DE3740520A1 - Schnelles verfahren zur gewinnung einer faktor vii - praeparation sowie ihre verwendung - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Gewinnung einer hochge­ reinigten Faktor-VII-Präparation aus menschlichem oder tierischem Plasma. Die Präparation aus menschlichem Pool-Plasma kann zur Be­ handlung von Blutgerinnungsstörungen verwendet werden.

Faktor VII (MG=50 000 Dalton) ist ein einkettiges Vitamin-K ab­ hängiges Plasmaprotein, das sowohl im intrinsischen als auch im extrinsischen Gerinnungssystem wirkt und eine Schlüsselrolle in der Initiation der Blutgerinnung spielt. Broze, G. J. and Majerus, P. W. J. Biol. Chem. 255, 1242-1247, 1980, and Methods of Enzymo­ logy 80, 229-236, 1981. Rao, L. V. M., Rapaport, S. I. and Bejaj, S. P. Blood 68, 685-691, 1986. Osterud, B. Scand. J. Haematol. 32, 337-345, 1984.

Bei der Initiation des extrinsischen Systems der Blutgerinnung wirkt das einkettige Faktor-VII-Molekül nur auf seine Substrate, Gerinnungsfaktor IX und X, wenn Gewebethromboplastin vorhanden ist. Gewebethromboplastin, ein membranständiges Glykoprotein, das selbst keine enzymatische Aktivität besitzt, fungiert hierbei als Kofaktor. In Analogie zu den Faktoren II, IX und X wird die Fak­ tor-VII-Gerinnungsaktivität durch proteolytische Verdauung erheb­ lich gesteigert. Die Faktoren Xa und Thrombin spalten das Faktor- VII-Molekül durch Proteolyse einer einzigen Peptidbindung in eine durch eine Disulfidbrücke verknüpfte leichte und eine schwere Peptidkette. Das Faktor-VII-Molekül wird auf diese Weise ohne Ab­ spaltung eines Peptids durch Proteolyse aktiviert. Eine Isolation von Faktor VII aus humanem Plasma ist schwierig, da er nur in einer Konzentration von 0.1 µg/ml im Plasma vorkommt und ver­ glichen mit den Faktoren II, IX oder X, die eine biologische Halbwertszeit von etwa 12 Stunden besitzen, nur 6-8 Stunden aktiv im Plasma vorzufinden ist.

Verfahren zur Faktor-VII-Präparation wurden von verschiedenen Au­ toren beschrieben. Bei diesen Verfahren wird der Faktor VII schrittweise aus menschlichem bzw. bovinem Plasma isoliert. Als Ausgangsmaterial für die Faktor-VII-Präparation verwendeten alle Autoren ein an Bariumcitrat adsorbiertes, Faktor-VII-aktives Material, welches nach Elution direkt verwendet oder von einigen Autoren noch fraktionierter Ammoniumsulfatfällung verwendet wurde.

In dem folgenden Text werden die nachstehenden Abkürzungen verwendet:

Abkürzungen:

DEAE: Diäthylaminoäthyl
EACA: ε-amino-n-Capronsäure
EDTA: Äthylendiamintetraacetat
FPLC: Fast Protein Liquid Chromatography
HIC: Hydrophobe Interaktions-Chromatography
PEG: Polyäthylenglykol. Mol.-Gewicht 3350
PMSF: Phenylmethansulfonylfluorid
QAE: Quarternäres aminoäthyl
SBTI: Soja-Bohnen-Trypsin-Inhibitor
SDS: Dodecylhydrogensulfat Natriumsalz.

Die Aufreinigung des Materials erfolgte bei den verschiedenen Autoren durch unterschiedliche Verfahren:

Durch Chromatographie an Benzamidin- und Heparin-Agarose und prä­ parative SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (Kiesel, W. and Davie, E. W. Biochem. 14, No. 22, 4928-4934, 1975). Durch Ionen­ austauschchromatographie an DEAE- und QAE-Sephadex und Gelfiltration an S-100 Sephadex oder ACA 44 (Bronze, G. J. and Majerus, P. W. J. Biol. Chem. 255, 1242-1247, 1980, und Methods of Enzymology 80, 229-236, 1981) bzw. durch präparative SDS-Polyacrylamid Gel­ elektrophorese (Bajaj, S. P. Rapaport, S. I. and Brown, S. F. J. Biol. Chem. 256, 253-259, 1981). Durch Chromatographie and DEAE- und Sulfopropyl-Sephadex (Rao, L. V. M. and Bejaj, S. P. Analyt. Biochem. 136, 357-361, 1984), oder durch Immunoaffini­ tätschromatographie und anschließender Gelfiltration an Sephadex- 200 (Bach, R., Oberdick, J. and Nemerson, Y., Blood 63, 393-398, 1984).

