JPS62145165A

JPS62145165A - 光の位相変調を利用した免疫反応の測定方法および装置

Info

Publication number: JPS62145165A
Application number: JP60285819A
Authority: JP
Inventors: Toshimitsu Musha; 利光武者
Original assignee: Olympus Optical Co Ltd
Current assignee: Olympus Corp
Priority date: 1985-12-20
Filing date: 1985-12-20
Publication date: 1987-06-29
Also published as: DE3643108C2; DE3643108A1; JPH0580980B2; US4799796A

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】〔産業上の利用分野〕この発明は、抗原−抗体反応に基づく免疫反応を、微粒
子による散乱光の位相情報を利用して測定する方法およ
び装置に関する。

〔従来の技術〕

免疫物質、ホルモン、医薬品、免疫調節等生体内微量成
分の検出法として免疫反応の特異的選択反応を利用した
免疫分析法がある。この免疫分析法には大別して酵素や
放射性アイソトープを標識物質として用いる標識免疫分
析法と、抗原・抗体複合対を直接測定する非標識免疫分
析法との２つの方法があり、前者の標識免疫分析法とし
ては、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、エンザイムイ
ムノアッセイ（ＥＩＡ）、フルオロイムノアッセイ（Ｆ
ＩＡ）等がよく知られている。また、後者の非標識免疫
分析法としては、免疫電気泳動法、免疫拡散法、沈降法
等があり、例えば「臨床検査法提要」　（金井泉原著、
金井正光編著、金属出版）や、「臨床検査Ｊ　Ｖｏｌ　
、　２２．　Ｎｏ、５（１９７８）　、第４７１〜４８
７頁に詳しく説明されている。

更に、非標識免疫分析法の１つとして、ｒｌｍｍｕｎｏ
−ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　Ｊ　、Ｖｏｌ、　１２．　Ｎｏ
、４（１９７５）　、第３４９〜３５１頁には、抗体ま
たは抗原を表面に固定させた微粒子を被測定液中の抗原
または抗体と反応させ、凝集粒子の大きさに比例して減
少するブラウン運動の指標となる平均拡散定数を、レー
ザ光の散乱光のスペクトル幅の変化から求めることによ
り抗原または抗体を定量分析する方法が開示されている
。

〔発明が解決しようとする問題点〕

しかしながら、上述した標識免疫分析法にあっては、高
感度であるが、測定に長時間を要するうえに標識試薬が
高価であるため、検査コ′ストが高くなるという問題が
あり、また特にＲＩＡにおいてはアイソトープの取扱い
や廃棄物処理等において種々の制限があるという問題が
ある。

また、非標識免疫分析法として、抗体または抗原を固定
した微粒子を用いないものにあっては、簡便ではあるが
、感度、定量性、再現性の点て精密測定としては不十分
であると共に、測定時間が長くなるという問題がある。

更に、上述した抗体または抗原を固定した微粒子を用い
るものにあっては、標識試薬を用いない利点はあるが、
微粒子のブラウン運動によるドツプラ効果によって入射
光のスペクトルが広がるのを分光計を用いて検出してい
るため、装置が大形で高価となる問題があると共に、分
光計を機械的に駆動する際に誤差が生じ、感度および再
現性が悪くなるという問題がある。

このような従来の問題点を解決するため、発明者は直線
偏光された光が微粒子により散乱を受けると、散乱光の
偏光状態が抗原−抗体反応と密接な関係にあることを利
用して、その散乱光を入射光の偏光面に対して直交する
偏光面を有する検光子を介して検知し、その検知出力に
基づいて抗原−抗体反応を測定する方法を提案した。

この方法によれば、高価な標識試薬や高価でかつ大形な
分光計を用いずに、高い精度および再現性を以って順次
の試料の測定を能率良く行うことができ、しかも測定時
間の短縮、抗原−抗体反応測定の自動化が可能であると
共に抗原−抗体反応について多くの有用な情報を得るこ
とができるという利点がある。

しかしながら、発明者による種々の実験によれば、上記
の方法には次のような問題点があることが判明した。す
なわち、測定感度を上げるために濃度を上げて散乱粒子
数を増やすと多重散乱が起こり、これがため抗原−抗体
反応が起こらなくても入射光と直交する偏光成分が検知
されて免疫反応を正確に測定することができなくなる。

この発明は、このような問題点に着目してなされたもの
で、高価な標識試薬や高価でかつ大形な分光計を用いず
に、高い精度および再現性を以って順次の試料の測定を
正確かつ能率良く行うことができ、しかも測定時間の短
縮、抗原−抗体反応測定の自動化が可能な免疫反応の測
定方法およびこのような方法を実施する装置を提供する
ことを目的とする。

