DE3229132A1

DE3229132A1 - Reinigung von rinder-thrombin

Info

Publication number: DE3229132A1
Application number: DE19823229132
Authority: DE
Inventors: Frank J. 60468 Peotone Ill. Mannuzza; Joseph G. 60915 Bradley Ill. Montalto
Original assignee: Miles Laboratories Inc
Current assignee: Bayer Corp
Priority date: 1981-08-12
Filing date: 1982-08-04
Publication date: 1983-03-03
Also published as: JPS5944286B2; JPS5852226A; US4380511A

Description

Reinigung von Rinder-Thronbin

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Entfernung pyrogenen Materials aus Rinder-Thrccbin.
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Pyrogene können unerwünschte Reaktionen in menschlichen Körper hervorrufen, darunter Fieber, Schüttelfrost, Schmerzen im Rücken und in den Beinen sowie Unwohlsein. Wegen dieser unerwünschten physiologischen Reaktionen,
die durch die Anwesenheit von Pyrogenen in Tieren verursacht werden, müssen pharmazeutische Präparate relativ frei von Pyrogenen sein.

Sämtliche biologischen Produkte für die parenterale
Verbreichung zu Zwecken der Verhütung, Diagnose oder Behandlung von Erkrankungen beim Menschen nüssen besondere Tests erfüllen, darunter auch eine Prüfung auf die Anwesenheit von Pyrogenen. Der Pyrogen-Test, wie er in der U.S.-Pharmakopoe beschrieben ist, ist ein biologischer Test, bei dem eine Fieber-Reaktion bei Kaninchen als Kriterium dient. Da die Verwendung von Pyrogene enthaltendem Thrombin bei topischer Anwendung zur Erzeugung lokalisierter Gerinnung Pyrogene in die Körperflüssigkeits-Systeme oder den Blutkreislauf einführen
kann, müssen solche Thrombin-Präparate den gleichen Anforderungen in bezug auf Pyrogene wie parenterale pharmazeutische Präparate genügen.

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Remington's Pharmaceutical Sciences, 14. Auflage, S. 1524-1525 (1970) , hebt die Schwierigkeit der Entfernung von Pyrogenen aus pharmazeutischen Präparaten hervor. Der Artikel gibt an, daß die bevorzugte Arbeitsweise
darin besteht, die Einschleppung von Pyrogenen in parenterale Präparate eher zu verhindern als ihre Entfernung zu versuchen, eine Aufgabe, die, der Angabe entsprechend, "im Grunde genommen unmöglich ist".

J.Pharm.Pharmac. _30.' 198 (1978), gibt an, daß zu den bisher vorgeschlagenen Methoden zur Entfernung von Pyrogenen aus pharmazeutischen Verabreichungsformen die Umkristallisation, sorgfältige Behandlung in Gegenwart von verdünntem Alkali, verdünnter Säure oder verdünnten Oxidationsmitteln, Adsorption an Aktivkohle, Asbest oder anderen Stoffen, Anionenaustauschchromatographie oder Kieselsäure-Dünnschichtchromatographie zählen. Die Autoren geben zu bedenken, daß die vorerwähnten Methoden für den Einsatz im Laboratorium zur Bewältigung

kleinerer Mengen wohl von Wert seien, jedoch keine bestmögliche Entfernung von Pyrogenen aus einem unbeständigen Arzneimittel im Maßstab vieler Liter zu bewirken imstande sind. Die Autoren entfernten die Pyrogene durch Molekularfiltration, die jedoch eine aufwendige Arbeitsweise darstellt.

Nach dem Stand der Technik gibt es zahlreiche Methoden der Reinigung von Blutfaktoren, darunter dem Faktor II (Prothrombin) , dem Faktor Ha (Thrombin) und dem Faktor X. Die zwei wichtigsten Methoden sind die Ionenaustauschchromatographie und die Affinitätschromatographie.

