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DE3639352C2 - - Google Patents

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Publication number
DE3639352C2
DE3639352C2 DE3639352A DE3639352A DE3639352C2 DE 3639352 C2 DE3639352 C2 DE 3639352C2 DE 3639352 A DE3639352 A DE 3639352A DE 3639352 A DE3639352 A DE 3639352A DE 3639352 C2 DE3639352 C2 DE 3639352C2
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DE
Germany
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particles
frequency
light
photodetector
output signal
Prior art date
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Expired
Application number
DE3639352A
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English (en)
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DE3639352A1 (de
Inventor
Toshimitsu Machida Tokio/Tokyo Jp Musha
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Olympus Corp
Original Assignee
Olympus Optical Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
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Publication date
Application filed by Olympus Optical Co Ltd filed Critical Olympus Optical Co Ltd
Publication of DE3639352A1 publication Critical patent/DE3639352A1/de
Application granted granted Critical
Publication of DE3639352C2 publication Critical patent/DE3639352C2/de
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Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Messen einer spezifischen Bindereaktion.
Die immunologische Analyse wurde entwickelt, um Immun-Substanzen, Hormone, Medikamente und verschiedene Komponenten, wie Immun-Regulatoren, welche in geringen Mengen in lebenden Körpern vorhanden sind, mittels spezifischer immunologischer Reaktionen zu vermessen. Der Ausdruck "spezifische Bindereaktion" soll nachfolgend so verstanden werden, daß alle Reaktionen erfaßt sind, bei denen Liganden mit spezifischen Substanzen reagieren. Der Begriff "spezifische Bindereaktion" umfaßt deshalb nicht nur immunologische Antigen/Antikörper-Reaktionen, sondern auch Avidin/Biotin-Reaktionen, Protein A-IgG Fc-Fragment-Reaktionen und Hormon/Rezeptor-Reaktionen. Beispielsweise kann die immunologische Analyse grob eingeteilt werden in eine Gruppe, in welcher eine Markierung stattfindet, wobei Enzyme und Isotope als Indikatoren verwendet werden, sowie eine nicht-markierende immunologische Analyse, bei welcher Antigen/Antikörper-Komplexe direkt gemessen werden.
Bei der zuerst genannten, markierenden immunologischen Analyse ist insbesondere die Radio-Immuno-Analyse (RIA), die Enzym-Immuno-Analyse (EIA) und die Fluoro-Immuno-Analyse (FIA) bekannt. Diese Analysemethoden haben den Vorteil hoher Empfindlichkeit, sind aber mit dem Nachteil behaftet, daß die Handhabung der Isotope sowie der verbrauchten Flüssigkeit schwierig ist. Auch sind die Meßzeiten sehr lang und die für die Markierung erforderlichen Substanzen teuer, so daß die Analysekosten pro Probe verhältnismäßig groß sind.
Bei der oben genannten nicht-markierenden immunologischen Analyse sind insbesondere die Immuno-Elektrophorese, die Immuno-Diffusion und die Sedimentation bekannt. Diese Verfahren sind eingehend in der japanischen Fachzeitschrift "Summary of Clinical Test Method", Verlag Kinbara, sowie in der Zeitschrift "Clinical Test", Vol. 22, Nr. 5 (1978), Seiten 471-487, beschrieben.
In der Zeitschrift "Immuno Chemistry", Vol. 12, Nr. 4 (1975), Seiten 349-351, ist ein Verfahren vorgeschlagen worden, das zur nicht-markierenden immunologischen Analyse zählt, wobei an die Oberfläche von feinen Partikeln gebundene Antigene oder Antikörper mit Antikörpern oder Antigenen reagieren, die in der Prüfflüssigkeit vorhanden sind. Eine mittlere Diffusionskonstante wird gemessen, welche ein Maß für die Brown'sche Molekularbewegung der aus agglutinierten Partikeln zusammengesetzten Aggregate ist. Die mittlere Diffusionskonstante wird aus der Änderung der spektralen Breite von Laser-Licht ermittelt, welches in einer Lösung der Teilchen gestreut wird. Dieses Verfahren hat den Vorzug, daß kein Reagens benutzt werden muß. Da aber die Aufweitung des Spektrums aufgrund des Doppler-Effektes entsprechend der Brown'schen Bewegung der Aggregate mittels eines Spektrometers gemessen wird, handelt es sich um eine sehr große und teure Vorrichtung. Ist das Spektrometer mechanisch betrieben, so können sich Fehler einschleichen und die Genauigkeit und Reproduzierbarkeit der Messung läßt zu wünschen übrig. Die bei diesen bekannten Verfahren vorgesehene Messung der mittleren Diffusionskonstante aufgrund der spektralen Breite ermöglicht auch nur eine begrenzte Information über die Antigen/Antikörper-Reaktion.
In der nicht vorveröffentlichten DE-OS 35 25 719 der Anmelderin wird ein Verfahren zum Messen einer Antigen/ Antikörper-Reaktion beschrieben, bei dem es nicht erforderlich ist, teure Reagentien und Spektrometer zu benutzen. Die Messung kann mit hoher Genauigkeit und guter Reproduzierbarkeit ausgeführt werden. Überdies läßt sich die Messung auch automatisch in sehr schneller Zeit durchführen.
