismen kopieren. Besonders bevorzugte Wirtsorganismen sind E. coli und Stämme von Bacillus subtilis, Bacillus sphaericus und andere Bacillusspezien. Da offensichtlich der Wunsch nach einem Produkt besteht, das frei von immunogenen Staphylokokkenverunreinigungen ist, müssen die Wirtsmikroorganismen nicht unbedingt zum Stamm Staphylococcus gehören. Das 1,5 kbp-DNA-Teilstück wird stabil gehalten, und das Lysostaphin wird auf einem hohen Niveau in den klonierten, transformierten Bakterien, die die Plasmide beherbergen, ausgedrückt. Das 1,5 kbp-DNA-Teilstück, das für Lysostaphin codiert ist, wird von S. simulans (NRRL B-2628) isoliert und ist in dem Organismus auf einem großen Penicillinaseplasmid anwesend. Es wurde jetzt nachgewiesen, daß ein Proenzym mit einem Molekulargewicht von 42.200 Daltons durch S. simulans produziert wird. Wenn das 1,5 kbp-DNA-Teilstück, das für Lysostaphin codiert ist, in die Plasmide der gegenwärtigen Erfindung eingefügt wird, wird Lysostaphin codierendes DNA durch transformierte Mikroorganismen ausgedrückt, um Prolysostaphin zu produzieren, und das Prolysostaphin wird durch die Mikroorganismen gespalten, um Lysostaphin zu produzieren, welches aus den Zellen abgegeben wird. Reifes Lysostaphin akkumuliert sich in großen Mengen in dem Medium, in dem die transformierten Bakterien wachsen. Einige der gentechnisch entwickelten transformierten Bacillus-Stämme produzieren erheblich mehr Lysostaphin pro mm Kulturüberstand, als S. simulans, der natürlichen Quelle des Enzyms.
Die vorliegende Erfindung sorgt insbesondere für Plasmide, pRG5, welches von dem E. coli-Klonierungsvektor pUC8 durch Insertion des 1,5 kbp-DNA-Teilstücks, das für Lysostaphin codiert ist, in das LacZ'-Gen des Plasmids pUC8 abgeleitet worden ist. Die spätlogarithmische Phase der Kulturen des E. coli-Stamms JM105, welches das Wirtsbakterium für rekombinante Plasmide, die von pUC8 abgeleitet worden sind, ist, transformiert durch pRG5, hat einen erkennbaren Gehalt von Lysostaphin-Aktivität im Überstand und in den periplasmatischen und zytoplasmatischen Fraktionen.
Weiterhin sieht die vorliegende Erfindung insbesondere rekombinante Plasmide vor, in die ein 1,5 kbp-DNA-Teilstück, das für Lysostaphin codiert ist, eingefügt worden ist, das dazu benutzt werden kann, Bacillus-Arten zu transformieren. So sorgt die Erfindung für rekombinante Bacillus-Plasmide pJP1, pDF8 und pRP1, die in einem transformierten Wirt Lysostaphin ausdrücken. Die Plasmide wurden durch Einfügung des 1,5 kbp- DNA-Teilstücks, das für Lysostaphin codiert ist, das vom pRG5 entnommen worden ist, in die jeweiligen Bacillus pBC16, pBD64 und pSPV1 gebildet. Eine weitere Ausführung dieser Erfindung enthält die transformierten Bacillus-Arten, welche nach der Transformation mit diesen Plasmiden Lysostaphin produzieren und abgeben Die Plasmide pJP1, pDF8 und pRP1 wurden benutzt, um B. subtillis und B. sphaericus zu transformieren. Das besonders bevorzugte rekombinante Plasmid dieser Erfindung für den Gebrauch in den Bacillus-Arten ist pJP1. Die besonders bevorzugten transformierten Wirtsorganismen, die Lysostaphin ausdrücken, sind kompetente Bacillus subtilis BD170- und Bacillus sphaericus OO-Stämme.
Insbesondere der b. sphaericus-Stamm OO, der durch pJP1 transformiert worden ist, produziert wenigstens eine 5mal größere Menge an Lysostaphin pro Liter Kultur als S. simulans, (NRRL B-2628). Das rekombinante Produkt, das vom B. sphaericus-Stamm OO/pJP1 isoliert worden ist, ist vom S. simulans Lysostaphin auf der Basis der elektrophoretischen Beweglichkeit, der immunologischen Kreuzreaktionsfähigkeit mit Lysostaphinsoezifischen Antikörpern und der katalytischen Aktivität nicht zu unterscheiden. Lysostaphin, welches von transformierten Mikroorganismus im Einklang mit dieser Erfindung produziert worden ist, ist weitgehendst frei von nicht-Lysostaphinen, immunogenen Staphylokokkenverunreinigungen.
E. coli JM105, welches pRG5 trägt, ATCC (American Type Culture Collection) Zugangsnr. 67076; B. subtilis BD170, welches pJP1 trägt, ATCC-Zugangsnr. 67078; B. sphaericus OO, welches pJP1 trägt, ATCC-Zugangsnr. 67080; B. subtilis BD170, welches pDF8 trägt, ATCC-Zugangsnr. 67077; und B. subtilis BD170, welches pRP1 trägt, ATCC-Zugangsnr. 67079 sind bei der American Type Culture Collection eingelagert.
Die folgenden Beispiele dienen der Darstellung der Erfindung, aber nicht als Einschränkung derselben.