Beispielsweise beschreibt J.Biol.Chem. 243, 112-117

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(1968), die Reinigung von Thrombin mittels einer stufenweisen chromatographischen Arbeitsweise an Diethylaminoethyl-(DEAE) -cellulose zur Entfernung von Plasminogen und Plasmin. PEBS Letters 5_1 (1) , 191-194 (1975) beschreibt die Reinigung von Rinder-Trypsin und -Thrombin durch Affinitätschromatographie.

Die wichtigsten Angaben zum Stand der Technik bezüglich der Reinigung von Blutfaktoren scheinen in Biochenica
et Biophysica Acta 222, 691-695 (1970), und 434. 199-208 (1976) , vorzuliegen.

Der Artikel von 1970 beschreibt eine Methode- zur Reinigung des menschlichen Blutgerinnungsfaktors X. Da Prothrombin (Faktor II) in Thrombin (Faktor Ha) mittels Katalyse durch den Faktor Xa umgewandelt werden kann, beschäftigten sich die Autoren damit, den Faktor X frei von anderen Blutgerinnungsfaktoren, darunter auch Thrombin, zu erhalten. Die Methode umfaßte die Komplexierung eines Komplexes aus blauem Farbstoff-Polysaccharid und Blutgerinnungsfaktoren und Chromatographieren. Die Methode beruht auf der von der Ionenstärke abhängigen Assoziation der Gerinnungsfaktoren mit den blauen Farbstoff-Anteilen des Komplexes und nachfolgenden Gelfiltrationen. Bei niedrigen Ionenstärken wurden die Faktoren II und IX aus dem Hohlraumvolumen eluiert, was zeigt, daß sie mit dem blauen Farbstoff-Polysaccharid komplexiert waren. Die Faktoren VII und X wurden aus dem eingeschlossenen Volumen eluiert, was zeigt,

daß sie nicht mit dem blauen Farbstoff-Polysaccharid-Komplex komplexiert waren. Die Struktur des verwendeten blauen Farbstoffs wurde in J. Chromatography 69, 201-214 (1972) , dahingehend identifiziert, daß es sich um eine 4-Phenylamino-l-aminoanthrachinon-Struktur handelte.

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Der Artikel von 1976 beschreibt die Reinigung der Faktoren II, VII, IX und X aus menschlichem Plasma unter Verwendung des gleichen blauen Anthrachinon-Farbstoffs, der mit einem Polysaccharid-Polymeren gekuppelt ist..
Die Elution mit Acetatpuffern trennte den Faktor X von den Faktoren II, VII und IX. Die Autoren geben an, daß eine Fraktion des an die Säule gebundenen Materials Faktor Ha- (Thrombin-) -Wirksamkeit zeigte, was auf eine mögliche Aktivierung des Faktors II zu Thrombin
hindeutete.

Sowohl der Artikel von 1970 als auch der Artikel von 1976 beschreiben die Reinigung des Faktors X zur Entfernung anderer, als Verunreinigungen vorliegender Gerinnungsfaktoren, z.B. der Faktoren II, VII und IX. In beiden Artikeln wird jedoch die Entfernung von Pyrogenen aus Thrombin weder nahegelegt noch offenbart.

Es besteht Bedarf an einer einfachen und wirksamen Methode zur Entfernung von Pyrogenen aus Bluteiweiß-Produkten, die sich leicht auf ein Verfahren im Maßstab vieler Liter übertragen läßt.