Dieses Verfahren zum Messen immunologischer Reaktionen weist die folgenden Schritte auf:
Strahlung wird auf eine Reaktionsflüssigkeit gerichtet, die zumindest ein Antigen und Antikörper aufweist;
durch Partikel-Substanzen in der Reaktionsflüssigkeit gestreute Strahlung wird gemessen;
das Leistungsdichte-Spektrum der Intensitätsschwankungen der gestreuten Strahlung wird abgeleitet; und
die Antigen/Antikörper-Reaktion wird auf der Grundlage dieses Leistungsdichte-Spektrums gemessen.
Befinden sich aber Verunreinigungen, wie hochpolymere Substanzen in der Prüfflüssigkeit, so wird der Lichtstrahl auch durch diese Verunreinigungen gestreut, weshalb das Ausgangssignal des Photodetektors Fehlerkomponenten aufgrund der hochpolymeren Substanzen enthält.
Aus der Zeitschrift "Laboratory Practice", May 1985, Seiten 74, 77, 78 und 81 sowie aus der US-PS 45 21 522 ist es bekannt, beim Messen spezifischer Bindereaktionen polarisiertes Licht zu verwenden.
Aus der Zeitschrift "Journal of Immunological Methods", Vol. 18, 1977, S. 365 bis 375 ist es bekannt, feine Teilchen mit Liganden zu beschichten und das gestreute Licht zu vermessen. In der DE-OS 30 14 036 schließlich werden bei der immunologischen Analyse Teilchen aus magnetischem Material verwendet.
Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zum Messen einer spezifischen Bindereaktion anzugeben, bei dem die spezifische Bindereaktion sehr genau ohne Verwendung teurer Markierungssubstanzen oder teurer Spektrometer durchgeführt werden kann, ohne daß Verunreinigungen das Meßergebnis stören können.
Die erfindungsgemäße Lösung dieser Aufgabe ist im Anspruch 1 und ihre Ausgestaltungen sind in den Patentansprüchen 2-22 gekennzeichnet.
Nachfolgend wird die Erfindung anhand der Zeichnung näher erläutert. Es zeigt:
Fig. 1 schematisch eine Anordnung zur Messung einer spezifischen Bindereaktion gemäß der Erfindung;
Fig. 2 eine schematische Darstellung einer Vorrichtung zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens zum Messen einer spezifischen Bindereaktion;
Fig. 3 eine schematische Darstellung einer Einrichtung zum Erzeugen eines magnetischen Feldes in einer Vorrichtung gemäß Fig. 2;
Fig. 4 eine schematische Darstellung des in der Vorrichtung gemäß Fig. 2 verwendeten Kollimators;
Fig. 5 eine schematische Darstellung einer anderen Anordnung zur Durchführung einer erfindungsgemäßen Messung einer spezifischen Bindereaktion;
Fig. 6A und 6B schematische Darstellungen weiterer Ausführungsbeispiele von Einrichtungen zur Erzeugung magnetischer Felder; und
Fig. 7 ein Block-Diagramm zur Erläuterung einer Signal-Verarbeitungsschaltung gemäß der Erfindung.
Fig. 1 zeigt schematisch den grundsätzlichen Aufbau des Meßverfahrens zum Messen der spezifischen Bindereaktion. Aus der Lichtquelle 1 stammendes Licht wird über einen Polarisator 2 zu einer Zelle 3 gelenkt, die Reaktionsflüssigkeit 4 enthält, in welcher eine Probe aus feinen Teilchen aus magnetischem Material enthalten ist.
Die Teilchen können rund geformt sein. Auf die Oberfläche der Teilchen ist ein Antikörper oder Antigen fixiert, das mit einem Antigen bzw. Antikörper spezifisch reagiert, welches in der zu analysierenden Probe enthalten ist. Das Licht wird mittels des Polarisators 2 linear polarisiert und durch die in der Reaktionsflüssigkeit 4 enthaltenen Teilchen gestreut. In diesem Falle wird der Polarisationszustand des gestreuten Lichts entsprechend dem Agglutinationszustand der Teilchen geändert. Da die nicht-agglutinierten Teilchen im wesentlichen kugelförmig sind und somit optische Isotropie aufweisen, sind sie in der gleichen Richtung bezüglich ihrer Vibration polarisiert, wie der elektrische Feldvektor der elektromagnetischen Welle des einfallenden, linear polarisierten Lichtes. Dementsprechend ist das von nicht-agglutinierten Teilchen gestreute Licht ebenfalls linear polarisiert in derselben Polarisationsebene wie das einfallende Licht. Findet eine Antigen/Antikörper-Reaktion statt und führen die Teilchen eine Agglutination miteinander aus, so ist die gesamte Anordnung der agglutinierten Teilchen nicht mehr kugelförmig, sondern weicht hiergegen in der Form ab, so daß dieser Agglutinationskörper optische Anisotropie aufweist. Wird das polarisierte Licht durch die agglutinierten Teilchen, die optische Anisotropie aufweisen, gestreut, so weist das gestreute Licht Polarisationskomponenten auf, die sich von den Polarisationskomponenten des einfallenden Lichts unterscheiden.