Beispiel 1

Der Aufbau von pRG5

Das Plasmid pRG5 wird aufgebaut durch Einfügung des 1,5 kbp- DNA-Teilstücks, das für Lysostaphin codiert ist, in das lacZ'-Gen des Plasmids pUC8, eines entwickelten Klonierungsvektors, beschrieben durch Vieira und Messing, Gene, Band 19, S. 259 bis 268 (1982).
Die gesamte DNA wurde von S. simulans (NRRL 8-2628) wie folgt isoliert:
S. simulans wurde bis zur mittleren logarithmischen Phase in Casaminosäurenmedium, beschrieben von Robinson et al., J. Bacteriol. Band 137, S. 1158 bis 1164 (1979), angezüchtet. Die Zellen wurden durch Zentrifugieren gewonnen, in Tris- Puffer (50 mMol Tris, 50 mMol EDTA, ph 7,8) gewaschen, und bis zu 20 % des ursprünglichen Kulturvolumens in Tris-Puffer resuspendiert, welches 50 ug/ml Lysostaphin (erhalten von Mead-Johnson) und Lysozym (0,5 mg/ml) enthielt. Nach zweistündiger Inkubation bei bei 37ºC wurden Pronase (1 mg/ml) und Natriumdodecylsulfat (0,6 %) hinzugegeben, und die Suspension wurde für weitere zwei Stunden bei 37ºC inkubiert. Das durch diese Behandlung gewonnene S. simulans-Lysat wurde zweimal mit der gleichen Menge an Phenol mit gebräuchlichen Standardtechniken extrahiert.
Die Nucleinsäure wurde von der wässrigen Phase des phenolextrahierten Lysates durch Hinzugabe von zwei Volumen eiskalten 95 %igen Ethanols gefällt, durch Zentrifugieren gesammelt und in TE-Puffer (10 mMol Tris, 1 mMol EDTA, pH 8,0) aufgelöst. Die aufgelöste Nucleinsäure wurde für zwei Stunden bei 37ºC mit einer Kombination von Pankreasribonuclease (30 ug/ml) und Tl-Ribonuclease (2 U/ml) digeriert, um jegliche gegenwärtige RNA in der Probe zu vermindern. Die resultierende DNA wurde wiederum mit Ethanol gefällt und in TE-Puffer gelöst. Ungefähr 1,5 mg an S. simulans-DNA wurde aus 0,5 l einer Kultur mit Zellen der mittleren logarithmischen Phase isoliert.
Die Klonierung wurde ausgeführt, indem pUC8 als Vektor und E. coli K12 Stamm JM105 als Wirt benutzt wurden. Die gesamte S. simulans-DNA, die wie oben beschrieben isoliert wurde, war teilweise mit Mbo I digeriert und durch Zentrifugieren mit 35.000 U min&supmin;¹ für 20 Stunden durch einen 12 ml 10-30 %igen Saccharosegradienten fraktioniert worden. 10 ug DNA-Teilstükken in einer Größe von 5-15 Kilobasenpaaren (kbp) mit einer 10 kbp Durchschnittsgröße wurden gesammelt und zu zwei ug des Bam HI-digerierten pUC8 ligiert. Dieses Plasmid überträgt eine Ampicillinresistenz und trägt das LacZ'-Gen, das für den terminalen Aminoabschnitt der E. coli beta-Galactosidase codiert ist. Die Einfügung der fremden DNA in die Klonierungsstelle, die in dem LacZ'-Gen lokalisiert ist, führt zu einer Inaktivierung der beta-Galactosidase.
Annähernd 80 % der JM105-Transformanten, die bei diesem Vorgang gewonnen wurden, enthielten rekombinante Plasmide, wie durch die Inaktivierung des lasZ'-Gens (lacZ'&supmin;) gezeigt wurde, das bedeutet, die Transformanten produzierten keine beta- Galactosidase.
Um die Lysostaphinexpression in den Transformanten zu untersuchen, wurde S. aureus RN492, beschrieben von Novick et al., Plasmid, Band 2, S. 109-129 (1979) und von dort erhalten, als Indikatorstamm benutzt. Dieser Bakterienstamm ist ein veranlagter beta-Lactamaseproduzent und ist relativ resistent gegen Ampicillin. E. coli JM105-Transformanten, die auf L Agar gezüchtet werden, der 50ug/ml Ampicillin enthält, wurden für 30 Minuten Chloroformdampf ausgesetzt, um sie zu lysieren und mit einer 0,1 %igen (v/v) Suspension einer stationären Phase einer Kultur von S. aureus RN492 in GL Agar überschichtet. Die Produktion von Lysostaphin durch E. coli JM105-Transformanten, die die erfolgreiche Insertion des Lysostaphin-Gens in das pUC8 zeigt, wurde durch die Beobachtung einer Lysis von Indikatorzellen, die auf eine JM105-Transformantenkolonie superponiert wurde, bestimmt. Annähernd neun von 1000 Klonen, die rekombinante Plasmide (amp&spplus;, lacZ'&supmin;) beherbergten, enthielten das Lysostaphin-Gen, eine Anzahl, die darauf hinweist, daß eine Vielzahl von Kopien des Lysostaphin-Gens pro Chromosomenäquivalent der S. simulans DNA (ungefähr 2.000 kbp) gegenwärtig war.
Lysostaphin produzierende Transformanten enthielten rekombinante Plasmide, die Einfügungen von 6,0, 6,5 oder 8,0 kbp haben. Restriktionsanalysen zeigten, daß diese Insertionen in jeder Orientierung in dem Klonierungsvektor gegenwärtig waren und im allgemeinen ein 4,3 kbp-DNA-Teilstück enthielten. Die DNA-Sequenz, die für Lysostaphin codiert ist, war weiter zu einem 1,5 kbp-Hpa II-Hind III DNA-Teilstück lokalisiert, das von einem 4,3 kbp-DNA-Teilstück erhalten worden war. Das 1,5 kbp-DNA-Teilstück wurde in die ACC I-Hind III-Stellen des pUC8 rekloniert, um das rekombinante Plasmid pRG5 zu schaffen, welches eine bevorzugte Ausführung dieser Erfindung ist.

