DE3686409T2

DE3686409T2 - Substratenansatz von mischungen in einem 2-amino-2-methyl-1-propanil enthaltenden puffer fuer alkalin-phosphatase-probe.

Info

Publication number: DE3686409T2
Application number: DE8686117629T
Authority: DE
Inventors: Jeffrey W Steaffens
Original assignee: Abbott Laboratories
Current assignee: Abbott Laboratories
Priority date: 1986-01-08
Filing date: 1986-12-18
Publication date: 1993-02-18
Anticipated expiration: 2006-12-19
Also published as: AU595570B2; US4748115A; EP0228663A2; ES2005545A6; AU6713387A; JPH0695958B2; JPS62166899A; CA1293677C; EP0228663B1; EP0228663A3; ATE79411T1; DE3686409D1

Description

Grundlage

Die vorliegende Erfindung betrifft generell Substratformulierungen für Enzymtests, und sie betrifft insbesondere Substratformulierungen für Tests, bei welchen alkalische Phosphatase verwendet wird, und welche Substratformulierungen ein phosphatiertes Indigo-Cogener und ein Tetrazoliumsalz enthalten.
Tests für den Nachweis von Substanzen, welche in kleinen Mengen vorliegen, sind auf die Verwendung von Indikatoren angewiesen. Bei biologischen Tests umfaßt eine Art von Indikator die Verwendung eines an eine Sonde gebundenen Enzyms, welche Sonde sich bevorzugt an eine nachzuweisende Zielsubstanz bindet. Sobald das Enzym an die Zielsubstanz gebunden ist, kann es dadurch als eine Anzeigegruppe fungieren, daß es eine Reaktion mit einem Substrat katalysiert, wobei ein Produkt entsteht, welches mit dem unbewaffneten Auge oder mit einer Maschine leicht feststellbar ist.
Ein Beispiel eines Enzyms, welches befähigt ist, als Anzeigegruppe zu dienen, ist alkalische Phosphatase. Der Ausdruck "alkalische Phosphatase" bezieht sich generell auf eine Gruppe nicht-spezifischer Enzyme, welche Phosphorsäuremonoester über einen pH-Bereich von etwa 8,5 bis 10,5 hydrolysieren.
Obgleich eine Anzahl von Substraten mit einem Enzym vom Typus einer alkalischen Phosphatase umgesetzt werden kann, ergibt die Umsetzung mit einem Indigo-Cogener, vorzugsweise einem 3-Indolylphosphatsalz, wie z.B. 5-Brom-4-chlor-3-indolylphosphat (BCIP), ein besonders nützliches Signal. Die alkalische Phosphatase baut das BCIP zu einem organischen Rest und einem Phosphat ab. Die organischen Reste dimerisieren sich unter Bildung eines blaugefärbten Produktes. Ein Transphosphorylierungspuffer entfernt das Phosphat, welches durch das Enzym aus dem Indigo-Cogener übermittelt worden ist, wodurch somit eine Anhäufung von Phosphat durch das Enzym und eine sich daraus ergebende Enzymhemmung vermieden werden. Transphosphorylierungspuffer, welche in solchen Reaktionen nützlich sind, umfassen 2-Amino-2-methyl-1-propanol (2A2M1P), Diethanolamin, Ethanaminoethanol und 2-Amino-2-methyl-1,3-propandiol. Siehe Starkweather, US-PS Nr. 4 030 995; und GB-PS Nr. 1 263 202.
Eine Verstärkung der Reaktion der alkalischen Phosphatase mit dem ECIP kann durch Zugabe von Nitroblautetrazolium (NBT) erreicht werden. Die Produkte der Reaktion der alkalischen Phosphatase mit dem BCIP reduzieren das NBT zu unlöslichem blauem Diformazan, welches ein stärkeres Signal erzeugen kann als jenes, welches durch die alleinigen BCIP-Reaktionsprodukte produziert wird. Siehe z.B. Parent et al., Phytoprotection, 66, 53-57 (1985). In einer wäßrigen Substratformilierung, welche BCIP und NBT enthält, bildet sich jedoch innerhalb von etwa 24 h nach dem Ansetzen der Formulierung ein Niederschlag. Die Bildung dieses Niederschlages ist mit einem Aktivitätsverlust verbunden, welcher die getrennte Verpackung von NBT, BCIP und Puffer in Kits für die Herstellung von Substratformulierungen für die Verwendung mit alkalischer Phosphatase erfordert.

Zusammenfassung der Erfindung

Durch die vorliegende Erfindung wird eine stabile Substratformulierung für einen Test, bei welchem alkalische Phosphatase verwendet wird, zur Verfügung gestellt. Diese Formulierung ist ausreichend stabil, so daß das NBT, das BCIP und der Puffer vorvermischt und als eine Einheit verpackt werden konnten. Die Formulierung enthält ein phosphatiertes Indol-Cogener, ein Tetrazoliumsalz in einer Konzentration, welche zum Erzeugen eines feststellbaren Signals bei der Reaktion mit dem phosphatierten Indol-Cogener wirksam ist, und 2-Amino-2-methyl- -1-propanol in einer Konzentration, welche zum Puffern einer Reaktion zwischen dem phosphatierten Indol-Cogener und dem Tetrazoliumsalz in wäßriger Lösung und innerhalb eines pH-Bereiches wirksam ist, bei welchem die Reaktion fortschreiten kann.
Es wird derzeit bevorzugt, daß die Substratformulierung gemäß der vorliegenden Erfindung das 5-Brom-4-chlor-3-indolylphosphat in einer Konzentration zwischen etwa 1,0 mM und etwa 10 mM, das Nitroblautetrazolium in einer Konzentration zwischen etwa 0,05 mM und etwa 0,5 mM und das 2-Amino-2-methyl-1-propanol in einer Konzentration zwischen etwa 0,1 M und etwa 1,0 M enthält. Die Substratfoimulierung kann auch MgCl&sub2; in einer Kolnzentration von etwa 1,0 mM enthalten.
Es wird besonders bevorzugt, daß die Substratformulierung gemäß der vorliegenden Erfindung das 5-Brom-4-chlor-3-indolylphosphat in einer Konzentration von 1,2 mM, das Nitroblautetrazolium in einer Konzentration von 0,17 mM, das 2-Amino-2-methyl-1-propanol in einer Konzentration von 100 mM, das MgCl&sub2; in einer Konzentration von 1 mM und Natriumazid in einer Konzentration von 0,02 % enthält.

