DE3650497T2

DE3650497T2 - Verfahren und Zusammensetzung zum Nachweis von Analyt-Anteilen

Info

Publication number: DE3650497T2
Application number: DE3650497T
Authority: DE
Inventors: Solomon Mowshowitz
Original assignee: Enzo Biochem Inc
Current assignee: Enzo Biochem Inc
Priority date: 1985-05-24
Filing date: 1986-05-23
Publication date: 1996-09-19
Anticipated expiration: 2006-05-24
Also published as: EP0202688B1; CA1268115A; ATE135410T1; EP0202688A2; EP0202688A3; US4746604A; DE3650497D1; JPS61272656A

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zum Nachweis von Analyteinheiten mit Hilfe einer Signaleinheit und insbesondere mit Hilfe einer Signaleinheit, die vergrößern kann oder die vergrößert werden kann, und eine Testzusammensetzung zum Nachweis eines Analyten in einer Probe.
Testsysteme zum Nachweis von Analyteinheiten von biomedizinischem Interesse sind bereits seit einigen Jahren bekannt. Diese Systeme umfassen, z.B., Immundiffusion, Immunelektrophorese, Agglutination und Immunfluoreszenz. Diese Systeme weisen jeweils unterschiedliche Einschränkungen auf, welche die folgenden Punkte betreffen, die Zweckmäßigkeit, die Empfindlichkeit, die Einfachheit der Zubereitung der Proben, die Automatisierbarkeit des Systems und die Anwendbarkeit auf verschiedene spezifische Analyteinheiten.
Der Radioimmunassay (RIA) stellt ein zweckmäßiges, empfindliches, flexibles und leicht automatisierbares Nachweisverfahren dar. Die Nachteile der RIA-Nachweissyteme betreffen die Probleme, die mit der Verwendung von Radioisotopen einhergehen, denn in den RIAs wird das Signal durch die Radioisotopen gegeben. Die Probleme umfassen verschiedene Punkte, wie hohe Kosten und eine niedrige Lagerdauer der radioaktiv markierten Reagentien, der Bedarf einer speziellen Ausstattung zum Nachweis des Signals, das Gesundheitsrisiko für das Laborpersonal und die großen Ausgaben und Schwierigkeiten bei der Entsorgung des radioaktiven Abfalls.
Kürzlich wurde ein empfindliches und zweckmäßiges Nachweisverfahren eingeführt, wobei keine Radioisotopen verwendet werden müssen. Im Enzymimmuntest ("enzyme linked immunosorbent assay" = ELISA) werden Enzyme als Signaleinheiten eingesetzt. Die Empfindlichkeit von ELISA wird z.T. durch die Zahl der Enzymmoleküle eingeschränkt, die mit der für den Analyten spezifischen Einheit verknüpft werden.
Sofern eine Analyteinheit zum Wachstum befähigt ist (z.B. ein Bakterium), ist es häufig vorteilhaft, diese Analyteinheit in vivo oder in vitro zu züchten, damit sie einfacher nachgewiesen werden kann. Nach der Züchtung kann die Analyteinheit nachgewiesen werden, indem beliebige physikalische oder metabolische Eigenschaften dieser Analyteinheit festgestellt werden, z.B. die Zell- oder Kolonie-Morphologie, die Bedürfnisse für bestimmte Nährstoffe, Stoffwechselprodukte, Anfärbeeigenschaften oder die Fähigkeit, pathogen zu wirken. Auf diese Weise kann sogar eine einzige lebensfähige Bakterienzelle nachgewiesen werden.
Bakterien erwiesen sich aufgrund ihrer Fähigkeit zu wachsen als nützliche Signaleinheiten zum Nachweis anderer Einheiten. Wenn das Bakterium nur in Abhängigkeit der Analyteinheit wachsen kann (d.h., wenn die Bakterien für die Analyteinheit auxotroph sind), kann das Vorliegen der Analyteinheit anhand des Wachstums der Bakterien nachgewiesen werden. Das Wachstum der Bakterien steht zur Menge der vorliegenden Analyteinheit in einem stöchiometrischen Verhältnis. Selbstverständlich ist diese Art von Biotest auf spezifische Signaleinheit-Analyteinheit-Paare beschränkt.
Farrell, C., et al., Scand J. of Immun. 4 (7), (1975), 673-680, beschreiben einen Radioimmuntest, wobei eine feste Phase C1g und ein ³²P-markierter, Protein A-reicher Staphylococcus aureus als Indikatorsystem eingesetzt werden, um C1q- bindende IgG-Aggregate und Antigen- IgG-Antikörper-Komplexe nachzuweisen.
WO-A-8 504 189 (das ein Dokument gemäß Art. 54(3) (4) EPC ist) beschreibt die Verwendung von Bakteriophagen als Agentien in einem Verfahren zum Nachweis und zur Identifizierung von Molekülen oder von zellulären Substanzen.
Eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung eines Verfahrens zum Nachweis von Analyteinheiten mit Hilfe einer Signaleinheit, die zur Vergrößerung (Wachstum, Replikation, Proliferation) befähigt ist.
Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung einer Testzusammensetzung, mit der eine Analyteinheit mit Hilfe einer Signaleinheit nachgewiesen werden kann, die zur Vergrößerung befähigt ist.