Beispiel 2

Sequenz und Charakteristiken des 1,5 kbp-DNA-Teilstücks, das für Lysostaphin codiert ist

Die DNA-Sequenz des pRG5 1,5 kbp-DNA-Teilstücks, das für Lysostaphin codiert ist, wurde durch die Dideoxy-Ketten-Terminationsmethode von Sager et al., Proc. National Academy of Science, Band 74, S. 5463 bis 5467 (1977) bestimmt, unter Verwendung der Phagenvektoren M13mp10 und M13mp11, wie durch Messing, Meth. Enzymol., Band 101, S. 20-78 (1983) beschrieben.
Die Nukleotidsequenz des gesamten 1,5 kbp-DNA-Teilstücks, das für Lysostaphin codiert ist, ist als Formel 1 vorgesehen. Mit Bezug auf die Formel I enthält das 1,5 kbp-DNA-Teilstück einen offenen Leserahmen von 1.167 Nukleotiden, der sich von einem TTG-Initiationscodon bei den Nukleotiden 245-247 bis zu einem TGA Terminationscodon bei den Nukleotiden 1412-1414 erstreckt. Das DNA-Teilstück enthält auch einen angenommenen Promotor bei -35 und -10 Regionen bei den Nukleotiden 89 bis 95 und 110 bis 119, die in der Formel I unterstrichen sind. Der Lysostaphinpromotor erscheint homolog zu den B. subtilis Promotoren, die durch die δ37 Regulatoruntereinheit der RNA- Polymerase erkannt wurde und durch Wong et al., Proc. National Academy of Science, Band 81, S. 1184-1188 (1984) beschrieben wurde. Die Ribosomenbindungssequenz, AGGAGGT, bei den Nukleotiden 231-237, vollständig komplimentär zu der mRNA-Bindungssequenz des 16S-Ribosomen-RNA, kann in der DNA- Sequenz 7 Basenpaare vor dem TTG Initiationscodon, der für f-Met codiert ist, gefunden werden.
Der offene Leserahmen codiert Präprolysostaphin, ein 389- Aminosäureprotein, das ein Molekulargewicht von 42.200 Daltons hat, welches der Vorläufer zu dem reifen enzymatisch aktivierten Lysostaphin ist. Die Aminosäuresequenz des Präprolysostaphins, die von der DNA-Sequenz abgeleitet worden ist, wird auch in der Formel I angegeben. Es war bisher unbekannt, daß Lysostaphin in einer Vorläuferform synthetisiert worden ist. Formel I
Die Amino-Terminale-36-Aminosäuresequenz des Präprolysostaphins ist das Signalpeptid, das heißt, der weitgehendst hydrophobe Bereich, der in Vorläufern von abgegebenen Proteinen gefunden wird.
Signalpeptide sind die Amino-Terminal-Sequenzen der abgegebenen Proteine beim Translatieren, die an dem Ausrichten der wachsenden Polypeptidkette durch die Membran nach der Synthese an den membrangebundenen Ribosomen beteiligt sind. In Eukaryonten wird das Signalpeptid durch eine spezifische Protease abgespalten, die lumenseitig von dem rauhen endoplasmatischen Retikulum (RER) gefunden wird, selbst bevor die Polypeptidsynthese vervollständigt ist.
In Bakterien, die kein RER haben, werden Sekretproteine auf Ribosomen synthetisiert, die an der innenseitigen Fläche der Plasmamembran gebunden sein können. Das Signalpeptid von entstehenden bakteriellen Polypeptidketten erscheint beim Transport des Proteins durch die Plasmamembran beteiligt zu sein. Bakterielle Signalpeptide werden im allgemeinen während oder kurz nach dem Transport durch die Plasmamembran entfernt, da die sekretierten Proteine, die sich in dem Kulturmedium ansammeln, nicht mehr diese Sequenz enthalten.
Mehrere Merkmale des Präprolysostaphins können in Bezug auf die Formel II gesehen werden, welche die Amino-Terminal-152- Aminosäuren des Präprolysostaphins (A) und die Nukleotidsequenz des 1,5 kbp-DNA-Fragments von den Basenpaaren 389-661 (B) darstellt.
Das Signalpeptid oder die Signalsequenz der abgesonderten oder membrangebundenen Proteine ist durch einen hohen Gehalt an hydrochoben Aminosäuren gekennzeichnet, wie es in dem Signalpeptid des Präprolysostaphins ersichtlich ist, das in der Formel IIA dargestellt ist. Obwohl die Hydrophobie jeglicher Signalsequenz ein ständiger Befund ist, können die dort tatsächlich enthaltenen Aminosäuren, die besondere Sequenz der Aminosäuren und die Länge des Peptids weitreichend variieren. Z. B. treten ungewöhnlich Lange Signalsequenzen (31-44 Aminosäuren) in Bacillusarten auf. Watson, Nucleic Acids Res., Band 12, S. 5145 bis 5164, 1984.