Die erwähnten Verfahren sind zeitaufwendig, umständlich, und füh­ ren nicht immer zu hochgereinigten Faktor-VII-Präparationen. Außerdem ist die Endreinigung großer Mengen an Faktor VII durch präparative SDS-Gelelektrophorese (Bejaj, S. P., Rapaport, S. I. and Brown, S. F. J. Biol. Chem. 256, 253-259, 1981) technisch nur schwer durchführbar. Ebenfalls ist die Faktor-VII-Reinigung mittels Immunoaffinitätschromatographie (Bach, R., Oberdick, J. and Nemerson, Y. Blood 63, 393-398, 1984) technisch unvorteilhaft, da bei größeren Faktor-VII-Präparationen, stets größere Mengen eines monospezifisch gegen Faktor VII gerichtetes Antiserum vorhanden sein muß. Dieses spezifisch gegen Faktor VII gerichtete Antiserum muß unter Verwendung hochgereinigten Faktor-VII-Antigens konti­ nuierlich (auch bei Verwendung von monoklonalen Antikörpern) nachproduziert werden, da erfahrungsgemäß Immunoaffinitätssäulen durch Verschmutzung und Inaktivierung nur eine relativ kurze Standzeit haben.

Es wurde überraschenderweise gefunden, daß man den Faktor VII schneller als nach den Verfahren des Standes der Technik, aus menschlichem und tierischem Plasma gewinnen kann. Gegenstand der Erfindung ist daher ein Verfahren zur schnellen Isolation von Faktor VII aus menschlichem oder tierischem Plasma unter Verwendung hochauflösender Chromatographieschritte mittels FPLC (Fast Protein Liquid Chromatography) gekennzeichnet durch die im Pa­ tentanspruch wiedergegebenen Maßnahmen.

Ausgangsmaterial für das Isolationsverfahren ist eine Faktor-VII- Präparation, welche durch Adsorption des Faktor VII an Bariumcitrat und nachfolgender Elution durch Polyäthylenglykol konzentriert und an DEAE-Sephadex und Sephadex-200 chromatographiert wird.

Hochgereinigter Faktor VII kann in kurzen Trennzeiten mit hoher Trennqualität bei Raumtemperatur durch Chromatographie an einem starken Anionenaustauscher mit hoher Kapazität auf Mono Bead- Basis (HPLC/FPLC) Mono Q HR 5/5, gefolgt von einer hochauflösenden hydrophoben Interaktionschromatographie (HPLC/FPLC) an z. B. Phenyl- bzw. Alkyl-Superose^TH(Pharmacia) oder Hi-Propyl-Wide- Pore^TH(Baker) erhalten werden. Die ermittelten Bedingungen können auch bei konventionellen Anionenaustauschern wie z. B. Q- Sepharose Fast Flow (Pharmacia) verwendet werden, wenn größere Probemengen aufgearbeitet werden sollen, keine präparative HPLC- Ionenaustauschersäule "Mono Q"^TM-Säule oder z. B. Alkyl-Phenyl- Superose^TM(Pharmacia) zur Verfügung steht und längere Trennzeiten in Kauf genommen werden können.

Beispiel

12 Liter menschlichem Plasma, welches 10 mM an EDTA, EACA, Benzamidin und PMSF war, wird 5 g Natriumcitrat und 60 mg Soja- Bohnen-Trypsin-Inhibitor zugesetzt.

Dem Überstand wird nach 15minütiger Zentrifugation bei 4500 g und 4°C langsam, innerhalb einer Stunde, 960 ml einer 1 molaren Ba­ riumchloridlösung bei 4°C zugetropft. Das sich unter Rühren bei 4°C bildende Präzipitat wird nach einer Stunde durch 15minütige Zentrifugation bei 4500 g und 4°C abzentrifugiert. Das Präzipitat wird in der Kälte mit einer Lösung, welche 2 mM an Barium­ chlorid, 200 mM an NaCl, 25 mM an Benzamidin, 1 mM an PMSF, 50 mM an Tris/HCL ist und 300 mg SBTI enthält, bei einem pH von 8,3 2mal gewaschen.

Die Elution des an Bariumcitrat adsorbierten Materials wird durch Resuspendierung des Präzipitats mit einer Lösung, welche 200 mM an EDTA, 25 mM an Benzamidin, 1 mM an PMSF, 150 mM an Natriumci­ trat, 100 mM an Tris/HCL ist und 300 mg SBTI enthält, bei einem pH von 7.4 in der Kälte erreicht.

Es wird festes Polyäthylenglykol (MG 3350) unter Rühren bis zu einer Endkonzentration von 4% (w/v) zugefügt und 45 Minuten bei 4°C gerührt. Nach einer 20minütigen Zentrifugation bei 4500 g wird der Bodensatz verworfen und dem Überstand unter Rühren festes PEG bis zu einer Endkonzentration von (35% w/v) zugefügt und nach 60minütigem Rühren bei 4°C, 20 Minuten bei 4500 g zentrifugiert. Der Bodensatz wird mit einer Lösung, welche 100 mM an Natriumphosphat, 1 mM an Benzamidin, 0.5 mM an PMSF ist, bei einem pH-Wert von 6.0 in der Kälte gelöst und gegen den selben Puffer dialysiert. Das dialysierte Material wird an DEAE-Sephadex A-50 (Säule: 4,8 cm×60 cm) adsorbiert, gewaschen und mittels eines linearen Natriumchlorid-Gradienten (150 mM-500 mM NaCl) bei einem pH-Wert von 6.0 chromatographiert.