Gemäß der Erfindung werden nicht-agglutinierte Teilchen und agglutinierte Teilchen mittels eines Magnetfeldes bewegt, welches durch eine außerhalb der Zelle 3 angeordnete Einrichtung 5 erzeugt wird. Beispielsweise können Teilchen periodisch in einer Ebene gedreht werden, die senkrecht auf der Richtung des einfallenden Lichtes steht. Da die nicht-agglutinierten Teilchen kugelförmig sind (und nach der Drehung auch bleiben), ist die Polarisationsrichtung des von den nicht-agglutinierten Teilchen gestreuten Lichtes gleich der des einfallenden Lichts. Die Polarisationsrichtung des von den agglutinierten Teilchen gestreuten Lichtes ist aber entsprechend der Drehung der agglutinierten Teilchen ebenfalls gedreht.
Wird das gestreute Licht über einen Analysator 6 auf den Photodetektor 7 gerichtet, so ändert sich das Ausgangssignal des Photodetektors entsprechend dem Agglutinationszustand der Teilchen in der Reaktionsflüssigkeit 4, d. h. entsprechend der Antigen/ Antikörper-Reaktion. Das heißt, wenn die Polarisationsebene des Analysators 6 der Polarisationsebene des Polarisators 2 entspricht, so wird das durch die nicht-agglutinierten Teilchen gestreute Licht zusammen mit dem von den agglutinierten Teilchen gestreuten Licht auf den Photodetektor 7 gelenkt. Wenn hingegen die Polarisationsebene des Analysators 6 senkrecht auf der Polarisationsebene des Polarisators 2 steht, so wird nur der Teil des gestreuten Lichtes auf den Photodetektor 7 gelangen, der von den agglutinierten Teilchen gestreut wird. In jedem Falle wird das von den agglutinierten Teilchen gestreute Licht, welches auf den Photodetektor 7 fällt, um eine Frequenz geändert, die der doppelten Rotationsfrequenz der Teilchen entspricht. Dementsprechend ist es möglich, die immunologische Reaktion dadurch zu messen, daß die Änderung des Ausgangssignals des Photodetektors 7 verfolgt wird.
Fig. 2 zeigt schematisch ein weiteres Ausführungsbeispiel einer Vorrichtung zum Durchführen einer immunologischen Messung. Bei diesem Ausführungsbeispiel wird ein Heterodyn-Verfahren angewandt, bei dem das gemessene gestreute Licht die gleiche Richtung wie das einfallende Licht aufweist. Als Lichtquelle für kohärente Strahlung dient ein He-Ne-Gaslaser 11, der einen Laserstrahl mit einer Wellenlänge von 632,8 nm hat. Die Strahlungsquelle für kohärentes Licht kann auch von einem Festkörperlaser, wie einem Halbleiterlaser, gebildet sein. Der Laser-Lichtstrahl 12, der von der Lichtquelle 11 abgegeben wird, wird durch den halbdurchlässigen Spiegel 13 in zwei Teilstrahlen 14 und 15 aufgeteilt. Der Lichtstrahl 14 wird durch eine Sammellinse 16 fokussiert und über einen Polarisator 17 (Glan-Thompson-Prisma) linear polarisiert auf die Zelle 18 gelenkt. Die Zelle 18 besteht aus durchsichtigem Quarz. Der Lichtstrahl 15 fällt auf einen Photodetektor 19, wie eine Silizium-Photodiode. Der Photodetektor 19 erzeugt ein Vergleichssignal, welches die Schwankungen der Intensität des von der Lichtquelle 11 erzeugten Lichtstrahles wiedergibt. Der Strahl 15 dient also als Referenz-Strahl.
Zunächst wird in die Zelle 18 eine Pufferlösung mit feinen, kugelförmigen Teilchen eingegeben, die einen Durchmesser im Bereich von 0,05 bis 0,1 µm haben. Die Teilchen können aus ferromagnetischem Material bestehen, wie Ni, Co sowie Legierungen daraus, welche keine oder nur eine sehr kleine spontane Magnetisierung aufweisen. Auf der Oberfläche der Partikel sind Antigene oder Antikörper fixiert, wie beispielsweise Immunoglobulin G (IgG). Sodann wird eine Probe, die Antikörper oder Antigen enthält, in die Zelle 18 eingegeben, um die Antigen/Antikörper-Reaktion in der Flüssigkeit 20 einzuleiten. Neben der Zelle 18 ist eine Einrichtung 21 zur Erzeugung eines magnetischen Feldes angeordnet. Bei diesem Ausführungsbeispiel erzeugt die Einrichtung 21 ein magnetisches Feld, um die magnetischen Teilchen periodisch in einer Ebene zu rotieren, die senkrecht auf der Richtung des einfallenden Lichtes steht.