Zusammenfassung der Erfindung

Gemäß der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zum Nachweis eines Analyten in einer Probe bereitgestellt, umfassend
a. Anheften der vermutlich den Analyten enthaltenden Probe an einen festen Träger;
b. Kombinieren des angehefteten Analyten mit einer Zusammensetzung, die (i) einen für den Analyten spezifischen Bestandteil, der mit dem Analyten einen spezifischen Komplex erzeugen kann, und (ii) einen nachweisbaren Bestandteil enthält, der einen Organimus, ausgewählt aus Mikroorganismen, Pilzzellen, Pflanzenzellen oder Tierzellen, die wachsen oder sich vermehren können, umfaßt, mit der Maßgabe, daß die Mikroorganismen keine Bakteriophagen sind, wobei der nachweisbare Bestandteil mit dem für den Analyten spezifischen Bestandteil verknüpft wurde, wodurch ein Komplex erzeugt wurde;
c. Abtrennen des nicht-komplexierten nachweisbaren Bestandteils vom Komplex; und
d. Einbringen des Komplexes in eine für die Förderung des Wachstums oder der Replikation des nachweisbaren Bestandteils geeignete Umgebung, wobei das Wachstum oder die Replikation proportional zur Konzentration des Analyten sind.

I. Definitionen

In der vorliegenden Erfindung werden die folgenden definierten Begriffe verwendet:
Analyteinheit - Eine Analyteinheit ist die Substanz, die nachgewiesen oder deren Menge bestimmt werden soll.
Für den Analyten spezifische Einheit - Dies ist eine Einheit, die befähigt ist, einen Komplex mit einer bestimmten Analyteinheit zu erzeugen, indem sie einen Informations-Teil der Analyteinheit erkennt.
Brückeneinheit - Dies ist eine Einheit, die zwei beliebige Einheiten verbindet.
Für die Signaleinheit spezifische Einheit - Dies ist eine Einheit, die befähigt ist, mit einer bestimmten Signaleinheit einen Komplex zu erzeugen, indem sie einen Informations-Teil der Signaleinheit erkennt.
Signaleinheit - Dies ist eine Einheit, die durch den Anwender nachgewiesen wird. Sie ist lebensfähig.
Signal - Das Signal wird im Test nachgewiesen. Das Vorliegen des Signals zeigt das Vorliegen der Signaleinheit an.
Lebensfähige Signaleinheit - Eine Signaleinheit, die zum Wachstum, zur Replikation und/oder zur Proliferation befähigt ist. Alle diese Einheiten enthalten Nudeinsäure und besitzen die Fähigkeit, entweder unabhängig vom Wirt oder mit seiner Hilfe Kopien ihrer Nudeinsäuren zu erzeugen.
Komplex aus der Analyteinheit und der für den Analyten spezifischen Einheit - Dies ist das Gebilde, das erzeugt wird, wenn die für den Analyten spezifische Einheit die Information der Analyteinheit erkennt und an die Analyteinheit bindet.