Kurze Beschreibung der Zeichnungen

Die Fig. 1 zeigt eine graphische Darstellung der Geschwindigkeit der Substratfarbbildung in einen Test unter Verwendung von alkalischer Phosphatase, der entweder in einen 2A2M1P-Puffer oder in Tris-Puffer durchgeführt wird.
Die Fig. 2 zeigt eine graphische Darstellung der Ergebnisse von Tests, die in 2A2M1P-Puffer bei verschiedenen pH-Werten durchgeführt worden sind; und
die Fig. 3 zeigt eine graphische Darstellung der Absorptionsspektren von Produkten, die durch die Reaktion von Substraten mit alkalischer Phosphatase entweder in 2A2M1P-Puffer oder in Tris-Puffer gebildet worden sind.

Eingehende Beschreibung

Obgleich das 2A2M1P für Tests mit alkalischer Phosphatase nützlich ist, die in Abwesenheit von NBT durchgeführt werden (Starkweather, supra), und für die Lagerung von alkalischer Phosphatase als solcher nützlich ist [McComb et al. in "Alkaline Phosphatase", Plenum Press, New York, unter 7.5.7.3 (1979)], wird angenommen, daß es vor der vorliegenden Erfindung nicht bekannt war, daß sich aus der Verwendung des 2A2M1P in Substratformulierungen für Tests mit alkalischer Phosphatase, welche NBT enthalten, ein besonderer Vorteil ergibt. Demzufolge wird generell ein 2-Amino-2-(hydroxymethyl)-1,3-propandiol-(Tris)-Puffer als Puffer in solchen Formulierungen verwendet, und dies trotz der sich daraus ergebenden Unbequemlichkeit, Kosten und potentiellen Ungenauigkeit, die allesamt das Ergebnis der Notwendigkeit sind, daß man die Komponenten der Substratformulierung getrennt verpacken muß, um die Bildung eines Niederschlages zu vermeiden.
Im Beispiel 1 werden Substratformulierungen untersucht, um die Ursache der Bildung des Niederschlages zu lokalisieren. Im Beispiel 2 werden modifizierte Formen des Tris-Puffers auf Niederschlagsbildung untersucht. Im Beispiel 3 werden organische Lösungsmittel zu den mit Tris gepufferten Substratformulierungen zugesetzt, um zu versuchen, die Niederschlagsbildung dadurch zu hemmen. Im Beispiel 4 wird eine Anzahl von Puffern erfolglos als Alternativen zu dem Tris in Betracht gezogen, und das 2A2M1P wird als jener Puffer identifiziert, der in einzigattiger Weise geeignet ist, die Substratformulierungen für Tests unter Verwendung von alkalischer Phosphatase zu stabilisieren. Im Beispiel 5 wird die Farbbildung in dem BCIP/NBT-Test für eine mit 2A2M1P gepufferte Formulierung mit jener für eine mit Tris gepufferte Formulierung verglichen. Im Beispiel 6 werden die Konzentrationen des BCIP und des NBT hinsichtlich ihrer Wirkung auf die Stärke des Signals und auf die Stabilität in dem 2A2M1P untersucht. Im Beispiel 7 werden verschiedene Substratpräparate hinsichtlich ihrer Langzeitbeständigkeit in 2A2M1P untersucht. Im Beispiel 8 werden die optimalen Gebrauchsbedingungen für den 2A2M1P-Puffer untersucht. Im Beispiel 9 wird die Beständigkeit einer bevorzugten Substratlösung des Beispiels 8 untersucht. Im Beispiel 10 wird ein spektrophotometrischer Vergleich zwischen dem Produkt des mit dem 2A2M1P gepufferten Substrates und dem Produkt des mit Tris gepufferten Substrates angestellt. Im Beispiel 11 wird die vorliegende Erfindung hinsichtlich ihrer Anwendung in einem Festphasentest untersucht. Im Beispiel 12 wird die vorliegende Erfindung hinsichtlich ihrer Anwendung in einem "Enzyme-Linked Immuno-Sorbent Assay" (ELISA)-Test untersucht. Im Beispiel 13 wird die vorliegende Erfindung hinsichtlich ihrer Anwendung in einem Western-Blot-Assay untersucht.

Beispiel 1

Um die Ursache der Niederschlagsbildung zu bestimmen, wurden Lösungen in 0,1 M Diethanolamin (pH 9,8) hergestellt, welche enthielten: 1,4 mM BCIP ohne NBT; 0,24 mM NBT ohne BCIP; oder 1,4 mM BCIP und 0,24 mM NBT. Diese Lösungen wurden auf die Bildung von Niederschlägen bei Zimmertemperatur beobachtet.
Kein Niederschlag wurde in der Lösung beobachtet, welche 1, 4 mM BCIP ohne NBT enthielt.
Ein schwerer, blauer Niederschlag wurde in der Lösung festgestellt, welche 0,24 mM NBT bei Fehlen von BCIP enthielt.
Ein schwerer, blauer Niederschlag wurde auch in der Lösung festgestellt, welche sowohl 1,4 mM BCIP als auch 0,24 mM NBT enthielt.
Daraus wurde geschlossen, daß das Vorliegen von NBT zu der Bildung des unerwünschten Niederschlages führte.