Die durch Partikel in der Zelle 18 gestreuten Lichtstrahlen fallen über einen Kollimator 22 auf einen Photodetektor 24. Der Kollimator 22 hat ein Paar von feinen Löchern. Weiterhin ist ein Analysator 23 gemäß Fig. 2 zwischengeschaltet. Der Photodetektor 24 wird von einem Photovervielfacher hoher Empfindlichkeit gebildet. Der Analysator 23 hat eine Polarisationsebene, die von derjenigen des Polarisators 17 verschieden ist. Bei diesem Ausführungsbeispiel steht die Polarisationsebene des Analysators 23 senkrecht auf der des Polarisators 17.
Das Ausgangs-Referenzsignal des Photodetektors 19 wird über einen Verstärker 28 mit geringem Rauschen in eine Daten-Verarbeitungseinrichtung 27 eingegeben, in welche auch das Ausgangssignal des Photodetektors 24 über einen Verstärker 25 (mit geringem Rauschen) und einem Tiefpaßfilter 26 eingegeben wird. Der Tiefpaßfilter 26 hat eine Abschneidefrequenz von einigen hundert Hertz. Die Datenverarbeitungsanlage 27 weist einen Analog/Digital-Wandler 29, einen schnellen Fourier-Transformator (FET) 30 und einen Rechner 31 auf. Die Anlage verarbeitet die Signale, wie nachfolgend näher erläutert werden wird, und gibt ein Meßsignal bezüglich der Antigen/Antikörper-Reaktion ab. Das Meßergebnis wird auf der Anzeigeeinrichtung 32 angezeigt.
Das Ausgangssignal des Photodetektors 24 ist ein Maß für die Intensität des gestreuten Lichtes, welches aus der Meßzelle 18 dringt. Das Signal wird mittels des Referenzsignals normaliert, das vom Photodetektor 28 stammt, und sodann über eine kurze Zeitspanne gemittelt. Auf diese Weise können alle Schwankungen der Intensität des Laser-Strahls 12 der Lichtquelle 11 ausgeschaltet werden. Sodann wird ein Leistungs-Dichtespektrum der Intensitätsschwankungen des gestreuten Lichtes gemessen und der Agglutinationszustand der Teilchen in der Zelle 18 und somit die Antigen/Antikörper-Reaktion wird gemessen.
Fig. 3 zeigt schematisch ein Ausführungsbeispiel für die Einrichtung 21 zum Erzeugen eines magnetischen Feldes. Die Einrichtung 21 weist ein Paar von Spulen 35 und 36 auf, die jeweils zueinander und zur Richtung des einfallenden Lichtstrahles 14 senkrecht stehen. Diese Spulen 35, 36 sind mit einem Oszillator 37 zum Erzeugen von Wechselströmen mit einer Frequenz f 0 von etwa 10 Hz und einer relativen Phasenverschiebung von 90° verbunden. Die Wechselströme können sinusförmig oder auch pulsförmig sein. Wenn die Spulen 35, 36 alternierende Magnetfelder mit einer Phasendifferenz von 90° erzeugen und senkrecht zueinander stehen, so wird in der Zelle 18 ein rotierendes Magnetfeld erzeugt. Werden die magnetischen Teilchen einem solchen rotierenden Magnetfeld ausgesetzt, so werden sie mit der Frequenz f 0 in einer Ebene gedreht, die senkrecht zur Ebene des einfallenden Lichtes 14 steht.
Wie vorstehend erläutert, werden die dem magnetischen Wechselfeld, welches eine Phasendifferenz von 90° aufweist und senkrecht zur Ebene des einfallenden Lichtes steht, ausgesetzten Teilchen mit der gleichen Frequenz gedreht, wie das magnetische Wechselfeld. Dies beruht auf der magnetischen Induktion.
Fig. 4 zeigt schematisch Einzelheiten des in Fig. 2 gezeigten Kollimators 22. Der Kollimator 22 weist ein Röhrchen 22 a auf, das aus nicht-durchsichtigem Material besteht, um alle Störungen durch äußeres Licht zu vermeiden. Weiterhin ist die Innenwand des Röhrchens 22 a mit einer nicht-reflektierenden Beschichtung versehen. An beiden Enden des Röhrchens 22 a sind feinste Löcher 22 b bzw. 22 c vorgesehen. Der Kollimator 22 dient dazu, den Erfassungswinkel des Photodetektors 24 zu begrenzen, so daß Störungen durch nicht zu vermessendes Streulicht vermieden sind. Die feinen Löcher 22 b und 22 c haben Durchmesser von 0,3 mm und einen Abstand von 30 cm.