Signal-Analyt-Gebilde - Dieser Begriff wird verwendet, um das Gebilde zu bezeichnen, das mindestens eine Analyteinheit, eine für den Analyten spezifische Einheit und eine Signaleinheit umfaßt. Die Signaleinheit kann die Analyteinheit oder die für den Analyten spezifische Einheit sein.
Verknüpft - Eine Einheit wird mit einer anderen Einheit verknüpft, wenn sie hieran kovalent (direkt oder indirekt) oder nicht-kovalent (direkt oder indirekt) gebunden wird.
Direkte Verknüpfung - Dies findet statt, wenn eine Einheit ohne eine Zwischenglied-Einheit an eine andere Einheit gebunden wird.
Indirekte Verknüpfung - Dies findet statt, wenn eine Einheit über eine Zwischenglied-Einheit an eine andere Einheit gebunden wird.
Vergrößerung - Dies bezieht sich auf die Zunahme der Masse, der Größe, des Volumens, des Molekulargewichts der Signaleinheit, wobei diese Zunahme dadurch zustandekommen kann, daß eine Signaleinheit mit anderen ähnlichen oder nicht-ähnlichen Einheiten verknüpft wird.
Unabhängige Vergrößerung - Dieser Begriff bedeutet, daß die Signaleinheit, oder sogar die Analyteinheit, bei der Vergrößerung nicht direkt von der Analyteinheit selbst abhängig ist. Das Vorliegen der Analyteinheit kann jedoch indirekt zur Bereitstellung eines Nährstoffes führen, den die Signaleinheit zur Vergrößerung benötigt.
Information - Dies ist der Teil der Analyteinheit, den die für den Analyten spezifische Einheit erkennen kann.
Erkennen - Dies findet statt, wenn die für den Analyten spezlfische Einheit an die Analyteinheit bindet.
Nährstoff - Ein beliebiges Molekül, das die Signaleinheit zur Vergrößerung oder zur Erzeugung des Signals benötigt.
Vorläufer - Eine Substanz, die durch einen Katalysator in einen Nährstoff umgewandelt wird, welchen eine lebensfähige Signaleinheit zur Vergrößerung oder zur Erzeugung des Signals verwenden kann.
Ein Verfahren wird bereitgestellt, um Analyteinheiten nachzuweisen, indem ein Komplex aus einer Analyteinheit und einer für den Analyten spezifischen Einheit erzeugt und die Analyteinheit mit Hilfe einer Signaleinheit, die zur unabhängigen Vergrößerung befähigt ist, nachgewiesen wird. Eine unabhängige Vergrößerung bedeutet, daß die Signaleinheit bei der Vergrößerung nicht direkt von der Analyteinheit selbst abhängig ist. In den Fällen, in denen die Analyteinheit selbst die Signaleinheit darstellt, ist jede Signaleinheit bei der Vergrößerung nicht vom Vorliegen anderer Analyteinheiten abhängig. Die Signale inheit kann mit dem Komplex aus der Signaleinheit und der für den Analyten spezifischen Einheit direkt oder indirekt verknüpft werden. Die verschiedenen Ausführungsformen werden hier nachstehend diskutiert.