〔問題点を解決するための手段〕

上記目的を達成するため、この発明の免疫反応測定方法
は、少なくとも抗原および抗体を含む反応液に直線偏光
された光を投射し、その入射光の抗原−抗体反応により
生成される微粒子による散乱光または反応液に加えた抗
体または抗原を固定した微粒子の抗原−抗体反応によっ
て生じる散乱光の前記入射光の偏光方向と異なる偏光方
向の成分と、前記入射光の位相を所定の変調周波数で変
調した位相変調光との混合光を検知し、その検知出力を
前記変調周波数に基づいて信号処理して抗原−抗体反応
を測定することを特徴とするものである。

更に、この発明は、少なくとも抗原および抗体を含む反
応液に光を投射し、抗原−抗体反応により生成される凝
集微粒子による散乱光または反応液に加えた抗体または
抗原を固定した微粒子の抗原−抗体反応によって生じる
凝集微粒子による散乱光に基づいて抗原−抗体反応を測
定する装置において、前記抗原−抗体反応を行う反応液を収容するセルと、このセルに直線偏光された光を入射させる光源装置と、前記セルの入射光の一部を分離し、その分離した光の位
相を所定の変調周波数で変調する位相変調装置と、この位相変調装置からの光と前記セルからの前方散乱光
との混合光を、前記入射光の偏光面と直交する偏光面を
有する検光子を介して受光する光検出装置と、この光検出装置の出力信号を、前記位相変調装置におけ
る変調周波数に基づいて信号処理し、その出力信号に基
づいて抗原−抗体反応を測定する手段とを具えることを
特徴とするものである。

〔作　用〕

反応液を収容するセルに直線偏光した光を入射させると
、その光は反応液中の微粒子により散乱され、その散乱
光の偏光状態は微粒子の凝集状態に応じて変化すること
になる。互いに凝集していない微粒子は球形であるため
、散乱光は入射光と同じ面内に直線偏光している。これ
に対し、抗原−抗体反応が起こり、微粒子が互いに凝集
すると、粒子塊は球形とはならなくなるから光学的に異
方性を呈することになり、散乱光は入射光とは異なる偏
光成分をもち、かつ位相にゆらぎを生じない。

散乱光が一回散乱光のみであれば、これを入射光の偏光
面と異なる、例えば直交する偏光面を有する検光子を介
して光検出器で受光すれば、光検出器には凝集した粒子
塊の散乱光のみが入射し、しかもその出力は反応液中の
微粒子の凝集状態すなわち抗原−抗体反応の状態に応じ
て変化するので、その出力に基づいて免疫反応を測定す
ることができる。

しかしながら、特に抗体または抗原を固定した微粒子を
用いる場合において、例えば測定感度を上げるために粒
子濃度を高めると多重散乱光が発生する。この多重散乱
光は、その位相が微粒子が球形、すなわち凝集しない場
合でもランダムに変化する。このため上述したように、
凝集粒子による一回散乱光を入射光と直交する偏光面を
有する検光子を介して光検出器で受光するようにしても
、非凝集粒子による多重散乱光を検知してしまい、これ
がため精度の高い測定ができなくなる。

この発明では、非凝集粒子による多重散乱光の位相がラ
ンダムに変化するのに着目し、セルへの入射光の一部を
分離してこれを位相変調し、この位相変調した光をセル
からの散乱光に加えて検光子を介して光検出器で受光し
、その出力を位相変調した光の変調周波数に基づいて信
号処理することにより、凝集粒子による一回数乱光成分
を分離して検出する。

ここで、光検出器の受光面での入射光の電界強度Ｅは、Ｅ＝Ｅ、ｃｏｓ　［：ａ＋ｔ＋φ＋］　＋　Ｂ２ｃｏｓ
　［ωｔ＋φ（ｔ）］十　　Ｂ５０Ｏ８〔ωｔ＋ａｃｏ
ｓ　　の　０１＋　φ　３　〕　　・・・（１）となる
。なお、ε、ＣＯＳ　（ωｔ＋φ１〕は凝集粒子による
一回散乱光の電界強度を表し、φ１は位ト目定数を表し
、Ｅ２ｃｏｓ　［ωｔ＋φ（ｔ）〕は非凝集粒子による
多重散乱光の電界強度を表し、φ（１）　はそのランダ
ムな位相成分を表し、Ｂ３ｃｏｓ　［：ωｔ＋ａｃｏｓ
ａ＋。ｔ＋φ３〕は入射光をａｃｏｓω。ｔて位相変調
した光の電界強度を表し、φ３は一般にはφ１と異なる
位相定数を表す。