Die Aufspaltungsstelle der Präprolysostaphinsignalsequenz ist die Ala-Ser-Bindung bei den Aminosäurenresiduen 36-37 (Formel IJA). Das Entfernen aus dem 1,5 kbp-DNA-Teilstück der DNA, die für die Signalsequenz des Präprolysostaphins codiert ist, würde höchstwahrscheinlich zu einem nicht abgesonderten Protein führen. Eine DNA-Sequenz, die für ein funktionell äquivalentes Signalpeptid codiert ist, welches die DNA ersetzt, die für das Lysostaphinsignalpeptid codiert ist, würde auch sicherlich ein absonderbares "Präprolysostaphin" codieren; obwohl mit einem unterschiedlichen aber zweckmäßigen Signalpeptid.
Nach der Abspaltung von der Signalsequenz, welche für eine Sekretion erforderlich ist, ist das Protein, das sich ansammelt und nachfolgend behandelt wird, Prolysostaphin. In der Formel IIA wird auch die Sequenz von Ala-49 bis hin zu Arg- 139 des Prolysostaphins dargestellt, die sieben Tandem-Wiederholungen einer 13-Aminosäuren-Sequenz enthält. Dieser Teil des Proteins, der eine größere Menge an Glutaminsäure enthält und netto eine negative Ladung besitzt, wird während des Verfahrens von Prolysostaphin zum reifen Lysostaphin abgespalten. Die DNA-Sequenz, dies ist bp 389-661, welche für die Aminosäuren-Wiederholungen codiert ist, ist zusammengesetzt aus sieben Wiederholungen einer homologen 39 bp-Sequenz. (Formel IIB). Die sieben Tandem-Aminosäuren-Wiederholungen (IIA) und die korrespondierenden Nukleotid-Sequenz-Wiederholungen (IIB) sind numeriert von 1 bis 7 in der Formel II. Formel II
Eine große Vielfalt von Proteinen wird in Vorläuferformen mit nachfolgendem Verfahren zu reifen aktiven Proteinen synthetisiert. Z. B. Insulin, welches in seiner aktiven Form ein zweikettiges Polypeptid ist, wird als einfache Polypeptidkette (Proinsulin) synthetisiert, die dann nachfolgend zum reifen Insulin nach proteolytischer Entfernung eines inneren Polypeptids zum reifen Insulin umgeformt wird. Auch die alkalischen und neutralen Proteasen von B. subtilis und B. amyloliquefaciens werden als Präproenzyme synthesiert. Bisher aber war es nicht bekannt, daß Lysostaphin als Präproenzym synthetisiert wird. Wie in Tabelle I dargestellt, beteiligt die Umwandlung der alkalischen und neutralen Protease-Proenzyme zu entwickelten Enzymen eine ähnliche Abspaltungsstelle, wie die Umwandlung von Prolysostaphin zu Lysostaphin. Tabelle I Vergleich von Präprolysostaphin mit Bacillus Präproproteasen Anzahl der Reste Enzyme Präprosequenz entwickelt abschließend Abspaltungsstelle Subtilisin B. subtilis B. amyloliquefaciens Neutrale Protease Lysostaphin
Die Amino-Terminal-Sequenz des gereinigten, entwickelten Lysostaphins von S. simulans, bestimmt durch die Edman Degradation, Ala-Ala-Thr-His-Glu, korrespondiert mit den Aminosäuren 144-148 der Präprolysostaphin-Sequenz, codiert durch das 1,5 kbp-DNA-Teilstück von pRG5 Die Aminosäurenzusammensetzung des entwickelten Lysostaphins, vorherbestimmt durch die DNA-Sequenz, zeigte eine ausgezeichnete Korrelation mit der experimentell bestimmten Aminosäurezusammensetzung des gereinigten Lysostaphins, erhalten von S. simulans (NRRL B- 2628)-Kulturüberständen durch Trayer et al., J. Biol.-Chem., Band 245, S. 4842-4846. Entwickeltes aktives Lysostaphin, wie bestimmt durch die vorherbestimmte Sequenz, hat ein Molekulargewicht von ungefähr 26.920 Daltons. Wie in der Formel II dargestellt, beteiligt die Umwandlung des Proenzyms zum entwickelten Lysostaphin die Abspaltung der Arg-Ala-Bindung bei den Resten 143-144 des Präprolysostaphins, codiert durch das 1,5 kbp-DNA-Teilstück.