Beispiel 2

Um festzustellen, ob eine modifizierte Form von Tris-Puffer in dem BCIP/NBT-Test ein zufriedenstellendes Verhalten zeigen würde, und dennoch für die Bildung eines Niederschlages während der Lagerung nicht anfallig sein würde, wurden die folgenden Versuche durchgeführt.
Es wurden Tests mit Substratformulierungen durchgeführt, indem man das Enzymkonjugat und das Substrat in einem Proberöhrchen vermischte, um die Substratformulierung von Variablen zu isolieren, welche durch andere Kopponenten von Standardtests eingeführt werden könnten.
In einem Proberöhrchentest wurden 20 ul des Konjugates [Verdünnung von 1:1000 des Anti-Human-Antikörpers, der an alkalische Phosphatase konjugiert war, und der in einer Konzentration von 0,5 mg/ml von der Firma Kirkegaard & Perry Laboratories, Inc., Gaithersburg, Maryland, geliefert worden war] mit 1,0 ml des Substrates in einer Gießwanne vermischt, und die Farbentwicklung wurde bei einer Wellenlänge von 575 nm überwacht. Ein quantitativer Vergleich der Reaktionsgeschwindigkeiten kann durch Berechnen der Zunahme in der Absorption je min (ΔA/min) anhand der folgenden Gleichung angestellt werden.
worin A die Absorption bei 575 nm ist, und X der Zeitpunkt ist, zu welchem die Probe entnommen wird.
Eine anfängliche Formulierung von mit Tris gepuffertem Substrat enthielt: 1,4 mM BCIP; 0,24 mM NBT; 100 mM Tris-Base (pH 9,6); und 50 mM MgCl&sub2;. Es wurden verschiedene Konzentrationen von Tris in Lösungen mit verschiedenen pH-Werten miteinander verglichen. Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 angeführt, in welcher eine 100 mM-Tris-Pufferlösung 50 mM MgCl&sub2;, 1,4 mM BCIP und 0,24 mM NBT enthielt, und in welcher eine 1,0 M Tris-Pufferlösung 1,4 mM BCIP und 0,24 mM NBT enthielt. TABELLE 1 ΔA&sub5;&sub7;&sub5;/min 0,1 M Tris ND = nicht bestimmt
Wie aus der Tabelle 1 zu ersehen ist, wurde festgestellt, daß eine 1,0 M Tris-Lösung mit einem pH-Wert von 9,6 ein besseres Verhalten als die ursprüngliche Formulierung zeigte. Bei einem pH-Wert von 9,6 ist das Tris (pKa = 8,05) jedoch ein gutes Stück außerhalb seines wirksamen Pufferbereiches. Es erwies sich somit, daß keine Tris-Lösungen innerhalb des Bereiches von pH-Werten nützlich waren, innerhalb dessen das Tris ein wirksamer Puffer ist.

Beispiel 3

In dem Bestreben, die Bildung des in den Lösungen des Beispiels 2 festgestellten Niederschlages zu verhindern, wurden zu dem mit Tris gepufferten Substrat organische Lösungsmittel zugesetzt. Die Zugabe so kleiner bangen wie 50 mM Ethanol, 50 mM Dimethylformamid oder 50 mM Dimethylsulfoxid verstärkte bereits die Bildung des Niederschlages, statt dieselbe zu hemmen. Diese Ergebnisse zeigen somit, daß die Zugabe von BCIP und NBT als Konzentrat in organischen Lösungsmitteln das Problem der Niederschlagsbildung nicht löst.