Die vorliegende Erfindung ist auf ein Verfahren zur
Entfernung von Pyrogenen aus Rinder-Thrombin gerichtet. Das Verfahren umfaßt die Stufen der Bildung eines Komplexes aus einem blauen Anthrachinon-Farbstoff der nachstehenden Struktur
NH,

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in der R- und R₂ für Wasserstoff oder SO₃H und R- für Cl oder OH stehen, und einem Dextran, das mit Epichlorhydrin unter Bildung eines Polysaccharids vernetzt wurde, und das Herbeiführen eines Gleichgewichts des Komplexes mit einer Salzlösung niedriger Ionenstärke. Das Pyrogene enthaltende Rinder-Thrombin wird in Berührung mit dem Komplex gebracht, und das Thrombin wird zur Entfernung der Pyrogene mit einer Salzlösung niedriger Ionenstärke gewaschen. Das Pyrogen-freie Rir.der-Thrombin wird dann isoliert, beispielsweise durch Desorption mit einer Salzlösung hoher Ionenstärke.

Das unreine, Pyrogene enthaltende Thronbin-Material, das bei der vorliegenden Erfindung eingesetzt wird,

kann aus Rinder-Plasma, das den Faktor II (Prothrombin) enthält, durch Umwandlung des Faktors II in Thrombin erzeugt werden. In der Literatur sind verschiedene Verfahren zur Gewinnung von Thrombin beschrieben. Beispielsweise kann Prothrombin aus Konzentraten des Faktors IX hergestellt werden /.""vgl. J.Biol.Chem. 248, 7729-7741 (1973)_/. Das Prothrombin kann an Bariumcitrat adsorbiert, mit Ethylendiamintetraessigsäure eluiert, mit Ammoniumsulfat fraktioniert und mittels Chromatographie an DEAE-Cellulose weiter gereinigt werden. Das Prothrombin kann dann mit dem Rinder-Faktor Xa aktiviert werden, wie in J.Biol.Chem. 250, 8897-8906 (1975) beschrieben ist-.

Das zur Gewinnung des thrombinhaltigen Ausgangsmaterials verwendete Verfahren wird im Folgenden beschrieben.

Ein nicht-steriler Prothrombin-Komplex wurde aus Rinder-Plasma mit Hilfe von Ionenaustausch-Verfahren frak-

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tioniert. Fibrinogen und andere Verunreinigungen wurden durch Ausfällung entfernt, und das Prothrombin wurde mit Rinder-Thromboplastin und Ca -Ionen aktiviert.

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Arch.Biochem. 5_, 265 (1944) , beschreibt die Verwendung von Thromboplastin und Calcium-, Strontium-, Magnesiumoder Barium-Salzen. J.Biol.Chem. 246, 6106-6114 (1971), beschreibt die Aktivierung des Prothrombins mit Natriumcitrat und die nachfolgende Dialyse.

Das Thrombin-Material wurde dann einer Hochgeschwindigkeits-Zentrifugierung unterworfen, um den Komplex zu klären, und anschließend einer makroporösen und einer mikroporösen Membranfiltration unterworfen. Wie bereits oben erwähnt umfaßt der Stand der Technik verschiedene Lehren in bezug auf die Erzeugung von Thrombin. Diese Methoden können zur Gewinnung des in der vorliegenden Erfindung verwendeten Ausgangsmaterials angewandt werden. Es ist dieses Pyrogene enthaltende Thrombin, das
bei dem Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung eingesetzt wird.

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Ein blauer Anthrachinon-Farbstoff mit der Struktur

0 NH

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in der R. und R- für· Wasserstoff oder SO-H und R, für Cl oder OH stehen, wurde an ein Dextran, das mit Epi-

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chlorhydrin unter Bildung eines dreidimensionalen PoIysaccharid-Netzwerks vernetzt wurde, gebunden. Eine geeignete blaue Farbstoff-Polysaccharid-Matrix, in der R-Cl ist, ist im Handel bei der Firma Pharmacia, Uppsala, Schweden, unter der Handelsbezeichnung Blue Sepharose CL6B erhältlich. Ein geeigneter blauer Farbstoff, in dem R- OH ist, ist im Handel bei der Firma Ciba AG, Basel, Schweiz, unter der Handelsbezeichnung Cibracon Blau F3G-A erhältlich. Geeignete Polysaccharide sind im ' Handel bei der Firma Pharmacia unter den Handelsbe- :'-: "hnunnen Sephadex Typ G erhältlich.

