DE3719524A1

DE3719524A1 - Verfahren zur messung der konzentration von substanzen

Info

Publication number: DE3719524A1
Application number: DE19873719524
Authority: DE
Inventors: Akihiro Namba
Original assignee: Olympus Optical Co Ltd
Current assignee: Olympus Corp
Priority date: 1986-06-11
Filing date: 1987-06-11
Publication date: 1987-12-23
Also published as: JPS62291547A; US4828388A; DE3719524C2

Description

Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Messung der Konzentration von Substanzen, die in einer Probe enthalten sind, bei dem von einer spezifischen Reaktion zwischen den Substanzen in der Probe und mit diesen spezifisch reaktionsfähigen Substanzen Gebrauch gemacht wird.

Eine solche spezifische Reaktion kann eine immunologische Reaktion zwischen Antigenen und Antikörpern sein oder eine spezifische Bindungsreaktion z. B. zwischen Biotin und Avidin.

Es gibt bereits ein Verfahren zum Bestimmen der Konzentration von Substanzen, die in einer Probe enthalten sind, unter Verwendung des Leistungs-Dichtespektrums der Intensitätsschwankungen von gestreutem Licht. Dieses Verfahren ist in der JP-OS 61-28 866 und der entsprechenden DE-OS 35 25 719 beschrieben. Bei diesem Verfahren wird zur Messung der Konzentration von dem Umstand Gebrauch gemacht, daß die Konzentration von Antigen- oder Antikörpersubstanzen in einer engen Beziehung steht zur Kippfrequenz des Leistungs-Dichtespektrums der Intensitätsschwankungen der aus einer Antigen-Antikörper (enthaltenden) Reaktionsflüssigkeit gestreuten Strahlung. Das heißt, daß bei diesem Verfahren nach der Ermittlung des Leistungs-Dichtespektrums dessen Kippfrequenz ermittelt und schließlich aus der Kippfrequenz die Konzentration ermittelt bzw. bestimmt wird.

Bei diesem bekannten Verfahren muß - damit die Konzentration von Substanzen genau gemessen wird - die Kippfrequenz genau ermittelt werden. In der Praxis ist es jedoch schwierig, die Kippfrequenz aus einem sehr breiten Frequenzbereich zu bestimmen.

Aufgabe der Erfindung ist es, ein Verfahren zur genauen Bestimmung der Konzentration von in einer Probe enthaltenen Substanzen zu entwickeln, bei dem von dem Leistungs-Dichtespektrum der Intensitätsschwankungen des gestreuten Lichtes Gebrauch gemacht wird, ohne daß die Kippfrequenz ermittelt bzw. bestimmt werden muß.

Erfindungsgemäß wird diese Aufgabe gelöst mit Hilfe eines Verfahrens zur Messung der Konzentration von Substanzen, die in einer Probe enthalten sind, das folgende Stufen umfaßt:

Richten einer elektromagnetischen Strahlung auf Komplexe, die durch eine spezifische Reaktion zwischen in der zu messenden Probe enthaltenen Substanzen und mit diesen Substanzen spezifisch reagierenden Substanzen erzeugt worden sind,
Nachweis der durch die Komplexe gestreuten Strahlung, um ein photoelektrisch umgewandeltes Ausgangssignal zu erhalten,
Ermitteln des Leistungs-Dichtespektrums der gestreuten Strahlung aus diesem Ausgangssignal,
Ermitteln des Weißpegels oder Weißpegelverhältnisses des Leistungs- Dichtespektrums und
Ermitteln der Konzentration der in der Probe enthaltenen Substanzen auf der Basis des ermittelten Weißpegels oder Weißpegelverhältnisses.