Findet in der Zelle 18 keine Antigen/Antikörper-Reaktion statt und agglutinieren die Teilchen nicht (d. h. bilden sie keine Zusammenballungen), so werden die kugelförmigen Teilchen weiterhin optische Isotropie aufweisen und auch nach einer Drehung der Teilchen wird das gestreute Licht die gleiche Polarisationsrichtung aufweisen wie das einfallende, linear polarisierte Licht 14. Deshalb wird das gestreute Licht nicht durch den Analysator 23 durchgelassen und das Ausgangssignal des Photodetektors 24 wird (theoretisch) Null. Im Gegensatz hierzu wird bei Auftreten einer Antigen/Antikörper-Reaktion eine Agglutination der Teilchen erfolgen (Zusammenballung) und die agglutinierten Teilchen werden eine optische Anisotropie aufweisen, so daß das gestreute Licht Polarisationskomponenten aufweist, die senkrecht zur Polarisationsebene des einfallenden Lichtes stehen. Somit wird ein Teil des gestreuten Lichtes durch den Analysator 23 durchgelassen und gelangt zum Photodetektor 24, welcher ein Ausgangssignal erzeugt, das von Null verschieden ist. Darüberhinaus wird die Polarisationsrichtung des gestreuten Lichtes aufgrund der Drehung der agglutinierten Teilchen entsprechend dem Magnetfeld gedreht. Somit enthält das vom Photodetektor 24 empfangene gestreute Licht eine Komponente, die mit einer Frequenz 2f 0 variiert, also der zweifachen Frequenz des magnetischen Wechselfeldes. Sine Verunreinigungen, wie hochpolymere Substanzen in der Prüfflüssigkeit (wie einem Serum) enthalten, so kann das von diesen Verunreinigungen gestreute Licht ebenfalls Polarisationskomponenten enthalten, die senkrecht zur Polarisationsebene des linear polarisierten, einfallenden Lichtes stehen, weshalb ein Teil des von den Verunreinigungen gestreuten Lichtes ebenfalls durch den Analysator 23 durchgelassen werden kann. Somit kann das Ausgangssignal des Photodetektors 24 Störkomponenten enthalten, die dem Signal der agglutinierten Teilchen überlagert sind. Da aber diese Verunreinigungen nicht magnetisch sind, werden sie nicht durch das Magnetfeld gedreht und die von den Verunreinigungen stammenden Komponenten des Ausgangssignals ändern sich nicht synchron mit dem magnetischen Wechselfeld. Somit kann eine Verarbeitung des Ausgangssignals des Photodetektors 24 auf der Grundlage der Frequenz 2f 0 diejenigen Signalkomponenten auswählen, die nur von den agglutinierten Teilchen stammen. Somit kann die Antigen/Antikörper-Reaktion mit großer Empfindlichkeit und mit einem guten Signal/Rausch-Verhältnis vermessen werden.
Beim vorliegenden Ausführungsbeispiel wird das Leistungs-Dichtespektrum der Intensitätsschwankungen des gestreuten Lichtes gemessen. Hierzu wird das Ausgangssignal des Photodetektors 24 in die Datenverarbeitungsanlage 27 über den Verstärker 25 und das Tiefpaßfilter 26 eingegeben und darin zusammen mit dem Ausgangssignal des Photodetektors 19 verarbeitet, um das Leistungs-Dichtespektrum der Intensitätsschwankungen des gestreuten Lichtes zu ermitteln. Das Leistungs-Dichtespektrum S(f) eines stationären stochastischen Prozesses x(t) kann wie folgt ausgedrückt werden:
Auf der Grundlage dieser Gleichung wird die Fourier-Transformation ausgeführt, um das Leistungs-Dichtespektrum zu gewinnen. Das Ausgangssignal des Photodetektors 24 wird vom Verstärker 25 mit geringem Rauschen verstärkt und zwar derart, daß die Signalhöhen einen großen Bereich von Analog/Digital-Umwandlungswerten überdecken. Die derart quantisierten Daten werden durch den Mikroprozessor verarbeitet, um das Leistungs-Dichtespektrum zu gewinnen. Aus dem Leistungs-Dichtespektrum wird der Zustand der immunologischen Reaktion ermittelt und numerisch auf dem Display 32 angezeigt.
Wie vorstehend erläutert, wird bei einer Drehung der agglutinierten Teilchen mit der Frequenz f 0 die optische Anisotropie der agglutinierten Teilchen periodisch mit der Frequenz 2f 0 geändert. Durch Messen derjenigen Komponenten des Leistungs-Dichtespektrums, die eine Frequenz 2f 0 aufweisen oder durch Messen des Leistungs-Dichtespektrums nahe der Frequenz 2f 0 ist es deshalb möglich, die Antigene in der Probe zu identifizieren oder die Menge an Antigenen zu ermitteln, die in der Probe enthalten sind.
Beim vorliegenden Ausführungsbeispiel ist es nicht erforderlich, teure und schwierig zu handhabende markierende Reagenzien, wie Enzyme und Radioisotope, zu verwenden und die Messung kann einfach und kostengünstig durchgeführt werden. Die Genauigkeit und Reproduzierbarkeit der Messung ist wesentlich besser als die der nicht-markierenden Immuno-Analyse, wie der Immuno-Elektrophorese, der Immuno-Diffusion und -Sedimentation. Es ist auch möglich, sehr zuverlässige Meßergebnisse zu erhalten. Im Vergleich mit einem herkömmlichen Verfahren, bei dem eine mittlere Diffusionskonstante aus der Änderung der spektralen Breite des gestreuten Lichtes ermittelt wird, ist es bei einem erfindungsgemäßen Verfahren nicht mehr erforderlich, teure und große Spektrometer zu verwenden. Deshalb kann die Vorrichtung insgesamt sehr kostengünstig, kompakt und leichtgewichtig gestaltet werden. Überdies ist es möglich, aufgrund einer Messung des Leistungs-Dichtespektrums der Intensitätsschwankungen des gestreuten Lichtes mehr Informationen über die Antigen/Antikörper-Reaktion zu gewinnen.