Beispiel 3

Expression von Lysostaphin in E. coli JM105/pRG5-Transformanten

Eine E. coli JM 105-KuLtur in ihrer späten logarithmischen Phase, transformiert durch pRG5, angezüchtet in einem 30 ml LB-Medium, welches 50 ug/ml Ampicillin enthielt, wurde durch Zentrifugieren gewonnen und mit Tris-Kochsalz-Puffer (Tris- Salin-Buffer-10 mM Tris, 30 mM NaCl, ph 8.0) gewaschen. Das Kügelchen wurde in 1 ml von TSB resuspendiert und für zwei Minuten bei 0 º C beschallt. Der Kulturüberstand wurde durch Ultrafiltration 20fach konzentriert, wobei eine Amicon YM10- Membran benutzt wurde. Lysostaphinaktivität wurde in den überständigen (65 % des ganzen), periplasmatischen (15 %) und cytoplasmatischen (20 %)-Fraktionen gefunden, die wie oben vorbereitet wurden.
Kaninchenantikörper zum Lysostaphin, das von S. simulans- Überständen gereinigt worden ist, wurden vorbereitet und durch Affinitätschromatographie nach Recsei et al. J. Biol. Chem., Band 257, S. 7196-7202 (1982) gereinigt und in Immunoblottingexperimenten benutzt, um Lysostaphin und Prolysostaphin, das durch beide E. coli JM105/pRG5 und S. simulans produziert worden ist, zu lokalisieren und zu kennzeichnen.
Gereinigte Ziegenantikörner zu Kaninchenimmunoglobulinen wurden durch alkalische Phosphatase (Sigma) mit Hilfe von Standardtechniken konjugiert. Die Immunoblottingproben wurden als erstes Natriumdodecylsulfat (SDS) Polyacrylamid-Gel-Elektrophorese ausgesetzt, gefolgt vom Transfer der getrennten Proteine zu Nitrozelluloselagen, wobei Standardtechniken gebraucht wurden. Immunreaktive Proteine auf den Nitrozellulosefiltern wurden durch die Inkubation der Filter als erstes mit Kaninchenantikörper zum Lysostaphin und dann mit Antikaninchenimmunoglobulinen, konjugiert zur alkalischen Phospatase, entdeckt. Das chromogene Substrat, 5-Bromo-4-Chloroindoxyl-Phosphat plus Nitroblau-Tetrazolium, wurde benutzt, um die alkalische Phosphataseaktivität, wie von Blake et al., Anal. Biochem., Band 136, S. 175 bis 179 (1984) beschrieben, zu entdecken.
Die Figur 1 stellt die Ergebnisse der Immunoblotting-Experimente dar. Die folgenden Proben wurden auf die dafür bestimmten Reihen gebracht, elektrophorosiert, zu den Filtern transferiert und zur Reaktion mit Anti-Lysostaphinantikörpern gebracht: Überstände von S. simulans-Kulturen, entnommen aus den spätlogarithmischen (Reihe 1 und 6), frühen stationären (Reihe 2), mittleren stationären (Reihe 3) und spät stationären (Reihe 4) Phasen; E. coli/pRG5-Überstand (Reihe 8) und Zellextrakt (Reihe 7) von Kulturen in der spätlogarithmischen Phase. Mead-Johnson-Lysostaphin wurde auf die Reihen 5 und 9 gebracht. Die Positionen der Molekulargewichtsbezugsmaße sind auch in Figur 1 dargestellt.
Die Immunoblottingtests zeigten die Anwesenheit von entwickeltem Lysostaphin (MW 26.920) im konzentrierten Kulturüberstand von E. coli JM105/pRG5-Transformanten in der spätlogarithmischen Phase (Figur 1, Reihe 8). Ein kreuzreagierendes Protein mit der identischen elektrophoretischen Mobilität wurde im Überstand von Lysostaphin, daß von S. simulans- Kulturen produziert worden ist, gefunden.
Die immunologische Analyse der elektrophoresierten Zellextrakte von E. coli JM105/pRG5-Transformanten in der spätlogarithmischen Phase zeigte die Gegenwart von zwei Proteinen, die mit Lysostaphinantikörpern reagierten. Das entwickelte Lysostaphin war in relativ kleinen Mengen anwesend. Zusätzlich wurde eine größere Menge an kreuzreagierenden Proteinen offensichtlich mit einem Molekulargewicht von 64.000 Daltons in der E. coli-Zellfraktion (Figur 1, Reihe 7) gesehen. Ein kreuzreagierendes Protein mit einer elektrophoretischen Beweglichkeit identisch zu diesem größeren Protein wurde auch in den Überständen von S. simulans gesehen, primär gewonnen nach der Anzucht bis zur spätlogarithmischen Phase. Das größere kreuzreagierende Protein ist höchstwahrscheinlich Prolysostaphin, da es in S. simulans und in E. coli JM105/pRG5 vor dem Lysostaphin in Erscheinung tritt und verschwindet, wenn sich das entwickelte Lysostaphin ansammelt (Figur 1, Reihen 1 bis 4 und 8). Die ersichtliche Überschätzung des Molekulargewichts von Prolysostaphin resultiert wahrscheinlich aus der reduzierten Bindung von SDS aufgrund des hohen Gehalts an Glutaminsäurenresten in den Tandem-Wiederholungen der Prolysostaphinsequenz.
Lysostaphin wird daher aus einem Präproenzym synthetisiert. Die Signalsequenz des Präprolysostaphins wird auf den vektoriellen Transport der Polypeptidkette durch die Membran hin abgespalten. Das resultierende Prolysostaphin wird folglich extrazellulär zum entwickelten Lysostaphin verändert. Die Umwandlung zum entwickelten aktiven Enzym wird durch die Abspaltung der Arg&sub1;&sub4;&sub3;-Ala&sub1;&sub4;&sub4;-Peptidbindung erreicht. Das Amino- Terminal-Teilstück des Prolysostaphins wird offenbar in Stufen entfernt, das bedeutet, daß die gesamte Proenzymsequenz nicht zur gleichen Zeit entfernt wird. Diese Verfahrensreaktion tritt in den Überständen der Kulturen von S. simulans während der stationären Phase auf. Da die entwickelten Enzyme auch durch Kulturen von E. coli JM105/pRG5-Transformanten produziert werden, ist die Bearbeitung des Proenzyms entweder autokatalytisch oder beteiligt ähnliche Verfahrensaktivitäten, die in E. coli JM105 und in S. simulans vorhanden sind. E. coli JM105/pRG5-Transformanten jedoch haben den Vorteil, daß sich die Bearbeitung eher intrazellulär als extrazellulär, wie bei S. simulans, zu ereignen scheint.

Beispiel 4

Aufbau von Plasmiden, die in transformierten Bacillus ssp. Lysostaphin ausdrücken

Bacillus-Expressionssysteme zur Produktion von klonierten Genprodukten haben signifikante Vorteile gegenüber ähnlichen Systemen, die E. coli als Wirtsorganismen benutzen. Bacillusspezies sondern normalerweise bereitwillig Proteine in das umgebende Medium ab. Wegen dieses Vorteiles wurden rekombinante Plasmide, die die 1,5 kbp-DNA-Sequenz, die für Lysostaphin codiert ist, beinhalten, von Plasmiden konstruiert, die sich in verschiedenen Bacillusspezies replizieren.
Das Plasmid pRG5 wurde als Quelle für die DNA, die für Lysostaphin codiert ist, gebraucht. Die Plasmid-pRG5-DNA, die mit Hind III und Eco R1 nach den Bedingungen, die durch die Hersteller spezifiziert worden sind, digeriert worden ist, wurde durch eine vorbereitende Elektrophorese in 1 %iger Agarose fraktioniert. Das 1,5 kbp-DNA-Teilstück, das für Lysostaphin codiert ist, wurde durch Ethidiumbromid-Färbung lokalisiert und durch Elektrophorese zu einem DEAE-Nitrozellulose-Filterstreifen transferiert. Der Streifen wurde mit NET-Puffer (0,15 M NaCl, 0,1 mM EDTA, 0,02 MTris, pH 8.0) gewaschen, und die gebundene DNA wurde durch Inkubation des Streifens in NET-Puffer, der 1 M NaCl enthielt, für eine Stunde bei 65 º C eluiert. Das Ethidiumbromid wurde von der DNA durch zweimaliges Extrahieren der Lösung mit einem gleichen Volumen an n- Butanol entfernt. Die DNA wurde durch Zugabe von 2 Volumen von kaltem 95 %igem Ethanol zur wässrigen Phase gefällt, gesammelt durch Zentrifugieren, gewaschen mit 80 %igem Ethanol und im TE-Puffer gelöst (Beispiel 1).