Es wurde experimentell gefunden, daß der Weißpegel oder das Weißpegelverhältnis des Leistungs-Dichtespektrums bzw. Dichtespektrums der von den Komplexen gestreuten Strahlung (bzw. des gestreuten Lichtes) in einer engen Beziehung steht zur Konzentration der Substanzen, die in der zu messenden Probe enthalten sind. Infolgedessen ist es möglich, durch Ermitteln des Weißpegels oder Weißpegelverhältnisses des Leistungs-Dichtespektrums der Intensitätsschwankung der von den Komplexen gestreuten Strahlung die Konzentration der spezifischen Substanzen in einer Probe zu bestimmen, ohne daß die Kippfrequenz ermittelt werden muß.

In der vorliegenden Beschreibung werden die in der Probe enthaltenen Substanzen auch als Probensubstanzen und die mit diesen Probensubstanzen spezifisch reaktionsfähigen Substanzen auch als Reagenssubstanzen bezeichnet. Es gibt zahlreiche Kombinationen von Probensubstanzen und Reagenssubstanzen, beispielsweise Antigen und Antikörper, Biotin und Avidin, IgG (Immunoglobulin G) und Protein A, und andere Proteinsubstanzen bzw. Eiweißsubstanzen, die miteinander spezifisch reagieren. Weiterhin können die Reagenssubstanzen an unlösliche Träger, wie Latexteilchen, gebunden sein.

Die Erfindung wird anhand der beiliegenden Zeichnungen näher erläutert.

Fig. 1 ist eine schematische Ansicht einer Ausführungsform einer Vorrichtung für die Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens;

Fig. 2 ist eine schematische Ansicht, die den Aufbau des in Fig. 1 gezeigten Kollimators darstellt;

Fig. 3 ist eine schematische Ansicht, die eine andere Ausführungsform (eines Teils) der Vorrichtung zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens zeigt;

Fig. 4 ist ein Diagramm, das das Leistungs-Dichtespektrum in Abhängigkeit von der Lichtstreuung von Latexteilchen mit einem mittleren Durchmesser von 0,212 µm zeigt;

Fig. 5 ist ein Fließbild zur Erläuterung des Verfahrens für die Ermittlung bzw. Bestimmung des Weißpegels des Leistungs-Dichtespektrums;

Fig. 6A, 6B und 6C sind graphische Darstellungen, die ein Verfahren zum Glätten der Kurve für das Leistungs-Dichtespektrum erläutern;

Fig. 7 zeigt die Beziehung zwischen der IgE-Konzentration und dem Weißpegel;

Fig. 8 zeigt die Beziehung zwischen der AFP-Konzentration und dem Weißpegel;

Fig. 9 zeigt die Beziehung zwischen der CRP-Konzentration und dem Weißpegel und

Fig. 10 zeigt schematisch eine weitere Ausführungsform der Vorrichtung zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens.

Bei der in Fig. 1 gezeigten Ausführungsform der Vorrichtung zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens zum Messen der Konzentration von Substanzen kann die Lichtquelle kohärentes Licht oder inkohärentes Licht abgeben. In der gezeigten Ausführungsform wird eine Lichtquelle zur Abgabe von kohärentem Licht gezeigt, die ein He/Ne-Gaslaser (1) ist, die/der einen Laserstrahl (Wellenlänge 632,8 nm) abgibt. Der von der Lichtquelle (1) abgegebene Laserlichtstrahl (2) wird durch einen Halbspiegel (3) in zwei Lichtströme bzw. -strahlen (4) und (5) geteilt. Der eine Lichtstrahl (4) wird mit Hilfe einer Sammellinse (6) auf eine Zelle (7) aus transparentem Material gerichtet. Der andere Lichtstrahl (5) wird auf einen Photodetektor (8), beispielsweise eine Silicium-Photodiode, gerichtet. Dann gibt der Photodetektor (8) ein Monitorsignal ab, das die Intensitätsschwankung des von der Lichtquelle (1) abgegebenen Lichtstrahls darstellt.