２乗検波特性を持った光検出器の出力信号Ｅ２は次のよ
うに表される。

上記（３）式で周波数（２ｎ−１）ω。で変動する成分
の振幅は、８１８３５ｉｎ（φ、−φ３）Ｊ２．−１　（ａ）　・
（４）である。また、周波数２ｎω。で変動する成分の
振幅は、 ε、Ｂ３ｃｏｓ（φ１−φ３）Ｊ２ｎ（ａ）　　’・・
　（５）である。したがって、実際に光検出器の出力信
号を角周波数ω。、２ω。、３ω。、４ω。、・・・つ
まりｍω。

（ｍは自然数）で変動する成分を検出すると、凝集粒子
の一回散乱光を検出することができる。

〔実施例〕

第１図はこの発明による免疫反応測定装置の一実施例の
構成を示すものである。この実施例では、コヒーレント
光を放射する光源１として波長５３２、８ｎｍのＨｅ−
Ｎｅガスレーザを用いる。コヒーレント光を放射する光
源１としては、このようなガスレーザの他に半導体レー
ザのような固体レーザを用いることもできる。光源１か
ら放射されるレーザ光束２は、例えばグラントムソンプ
リズムより成る偏光子３に通して直線偏光とした後、ハ
ーフミラ−４により光束５と光束６とに分離し、その一
方の光束５を集光レンズ７を経て透明なセル８に投射す
る。

セル８中には、表面に抗体または抗原を固定した球状の
微粒子、例えば表面に免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）を固
定したポリスチレンラテックス粒子を分散させた緩衝液
に、抗原または抗体を含む被検液を加えて作成した抗原
−抗体反応液９を収容する。したがって、セル８中で抗
原−抗体反応が起こり、微粒子間に相互作用が生じると
、微粒子が相互に付着するため、散乱光の偏光状態が変
化する。このセル８中の微粒子による前方散乱光を、一
対のスリット１０ａ、　ｌＯｂ、ハーフミラ−１１およ
び入射側に設けた偏光子３の偏光面と直交する偏光面を
有する検光子１２を経て光電子増倍管より成る光検出器
１３に入射させる。

また、ハーフミラ−４によって分離した他方の光束６は
、反射ミラー１４で反射させた後、１７２波長板１５を
通してその偏光面を９０”回転させて検光子１２の偏光
面と一致させ、その光を位相変調器１６により発振器１
７からの変調周波数ω。で位相変調してｃｏｓ　（ωｔ
＋ａｃｏｓω。ｔ＋φ、〕で変動する直線偏光を作り、
これを反射ミラー１８、ハーフミラ−１１および検光子
１２を経て光検出器１３に入射させる。

光検出器１３の出力信号は同期検波器１９に供給し、こ
こで発振器１７からの周波数ω。をもった参照信号によ
り同期検波し、その出力を表示装置２０に表示させる。

この実施例では、光検出器１３の出力信号を周波数ω。

または２ω０で同期検波する。なお、位相変調器１６に
おける変調振幅ａは、最大感度を得るために上記（４）
、（５）式が最大値をとるように調整する。

上記構成において、同期検波器１９の出力は凝集粒子の
一回散乱光、したがって粒子の凝集状態すなわち抗原濃
度にのみ依存することになる。したがって、抗原濃度既
知の試料について予め検量線を求めておけば、未知試料
における同期検波器１９の出力から抗原濃度を正確かつ
高精度で求めることができる。しかも、上記（４）、　
（５）式から明らかなように、光検出器１３の出力は′
Ｆ２１とＥ３との積になるので、Ｅ３を大きくとれば同
期検波出力を増幅することができる。また、散乱粒子数
を増やしても非凝集粒子による多重散乱光の影響がない
ので、粒子濃度を高めることによって光検出器１３の感
度を増大させて高感度の測定を行うことができる。

第２図ＡおよびＢは第１図に示した位相変調器１６の二
つの例を示すものである。位相変調器１６は、ポッケル
ス効果を利用したもので、結晶構造の物質に電界を印加
することにより結晶の屈折率を変化させて透過光の位相
を変調するものである。第２図Ａにおいては、光が透過
する結晶構造の光学部材２１に、光路を挟むように一対
の電極２２ａ、　２２ｂを設け、これら電極間に発振器
１７からの周波数の。

の電界を印加するようにしたものである。また、第２Ｎ
８においては、光学部材２１０入射側および出射側端面
に一対の透明電極２３ａ、　２３ｂを設け、これら電極
間に同様に電界を印加するようにしたものである。