Beispiel 4

In dem Bestreben, eine Alternative zu dem Tris zur Verfügung zu stellen, welche die Stabilität der Substratformulierung erhöhen würde, wurden mehare Puffer untersucht.
Alle Puffer wurden bei einer Konzentration von 100 mM geprüft, sie waren auf einen pH-Wert von 9,5 eingestellt worden, und sie enthielten 1 mM MgCl&sub2;. Die Puffer wurden bei 45ºC inkubiert. In jedem Substratpuffer betrug die Konzentration des BCIP 1, 4 mM, und die Konzentration des NBT betrug 0,24 mM. Parallel zu einem Stabilitätstest für jeden Puffer wurde auch die Wirksamkeit jeder gelagerten Lösung in einem HCG-Test geprüft.
In einem Festphasentest wurde eine Mehrzahl von 1m wesentlichen kugelförmigen, festen Teilchen, welche einen mittleren Durchmesser von etwa 1,0 bis etwa 5 um aufwiesen, auf einer porösen Matrix aus einem Fasermaterial immobilisiert. Das Fasermaterial kann aus Glas, mit Polystyrol überzogenem Glas, Zellulose, Nylon oder anderen Fasermaterialien angefertigt sein, von welchen es bekannt ist, daß sie mit Teilchen in Wechselwirkung treten und dieselben immobilisieren. Die Teilchen können aus Polystyrol, Polymethacrylat, Polypropylen, Latex, Polyacrylnitril, Polycarbonat oder aus ähnlichen Materialien zusammengesetzt sein, welche eine Oberfläche aufweisen, welche befähigt ist, eine zu analysierende Substanz festzuhalten.
Für einen Test auf Humanes Choriongonadotropin (HCG) wurden Mikroteilchen hergestellt, indem 100 ul von Mikroteilchen aus carboxylatmodifiziertem Polystyrol (im Handel von der Firma Seragen, Indianapolis, Indiana, erhältlich) zu 1, 0 ml von 5 mM Methylethylsulfonat-(MES)-Puffer (pH 4,75) und 75 ul von Anti-HCG-Antikörperlösung (2 mg/ml) zugesetzt wurden. Die Lösung wurde gerührt, bevor 100 ml von 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl-carbodiimid-HCl (EDAC) einer Konzentration von 0,5 mg/ml H&sub2;O zugesetzt wurden. Die Lösung wurde über Nacht bei 2 bis 8ºC gerührt, wonach die Mikroteilchen durch Zentrifugieren isoliert, zweiinal mit einer 0,1%igen Tween-20-Lösung gewaschen und erneut in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (0,01 M KH&sub2;PO&sub4; und 0,15 M NaCl vom pH 7,2) zur Erzielung einer 0,125%igen Lösung suspendiert wurden. Nach dem erneuten Suspendieren in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) wurden die Teilchen für den späteren Gebrauch bei 2 bis 8ºC gelagert.
50 ul der mit dem Antikörper überzogenen Mikroteilchen wurden tropfenweise auf die Mitte eines Whatman-GF/D-Glasfilters aufgebracht. Dann wurden 100 ul Schweineseren zugesetzt, und das Filter und die Mikroteilchen wurden während 30 min in einer feuchten Kammer bei Zimmertemperatur inkubiert. Nach dieser Zeit wurde das Filter dreimal in 300 ul PBS-Puffer gewaschen. Das Filter wurde dann bis zum Gebrauch in einer feuchten Kammer gelagert. Die Tatsache, daß die Mikioteilchen irreversibel auf den Glasfasern des Filtermaterials gefangen oder agglomeriert waren, wurde durch Rasterelektronenmikroskopie bestätigt.
Antikörper-Enzym-Konjugate wurden nach der Verfahrensweise von Kearney et al., Immunology, 123, 1548 (1979), aus monoklonalen Mause-Anti-HCG- -Antikörpern hergestellt. Die alkalische Phosphatase wurde von der Firma Boehringer Mannheim GmbH, Indianapolis, Indiana, bezogen.
Das Glasfiltermaterial, welches die mit dem Antikörper überzogenen Mikroteilchen enthielt, wurde zu im wesentlichen kreisförmigen "Scheiben" eines Durchmessers von 12 mm zerschnitten, und die Scheiben wurden in Berürung mit einem saugfähigen, löschpapierartigen ("blotter"-) Material gebracht, um die überschüssige Flüssigkeit zu absorbieren. Anschließend wurden 5 Tropfen (etwa 280 ul) von Standardproben eines Human-Urins (im Handel erhältlich von dem Scripps Institute, San Diego, California), welche Null, oder 50 oder 100 mIE:/ml-Mengen von HCG enthielten, durch ein oberhalb jeder Matrix angeordnetes Vorfilter zu der Matrix zugegeben. Dann wurden zu jeder Matrix durch das Vorfilter drei Tropfen des Antikörper-Enzym-Konjugates zugegeben, und jede Matrix wurde bei Zimmertemperatur während etwa 2 min inkubiert. Als nächstes wurde das Vorfilter entfernt, und 1,0 ml einer Detergenswaschlösung (mit einem Gehalt an Citrat, Phosphat und Tween 20) wurden zu jeder Matrix hinzugefügt, um jeglichen Überschuß des Antikörper-Enzym-Konjugates zu entfernen. Die Matrix wurde erneut auf ein Löschpapier gelegt, und 5 Tropfen (etwa 250 ul) des zu untersuchenden Substratpuffers wurden zu jeder Matrix zugegeben. Nach 2 min wurde 1 ml der Waschlösung zugesetzt, und jede Matrix wurde visuell auf Farbentwicklung geprüft. Die Farbentwicklung wurde für die Testproben beobachtet, welche HCG enthielten, und die der Farbentwicklung entsprechende, dekadische Extinktion wurde instrumentell, unter Verwendung eines herkömmlichen Spektrophotometers, bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 angeführt, in welcher die Anzahl der Tage der Inkubation bei 45ºC und der Grund, warum der betreffende Puffer abgelehnt wird, angegeben sind. TABELLE 2 Puffer Testperiode (in Tagen, bei 45ºC) Grund, warum der betreffende Puffer abzulehnen ist Natriumborat Natriumcarbonat Triethanolamin Ethanolamin Glycin Tris-(Hydroxyethyl)-aminomethan Phenol CHES (2-[N-Cyclohexylamino]ethansulfonsäure Piperazin Alanin 2-Amino-2-methyl-1,3-propandiol Keine Farbentwicklung nach 3 Tagen bei 45ºC Schlechte Farbentwicklung nach 20 Tagen bei 45ºC Entwicklung von Teilchen nach 20 Tagen bei 45ºC Sofortige Bildung unlöslicher Niederschläge Entwicklung von Teilchen innerhalb von 4 Tagen bei 45ºC
Wie aus der Tabelle 2 zu ersehen ist, hat sich jeder dieser Puffer als unbefriedigend erwiesen, und zwar entweder durch Hemmung des Enzyms oder durch Verstärkung der Präzipitation des Chromogens. In Phenol und CHES war das NBT sogar vor der Inkubation (d.h. nach "0" Tagen) unlöslich.
In Probenröhrchentests, wie sie im Beispiel 2 beschrieben sind, wurden Tris-Pufferlösungen van pH 9,6 und mit Konzentrationen von 0,1 M und 1,0 M mit 1,0M Diethanolamin (pH 9,3) und 0,1 M 2A2M1P (pH 9,8) in einer Substratformulierung von 11,4 mM BCIP und 0,24 mM NBT verglichen. Die Ergebnisse sind in der Tabelle 3 angeführt. TABELLE 3 Puffer Kommentar 0,1 M Tris (pH 9,6) 0,1 M Diethanolamin (pH 9,3) Geschwindigkeit der Farbbildung langsam: (ΔA&sub5;&sub7;&sub5;/min = 0,17). Das Präzipitat bildete sich nach mehreren (annähernd 7) Tagen bei Zimmertemperatur oder innerhalb von 24 h bei 45ºC. Geschwindigkeit der Farbbildung gut:(ΔA&sub5;&sub7;&sub5;/min = 0,30). Das Präzipitat bildete sich nach mehreren (etwa 3) Tagen bei Zimmertemperatur. Geschwindigkeit der Farbbildung sehr gut: (ΔA&sub5;&sub7;&sub5;/min = 0,34). Das Präzipitat bildete sich innerhalb von 24h bei Zimmertemperatur. Geschwindigkeit der Farbbildung gut: (ΔA&sub5;&sub7;&sub5;/min = 0,30). Stabil bei Zimmertemperatur während wenigstens 2 Monaten. Stabil bei 45ºC während 7 Tagen.
In der Tabelle 2 wurden 1,0 M Tris und 1,0 M Diethanolamin wegen des Erscheinens eines Niederschlages bei Zimmertemperatur innerhalb einiger weniger Tage bei 45ºC erst gar nicht geprüft.
So wurde beobachtet, daß Substrate, welche in 1,0 M Tris hergestellt worden waren, viel leichter als jene ausfielen, die in 0,1 M Tris hergestellt worden waren. Was aber noch wichtiger ist, liegt darin, daß bei diesen Versuchen das 2A2M1P der einzige Puffer war, der in Gegenwart einer Substratformulierung (eines Chromogens) eine Kombination von Wirksamkeit und brauchbarer Lagerbeständigkeit zeigte.