Die Zelle (7) enthält eine Testflüssigkeit, die ein Gemisch ist aus einer Probe, in der Substanzen enthalten sind, deren Konzentration bestimmt bzw. gemessen werden soll, sowie von Reagenssubstanzen, die mit den Probensubstanzen spezifisch reagieren. Bei dieser Ausführungsform sind die Reagenssubstanzen auf der Außenfläche von Teilchen (9) immobilisiert. Infolgedessen findet in der Zelle (7) die spezifische Reaktion statt, und es werden Anziehungskräfte zwischen den Teilchen (9) erzeugt. Dann werden die Teilchen (9) miteinander agglutiniert unter Bildung von Aggregaten oder Komplexen und die Brown'sche Bewegung der Komplexe verändert sich entsprechend der Größe und der Form der Komplexe. Das von den Teilchen (9) und ihren Aggregaten in der Zelle (7) gestreute Licht wird so geführt, daß es über einen Kollimator (10) mit einem Paar (optischer) Blenden einen Photodetektor (11) trifft. Der Photodetektor (11) besteht aus einem hochempfindlichen Photoverstärker.

Das Ausgangs-Monitorsignal aus dem Photodetektor (8) wird über einen geräusch- bzw. rauscharmen Verstärker (13) an die Datenverarbeitungsvorrichtung (14) abgegeben, die auch das Ausgangssignal aus dem Photodetektor (11) über den rauscharmen Verstärker (15) und das Tiefpaßfilter (L.P.F.) (16) aufnimmt. Die Datenverarbeitungsvorrichtung (14) umfaßt einen Analog-Digital(A/D)- Umwandler (17), einen Schnell-Fourier-Transformer (F.F.T.) (18) und einen Rechner (19) und verarbeitet die Signale, wie weiter unten näher erläutert, um die Konzentration der Probensubstanzen zu ermitteln bzw. zu bestimmen. Die gemessene Konzentration wird durch den Display bzw. die Anzeigevorrichtung (20) angezeigt.

Das Ausgangssignal aus dem Photodetektor (11) zeigt die Intensität des gestreuten Lichtes an, das aus der Meßzelle (7) austritt, und wird durch das vom Photodetektor (8) abgegebene Monitorsignal normiert und über einen kurzen Zeitraum gemittelt. Dann bzw. dadurch kann jede Schwankung auf Grund der Änderung der Intensität des Laserlichtstroms (2), der von der Lichtquelle (1) abgegeben wird, ausgeschaltet werden. Anschließend wird das Leistungs-Dichtespektrum der Intensitätsschwankung des gestreuten Lichtes ermittelt und die Konzentration der Probensubstanzen mit Hilfe des Leistungs-Dichtespektrums gemessen.

Fig. 2 zeigt schematisch die Konstruktion des Kollimators (10) der Fig. 1 im einzelnen. Der Kollimator (10) besteht aus einem Rohr (10 a) aus opakem Material, um den Einfluß von Außenlicht auszuschalten. Außerdem ist die Innenseite des Rohres (10 a) mit einem nichtreflektierenden Überzug versehen. An beiden Enden des Rohres (10 a) befinden sich Blenden (10 b und 10 c). Wenn die Radien der Blenden (10 b und 10 c) mit a₁ und a₂ angegeben werden, der Abstand zwischen den Blenden L, der Brechungsindex des Mediums innerhalb des Rohres (10 a) n und die Wellenlänge des Lichtes λ ist, wird der Kollimator (10) so ausgelegt, daß er folgender Gleichung (1) entspricht:

Erfindungsgemäß wird das Leistungs-Dichtespektrum der Intensitätsschwankungen des gestreuten Lichtes ermittelt bzw. bestimmt. Das Leistungs-Dichtespektrum setzt sich zusammen aus einem Schwankungsstern auf Grund der Lichtinterferenz, die von Teilchen auf Grund ihrer willkürlichen Bewegung verursacht wird, und aus einem Schwankungssstern, der durch die Zahl der Teilchen bedingt ist, die in das streuende Volumen eintreten und daraus austreten. Der erste Schwankungsstern, der auf der Interferenz beruht, wird als räumliche Schwankung eines Punktmusters beobachtet. Wird diese räumliche Schwankung von einem Photodetektor mit einem breiten Lichtaufnahmebereich ermittelt, so erfolgt eine räumliche Mittelung über die lichtaufnehmende Fläche, und es kann daher nur eine geringe Schwankung ermittelt bzw. nachgewiesen werden. Bei der vorliegenden Ausführungsform ist das Blickfeld des Photodetektors (11) durch den Kollimator (10) mit den Blenden begrenzt, so daß die Schwankung mit sehr hoher Empfindlichkeit nachgewiesen werden kann. Die obige Gleichung (1) kann erfüllt werden durch Verwendung eines Kollimators (10) mit Blenden, die einen Durchmesser von 0,3 mm, die 30 cm voneinanader entfernt sind, wenn das Medium im Kollimator Luft mit einem Brechungsindex n = 1 ist.

Bei der in Fig. 1 gezeigten Ausführungsform trifft der Lichtstrahl (4) auf die Zelle (7) senkrecht zur optischen Achse des Kollimators (10) auf, so daß der auftreffende Lichtstrahl nicht direkt in den Photodetektor (11) geführt wird. Dies wird als homodyne Methode bezeichnet. Erfindungsgemäß kann auch die heterodyne Methode angewandt werden, bei der ein Teil des auffallenden Lichtstroms (direkt) auf den Photodetektor (11) auftrifft. Erfindungsgemäß kann ein Neigungswinkel R zwischen dem auftreffenden Lichtstrahl (4) und der optischen Achse des Kollimators (10), wie in Fig. 3 gezeigt, nach Belieben festgelegt werden. Bei der in Fig. 1 gezeigten homodynen Anordnung ist das Ausgangssignal aus dem Photodetektor (11) proportional dem Mittelwert des Quadrates , wobei die Intensität des elektrischen Feldes des gestreuten Lichtes ist. Bei der heterodynen Anordnung, bei der der in Fig. 3 angegebene Neigungswinkel R null ist, wird das Ausgangssignal aus dem Photodetektor (11) folgendermaßen angegeben:

wobei die Intensität des elektrischen Feldes des direkt einfallenden bzw. auftreffenden Lichtes ist. schwankt überhaupt nicht oder nur langsam im Vergleich mit der Schwankung des gestreuten Lichtes, und die letzten beiden Glieder der Gleichung schwanken. Da die Intensität des gestreuten Lichtes sehr viel schwächer ist als das auftreffende Licht, ist

Dies heißt, daß sogar bei der heterodynen Methode das Ausgangssignal im wesentlichen proportional zur Amplitude des elektrischen Feldes des gestreuten Lichtes ermittelt werden kann.

Der Kollimator (10) ist nicht auf die oben erläuterte Ausführungsform beschränkt, sondern kann verschiedene Formen haben, sofern das Blickfeld des Photodetektors (11) kleiner gehalten werden kann als ein Punktmuster.

Im folgenden wird die Verarbeitung des Signals erläutert.

Das Ausgangssignal aus dem Photodetektor (11) wird über den Tiefpaßfilter (16) in die Datenverarbeitungsvorrichtung (14) eingegeben und darin zusammen mit dem Ausgangs-Monitorsignal aus dem Photodetektor (8) verarbeitet, um das Leistungs-Dichtespektrum der Intensitätsschwankung des gestreuten Lichtes zu erhalten. Das Leistungs-Dichtespektrum S (f) eines stationären stochastischen Prozesses x (t) kann folgendermaßen angegeben werden:

Auf der Basis dieser Gleichung (2) wird die Fourier-Transformation durchgeführt, um das Leistungs-Dichtespektrum zu berechnen. Das Ausgangssignal aus dem Photodetektor (11) wird durch den rauscharmen Verstärker (15) so verstärkt, daß Signalwerte einen weiten Bereich von Analog-Digital-Umwandlungspegeln abdecken können und derart gequantelte Daten mit Hilfe eines Mikroprozessors berechnet werden, um das Leistungs-Dichtespektrum zu ermitteln bzw. zu bestimmen. Aus dem Leistungs-Dichtespektrum wird der Zustand der immunologischen Reaktion gemessen, wie nachfolgend näher erläutert, und zahlenmäßig auf der Displayeinheit (20) angezeigt.