.■ : Farbstoff wurde an das Polysaccharid mit Hilfe von ■ --.-."fahren gebunden, die in der Fachwelt wohlbekannt

sind /."vgl. J.Chromatography 6J3, 209-214 (1972)_7. Der Farbstoff und das Polysaccharid können in wäßriger Lösung zusammengemischt werden, und ein Natrium-Salz kann hinzugegeben werden. Das Rinder-Thrombin von geringer Reinheit, das wie im Vorstehenden beschrieben erhalten wurde, wurde dann auf eine Säule aufgebracht, die aus dem blauen Farbstoff-Polysaccharid-Komplex im Gleichgewicht mit einer Salz-LÖsung niederer Ionenstärke, z.B. 0,10 bis 0,20 M NaCl, bestand. Das Thrombin wird mit dem Komplex eine Zeit in Berührung gebrach't, die aus-

reicht, um eine Bindung des Thrombins an den Komplex zu ermöglichen. Bei der Berührung erfolgt die Bindung, und das Waschen mit der die Gleichgewichtseinstellung bewirkenden Lösung wird unmittelbar nach der Berührung durchgeführt. Das Thrombin wurde dann mit der die

Gleichgewichtseinstellung bewirkenden Lösung gewaschen, und die Pyrogene wurden mit der Waschlösung entfernt. Das gereinigte Thrombin wurde dann von der Säule durch Desorption derselben mit einer Lösung hoher Ionenstärke, z.B. 0,4 bis 2,0 M NaCl, entfernt.

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Beispiel 1

Eine Lösung von 2 g eines blauen Anthrachinon-Farbstoffs mit der vorstehend dargestellten Struktur, in
der R.. für OH steht, in 60 ml Wasser wurde tropfenweise unter kräftigem Rühren bei einer Temperatur von 60⁰C zu einer Suspension von 10 g Sephadex G-75 in 350 ml Wasser hinzugefügt, und anschließend wurde 30 min gerührt. Ein Anteil von 45 g NaCl wurde zugesetzt, und das Rtih-

ren wurde 1 h fortgesetzt. Die Mischung wurde dann auf 8O⁰C erhitzt, mit 4 g Na₂CO₃ behandelt und weiter lh bei dieser Temperatur gerührt. Nach dem Abkühlen auf Raumtemperatur wurde das Gel durch Absaugen über einen Büchner-Trichter filtriert und mit Wasser gewaschen.

Das Gel wurde in eine Säule (10 cm) gepackt .und mit einer 0,2 M NaCl-Lösung bei einem pH im Bereich von etwa 6 bis 8 ins Gleichgewicht gesetzt.

Ein wie weiter oben beschrieben hergestelltes, pyrogenes Material enthaltendes Thrombin-Präparat mit einer Anfangs-Reinheit von etwa 3 % Thrombin wurde dann auf die Gel-Säule aufgebracht. Das Gel wurde dann zur Entfernung der Pyrogene mit der die Gleichgewichtseinstellung bewirkenden Lösung niedriger Ionenstärke gewaschen. Die Anwesenheit des pyrogenen Materials in der durch die Kolonne hindurchtretenden Waschflüssigkeit wurde mittels eines auf einem in Biochemica et Biophysica Acta 261, 284-289 (1972), beschriebenen Test beruhenden, als "Limulus Amebocyte Lysate" bezeichneten Verfahrens geprüft.

Nachdem der Test auf die Anwesenheit pyrogenen Materials in der Lösung negativ verlaufen war, wurde das

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Thrombin von der Gel-Säule dadurch desorbiert, daß diese mit einer Salzlösung hoher Ionenstärke, d.h. einer 2 M NaCl-Lösung in Berührung gebracht wurde. Das Thrombin hatte eine Reinheit von etwa 70 %. Das von der GeI-Säule desorbierte Thrombin wurde dann gegen 0,15 M NaCl dialysiert, durch Filtration sterilisiert und gefriergetrocknet.