Beispiel 5

In einer anderen Versuchsreihe wurde die Geschwindigkeit der Farbbildung in Substraten, die in 2A2M1P hergestellt worden waren, mit der Geschwindigkeit der Farbbildung des gleichen Substrates in Tris verglichen. Für jeden Test wurden 20 ul des Konjugates (wie im Beispiel 2) mit 1,0 ml der Substratformulierung vermischt, und die Farbentwicklung wurde spektrophotometrisch überwacht. Die Lösungen waren: 0,1 M 2A2M1P (pH 9,8), 1,4 mM BCIP, 0,24 mM NBT und 1,0 mM MgCl&sub2;; und 0,1 M Tris (pH 9,6), 1,4 mM BCIP, 0,24 mM NBT und 50 mM MgCl&sub2;.
In Kurven, die durch Auftragen der optischen Dichte (O.D.) bei 575 nm gegen die Zeit erhalten worden sind, und welche in der Fig. 1 dargestellt sind, wobei die Ergebnisse für das 2A2M1P als Kurve A aufgetragen sind, und wobei die Ergebnisse für Tris als Kurve B aufgetragen sind, zeigt es sich, daß die Geschwindigkeit der Farbentwicklung nach 2 min ungefähr linear ist.
Unter Anwendung der Gleichung (1) ergibt sich für 0,1 M 2A2M1P
Für 0,1 Tris

Beispiel 6

Es wurden Versuche durchgeführt, um die Konzentrationen von BCIP und NBT zu bestimmen, welche ein starkes Signal einer annehmbaren Farbe und eine verstärkte Stabilitat in 2A2M1P ergeben würden.
Um die Konzentrationen von BCIP und NBT zu bestimmen, welche diesen Anforderungen entsprechen, wurde eine Matrix von neun Substraten in 0,1 M 2A2M1P (pH 9,8), mit einem Gehalt von 1,0 mM MgCl&sub2;, hergestellt. Die BCIP-Konzentrationen waren 2,3 mM, 1,4 mM oder 1,0 mM. Die NBT-Konzentrationen waren 0,24 mM, 0,10 mM oder 0,05 mM. Diese Substrate wurden sowohl in einem Proberöhrchentest, gemäß Beispiel 2, als auch in Tests auf einen Streptococcus der Gruppe A geprüft. Die Ergebnisse des Proberöhrchentests sind in Tabelle 4 als ΔA&sub5;&sub7;&sub5;/min dargestellt. TABELLE 4
Für die Tabelle 4 zeigte eine Bezugssubstratpufferformulierung (mit einem Gehalt von 0,1 M Tris (pH 9,6), 50 mM MgCl&sub2;, 1,4 mM BCIP und 0,24 mM NBT) einen Wert für ΔA&sub5;&sub7;&sub5;/min von 0,174.
In einem Test auf einen Streptccoccus der Gruppe A, dessen Ergebnisse in der Tabelle 5 aufscheinen, wurden 3 Tropfen einer Lösung von Streptokokkenextrakt (aus 5x10&sup4; Zellen je ml) zu einer Matrix hinzugefügt, an welche Polystyrol-Mikroteilchen gebunden waren, welche ihrerseits mit Kaninchen-Anti-Gruppen-A-Streptococcus-Antikörpern überzogen waren. Als nächstes wurden 3 Tropfen einer Lösung von Kaninchen-Anti-Gruppen-A- -Streptoccccus-Antikörpern, welche an alkalische Phosphatase konjugiert waren, zugesetzt. Die Matrix wurde gewaschen, die Substratformulierung wurde zugesetzt, und die Farbe wurde während 2 min entwickelt. Die Matrix wurde dann gewaschen, bevor die Farbintensität mit einem Gerät zum Ablesen des Reflexionsvermögens gemessen wurde. Die Ergebnisse sind in Tabelle 5 angeführt, wobei ein niedrigeres Reflexionsvermögen einen dünkleren Flecken anzeigt, und wobei eine Bezugspufferformulierung [0, 1 M Tris (pH 9,6); 50 mM MgCl&sub2;; 1,4 mM BCIP; und 0,24 mM NBT] in dem Test ein Reflexionsvermögen von 37,0 zeigte. TABELLE 5 Dunkles Purpurrot Dunkelblau Purpurrot Blau/Purpurrot Blau
Aus der Tabelle 5 ist zu ersehen, daß eine Verringerung des NBT auf 0,05 mM die Farbe des Niederschlages auf der Matrix von Pulpurrot auf Blau verschob. Obgleich mit dem Gerät zum Ablesen des Reflexionsvermögens kaum ein unterschied feststellbar war, wurde die blaue Farbe visuell nicht als so dunkel wie ein purpurroter Fleck mit vergleichbarem Reflexionsvermögen wahrgenommen. Drei Substratformulierungen wurden übereinstimmend deshalb ausgewählt, weil sie eine überlegene Leistung sowohl hinsichtlich der visuellen Wahrnehmung der Farbe als auch hinsichtlich der Messungen des optischen Reflexionsvermögens aufwiesen. Es waren dies: 1,4 mM BCIP, 0,24 mM NBT; 1,4 mM BCIP, 0,10 mM NBT; und 1,0 mM BCIP, 0,24 mM NBT.

Beispiel 7

Substratpräparationen wurden bei 45ºC inkubiert, um für eine Kurzzeitanzeige der Langzeitstabilität bei Zimmertemperatur zu sorgen.
Es wurde ein HCG-Test wie im Beispiel 4 beschrieben für jedes Substrat durchgeführt, welches in 0,1 M 2A2M1P (pH 9,8), 1,0 mM MgCl&sub2; (pH 9,8) angesetzt und bei 45ºC im Dunkeln und in Glasfläschchen gelagert wurde.
Die Tabelle 6 zeigt den Tag an, an welchem in den Substraten aus der BCIP/NBT-Matrix nach der Lagerung bei 45ºC ein sichtbarer Niederschlag erschien. TABELLE 6 Bildung eines Niederschlages bei 45ºC in einem Substrat mit Schwankungen in der Chromogenkonzentration 4 Tage
Aus der Tabelle 6 ist zu ersehen, daß die Substrate, welche 1,4 BCIP und 0,24 mM NBT in 0,1 M Tris, 0,1 M 2A2M1P und 0,1 M 2A2M1P enthielten, während vier Tagen stabil blieben. Wurde MgCl&sub2; zu den gleichen Lösungen zugesetzt, dann wurde bis zum Tag 12 kein Niederschlag festgestellt. Diese Untersuchungen weisen darauf hin, daß die Bildung des Niederschlages dadurch verzögert werden kann, daß man die Konzentration von BCIP und NBT - in Kombination mit der Zugabe von MgCl&sub2; - verringert.