Fig. 4 ist eine graphische Darstellung, die das Leistungs- Dichtespektrum S (f) zeigt, das mit Hilfe der in Fig. 1 gezeigten Vorrichtung ermittelt wird, wenn die Teilchen (9) in der Zelle (7) runde Latexteilchen mit einem mittleren Durchmesser von 0,212 µm sind. Die Konzentration der Latexteilchen in der Testflüssigkeit beträgt 0,23 Gew.-%. In einem Bereich niederer Frequenz wird das Leistungs-Dichtespektrum weiß und in einem Bereich hoher Frequenz wird das Leistungs-Dichtespektrum kleiner bzw. nimmt ab, in Übereinstimmung mit der Frequenzzunahme.

Nachfolgend wird ein Verfahren zum Ermitteln des Weißpegels des Leistungs-Dichtespektrums angegeben.

Gemäß einer ersten Methode werden Werte des Leistungs-Dichtespektrums S (f₀), S (f₁), S (f₂), S (f₃) . . ., S (f _n) . . . bei Frequenzen f₀, f₁, f₂, f₃ . . ., f _n . . ., die voneinander durch einen gegebenen Abstand Δ (Δ = f _n-f _n-1) entfernt sind, nacheinander miteinander verglichen, um zwischen ihnen vorhandene Unterschiede bzw. Differenzen wie folgt zu ermitteln:

Δ S₀= S (f₀)-S (f₁) Δ S₁= S (f₁)-S (S (f₂) ·
·
·
Δ S _n= S (f _n)-S (f _n+1)

Weist eine vorgegebene Anzahl (mehrere bis 10 und mehrere) Differenzen kontinuierlich ein positives Zeichen auf, d. h. nimmt eine vorgegebene Anzahl von Werten für das Leistungs-Dichtespektrum kontinuierlich ab, wird eine Frequenz fp des ersten Wertes für das Leistungs-Dichtespektrum dieser Reihe von Werten als Frequenz an einem Biegepunkt (flexion point) ermittelt. Dann wird der Mittelwert der (Einzel)Werte für das Leistungs- Dichtespektrum bis zum Wert S (fp) entsprechend der folgenden Gleichung

berechnet. Der so berechnete Mittelwert wird als Weißpegel des Leistungs-Dichtespektrums der Intensitätsschwankungen des von den Teilchen gestreuten Lichtes ermittelt bzw. bestimmt.

Fig. 5 ist ein Fließbild, das die aufeinanderfolgenden Stufen zur Ermittelung des Weißpegels entsprechend einem zweiten Verfahren erläutert. Bei dem zweiten Verfahren wird das photoelektrisch umgewandelte Ausgangssignal aus dem Photodetektor (11) zu einem Analogsignal verarbeitet und dann das Analogsignal in ein Digitalsignal umgewandelt. Darauf wird das Digitalsignal in die Einheit (18) für die Schnell-Fourier-Transformation eingespeist und ergibt ein Leistungs-Dichtespektrum S (f). Das so erhaltene Leistungs-Dichtespektrum enthält eine Anzahl kleiner Schwankungen, wie in Fig. 6A angegeben. Darauf wird das Leistungs-Dichtespektrum der Fourier-Transformation unterworfen, um die in Fig. 6B gezeigten Raumfrequenzkomponenten zu erhalten. Dann werden die Raumfrequenzkomponenten durch ein digitales Tiefpaßfilter mit einer Grenzfrequenz f _c geschickt. Das Ausgangssignal aus dem Tiefpaßfilter wird der inversen Fourier-Transformation unterworfen, um ein Leistungs-Dichtespektrum S (f) mit einer glatten Wellenform, wie in Fig. 6C gezeigt, zu erhalten. Darauf wird das geglättete Leistungs-Dichtespektrum wie beim ersten Verfahren verarbeitet, um den Weißpegel als gemitteltes Leistungs-Dichtespektrum zu erhalten.