Lebensfähige Signaleinheiten

Lebensfähige Signaleinheiten, die zur Vergrößerung befähigt sind, sind Einheiten, die in einer geeigneten Umgebung wachsen, sich replizieren oder proliferieren können, wenn sie mit den richtigen Nährstoffen versorgt werden. Die Nährstoffe umfassenalle für den Stoffwechsel der Signaleinheit erforderlichen Substanzen und können intakte Zellen enthalten. Der Vorteil bei der Verwendung einer Signaleinheit, die sich vergrößern kann besteht darin, daß sie die Erzeugung mehrerer Signaleinheiten ermöglicht, wodurch mehr Signal bereitgestellt wird. Lebensfähige Signaleinheiten umfassen z.B. Phagen, Viren, Bakterien, Protozoen, Rickettsien, Pilze, Hefen, Algen, Mikroorganismen, prokaryotische Zellen, eukaryotische Zellen, Tumorzellen, Pflanzenzellen und Tierzellen. Bevorzugte lebensfähige Signaleinheiten sind Phagen, Viren, Bakterien und Hefen. Insbesondere sind Bakterien und Hefen bevorzugt.
Lebensfähige Signaleinheiten können nachgewiesen werden, indem die eigentlichen Einheiten selbst oder die durch die Einheiten erzeugten Stoffwechselprodukte betrachtet werden. Die Signaleinheiten, die Bakterien sind, können selbst nachgewiesen werden, indem das Vorliegen z.B. von Kolonien auf einer Platte mit festem Nährmedium oder die Trübung in einem flüssigen Medium betrachtet werden. Bakterien, die unter bestimmten Bedingungen wachsen können (z.B. bei erhöhten Temperaturen oder bei einem niedrigen pH-Wert) oder die von anderen lebensfähigen Signaleinheiten leicht unterschieden werden können (z.B. produzieren sie Kolonien mit einer charakteristischen Morphologie oder Farbe), bieten dadurch einen weiteren Vorteil, daß sie in Gegenwart anderer Signaleinheiten betrachtet werden können, die unter diesen Bedingungen nicht wachsen können oder die diese charakteristischen Merkmale nicht zeigen. Ein Beispiel einer Bakterienart, die charakteristische Kolonien bildet, ist Serratia marcescens, die rote Kolonien bildet.
Lebensfähige Signaleinheiten erzeugen Stoffwechselprodukte, die nachgewiesen werden können, wodurch das Vorliegen der Signaleinheit bestätigt wird. Sie umfassen die meisten zellulären oder viralen Produkte und Bestandteile. Diese beinhalten z.B. Proteine, Hormone, Antikörper, Enzyme, Epitope, Antigene, Polypeptide, Peptide, Aminosäuren, Nudeinsäuren, Polynucleotide, Nudeotide, Nudeoside, Basen, Kohlenhydrate, Zucker, Stärken, Lipide, Fettsäureester, Glycerine, Fettsäuren, Kohlenhydrate, Glykoproteine, Lipoproteine, Vitamine, Steroide, Arzneistoffe, Flavone, Antibiotika, Terpene, Purine und Pyrimidine. Bevorzugte Stoffwechselprodukte sind Proteine, Polynudeotide und Polysaccharide. Besonders bevorzugt sind Epitope, Antigene, Enzyme und Polynudeotide. Enzyme umfassen z.B. Hydrolasen, Esterasen, Phosphatasen, Peroxidasen, Katalasen, Glykosidasen, Oxidoreduktasen, Proteasen, Lipasen und Nudeasen. Besonders bevorzugt sind Phosphatasen, Peroxidasen und Oxidoreduktasen.
Der Nachweis eines Stoffwechselproduktes kann auf verschiedene Art und Weise durchgeführt werden. Ein Stoffwechselprodukt kann mittels einer physikalischen Eigenschaft oder einer chemischen Eigenschaft nachgewiesen werden. Physikalische Eigenschaften umfassen Merkmale, wie z.B. Fluoreszenzemission, UV-Absorption, Molekulargewicht, die Mobilität in der Elektrophorese und das Verhalten in der Chromatographie. Chemische Eigenschaften umfassen alle Merkmale, die das Stoffwechselprodukt befähigen, mit anderen Substanzen zu reagieren, mit ihnen in Wechselwirkung zu treten oder an sie zu binden. Die chemische Eigenschaft kann eine Eigenschaft sein, die die Umwandlung des Stoffwechselproduktes in eine Verbindung erlaubt, die nachgewiesen werden kann, sie kann eine Eigenschaft sein, die das Stoffwechselprodukt befähigt, eine Substanz in ein nachweisbares Produkt umzuwandeln, oder sie kann eine Eigenschaft sein, die die Verknüpfung des Stoffwechselproduktes mit einer nachweisbaren Substanz erlaubt.