a. Plasmid pJP1

Rekombinantes Plasmid pJP1, eine bevorzugte Ausführung dieser Erfindung, wurde durch Insertion des 1,5 kbp-DNA-Teilstücks, das für Lysostaphin codiert ist, in das Bacillusplasmid pBC16, welches die Gene für die Tetracyclin-Resistenz trägt, aufgebaut. Plasmid pBC16, erhalten von der Sammlung des Richard P. Novick, Public Health Research Institute, New York, New York, wurde von Erdbazillen isoliert und ist hoch homolog zu und inkompatibel mit pUB110, einem S. aureus-Plasmid, daß die Kanamycin-Resistenz spezifiziert. pBC16-DNA wurde von B. subtilis durch das alkalische SDS-Verfahren, beschrieben durch Birnboim, Meth. Enzymol., Band 100, S. 243- 255 (1983), isoliert. Zellen von einer 250 ml Übernacht- Kultur, in VY-Medium angezüchtet (25 g Difco-Kalbfleisch- Infusion; 5 g Difco-Hefeextract/l H&sub2;O) wurden durch Zentrifugieren gewonnen, in TE-Puffer gewaschen und in 5 ml des TEG-Puffer (25 mM Tris, 10 mM EDTA, 50 mM Glucose, ph 8,0) resuspendiert. Lysozym (1 mg/ml) wurde zugegeben und die Suspension wurde bei Raumtemperatur für 20 Minuten inkubiert. Nach Zugabe von 10 ml von 0,2 %iger NaOH-1 %iger SDS, wurde die Mischung bei 0 º C für 45 Minuten inkubiert. 10 ml von 3M Kaliumazetat - 1,8M Ameisensäure wurden dann zugegeben, und die Mischung wurde weiterhin bei 0 º C für 30 Minuten inkubiert. Das so erhaltene Lysat wurde bei 15.000 X g für 20 Minuten zentrifugiert. Zwei Volumen an 95 %igem Ethanol wurden zum Überstand und dem resultierenden Niederschlag, erhalten nach 15 Minuten bei Raumtemperatur, hinzugegeben, und wurde durch Zentrifugieren bei 10.000 X g für 10 Minuten gesammelt, mit 80 %igem Ethanol gewaschen und in 0,5 ml TE-Puffer gelöst. Ungefähr 200ug von geschlossener, ringförmiger pBC16 DNA wurde mit diesem Verfahren erhalten.
Die Plasmid DNA wurde durch Eco RI Abspaltung linearisiert. Eine Mischung der Linearisierten pBC16 DNA (ungefähr 1 ug) mit dem 1,5 kbp-DNA Teilstück, das für Lysostaphin codiert ist (ungefähr 1 ug), wurde durch Gebrauch einer DNA-Polymerase (Klenow Fragment) stumpf geendet. Eine T4 DNA Ligase wurde dann benutzt, um das Plasmid und die Fragment DNA miteinander zu Legieren, um dadurch geschlossene, ringförmige Plasmid-DNA-Moleküle zurückzubilden.
Kompetente B. subtilis-Stamm BD 170 Zellen, von David Dubnau vom Public Health Research Institute, New York, New York, wurden mit der legierten DNA (ungefähr 1ug DMA pro 0,1 ml an Zellen) nach der Methode von Contente et. al., Mol. Gen. Genet., Band 167, S. 251-258 (1979), transformiert. Die Zellen wurden dann bei 37 º C für 90 Minuten inkubiert, um die Expression des tetracyclin-resistenten Gens des Plasmids zu erlauben und auf TBAB Agar aufgetragen, der eine selektive Menge an Tetracyclin (5ug/ml) und suspendierte, durch Hitze abgetötete S. aureus-Zellen enthält, um die Lysostaphinproduktion anzuzeigen.
Durch Hitze getötete S. aureus-Zellen zum Messen der Lysostaphin-Aktivität wurden durch Autoklavieren (40 min) einer Kultur in ihrer stationären Phase, angezüchtet in 500 ml CYGP Bouillon, vorbereitet. Die toten Zellen wurden zentrifugiert und in 10 ml sterilen Wassers resuspendiert. Zwei ml dieser Zubereitung an toten Zellen wurden zu 500 ml TBAB Agar zur Vorbereitung auf den Indikatorplatten hinzugegeben.
Ungefähr 1 % der B. subtilis-Zellen, transformiert mit abgebundener DNA, produzierten Lysostaphin, wie durch die Lysis der Staphylokokkenzellen angezeigt, die die B. subtilis Kolonien umgeben. pJP1 wurde durch mehrmaliges Wiederausstreichen von einem der B. subtilis-Transformanten auf Lysostaphinindikatorplatten erhalten bis ein vollständig stabiler Klon erhalten wurde.
Eine Lysostaphin-Aktivität war primär in der Überstandsfraktion von B subtilis BD 170/pJP1 Transformanten, die bis zur stationären Phase in flüssigem Medium angezüchtet wurden, vorhanden. Eine Immunoblot-Analyse zeigte, daß eine Lysostaphin-Vorläuferform abgesondert wurde, welche nachfolgend in reifes Lysostaphin umgewandelt wurde. Zusätzlich zeigte Immunoblotting auch das Vorhandensein von Lysostaphin-Zerfallsprodukten in Kulturüberständen, welche minimalisiert wurden, wenn Phenylmethylsulfonyl-Fluorid, ein Serine-Protease Inhibitor, zur Kultur hinzugegeben wurde. So ist es wahrscheinlich, daß eine Serine-Protease in das Medium abgesondert wird oder auf der Oberfläche von B. subtilis BD 170 Zellen vorhanden ist.