In den Fig. 7 bis 9 wird die Beziehung zwischen dem Weißpegel (bzw. Weißpegelverhältnis) und der Konzentration der Probensubstanzen gezeigt. Zur Ermittlung dieser Beziehung wurden kugelige Latexteilchen mit einem mittleren Durchmesser von 0,212 µm und mit Reagenssubstanz an ihrer Oberfläche bzw. als Überzug verwendet.

In Fig. 7 wird die Beziehung zwischen dem Weißpegel und der Konzentration an IgE gezeigt. Um diese Beziehung zu ermitteln, wurden mehrere Standard-Probenflüssigkeiten mit bekannten unterschiedlichen IgE-Konzentrationen hergestellt; dann wurden Reaktionsflüssigkeiten hergestellt, indem Reagensflüssigkeiten, die mit Anti-IgE beschichtete Latexteilchen enthielten, zu diesen Standard-Probenflüssigkeiten zugegeben wurden. Die Konzentration an beschichteten Latexteilchen wurde (in jedem Falle) auf 0,23 Gew.-% (4,45×10¹¹ Teilchen/cm³) eingestellt, bezogen auf die Summe der Einzelgewichte von Latexteilchen und flüssigem Medium, beispielsweise Pufferlösung.

Die Beziehung zwischen dem Weißpegel des Leistungs-Dichtespektrums und der IgE-Konzentration kann ermittelt werden unter Verwendung von Weißpegelwerten, die direkt durch die in Fig. 1 gezeigte Vorrichtung erhalten werden. Ist jedoch das Meßsystem nicht sauber und kann es rauschen, so kann die direkte Messung nicht in reproduzierbarer Weise durchgeführt werden, wegen des Einflusses des Rauschens. Infolgedessen wurde die in Fig. 7 gezeigte graphische Darstellung erhalten, indem das Verhältnis des Weißpegels nach der Reaktion zu dem Weißpegel vor der Reaktion ermittelt wurde. Das heißt, die Ordinate in Fig. 7 gibt das Weißpegelverhältnis R an, das folgendermaßen definiert wird:

Auf der Abszisse ist die IgE-Konzentration in g/ml angegeben. Wie durch die ausgezogene Linie in Fig. 7 gezeigt, nimmt das Weißpegelverhältnis mit steigender IgE-Konzentration zu.

Fig. 8 zeigt die Beziehung zwischen dem Weißpegelverhältnis und der Konzentration an AFP. Zur Bestimmung wurden Latexteilchen mit darauf aufgebrachtem Anti-AFP verwendet. Die Konzentration der mit Anti-AFP beschichteten Latexteilchen wurde auf 0,38 Gew.-% (7,41×10¹¹ Teilchen/cm³) eingestellt. Die weiteren Bedingungen waren die gleichen wie bei dem Versuch entsprechend Fig. 7.

Fig. 9 zeigt die Beziehung zwischen dem Weißpegelverhältnis und der CRP-Konzentration. Verwendet wurden zur Bestimmung Latexteilchen, die mit Anti-CRP beschichtet waren. Die Konzentration der Teilchen wurde auf 0,40 Gew.-% (7,65×10¹¹ Teilchen/cm³) festgelegt. In diesem Falle wurde das Weißpegelverhältnis R zur Erleichterung des Versuchs entsprechend folgender Gleichung ermittelt:

Alle übrigen Bedingungen waren die gleichen wie bei den vorausgegangenen Experimenten. Fig. 9 zeigt an, daß das Weißpegelverhältnis R mit Zunahme der CRP-Konzentration bis zu 10^-6 g/ml zunimmt, dann aber mit weiter ansteigender CRP-Konzentration abnimmt. Dies beruht darauf, daß die Reaktion durch die starke CRP-Konzentration unterdrückt wird.