Das erhaltene Thrombin wurde mittels des im Vorstehenden erwähnten Pyrogen-Kaninchen-Tests geprüft; hierbei wurde festgestellt, daß das Thronbin pyrogen-frei und für die Verwendung als tcpisch verabreichtes Blutgerinnungsmittel geeignet ist.

Mit dem Thrombin assoziiert können auch Enzyme und Pro-■ enzyme, z.B. Plasmin und Plasminogen, vorliegen. Diese Substanzen sind an dem Gerinnungsvorgang beteiligt, speziell an der Lyse von Thromben. Vorläufige Tests mit dem wie oben beschrieben hergestellten Thrombin zeigen, daß die angegebene Verfahrensweise Plasmin und Plasminogen aus dem Rinder-Thrombin entfernt.

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Claims

Patentansprüche ;

1. Verfahren zur Entfernung pyrogenen Materials aus Pyro-

gene enthaltendem Rinder-Thrombin, das die folgenden 5. Stufen umfaßt:

Bildung eines Komplexes aus einem Farbstoff der r.achsteher.den Struktur

in der R₁ und R„ für Wasserstoff oder SO-H und R-für Cl oder OH stehen, und einem Dextran, das mit Epichlorhydrin unter Bildung eines dreidimensionalen Polysaccharid-Netzwerks vernetzt wurde; Herbeiführen eines Gleichgewichts des Komplexes mit einer Salzlösung niedriger Ionenstärke; Zusammenbringen des Komplexes mit dem Pyrogene enthaltenden Rinder-Thrombin;

Waschen des Thrombins zur Entfernung' der Pyrogene mit einer Salzlösung niedriger Ionenstärke und Isolierung des von Pyrogenen freien Rinder-Thrombins.

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2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die zur Herbeiführung des Gleichgewichts mit dem Komplex verwendete Lösung niedriger Ionenstärke eine Ionenstärke von nicht mehr als 0,20 besitzt.

3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die zum Waschen des Thrombins verwendete Salzlösung niedriger Ionenstärke die gleiche Salzlösung wie diejenige ist, die zur Herbeiführung des Gleichgewichts mit dem Farbstoff-Polysaccharid-Komplex verwendet wurde.

4. Verfahren nach Anspruch I₁ dadurch gekennzeichnet, daß die Isolierung des von Pyrogenen freien Rinder-Thrcrr.-bins in der Weise durchgeführt wird, daß das Thrombin

mit einer Salzlösung, deren Ionenstärke ausreicht, um das Thrombin von dem Komplex zu entfernen, behandelt und anschließend das von Pyrogenen freie Rinder-Thrombin gesammelt wird.

5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß die zur Entfernung des Thrombins von dem Komplex verwendete Salzlösung eine Ionenstärke von nicht weniger als 0,4 besitzt.

6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß die Salzlösung niedriger Ionenstärke und die zur Entfernung des Thrombins verwendete Salzlösung beide NaCl enthalten.

7. Pyrogen-freies Rinder-Thrombin, hergestellt durch die Schritte der

Bildung eines Komplexes aus Farbstoff der nachstehenden Struktur

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O NH

in der R₁ und R_ für Wasserstoff oder SO₁-H und R, für Cl oder OH stehen, und einem Dextran, das mit Epichlorhydrin unter Bildung eines dreidimensionalen Polysaccharid-Netzwerks vernetzt wurde; Herbeiführen eines Gleichgewichts des Komplexes mit einer Salzlösung niedriger Ionenstärke; Zusammenbringen des Komplexes mit dem Pyrogene enthaltenden Rinder-Thrombin;

Waschen des Thrombins zur Entfernung der Pyrogene mit einer Salzlösung niedriger Ionenstärke und Isolierung des von Pyrogenen freien Rinder-Thrombins.

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