BEISPIEL 8

Es wurden die optimalen Bedingungen für die Verwendung von 2A2M1P (pKa 9,3) als Puffer erforscht.
Aus der Fig. 2 ist zu ersehen, daß ein optimaler pH-Wert für ein in 2A2M1P hergestelltes Substrat bestimmt wurde. Die Substrate wurden in einem Röhrchentest (Kurve A), gemäß Beispiel 2, und in einem Test auf das Rubella-Virus mit einem hcchgradig positiven Serum, welches eine hohe enge an Antikörpern gegen das Rubella-Virus enthielt (Kurve B), sowie mit negativen Proben (Kurve C) geprüft. Ein in 0,1 M Tris vom pH 9,6 hergestelltes Substrat wurde als Kontrolle, für D, in einem Röhrchentest; für E, in einem Test auf das Rubella-Virus mit einem hochgradig positiven Serum, wie bei B; und für F, in einem Test auf das Rubella-Virus mit einem negativen Serum, mitumfaßt.
Jede Formulierung enthielt 1,4 mM BCIP, 0,24 mM NBT und 1,0 mM MgCl&sub2; in 100 mM 2A2M1P. Der pH-Wert von jeder Lösung wurde unter Verwendung von konzentrierter HCl eingestellt. Die Mikroteilchen wurden mit dem Rubella-Virus überzogen, und anschließend wurden sie der Einwirkung von Human-Serum ausgesetzt, welches Antikörper gegen das Rubella-Virus enthielt, und dann wurden sie der Einwirkung von an alkalische Phosphatase konjugierten Kaninchen-Anti-Human-Antikörpern ausgesetzt.
Die Kurve A zeigt die Geschwindigkeit der Farbbildung in einem Proberöhrchentest mit einem Substrat an, welches in 2A2M1P bei unterschiedlichen pH-Werten gepuffert war. Im Vergleich hierzu stellt der Punkt D eine Anzeige der Geschwindigkeit der Farbbildung bei einem Substrat dar, welches in Tris (0,1 M vom pH 9,6, und mit einem Gehalt von 50 mM MgCl&sub2;) gepuffert war.
Jede der Substratpräparationen wurde unter Anwendung des Rubella-Tests analysiert. Durch die Matrix wurden Seren mit einem hohen Gehalt an Antikörpern gegen das Rubella-Virus (hochgradig positive Seren) oder Seren geführt, welche hinsichtlich des Antikörpers gegen des Rubella-Virus negativ waren. Im Anschluß daran wurde - wie im Beispiel 4 - eine Behandlung mit einem an alkalische Phosphatase konjugierten Anti-Human-Antikörper vorgenommen. Nach einem geeigneten Waschvorgang wurde das Substrat hinzugefügt, und die Farbe wurde während 2 min entwickeln gelassen. Die Farbentwicklung wurde durch Waschen angehalten, um überschüssiges Substrat zu entfernen, und die Farbintensität wurde auf einem Gerüt zum Ablesen des Reflexionsvermögens gemessen. Die Kurve B zeigt des Signal, welches durch eine hochgradig positive Probe erzeugt wurde, und die Kurve C zeigt das Signal, welches durch eine negative Probe erzeugt wurde. Die Punkte E und F zeigen das Reflexionsvermögen jener Flecken, die unter Verwendung von Substraten gebildet worden sind, welche in 0,1 M Tris, 50 mM MgCl&sub2; van pH 9,6 (1,4 mM BCIP, 0,24 mM NBT) gepuffert worden waren.
Aus der Fig. 2 ist zu ersehen, daß der optimale pH-Wert für Substrate, welche mit 2A2M1P gepuffert waren, sowohl für den Proberöhrchentest als auch für den Rubella-Test 9,8 in einer 0,1 M Lösung betrug. Kein zusätzliches Signal wurde beobachtet, wenn die Konzentration des 2A2M1P auf 1,0 M erhöht wurde.
Die Komponenten der Substratformulierung gemäß der vorliegenden Erfindung sind in einem Proberöhrchentest gemäß Beispiel 2 (1, 0 ml Substrat/20 ul Konjugat) bei verschiedenen Konzentrationen von BCIP und NBT geprüft worden.
Die Tabelle 7 enthält die Ergebnisse für verschiedene Konzentrationen von BCIP in 0,1 M 2A2M1P (pH 9,8), 1,0 mM MgCl&sub2; und 0,24 mM NBT. TABELLE 7 Konzentration des BCIP
Die Tabelle 8 zeigt die Ergebnisse für verschiedene Konzentrationen von NBT in 0,1 M 2A2M1P (pH 9,8), 1,0 mM MgCl&sub2; und 2,3 mM BCIP. TABELLE 8 Konzentration des NBT
Wie aus der Tabelle 7 zu ersehen ist, wurde gefunden, daß Konzentrationen des BCIP zwischen 1,0 mM und 10 mM gut funktionieren. Wie aus der Tabelle 8 zu ersehen ist, wurde auch gefunden, daß Konzentrationen des NBT zwischen 0,05 und 0,5 mM ebenfalls gut funktionieren. Obwohl das 2A2M1P in diesen Beispielen nur in Konzentrationen von 0,1 M und 1,0 M verwendet wurde, ist es durchaus möglich, daß dieser Puffer auch bei anderen Konzentrationen gut funktioniert.
Die Suche nach dem optimalen pH-Bereich für das 2A2M1P unter den für die obige Tabelle 1 angegebenen Bedingungen und parallel zu den dort angeführten Versuchen führte zu den in der Tabelle 9 angegebenen Resultaten. TABELLE 9 ND = nicht bestimmt
Auf der Basis der in der Tabelle 9 angeführten Ergebnisse werden die 2A2M1P-Substratformulierungen gemäß der vorliegenden Erfindung vorzugsweise so eingestellt, daß ihr pH-Wert in einen Bereich von 9,7 bis 9,9 fällt.
Über die Rolle des Magnesiums in den Substratlösungen ist man sich noch nicht im klaren. Magnesiumsalze haben bei einem hohen pH-Wert eine sehr niedrige Löslichkeit, nämlich von etwa 1,4 mM bei einem pH-Wert von 10,3. Die Zugabe von Spurenmengen von Magnesium (10 bis 1000 uM) hatte keine Wirkung auf das von diesen Substraten erzeugte Signal. Durch die Zugabe von 1 mM MgCl&sub2; wird jedoch die Ausfällung des Chromogens unterdrückt, wenn das Substrat bie 45ºC belastet wird.
Ein wichtiger Apsekt für die Formulierung ist die Stabilität des Substrates. Obgleich durch einen Wechsel auf 2A2M1P die Stabilität verbessert wird, zeigen die Untersuchungen über die Temperaturbelastung, über welche im Beispiel 7 berichtet wurde, daß durch eine Abnahme in den Konzentrationen von BCIP und NBT auch die Stabilität verbessert wird. Es wird daher derzeit bevorzugt, daß Konzentrationen von 1,2 mM BCIP und 0,17 mM NBT in den Substratformulierungen gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet werden.
Auf der Basis der obigen Ergebnisse enthält eine bevorzugte Substratformulierung für einen Test, bei welchem alkalische Phosphatase verwendet wird, gemäß der vorliegenden Erfindung: 100 mM 2A2M1P (pH 9,8); 1,2 mM BCIP; 0,17 mM NBT; 1,0 mM MgCl&sub2;; und 0,02 % Natriumazid. Für einen Liter der Lösung werden 140 mg NBT mit etwa 475 ml destillierten Wassers vermischt und während 30 min im Dunkeln gerührt, um eine Lösung A herzustellen. Als nächstes werden - zur Herstellung einer Lösung B - 10 ml von 2A2M1P zu 450 ml destillierten Wassers unter Rühren zugegeben, und die Lösung wird während mindestens 5 min vermischt. Zu der Lösung B werden 520 mg BCIP zugesetzt, und das Rühren wird während wenigstens 20 min unter reduziertem Licht fortgesetzt. Der pH-Wert der Lösung B wird mit 6,0 N HCl auf 9,8 (einen Bereich von 9,7 bis 9,9) eingestellt. Die Lösungen A und B werden langsam, unter Rühren, vermischt. 1 ml einer wäßrigen Lösung von 1,0 M MgCl&sub2; wird zu dem Gemisch zugesetzt, wonach 200 mg Natriumazid zugegeben weden. Die Lösung wird so lange gerührt, bis sich alle Feststoffe aufgelöst haben. Das Volumen wird mit Wasser auf 1,0 Liter aufgefüllt. Die Lösung wird dann durch ein 0,2 um-Nalgen- Filter filtriert und bei 2 bis 8ºC im Dunkeln gelagert. Bei der Herstellung dieses Substrates sollte das NBT in destilliertem Wasser aufgelöst werden, bevor das 2A2M1P zugegeben wird, um Probleme hinsichtlich einer Unlöslichkeit in 0,1 M 2A2M1P zu vermeiden.