Wie oben erläutert, stehen die Konzentrationen, die Probensubstanzen und der Weißpegel des Leistungs-Dichtespektrums in einer gegebenen Beziehung zueinander, so daß diese Beziehung als Eichkurve benützt werden kann. Wird daher zunächst eine Beziehung bestimmt bzw. festgelegt unter Verwendung von Standard- Proben mit bekannten unterschiedlichen Konzentrationen an Probensubstanzen, die gemessen werden sollen, so kann nachher eine unbekannte Konzentration an Probensubstanz in einer Probe gemessen bzw. bestimmt werden, indem der Weißpegel oder das Weißpegelverhältnis des Leistungs-Dichtespektrums des von Teilchen in einer Testflüssigkeit gestreuten Lichtes bestimmt werden, wenn Reagenssubstanzen mit vorgegebener konstanter Konzentration zugesetzt werden.

Bei den bisher erläuterten Ausführungsformen wurde das Leistungs- Dichtespektrum des von den in der Reaktionsflüssigkeit enthaltenen (infizierten) Latexteilchen gestreuten Lichtes mit Hilfe der in Fig. 1 gezeigten Vorrichtung gemessen bzw. bestimmt. Erfindungsgemäß ist es auch möglich, beliebige Vorrichtungen zu verwenden, die das Leistungs-Dichtespektrum aus der Intensität des von teilchenförmigen Substanzen gestreuten Lichtes messen können. Ein Beispiel einer derartigen Vorrichtung ist in Fig. 10 gezeigt.

In Fig. 10 sind gleiche Bauteile wie in Fig. 1 mit den gleichen Bezugszeichen angegeben und auf deren nähere Beschreibung wird hier verzichtet. Bei dieser Ausführungsform sind in der Achse des Lichtstrahls (4) ein Polarisator (21) und ein Analysator (22) vor bzw. hinter der Zelle (7) angeordnet. Der Analysator (22) läßt lediglich polarisierte Lichtkomponenten durch, deren Polarisationsrichtung senkrecht zur Polarisationsrichtung des Polarisators (21) verläuft. Infolgedessen weist der Photodetektor (11) nur eine Kreuz-Polarisationskomponente des linear polarisierten Lichtes, das auf die Zelle (7) auftrifft, nach. Von einem kugeligen Teilchen nach vorne gestreutes Licht hat Polarisationskomponenten, die parallel zum einfallenden bzw. auftreffenden polarisierten Licht verlaufen, so daß es nicht durch die polarisierende Scheibe bzw. den Analysator (22) hindurchgeht. Hingegen wird von kugeligen Teilchen in mehrere Richtungen gestreutes Licht und von optisch anisotropen agglutinierten Teilchen gestreutes Licht - da es Depolarisationskomponenten aufweist - vom Analysator (22) durchgelassen. Infolgedessen kann das Leistungs-Dichtespektrum mittels Kreuz-Polarisation des nach vorne gestreuten Lichtes ermittelt und dann die Konzentration der Probensubstanzen mit Hilfe des Weißpegels des so bestimmten Leistungs-Dichtespektrums gemessen werden.

Bei den obigen Ausführungsformen sind die Reagenssubstanzen an die Oberflächen der kugeligen Latexteilchen gebunden. Die Erfindung ist jedoch nicht auf solche Ausführungsformen beschränkt. Wird beispielsweise die Lichtstreuung von den Reagenssubstanzen selbst hervorgerufen, so ist es nicht notwendig, unlösliche Träger, wie Latexteilchen, zu verwenden.