Beispiele von Stoffwechselprodukten, die durch die vorstehenden Verfahren nachgewiesen werden können, umfassen Cofaktoren, deren Nachweis mittels ihres UV-Spektrums, Peptide, deren Nachweis mittels ihrer Retentionszeiten auf HPLC, Ribonudeotide, deren Nachweis mittels Orcinol, Carbonsäuren, deren Nachweis mittels pH-Indikatoren, Nudeinsäuren, deren Nachweis mittels Ethidiumbromid, Epitope, deren Nachweis mittels Antikörper, die mit einer fluoreszierenden Einheit verknüpft sind, Lysozyme, deren Nachweis mittels Plaques, und Phosphatase-Enzyme, deren Nachweis mittels chromogener Substrate, wie z.B. p-Nitrophenylphosphat, erfolgen kann.
Die lebensfähige Signaleinheit, die zur Vergrößerung befähigt ist, ist Teil des Analyt-Signal-Gebildes. Die Signaleinheit kann die Analyteinheit, die für den Analyten spezifische Einheit oder eine andere Einheit sein, die entweder mit der Analyteinheit oder mit der für den Analyten spezifischen Einheit verknüpft wird.
Das Signal-Analyt-Gebilde läßt sich an vier verschiedene Fälle anpassen. Im ersten Fall ist die lebensfähige Signaleinheit die Analyteinheit, im zweiten Fall ist die lebensfähige Signaleinheit die für den Analyten spezifische Einheit, im dritten Fall ist die lebensfähige Signaleinheit eine getrennt vorliegende Einheit, die direkt oder indirekt mit der Analyteinheit verknüpft wird, im vierten Fall ist die lebensfähige Signaleinheit eine getrennt vorliegende Einheit, die direkt oder indirekt mit der für den Analyten spezifischen Einheit verknüpft wird. Der dritte und der vierte Fall sind die einzigen Ausführungsformen, die in den vorliegenden Patentansprüchen enthalten sind.
Ein Beispiel einer lebensfähigen Signaleinheit, die auch die Analyteinheit ist, liegt dann vor, wenn ein Antikörper gegen Serratia marcescens die immobilisierte für den Analyten spezifische Einheit ist und Serratia marcescens die Analyteinheit ist. Hier ist Serratia marcescens auch die lebensfähige Signaleinheit, die zur Vergrößerung befähigt ist (vgl. Beispiel I).
Ein Beispiel einer lebensfähigen Signaleinheit, die auch die für den Analyten spezifische Einheit ist, liegt dann vor, wenn ein IgG-Antikörper die immobilisierte Analyteinheit ist und Staphylococcus aureus die für den Analyten spezifische Einheit ist. Hier ist Staphylococcus aureus auch die lebensfähige Signaleinheit, die zur Vergrößerung befähigt ist (vgl. Beispiel II).
Ein Beispiel einer lebensfähigen Signaleinheit, die mit einer Analyteinheit verknüpft ist, liegt dann vor, wenn Ziegen-Anti-Kaninchen-IgG (Fab'2) die immobilisierte, für den Analyten spezifische Einheit ist und Kaninchen-IgG die Analyteinheit ist. Staphylococcus aureus dient als die lebensfähige Signaleinheit, die zur Vergrößerung befähigt ist, und wird direkt mit der Analyteinheit verknüpft (vgl. Beispiel III).
Ein Beispiel einer lebensfähigen Signaleinheit, die mit einer für den Analyten spezifischen Einheit verknüpft ist, liegt dann vor, wenn biotinyliertes Rinderserumalbumin die immobilisierte Analyteinheit, Avidin die für den Analyten spezifische Einheit und Serratia marcescens die lebensfähige Signaleinheit ist, die zur Vergrößerung befähigt ist. Der biotinylierte Antikörper gegen Serratia marcescens ist die Brückeneinheit mit deren Hilfe die Signaleinheit mit der für den Analyten spezifischen Einheit verknüpft wird (Beispiel IV).
Alle Nährstoffe können für die Signaleinheit fertig zubereitet bereitgestellt werden, in einer anderen Ausführungsform können ein oder mehrere benötigte Nährstoffe in Form von Vorläufern bereitgestellt werden, die mit Hilfe eines oder mehrerer Katalysatoren in Nährstoffe umgewandelt werden. Der Katalysator kann Teil des Analyt-Signal-Gebildes sein, oder er kann ein getrennt vorliegendes, nicht-verknüpftes Gebilde sein.