なお、この発明は上述した実施例にのみ限定されるもの
ではなく、幾多の変更または変形が可能である。例えば
、上述した説明では免疫グロブリンＧ　（ＩｇＧ）　に
ついて例示したが、免疫グロブリンＡ　（ＩｇＡ）　、
ＩｇＭ、　ＩｇＤ、　ＩｇＥ　、オーストラリア抗原、
梅毒抗原、インシュリンなどの抗原−抗体反応によって
凝集を生ずるすべての物質の測定に適用することができ
る。また、上述した実施例では、微粒子の表面に抗体を
固定して、被検体中の抗原を検出するようにしたが、微
粒子の表面に抗原を固定し、被検体中の抗体を検出する
こともできる。

更に、上述した実施例では、微粒子としてポリスチレン
ラテックス粒子を用いたが他の有機物粒子や、金属、ガ
ラスなどの無機物粒子を用いることもできる。また、上
述した実施例では抗原−抗体反応液の中に、最初から微
粒子を存在させたが、このような微粒子を用いずに、抗
原−抗体反応の結果として生ずる微粒子状生成物による
散乱光を利用することもできる。このような抗原−抗体
反応の実施例としては、抗原としてヒト絨毛ゴナドトロ
ピン（）ＩＣＧ）を用い、抗体として抗ヒト絨毛ゴナド
トロピン（抗ＨＣＧ）を用いる反応があり、この反応に
より生成される抗原−抗体複合体は微粒子として扱うこ
とができる。更に、抗原そのものを粒子として用いるこ
ともできる。このような抗原−抗体反応としては、抗原
としてカンディダ・アルビカンス（酵母）を用い、抗体
として抗力ンディダ・アルビカンスを用いる例や、他に
血球、細胞、微生物などを粒子として用いることもでき
る。

また、上述した実施例では、抗原−抗体反応液をセルに
収容して測定を行うバッチ方向としたが、抗原−抗体反
応液を連続的に流しながら測定を行うフロ一方式とする
ことも勿論可能である。更に、光源としてコヒーレント
な光を放射するレーザ光源を用いたが、インコヒーレン
トな光を放射する光源を用いることもできる。また、セ
ルへの入射光として直線偏光以外のものを用いることも
できる。

〔発明の効果〕

以上述べたように、この発明によれば直線偏光された光
を反応液に入射させると共にその入射光の一部を分離し
て位相変調し、反応液での散乱光の入射光と異なる偏光
成分と、位相変調した光とを検知して、その検知出力を
位相変調の周波数に基づいて信号処理するようにしたの
で、非凝集粒子による多重散乱光の影響を有効に除去す
ることができる。したがって、常に正確でかつ高精度の
測定を行うことができると共に、粒子濃度を高くして高
感度の測定を行うことができる。

【図面の簡単な説明】

第１図はこの発明による免疫反応測定装置の一実施例の
構成を示す線図、第２図ΔおよびＢは第１図に示す位相変調器の二つの例
の構成を示す斜視図である。１・・・光源　　　　　　３・・・偏光子４．１１・・
・ハーフミラ−７・・・集光レンズ訃・・セル　　　　
　　９・・・反応液１０ａ、　１０ｂ・・・スリット１２・・・検光子　　　　　１３・・・光検出器１４．
１８・・・反射ミラー ■訃・・１７２波長板　　　１６・・・位相変調器１７
・・・発振器　　　　　１９・・・同期検波器２０・・
・表示装置

Claims

【特許請求の範囲】１、少なくとも抗原および抗体を含む反応液に直線偏光
された光を投射し、その入射光の抗原−抗体反応により
生成される微粒子による散乱光または反応液に加えた抗
体または抗原を固定した微粒子の抗原−抗体反応によっ
て生じる散乱光の前記入射光の偏光方向と異なる偏光方
向の成分と、前記入射光の位相を所定の変調周波数で変
調した位相変調光との混合光を検知し、その検知出力を
前記変調周波数に基づいて信号処理して抗原−抗体反応
を測定することを特徴とする光の位相変調を利用した免
疫反応の測定方法。２、少なくとも抗原および抗体を含む反応液に光を投射
し、抗原−抗体反応により生成される凝集微粒子による
散乱光または反応液に加えた抗体または抗原を固定した
微粒子の抗原−抗体反応によって生じる凝集微粒子によ
る散乱光に基づいて抗原−抗体反応を測定する装置にお
いて、前記抗原−抗体反応を行う反応液を収容するセルと、このセルに直線偏光された光を入射させる光源装置と、前記セルの入射光の一部を分離し、その分離した光の位相を所定の変調周波数で変調する位相変調
装置と、この位相変調装置からの光と前記セルからの前方散乱光との混合光を、前記入射光の偏光面と直交
する偏光面を有する検光子を介して受光する光検出装置
と、この光検出装置の出力信号を、前記位相変調装置における変調周波数に基づいて信号処理し、その
出力信号に基づいて抗原−抗体反応を測定する手段とを
具えることを特徴とする光の位相変調を利用した免疫反
応の測定装置。