Beispiel 9

Die Stabilität der neuformulierten Substratlösung gemäß Beispiel 8 für einen Test, bei welchem alkalische Phosphatase verwendet wird, wurde untersucht. Die Substratlösung wurde bei Umgebungstemperatur, bei 2-8ºC, bei 37ºC und bei 45ºC gelagert. Nach der in der Tabelle 10 angegebenen Anzahl von Tagen der Lagerung wurden die Proben in dem HCG-Test des Beispiels 4 geprüft. TABELLE 10 Prozentsatz der richtigen Diagnosen gegenüber den Standards HCG (mIE/ml) Tag Temp. Wiederholungen Kommentar Keine Probleme Keine Probleme Einige Flecken auf der Matrix bei 37 und 45. Einige Flecken bei der 45º-Flasche. 37 und 45 waren etwas heller als die anderen zwei und wiesen einige Flecken auf. 37 und 45 zeigten ein verringertes Signal und wiesen Flecken auf. Wie oben für 28 angegeben; wobei die höheren Temperaturen zu mehr Niederschlag auf den Matrizes und in den Flaschen führten. Wie oben Wie oben Die 45- und 37-Matrizes haben das Aussehen von "schmutziger Wäsche", sind aber sehr wirksam. 37 und 45 weisen eine leichte Trübung auf. 2 bis 8 und Umgebungstemperatur sahen sehr gut aus.

Beispiel 10

Ein spektrophotometrsicher Vergleich des Produktes des mit 2A2M1P gepufferten Substrates gemäß der vorliegenden Erfindung mit dem Produkt eines mit Tris gepufferten Substrates findet sich in der Fig. 3.
In der Fig. 3 sind die Absorptionsspektren von Produkten dargestellt, welche durch die Reaktion von Substraten mit alkalischer Phosphatase gebildet worden sind. Die Linie A stellt die Ergebnisse für ein Substrat dar, welches in einer 0,1 M wäßrigen Lösung von 2A2M1P (pH 9,6) und 1,0 mM MgCl&sub2; mit einem Gehalt von 1,2 mM BCIP und 0,17 mM NBT hergestellt worden war. Die Linie T stellt die Ergebnisse für ein Substrat dar, welches in 0,1 M Tris (pH 9,6) und 50 mM MgCl&sub2;, mit einem Gehalt von 1,4 mM BCIP und 0,24 mM NBT, hergestellt worden war.
Aus den in der Fig. 3 dargestellten Ergebnissen ist zu ersehen, daß die Produkte beider Formulierungen im wesentlichen gleich sind.

Beispiel 11

Die vorliegende Erfindung kann in einem Festphasentest angewendet werden. Ein Beispiel für einen Festphasentest ist ein Test auf HCG von der im Beispiel 4 beschriebenen Art, jedoch mit einer unbekannten Probe statt einer Standard-Urinprobel. In einem solchen Test werden Teilchen mit einem für HCG spezifischen Antikörper überzogen und in einer Glasfasermatrix festgehalten. Eine Urinprobe aus einer Patientin wird durch die Matrix geführt. Ist HCG in dem Urin vorhanden, dann bindet sich das HCG an den HCG-spezifischen Antikörper.
Ein zweiter, für HCG spezifischer Antikörper wird an alkalische Phosphatase konjugiert. Indem man eine Lösung des zweiten Antikörpers durch die Matrix hindurchführt, bindet sich der zweigte Antikörper an jegliches, darin befindliches HCG.
Nach dem Waschen und Inkubieren der Matrix mit der Substratformulierung gemäß der vorliegenden Erfindung wird jegliche Reaktion dadurch angehalten, daß man das überschüssige Substrat aus der Matrix herauswäscht.
In Gegenwart von HCG reagiert der an die alkalische Phosphatase konjugierte und an das HCG gebundene Antikörper mit der Substratformulierung unter Bildung eines dunklen, blauschwarzen Fleckens. Bei Fehlen von HCG wird der konjugierte Antikörper weggewaschen, und es bildet sich kein Flecken.