Das Verfahren umfaßt in allen vier Fällen im allgemeinen, ist jedoch nicht darauf beschränkt, die Immobilisierung der Analyteinheit oder der für den Analyten spezifischen Einheit an einen Träger und die Behandlung des Trägers, so daß eine unspezifische Bindung beliebiger Einheiten, die im Analyt- Signal-Gebilde enthalten sind, an den Träger verhindert wird. Das Analyt-Signal-Gebilde wird sodann auf dem Träger konstruiert, indem die Bestandteile, die von dem zu Beginn immobilisierten Bestandteil verschieden sind, mit dem Träger entweder nacheinander oder gleichzeitig in Kontakt gebracht werden. Die Bestandteile des Analyt-Signal-Gebildes können, müssen aber nicht, vor dem Kontakt mit dem Träger teilweise zusammengesetzt werden. Bestandteile, die nicht spezifisch an den Träger gebunden sind, werden entfernt, z.B. indem der Träger gewaschen wird.
Wenn die Signaleinheit eine Einheit ist, die vom Analyten oder der für den Analyten spezifischen Einheit verschieden ist, wird sie mit der Analyteinheit oder mit der für den Analyten spezifischen Einheit verknüpft. Die Verknüpfung kann kovalent oder nicht-kovalent sein. Die Signaleinheit kann direkt mit der Analyteinheit oder mit der für den Analyten spezifischen Einheit verknüpft werden, oder sie kann indirekt mit der Analyteinheit oder mit der für den Analyten spezifischen Einheit mit Hilfe einer für die Signaleinheit spezifischen Einheit und/oder einer oder mehrerer Brückeneinheiten verknüpft werden. Die Signaleinheit kann mit der Analyteinheit oder der für den Analyten spezifischen Einheit vor der Erzeugung des Komplexes aus der Analyteinheit und der für den Analyten spezifischen Einheit verknüpft werden, oder sie kann mit der Analyteinheit oder der für den Analyten spezifischen Einheit nach der Erzeugung des Komplexes aus der Analyteinheit und der für den Analyten spezifischen Einheit verknüpft werden Genauso kann, sofern eine Brückeneinheit und/oder eine für die Signaleinheit spezifische Einheit enthalten ist, diese mit der Signaleinheit verknüpft werden, bevor sie mit der Analyteinheit oder der für den Analyten spezifischen Einheit verknüpft wird, oder nachdem sie mit der Analyteinheit oder der für den Analyten spezifischen Einheit verknüpft wurde.
Geeignet sind jeder beliebige Träger, der die Analyteinheit oder die für den Analyten spezifische Einheit binden kann, und jedes Blockierungsmittel, das die unspezifische Bindung anderer Einheiten an den Träger verhindern kann. Geeignete Träger umfassen Nitrocellulose, Nylonmembranen, Glasobjektträger, Polystyrol, Polypropylen und Polycarbonat. Ein bevorzugter Träger ist Nitrocellulose, ein bevorzugtes Blockierungsmittel ist Rinderserumalbumin (BSA). Im allgemeinen ist die Bindung der Analyteinheit oder der für den Analyten spezifischen Einheit an den Träger nicht-kovalent, in einigen Fällen ist jedoch eine kovalente Bindung wünschenswert.
Eine Anforderung der vorliegenden Erfindung für alle Ausführungsformen besteht darin, daß die Signaleinheit zur Vergrößerung befähigt ist. Das bedeutet jedoch nicht, daß die Erfindung auf Situationen beschränkt ist, in denen eine Vergroßerung tatsächlich ausgeführt wird. In bestimmten Fällen kann die Signaleinheit ohne jegliche Vergrößerung nachweisbar sein, insbesondere wenn eine große Menge der Analyteinheit vorliegt. In anderen Fällen ist eine gewisse Vergrößerung erforderlich, um den Nachweis zu ermöglichen. In anderen Fällen wird die Signaleinheit so stark vergrößert, bis sichtbare Kolonien, Plaques oder Polymere erzeugt werden.
Häufig kann mit den erfindungsgemäßen Verfahren sogar eine einzige Analyteinheit nachgewiesen werden. Die Verfahren sind vielseitig, ziemlich schnell, die Gebrauchsanweisung ist einfach, dabei werden Reagentien verwendet, die standardisiert und in handelsüblichen Kits bereitgestellt werden können, außerdem kann mit diesen Verfahren eine große Anzahl von Proben schnell durchgemustert werden.