Fig. 5 ist eine Block-Darstellung einer anderen Vorrichtung zum Vermessen einer immunologischen Reaktion. Bei diesem Ausführungsbeispiel wird das Ausgangssignal des Photodetektors 24 in einen Synchron-Detektor 41 eingegeben, in den auch ein Referenz-Signal der Frequenz f 0 des Oszillators 37 eingegeben wird und eine Signal-Komponente mit der Frequenz 2f 0 wird synchron nachgewiesen. Das derart gewonnene Ausgangssignal wird auf der Anzeigeeinrichtung 32 dargestellt.
Bei diesem Ausführungsbeispiel hängt das Ausgangssignal des Synchron-Detektors 41 ausschließlich vom Agglutinationszustand, d. h. der Konzentration des in der Probe enthaltenen Antigen, ab. Wenn deshalb eine Eichkurve vorab unter Verwendung einer Standardprobe mit bekannter Antigenkonzentration abgeleitet wird, ist es möglich, die unbekannten Konzentrationen von Antigen in den Proben präzise zu messen. Im Vergleich zum zuvor beschriebenen Ausführungsbeispiel ist beim vorliegenden Ausführungsbeispiel die Signalverarbeitung wesentlich einfacher und die Meßzeit kann verkürzt werden. Auch wird die Messung mit einem besseren Signal/Rausch-Verhältnis und größerer Genauigkeit durchgeführt.
Die vorstehend beschriebenen Ausführungsbeispiele lassen verschiedene Abwandlungen zu. Statt der Immunoglobulin G (IgG) können verschiedene andere Substanzen, wie Immunoglobulin A (IgA), IgM, IgD, IgE, Australia-Antigen, Syphilis-Antigen und Insulin benutzt werden, welche im Verlaufe der Antigen/Antikörper-Reaktion Agglutinationen erzeugen. Auch sind andere spezifische Bindereaktionen als immunologische Antigen/Antikörper-Reaktionen meßbar. Beispielsweise können Teilchen benutzt werden, die mit Hormonen beschichtet sind und es ist möglich, die in der Probe enthaltenen Rezeptoren zu analysieren. Falls Teilchen benutzt werden, die mit Avidin, Biotin, Protein A oder IgG Fc-Fragment beschichtet sind, so können Biotin, Avitin, IgG Fc-Fragmente oder Protein A in Proben vermessen werden. Beim vorstehenden Ausführungsbeispiel sind Antikörper auf der Oberfläche der Partikel fixiert, um in der Probe enthaltenes Antigen zu messen. Es ist aber auch möglich, in der Probe enthaltene Antikörper mittels Partikeln zu messen, auf denen Antigene fixiert sind. Beim vorstehenden Ausführungsbeispiel ist die Antigen/Antikörper-Reaktionsflüssigkeit in einer Zelle enthalten und die Messung wird stationär durchgeführt, es ist aber auch möglich, das erfindungsgemäße Verfahren im Fließzustand einzusetzen, bei dem eine Antigen/Antikörper-Reaktionsflüssigkeit kontinuierlich durch eine Strömungszelle fließt. Weiterhin ist in den vorstehenden Ausführungsbeispielen von einer Laser-Lichtquelle zur Erzeugung kohärenter Strahlung die Rede; es ist aber auch möglich, Lichtquellen zu benutzen, die inkohärente Strahlung erzeugen. Auch müssen die magnetischen Teilchen nicht immer kugelförmig sein, es können auch nicht-kugelförmige Teilchen verwendet werden, solange die Teilchengröße hinreichend klein ist (und den beschriebenen optischen Anforderungen genügt ist).
Beim vorstehenden Ausführungsbeispiel steht die Polarisationsebene des Analysators 23 senkrecht auf der des Polarisators 17, so daß von nicht-agglutinierten Teilchen gestreutes Licht nicht auf den Photodetektor 24 fällt. Deshalb kann die immunologische Reaktion genauestens aufgrund der Intensität oder eines Mittelwertes des Ausgangssignals des Photodetektors 24 gemessen werden. Es kann aber auch die Polarisationsebene des Analysators 23 willkürlich in bezug auf die Polarisationsebene des Polarisators 17 gesetzt werden.