Beispiel 12

Die Substratformulierung gemäß der vorliegenden Erfindung kann in einem "Enzyme-Linked Immuno-Sorbent Assay" zu dem Zweck der Bestimmung des Vorliegens eines Antikörpers in einer Blutprobe verwendet werden. In einem solchen Test wird ein spezifisches Antigen auf Nitrozellulose aufgetüpfelt. Die Nitrozellulose wird mit einer Patientenprobe inkubiert, wonach eine Inkubation mit einem an alkalische Phosphatase konjugierten Antikörper gegen den Human-Antikörper vorgenommen wird. Die anschließende Inkubation der Nitrozellulose mit der Substratformulierung gemäß der vorliegenden Erfindung führt zu der Bildung eines blauschwarz gefärbten Fleckens, wenn in der Probe ein für das aufgetüpfelte Antigen spezifischer Antikörper vorhanden ist. Ist kein solcher Antikörper vorhanden, dann bildet sich auch kein Flecken.

Beispiel 13

Die Substratformulierung gemäß der vorliegenden Erfindung kann in einem Western-Blot-Test verwendet werden. Bei dieser Art von Test werden Proteine aus Elektrophoresegelen auf Nitrozellulose transferiert. Die Nitrozellulose kann auf ein spezifisches Protein durch Inkubieren mit einem an alkalische Phosphatase konjugierten Antikörper gegen das spezifische Protein und eine anschließende Inkubation mit der Substratformulierung gemäß der vorliegenden Erfindung sondiert werden. Ist das Protein vorhanden, dann bindet sich der konjugierte Antikörper an dasselbe, und die Reaktionsprodukte aus der alkalischen Phosphatase und den Substraten lagern sich an den Stellen ab, wo das Protein lokalisiert ist.
Mit dem gepufferten Phosphatase-Substrat gemäß der vorliegenden Erfindung erreicht man zwei Ziele: Erstens das Ziel einer Schaffung von zusätzlicher Stabilität; und zweitens, das Ziel einer Verstärkung des Signals oder des Verhältnisses zwischen Signal und Rauschen. Eine Vergrößerung des Verhätlnisses von Signal zu Raumschen für das 2A2M1P gegenüber dem Tris wird durch ein stärkeres Signal in dem Proberöhrchentest des Beispiels 5 und durch die stärkere Farbe in dem Rubella-Test des Beispeils 8 demonstriert.
Durch einen Wechsel von Tris auf das 2A2M1P mit Spurenmengen von Mg&spplus;&spplus; ist die Stabilität der Präparation erhöht worden. Außerdem wies das in 2A2M1P hergestellte Substrat in einem Proberöhrchentest einen größeren Wert für ΔA/min und wenigstens vergleichbare Signale in den Tests gegenüber den mit Tris gepufferten Substraten auf.
Obgleich die vorliegende Erfindung unter Bezugnahme auf eine bevorzugte Ausführungsform beschrieben worden ist, so versteht es sich dennoch von selbst, daß Modifikationen und Verbesserungen für den Fachmann auf der Hand liegen werden. Beispielsweise ist es zu erwarten, daß - obgleich BCIP bei der bevorzugten Ausführungsform verwendet worden ist - auch andere Indigo-Cogeners im Rahmen der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, darunter Indolylphosphat, wenn ein geeignetes Oxidationsmittel, wie z.B. K&sub3;Fe(CN)&sub6; , zur Verfügung gestellt wird. Es ist auch zu erwarten, daß andere Tetrazoliumsalze im Rahmen der vorliegenden Erfindung verwendet werden können; und tatsächlich ist auch beobachtet worden, daß Tetranitroblautetrazolium einen gefärbten Flecken bildet, der als Indikator in dem HCG-Test des Beispeils 4 nützlich ist. Demgemäß sollen die angeschlossenen Patentansprüche alle solchen äquivalenten Abänderungen umfassen, welche unter den Schutzumfang der beanspruchten Erfindung fallen.

Claims

1. Substratformulierung für einen Test, bei welchem alkalische Phosphatase verwendet wird, welche Substratformulierung enthält:

ein phosphatiertes Indigo-Cogener;

ein Tetrazoliumsalz in einer Konzentration, welche zum Erzeugen eines feststellbaren Signals bei der Reaktion mit dem phosphatierten Indigo-Cogener wirksam ist; und

2-Amino-2-methyl-1-propanol in einer Konzentration, welche zum Puffern einer Reaktion zwischen dem phosphatierten Indigo-Cogener und dem Tetrazoliumsalz in wässeriger Lösung und innerhalb eines pH-Bereiches wirksam ist, bei welchem die Reaktion fortschreiten kann.

2. Substratformulierungen nach Anspruch 1, wobei das phosphatierte Indigo-Cogener 5-Brom-4-chlor-3-indolylphosphat ist.

3. Substratformulierung nach Anspruch 2, wobei das 5-Brom-4-chlor-3- indolylphosphat in einer Konzentration zwischen etwa 1,0 mM und etwa 10 mM vorliegt.

4. Substratformulierung nach Anspruch 1, wobei das Tetrazoliumsalz Nitroblautetrazolium ist.

5. Substratformulierung nach Anspruch 4, wobei das Nitroblautetrazolium in einer Konzentration zwischen etwa 0,05 mM und etwa 0,5 mM vorliegt.

6. Substratformulierung nach Anspruch 1, wobei das 2-Amino-2-methyl-1- propanol in einer Konzentration zwischen etwa 0,1M und etwa 1,0 M vorliegt.

7. Substratformulierung in wässeriger Lösung für einen Test, bei welchem alkalische Phosphatase verwendet wird, welche Substratformulierung enthält:

5-Brom-4-chlor-3-indolylphosphat in einer Konzentration zwischen etwa 1,0 mM und etwa 10 mM;

Nitroblautetrazolium in einer Konzentration zwischen etwa 0,05 mM und etwa 0,5 mM; und

2-Amino-2-methyl-1-propanol in einer Konzentration zwischen etwa 0,1M und etwa 1,0 M.

8. Substratformulierung nach Anspruch 7, welche weiterhin MgCl&sub2; in einer Konzentration von etwa 1,0 mM enthält.

9. Substratformulierung nach Anspruch 8, wobei

das 5-Brom-4-chlor-3-indolylphosphat in einer Konzentration von 1,2 mM vorliegt:

das Nitroblautetrazolium in einer Konzentration von 0,17 mM vorliegt; und

das 2-Amino-2-methly-1-propanol in einer Konzentration von 100 mM vorliegt.

10. Substratformulierung nach Anspruch 9, welche weiterhin Natriumazid in einer Konzentration von 0,2 % enthält.