Beschreibung anderer Einheiten

Die Analyteinheit ist das Gebilde, dessen Vorliegen nachgewiesen werden soll. Die Analyteinheit muß einen Informations-Teil umfassen, den die für den Analyten spezifische Einheit erkennen kann. Analyteinheiten umfassen z.B. Mikroorganismen, Pilze, Algen, Pflanzenzellen, Tierzellen, Tumorzellen, Liganden, Rezeptoren, Antikörper, Antigene, Proteine, Hormone, Polysaccharide, Polypeptide, Nudeinsäuren und Polynudeotide. Die Analyteinheit kann aus Serum, Gewebeextrakten, Zellausstrichen, Urin, Sputum, Faeces, Speichel, Eiter, Sperma, Fermentationsbrühen, Kulturmedien, Wasserproben, Umweltproben und Nahrungsmitteln stammen.
Es ist klar, daß möglicherweise experimentelle Manipulationen erforderlich sind, um den Informations-Teil der Analyteinheit mit der Erkennungsstelle der für den Analyten spezifischen Einheit in Kontakt zu bringen. Somit kann es erforderlich sein, daß Membranen aufgebrochen werden, um Zugang zu den zellulären Bestandteilen zu erhalten, und daß Polynudeotide denaturiert werden, um einzelsträngige Regionen bereitzustellen. Diese Verfahren sind dem Durchschnittsfachmann bekannt.
Die für den Analyten spezifische Einheit ist die Einheit, die mit der Analyteinheit komplexiert, indem sie einen Informations-Teil der Analyteinheit erkennt. Die für den Analyten spezifische Einheit ist somit für die Analyteinheit selektiv. Im allgemeinen wird der Komplex durch Wasserstoffbindung, elektrostatische Wechselwirkung, hydrophobe Wechselwirkung oder eine Kombination aus verschiedenen Wechselwirkungen erzeugt. Die für den Analyten spezifischen Einheiten umfassen z.B. Mikroorganismen, Liganden, Rezeptoren, Antigene, Antikörper, Proteine, Hormone, Polynudeotide, Aminosäuren, Enzyme, Enzymsubstrate, Enzyminhibitoren und Lipide.
Die für die Signaleinheit spezifische Einheit ist eine Einheit, die befähigt ist, mit einer bestimmten Signaleinheit zu komplexieren. Ihre Funktion besteht darin, eine Signaleinheit mit einer anderen Einheit zu verknüpfen. Eine Brückeneinheit verknüpft eine beliebige Einheit mit einer anderen Einheit. Diese Einheiten können mit den anderen Einheiten kovalent oder nicht-kovalent verknüpft werden.
Die für die Signaleinheit spezifischen Einheiten umfassen z.B. Antikörper, Epitope, Antigene, Rezeptoren, Polynucleotide, Lectine, Agglutinine, Polysaccharide, Coenzyme und Lipide. Brückeneinheiten umfassen z.B. Mikroorganismen, Polymere, Biotin, biotinylierte Verbindungen, Lectine, Agglutinine, Avidin, Antikörper, Nudeinsäuren, Proteine, Lipide, Saccharide und bifunktionelle organische Verbindungen.
Die Zahl der Einheiten, die im Signal-Analyt-Gebilde enthalten sind, kann variieren. Das Gebilde kann zwei Einheiten (die Analyteinheit und die für den Analyten spezifische Einheit) oder viele Einheiten (die Analyteinheit, die für den Analyten spezifische Einheit, die Brückeneinheit (eine oder mehrere), die für die Signaleinheit spezifische Einheit und die Signaleinheit) umfassen. Die tatsächliche Zahl ist für die Erfindung unwichtig.
Diese Erfindung betrifft außerdem Zusammensetzungen, die Analyteinheiten, für den Analyten spezifische Einheiten und Signaleinheiten umfassen. Zusammensetzungen sind bekannt, in denen z.B. Staphylococcus aureus mit einem Antikörper verknüpft ist, der mit einem Antigen komplexiert ist. In allen diesen Zusammensetzungen sind die Bakterien jedoch nicht zur Vergrößerung befähigt, da fixierte Bakterien verwendet werden.
Die in dieser Erfindung offenbarte Zusammensetzung, die eine lebensfähige Signaleinheit, eine Analyteinheit und eine für den Analyten spezifische Einheit umfaßt, ist neu, da diese Signaleinheit zur Vergrößerung befähigt ist. Die Zusammensetzungen, die ferner eine für die Signaleinheit spezifische Einheit und/oder eine Brückeneinheit umfassen, sind somit auch neu.
Die Erfindung ist vielseitig, und die Reagentien zur Durchführung des Verfahrens können in Kits formuliert werden. Die Kits können die gewünschte, für den Analyten spezifische Einheit, eine Signaleinheit und Mittel zur Verknüpfung der Signaleinheit mit der für den Analyten spezifischen Einheit umfassen. Sofern die nachzuweisende Analyteinheit selbst zur Vergrößerung befähigt ist, muß der Kit keine Signaleinheit umfassen.