Beim in Fig. 3 gezeigten Ausführungsbeispiel sind die beiden Spulen 35 und 36 senkrecht auf die Richtung des einfallenden Lichtstrahls sowie senkrecht zueinander ausgerichtet. Bei dem in Fig. 6A gezeigten Ausführungsbeispiel sind ein Paar von Spulen 35 a und 35 b in bezug auf die Zelle 18 gegenüberliegend angeordnet und ein Paar von Spulen 36 a und 36 b ist ebenfalls gegenüberliegend beiderseits der Zelle angeordnet. Es sei erwähnt, daß es nicht immer erforderlich ist, die Teilchen in einer Ebene zu drehen, die senkrecht auf der Richtung des einfallenden Lichtes steht. Durch Anordnung eines Paares von Spulen 35 a und 35 b gegenüberliegend in bezug auf die Zelle 18 und eine Serienschaltung dieser Spulen mit einem Oszillator 37 gemäß Fig. 6B ist es möglich, die Teilchen mit einer Frequenz f 0 hin- und herzuschwingen. Auch in diesem Falle schwankt das Ausgangssignal des Photodetektors periodisch mit der Frequenz 2f 0. Auch können die Teilchen dadurch bewegt werden, daß intermittierend ein Gleichstrom durch die Spulen fließt, oder daß ein Permanentmagnet ohne Verwendung von Spulen gedreht wird. Überdies ist es möglich, vor Durchführung der Messung die Reaktionsflüssigkeit 20 intermittierend einem gleichförmigen oder nicht gleichförmigen Magnetfeld auszusetzen, welches durch die Magnetfeld-Erzeugungseinrichtung 21 erzeugt wird, um die Teilchen intermittierend in Richtung des Magnetfeldes auszurichten. Sodann werden die Teilchen gerührt und die Antigen/Antikörper-Reaktion wird durchgeführt. Auf diese Weise ist es möglich, die Meßzeit wesentlich zu kürzen.
Beim vorstehend beschriebenen Ausführungsbeispiel wird das Streulicht in der gleichen Richtung nachgewiesen, in der auch das einfallende Licht nachgewiesen wird. Es ist aber auch möglich, das seitwärts gestreute Licht zu messen, um die Antigen/Antikörper-Reaktion zu verfolgen.
Beim vorstehend beschriebenen Ausführungsbeispiel fällt linear polarisiertes Licht auf die Zelle 18. Es ist aber auch möglich, zirkular polarisiertes oder elliptisch polarisiertes Licht zu verwenden. In diesem Falle kann das Streulicht nach Passieren eines Viertelwellenlängen-Plättchens auf den Analysator 17 treffen.
Da beim beschriebenen Ausführungsbeispiel magnetische Teilchen mittels eines Magnetfeldes bewegt, rotiert oder geschwungen werden, ist es möglich, auch magnetische Teilchen in der Umwelt zu vermessen, also beispielsweise die atmosphärische Verschmutzung oder auch die Wasserqualität.
Beim in Fig. 5 gezeigten Ausführungsbeispiel wird die Signalkomponente mit einer vorgegebenen Frequenz 2f 0 durch den Synchron-Detektor abgeleitet. Es ist auch möglich, die gewünschte Signal-Komponente mittels eines Band-Durchlaßfilters zu gewinnen. Fig. 7 ist ein Blockdiagramm eines derartigen Ausführungsbeispieles. Hier wird das Ausgangssignal des Photodetektors, der das durch die Teilchen gestreute und durch einen Analysator geschickte Licht empfängt, mittels eines Verstärkers 52 verstärkt, der ein geringes Rauschen aufweist. Sodann passiert das vom Verstärker 53 verstärkte Signal das Band-Durchlaßfilter 53, dessen Durchlaß-Mittenfrequenz 2f 0 der zweifachen Frequenz f 0 entspricht, mit welcher die magnetischen Teilchen in der Prüfflüssigkeit gedreht werden. In diesem Falle hat ein Ausgangssignal aus dem Filter 53 eine Signalkomponente der Frequenz 2f 0. Dieses Signal wird in die Signal-Verarbeitungsschaltung 54 eingegeben, um den Grad der Agglutination der magnetischen Teilchen zu messen, d. h. die Agglutinationsreaktion selbst. Die Signal-Verarbeitungsschaltung bei diesem Ausführungsbeispiel ist wesentlich einfacher als die der zuvor beschriebenen Ausführungsbeispiele.
Wie zuvor beschrieben, werden die magnetischen Teilchen durch Änderung eines Magnetfeldes bewegt und eine Komponente des gestreuten Lichtes, die entsprechend der Bewegung der Teilchen schwankt, wird selektiv vermessen. Dementsprechend läßt sich der störende Einfluß von Verunreinigungen, wie in der Prüfflüssigkeit enthaltenen hochpolymeren Substanzen, im wesentlichen ausschalten. Somit ergibt sich eine hohe Meßgenauigkeit und Empfindlichkeit bei sehr kurzer Meßzeit.
Es ist auch möglich, magnetische Teilchen zu verwenden, die nicht vollständig aus magnetischem Material bestehen. Beispielsweise ist es möglich, magnetotaktische Bakterien, wie Aquaspirilum Magnetotacticum oder magnetotaktisches Coccus, zu verwenden. Diese Teilchen enthalten fein magnetische Partikel, Magnetosome genannt. Derartige Magnetosome bestehen aus Fe3O4-Teilchen mit einem mittleren Durchmesser von 0,05 bis 0,15 µm. Weiterhin ist es auch möglich, magnetische Mikrokapseln zu verwenden, bei denen sehr feine magnetische Teilchen durch eine Polymer-Schicht bedeckt sind.