b. pDF8 und pRp1

Zwei andere rekombinante Plasmide, pDF8 und pRP1, die Lysostaphin-Gene enthalten, wurden für die Transformation von Bacillus-Spezies, hauptsächlich wie in Beispiel 4a zum Aufbau von pJP1 vorgesehen, aufgebaut.
pDF8 wurde durch Insertion des 1,5 kbp-DNA-Teilstücks, das für Lysostaphin codiert ist, in die Eco RI Restriktionsstelle des Plasmids pBD64, einem Kanamycin, Chloramphenicol Resistenzplasmids von der Sammlung des David Dubnau, Public Health Research Institut, New York, New York, erhalten. pDF8 wurde, wie oben, der Transformation von B subtilis BD 170 folgend, mit rezirkularisierten Plasmiden und Beschichten solcher Transformanten auf Lysostaphin-Indikatorplatten, die 5 ug/ml Chloramphenikol enthielten, gewonnen. pDF8 wurde durch wiederholtes Wiederausstreichen von positiven Klonen selektiert.
Genauso wurde pRP1 durch Insertion des für Lysostaphin codierten 1,5 kbp-DNA-Teilstücks, in die HpaI-Stelle von pSPV1, einem Chloramphenikol Resistenzplasmid von Steven Projan, Public Health Research Institut, New York, New York gebildet. Alle folgenden Schritte zur Isolierung von pRP1 waren identisch mit denjenigen für die Konstruktion von pJP1 und pDF8.

Beispiel 5

Lysostaphin Expression in B. sphaericus 99/pJP1 Transformanten

Eine Anzahl von Bacillusstämmen wurde mit pJP1 transformiert, um einen passenden Wirt für eine Produktion von Lysostaphin in einem größeren Ausmaß zu erhalten. Transformanten, die große Lysishöfe auf Lysostaphin-Indikatorplatten produzierten, wurden isoliert und weiterhin gekennzeichnet. Von den untersuchten Bacillusstämmen sorgt der B. sphaericus-Stamm 00, ein Organismus, isoliert, und in der Kulturensammlung des Public Health Research Instituts, New York, New York, erhalten, für eine maximale Produktion an Lysostaphin.
B. sphaericus 00/pJP1-Transformanten wurden durch Behandlung von Protoplasten gewonnen, die durch Lysozym-Behandlung von intakten Zellen mit pJP1 DNA in Gegenwart von Polyethylenglykol nach der Methode von Chang et al., Molec. Gen. Genet., Band 168, S. 11-115 (1979), gewonnen wurden. Entsprechend der Behandlung wurden die Zellen auf DM3 Regenerationsplatten in Gegenwart von Tetracyklin (5 ug/ml) vor der Untersuchung auf Lysostaphin-Indikatorplatten angezüchtet.
B. sphaericus 00/pJP1-Transformanten wurden auf VY oder CYGP Medium angezüchtet und produzierten und sonderten ungefähr 150 mg entwickelten aktiven Lysostaphins pro Liter Kulturmedium ab. Diese Menge ist ungefähr fünfmal so groß wie die Menge, die durch S. simulans unter den besten Fermentationstechniken, die z. Zt. erhältlich sind, produziert wird. Aktives Lysostaphin sammelt sich in dem Wachstumsmedium mit wenig Zerfall, selbst nach verlängerter Inkubation von Kulturen, und beträgt ungefähr 80 % des gesamten extrazellulären Proteins. Lysostaphin, isoliert von B. sphaericus 00/pJP1- Transformanten, ist immunologisch, elektrophoretisch und katalytisch nicht von dem zu unterscheiden, das von S. simulans-Kulturen erhalten werden kann. Lysostaphin wird vom Wachstumsmedium im Einklang mit bekannten fraktionellen Ausfällverfahren (salting out) gewonnen. Alternativ kann eine besonders effektive Reinigung erreicht werden durch die Kombination einer Fällung mit einer chromatographischen Trennung der Fermentationbouillon von Kulturen der Lysostaphin produzierenden B. sphaericus 00/pJP1-Transformanten.
Die Zellen werden von der Fermentationsbouillon z. B. durch Zentrifugieren oder Ultrafiltration entfernt, und festes Ammoniumsulfat wird dem Überstand bis zu 40-60 % der Sättigung, vorzugsweise 50 %, zugegeben. Nach einer Stunde bei 4º C wird der Lysostaphin enthaltende Niederschlag durch Zentrifugieren zurückerhalten. Die Rückgewinnung ist bei diesem Schritt größer als 80 %.
Der Niederschlag wird in einem minimalen Volumen von 10 mM Natriumphosphatpuffer (pH 7,0, 50 mM NaCl) wider gelöst und gegen 100 Volumeneinheiten des gleichen Puffers dialysiert. Nach der Entfernung jeglichen partikulierenden Materials wird die dyalisierte Lösung auf einer Kation-Austauschsäule (vorzugsweise Pharmacia FPLC Mono S) chromatographiert und durch Benutzung eines gepufferten Gefälles an wachsender Salzkonzentration von 0,05 - 0,25 M NaCl eluiert. Die Wiedergewinnung von Lysostaphin für den einzelnen chromatographischen Schritt betrug mehr als 90 %. Lysostaphin-Aktivität ist mit zwei größeren Peaks assoziiert. Der spätere Eluierungspeak des Lysostaphins besteht aus nicht-kovalenten Aggregaten und Proteinen. Diese Aggregate dissoziieren auf Verdünnung im Puffer und unter den Bedingungen der Natrium-Dodecyclsulfat- Polyacrylamid-Gel-Elektrophorese.
Das Lysostaphin, das vom Kulturmedium der B. sphaericus 00/pJP1-Transformanten gereinigt worden ist, ist im wesentlichen frei von Nicht-Lysostaphin-Verunreinigungen. Von besonderer Bedeutung ist, daß das B. sphaericus 00/pJP1 Lysostaphin im wesentlichen frei von immunogen Staphylokokken-Verunreinigungen ist.