Mit Hilfe des erfindungsgemäßen Verfahrens kann die Konzentration von spezifischen Substanzen in einer Probe gemessen werden, indem ein Weißpegel oder ein Weißpegelverhältnis eines Leistungs-Dichtespektrums von durch Komplexe in einer Reaktionsflüssigkeit gestreutem Licht bestimmt wird. Da der Weißpegel oder das Weißpegelverhältnis genau und einfach bestimmt werden kann, können die Konzentrationen von Probensubstanzen genau und einfach gemessen werden.

Claims

1. Verfahren zur Messung der Konzentration von Substanzen in einer Probe auf der Basis von Komplexen, die durch eine spezifische Reaktion zwischen den in der Probe enthaltenen Substanzen und mit diesen spezifisch reagierenden Substanzen erzeugt worden sind, dadurch gekennzeichnet, daß man
eine elektromagnetische Strahlung auf diese Komplexe richtet,
die durch die Komplexe gestreute Strahlung nachweist und in ein Ausgangssignal umwandelt,
das Ausgangssignal zu einem Leistungs-Dichtespektrum der von den Komplexen gestreuten Strahlung verarbeitet,
den Weißpegel oder das Weißpegelverhältnis des Leistungs- Dichtespektrums ermittelt und
auf der Basis des Weißpegels oder Weißpegelverhältnisses die Konzentration der in der Probe enthaltenen Substanzen mißt.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die spezifische Reaktion eine Reaktion zwischen der Substanz in der Probe, die gemessen werden soll, und unlöslichen Substanzen ist, die mit den Substanzen in der Probe spezifisch reagieren.

3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die unlöslichen Substanzen kugelige Teilchen sind, an die Substanzen gebunden sind, die mit den in der Probe enthaltenen Substanzen spezifisch reagieren.

4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß die kugeligen Substanzen Latexteilchen sind.

5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß man den Weißpegel des Leistungs-Dichtespektrums ermittelt, indem man aufeinanderfolgende Werte S (f₀), S (f₁), S (f₂) . . . des Leistungs- Dichtespektrums bei Frequenzen f₀, f₁, f₂ . . ., die untereinander durch einen konstanten Wert getrennt sind, vergleicht und Differenzen Δ S₀ = S (f₀)-S (f₁), Δ S₁ = S (f₁)-S (f₂) . . .ermittelt,
eine Reihe von Werten des Leistungs-Dichtespektrums auswählt, die eine gegebene Anzahl von Differenzen mit kontinuierlich dem gleichen Zeichen ergeben,
aus der ausgewählten Reihe von Werten des Leistungs-Dichtespektrums den ersten Wert S (fp) auswählt und
einen Mittelwert der Werte des Leistungs-Dichtespektrums bis zu dem ersten Wert S (fp) des Leistungs-Dichtespektrums entsprechend der folgenden Gleichung als den Weißpegel des Leistungs-Dichtespektrums ermittelt.

6. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man vor dem Ermitteln des Weißpegels oder Weißpegelverhältnisses das Leistungs- Dichtespektrum einem Glättungsprozeß unterwirft, indem man
aus dem Leistungs-Dichtespektrum mit Hilfe einer Fourier- Transformation Raumfrequenzkomponenten ermittelt,
die Raumfrequenzkomponenten durch ein Tiefpaßfilter führt und
das Ausgangssignal aus dem Tiefpaßfilter einer inversen Fourier-Transformation unterwirft und das geglättete Leistungs- Dichtespektrum erhält.

7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß man die elektromagnetische Strahlung vor dem Auftreffen auf die Reaktionsflüssigkeit durch einen Polarisator führt und die von den Komplexen gestreute Strahlung durch einen Analysator nachweist, dessen Polarisationsrichtung senkrecht zu einer Polarisationsrichtung des Polarisators verläuft.

8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß man das Weißpegelverhältnis bestimmt, indem man das Verhältnis von Weißpegel nach der Reaktion zu Weißpegel vor der Reaktion berechnet.

9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß man das Weißpegelverhältnis bestimmt, indem man das Verhältnis von Weißpegel nach der Reaktion zu Weißpegel bei Beginn der Reaktion berechnet.