Faktor-VII-Aktivität eluiert bei 250 mM NaCl.

Die aktiven Fraktionen werden gesammelt und mittels eines Ultra­ filters auf 10 ml konzentriert und angefüllt mit Sephadex-200 (Säure: 2,5 cm×130 cm) in einem Puffer, welcher 50 mM an Tris/HCl pH 8.0, 1 M an NaCl, 1 mM an EDTA und 1 mM an PMSF ist, chromatographiert.

Faktor VII enthaltene Proben werden vereinigt, mittels eines Ultra­ filters konzentriert und nach Dialyse gegen 20 mM Tris/HCl Puffer pH 7.5, welcher 1 mM an Benzamidin ist, an einen starken Anionenaustauscher auf Mono-Bead-Basis (FPLC Mono Q HR 5/5 Phar­ macia), gebunden und mittels eines in die FPLC-Anlage (Pharmacia) einprogrammierten linearen Natriumchloridgradienten (100 mM NaCl bis 500 mM NaCl) bei einem pH-Wert von 7.5 chromatographiert.

Faktor-VII-Aktivität eluiert bei 330-350 mM NaCl.

(Gesamtchromatographiedauer etwa 40 Minuten bei Raumtemperatur).

Aktive Fraktionen werden durch Ultrafiltration, konzentriert gegen einen 50-mM-Natriumphosphatpuffer pH 7.0, welche 1.2 M an Ammo­ niumsulfat und 1 mM an Benzamidin ist, dialysiert und an eine FPLC Phenyl-Superose Säule HR 5/5 (Pharmacia) adsorbiert. Chromatographiert wurde in Natriumphosphatpuffer mittels eines programmierten linearen Ammoniumsulfat/Äthylenglykolgradienten.

Anfangsbedingungen, Puffer A:

50 mM Natriumphosphat pH 7.0
1.2 M Ammoniumsulfat
1 mM Benzamidin

Endbedingungen, Puffer B:

50 mM Natriumphosphat pH 7.0
0.0 M Ammoniumsulfat/1% v/v Äthylenglykol
1 mM Benzamidin.

Faktor-VII-Aktivität eluiert bei 100% Puffer B (Gesamtchromato­ graphiedauer etwa 40 Minuten bei Raumtemperatur).

Während des gesamten Faktor-VII-Reinigungsverfahrens wurde nach jedem Reinigungsschritt die Aktivität des erhaltenen Materials durch einen einstufigen Gerinnungstest mittels Faktor-VII-Man­ gelplasma bestimmt, sowie die chemische Reinheit des Materials durch analytische SDS-Gelelektrophorese mit Silberfärbung der Gele verfolgt.

Das bei der hydrophoben Interaktionschromatographie eluierte Material, welches Faktor-VII-Aktivität besitzt, zeigt nur eine Proteinbande mit einem apparenten Molekulargewicht von (50 000) Dalton unter nicht reduzierenden Bedingungen in einem mit Silber gefärbten SDS-Polyacrylamidgel.

Claims (5)

1. Verfahren zur Gewinnung einer hochreinen Faktor-VII-Präpara­ tion aus einer wäßrigen Lösung dadurch gekennzeichnet, daß das zuvor an Bariumcitrat ad­ sorbierte, gefällte und eluierte Faktor VII enthaltene Material zweimal durch einen Polyäther gefällt an einen Anionen­ austauscher (DEAE) chromatographiert durch Gelfiltration und durch zwei nachfolgende hochauflösende HPLC/FPLC-Chromatogra­ phie-Verfahren bei Raumtemperatur präpariert wird.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Polyäther Äthylenglykol ist und Äthylenglykol im festen Zustand dem Gemisch in einer Endkon­ zentration von 4% (w/v), bei der ersten Fällung und in einer Endkonzentration von 35% (w/v) dem Gemisch bei der zweiten Fällung zugefügt wird.

3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das durch Anionenaustauscher-Chromato­ graphie (DEAE) angereicherte Material durch Gelfiltration (z. B. an Sephadex-200^TM, Pharmacia oder ähnlichem Gelfiltrations­ material, vorzugsweise jedoch an Superose^TM, Pharmacia) chro­ matographiert wird.

4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das durch Gelfiltration nach Anspruch 3 präparierte Material durch hochauflösende HPLC/FPLC-Chromato­ graphie an einem Anionenaustauscher (z. B. an SAX^TM-Baker vor­ zugsweise jedoch an einem Ionenaustauscher speziell entwickelt für die Fast Protein Liquid Chromatographie z. B. FPLC-Mono Q HR^TM, Pharmacia) chromatographiert wird.

5. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das durch Anionenaustauscher-Chromatographie nach Anspruch 4 prä­ parierte Material durch eine hochauflösende HPLC/FPLC-hydro­ phobe Interaktionschromatographie (z. B. an Hi-Propyl Wide- Pore^TM, Baker an Alkyl-Superose^TM Pharmacia, vorzugsweise je­ doch an FPLC-Phenyl-Superose^TM Pharmacia) chromatographiert wird.