Claims (22)

1. Verfahren zum Messen einer spezifischen Bindereaktion, gekennzeichnet durch folgende Schritte:
- polarisiertes Licht wird auf eine Reaktionsflüssigkeit gerichtet, die eine Probe und feine Teilchen aus magnetischem Material enthält, welche mit Liganden beschichtet sind, die selektiv mit bestimmten Substanzen der Probe reagieren;
- die genannten Teilchen in der Reaktionsflüssigkeit werden mittels eines Magnetfeldes bewegt;
- das durch die Teilchen gestreute Licht wird in einen Analysator eingegeben;
- das den Analysator passierende Licht wird in einen Photodetektor eingegeben, um ein Ausgangssignal zu erzeugen; und
- das Ausgangssignal des Photodetektors wird zum Vermessen der spezifischen Bindereaktion verarbeitet.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Magnetfeld derart angelegt wird, daß die Teilchen periodisch mit einer vorgegebenen Frequenz f 0 bewegt werden.
3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Teilchen mit der Frequenz f 0 gedreht werden.
4. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Teilchen mit der Frequenz f 0 geschwungen werden.
5. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß von den Teilchen in der gleichen Richtung wie das einfallende Licht gestreutes Licht auf den Analysator fällt und daß die Teilchen in einer Ebene bewegt werden, die senkrecht zur genannten Richtung steht.
6. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Licht einer Lichtquelle nach Passieren eines Polarisators auf die Reaktionsflüssigkeit gerichtet wird.
7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß der Analysator eine Polarisationsebene hat, die verschieden ist von der Polarisationsebene des Polarisators.
8. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Polarisationsebene des Analysators senkrecht auf der Polarisationsebene des Polarisators steht.
9. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Ausgangssignal des Photodetektors in einen schnellen Fourier-Transformator gegeben wird, um ein Leistungs-Dichtespektrum der Intensitätsschwankungen des Streulichtes sowie zumindest eine Komponente der Frequenz 2f 0, also der zweifachen vorgegebenen Frequenz f 0, selektiv aus dem Leistungs-Dichtespektrum abgeleitet wird.
10. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß die immunologische Reaktion derart vermessen wird, daß die Intensität der Komponente mit der Frequenz 2f 0 gemessen wird.
11. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß die immunologische Reaktion derart gemessen wird, daß der Verlauf eines Teiles des Leistungs-Dichtespektrums vermessen wird, wobei der Teil die Komponente mit der Frequenz 2f 0 enthält.
12. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß das Ausgangssignal des Photodetektors synchron mit der Veränderung des Magnetfeldes gemessen wird.
13. Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß das Ausgangssignal des Photodetektors in einen Synchron-Detektor eingegeben wird, in den auch ein Referenz-Signal mit der Frequenz 2f 0 eingegeben wird, also der verdoppelten gegebenen Frequenz f 0, und daß die immunologische Reaktion entsprechend einer Amplitude des Ausgangssignals des Synchron-Detektors gemessen wird.
14. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß das veränderliche Magnetfeld zum Rotieren der Teilchen durch ein Paar von Spulen erzeugt wird, die senkrecht zueinander angeordnet sind und mit Wechselstrom gleicher Frequenz f 0 aber mit einer Phasenverschiebung von 90° beschickt werden.
15. Verfahren nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß das veränderliche Magnetfeld durch ein erstes Paar von Spulen erzeugt wird, die einander in bezug auf die Reaktionsflüssigkeit gegenüberliegen, sowie ein zweites Paar von Spulen, die ebenfalls in bezug auf die Reaktionsflüssigkeit einander gegenüberliegen, wobei die ersten und zweiten Paare von Spulen zueinander senkrecht stehen und mit Wechselstrom versorgt werden, der die gleiche Frequenz f 0 bei einer Phasenverschiebung von 90° aufweist.
16. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß das veränderliche Magnetfeld zum Schwingen der Teilchen durch ein Paar von Spulen erzeugt wird, die in bezug auf die Reaktionsflüssigkeit einander gegenüberliegen und mit Wechselstrom versorgt werden, der die Frequenz f 0 hat.
17. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die magnetischen Teilchen kugelförmig sind.
18. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die magnetischen Teilchen aus ferromagnetischem Material bestehen.
19. Verfahren nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, daß die magnetischen Teilchen aus Ni, Co oder deren Legierungen bestehen.
20. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die magnetischen Teilchen Durchmesser im Bereich von 0,05 bis 0,1 µm aufweisen.
21. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die feinen Partikel mit Liganden beschichtet sind, wobei es sich bei den Liganden um folgende Stoffe handeln kann: Antigen, Antikörper, Avidin, Biotin, Protein A, IgG Fc-Fragmente und Hormone.
22. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß das Ausgangssignal des Photodetektors in ein Band-Filter eingegeben wird, welches eine Mitten-Frequenz 2f 0 aufweist, die dem doppelten der gegebenen Frequenz entspricht, um eine Signal-Komponente abzuleiten, die die Frequenz 2f 0 hat.
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