Claims

1. 1,5 Kilobasen-DNA, die fur Lysostaphin codiert ist und die Nukleotidsequenz der Formel 1 umfaßt:

mit einem offenen Leserahmen, der sich von einem TTG-Initiationscodon bei den Nukleotiden 245 bis 247 zu einem TGA-Terminationscodon bei den Nukleotiden 1412 bis 1414 erstreckt, wobei der offene Leserahmen für Präprolysostaphin codiert ist, welches ein Vorläufer des entwickelten aktiven Lysostaphin ist, das eine Sequenz von 389 Aminosäuren besitzt, die ein Signalpeptid und ProLysostaphin beinhaltet, welches nach der Synthese zum entwickelten Lysostaphin verarbeitet wird.

2. DNA, die ein Teil der in Anspruch 1 beanspruchten DNA ist, und Homologe davon, die für entwickeltes Lysostaphin oder funktionelle Äquivalente des entwickelten Lysostaphins codiert sind.

3. DNA, die ein Teil der in Anspruch 1 beanspruchten DNA ist, und Homologe davon, die für Präprolysostaphin oder funktionelle Aquivalente des Präprolysostaphins codiert sind.

4. DNA, die ein Teil der in Anspruch 1 beanspruchten DNA ist, und deren Homologe, die für Prolysostaphin und deren funktionelle Aquivalente codiert sind.

5. DNA, die ein Teil der in Anspruch 1 beanspruchten DNA ist, und deren Homologe, die für das Lysostaphin-Signalpeptid und deren funktionelle Aquivalente codiert sind.

6. Rekombinantes Plasmid, welches DNA enthält, die für Lysostaphin von Staphylococcus simulans (NRRL B-2628) codiert ist und welche in einem transformierten Mikrobenwirt die besagte DNA ausdrücken wird.

7. Rekombinantes Plasmid, welches DNA gemäß Anspruch 1 enthält.

8. Rekombinantes Plasmid nach Anspruch 7, wie vorhanden im Depot von transformierten Escherichia coli ATCC 67076 und bezeichnet als pRG5.

9. Rekombinantes Plasmid nach Anspruch 7, wie vorhanden im Depot von transformierten Bacillus subtilis ATCC 67077 oder Bacillus sphaericus ATCC 67080 und bezeichnet als pJP1.

10. Rekombinantes Plasmid nach Anspruch 7, wie vorhanden im Depot von transformierten Bacillus subti Lis ATCC 67078 und bezeichnet als pDF8.

11. Rekombinantes Plasmid nach Anspruch 7, wie vorhanden im Depot von transformierten Bacillus subtilis ATCC 67079 und bezeichnet als pRP1.

12. Transformierte Mikroorganismen, dadurch gekennzeichnet, daß sie Lysostaphin von Staphylococcus simulans (NRRL B-2628) produzieren, und daß die Mikroorganismen durch ein rekombinantes Plasmid, das DNA enthält, welche für Lysostaphin codiert ist, transformiert worden sind.

13. Transformierte Mikroorganismen nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß die Mikroorganismen Escherichia coli, Hefen oder eine Streptomyces-Spezies oder eine Bacillus-Spezies sind.

14. Transformierte Mikroorganismen nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß die Mikroorganismen Escherichia coli, Bacillus subtilis oder Bacillus sphaericus sind.

15. Transformierte Mikroorganismen nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß sie vom E. coli K-12-Stamm JM105, Bacillus subtilis-Stamm BD170 oder Bacillus sphaericus-Stamm 00 sind.

16. Transformierte Mikroorganismen nach Anspruch 15, wie in dem ATCC-Depot 67076, 67077, 67078, 67079, oder 67080.

17. Lysostaphin von Staphylococcus simulans (NRRL B-2628), im wesentlichen frei von nichtlysostaphinen, immunogenen Staphylokokkenverunreinigungen.

18. Vorgang zur Vorbereitung eines Produktes, welches Lysostaphinaktivität besitzt und welches im wesentlichen frei von nichtlysostaphinen, immunogenen Staphylokokkenverunreinigumgen ist, welcher die Kultivierung von transformierten Mikroorganismen nach den Ansprüchen 12, 13, 14, 15 oder 16 (andere als die von dem Genus Staphylococcus) umfaßt, bis die lysostaphincodierte DNA ausgedrückt wird, um Prolysostaphin zu produzieren und das Prolysostaphin durch die Mikroorganismen gespalten wird, um das besagte Produkt zu produzieren.

19. Lysostaphin, codiert durch die DNA nach Anspruch 1 und im wesentlichen frei von nichtlysostaphinen, immunogenen Verunreinigungen.