Beispiele

In den Beispielen wird auf die folgenden Substanzen Bezug genommen:
PBS - Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung, pH 7,4.
Blockierungsduffer PBS, enthaltend 2 % fetales Rinderserumalbumin (BSA) und 0,1 % Triton X-100.
Probenduffer - PES, enthaltend 1 % Rinderserumalbumin.
Nitrocellulose-Membranen - Bezogen von Schleicher und Schuell, Keene, N.H., BA 85, Chargen-Nr. 4098/4.
Nähragardlatten - 90 mm Petrischalen mit Nähragar, 1,5 %, enthaltend L-Brühe und 15 µg/ml Tetracyclin.
Serratia marcescens - ATCC # 14756, FDA-Stamm PCI 1107. Optimales Wachstum dieses Stammes bei 26ºC. Eine Tetracyclin-resistente Variante wurde auf den Nähragarplatten selektiert und in den Beispielen I und III eingesetzt.
Kaninchen-Antiserum, das gegen 5. marcescens gerichtet ist - Antiseren wurden in "New Zealand White"-Kaninchen durch Immunisierung mit Formalin-fixierten 5. marcescens in komplettem Freundschem Adjuvans hervorgerufen.
Staphylococcus aureus - Dies ist der Protein-A-positive Cowan- Stamm, Tetracyclin-resistent.
Biotinylierte Proteine - Antikörper gegen S. marcescens und Rinderserumalbumin wurden mit NHS-C&sub7;-Biotin in Gegenwart von 10 % DMSO umgesetzt.
Avidin - Eiweiß-Avidin wurde von Sigma Chemical Company, St. Louis, MO, bezogen.

Beispiel I

In diesem Beispiel war der Analyt (S. marcescens) zur Vergrößerung befähigt und diente als Signaleinheit.
1. Drei 1 µl-Proben von unmodifiziertem Antiserum gegen 5. marcescens, verdünnt 1:100 in PBS, wurden auf eine 4x4 cm große trockene Nitrocellulose-Membran in einem Dreieck- Muster aufgetragen. Die Membran ließ man an der Luft trocknen.
2. Die Membran wurde 30 Minuten bei 37ºC in Blockierungspuffer getaucht, um eine unspezifische Adsorption der Proteine an die Membran zu verhindern.
3. Die Membran wurde mit PBS gewaschen. Nun war sie bereit für den Nachweis von Serratia marcescens.
4. Eine Suspension von Serratia marcescens in PBS (O.D.500nm = 0,645) wurde 1:1000 in Probenpuffer verdünnt. Die Membran wurde mit 1 ml der verdünnten Suspension 20 Minuten unter leichter Bewegung in Kontakt gebracht.
5. Die Membran wurde viermal mit PBS gewaschen, um ungebundene Organismen zu entfernen, und mit dem Gesicht nach oben auf die Oberfläche einer Nähragarplatte aufgelegt. Die Platte wurde umgedreht und über Nacht bei Raumtemperatur inkubiert.
6. Drei charakteristische rote Kolonien im Muster eines Dreiecks wurden festgestellt, wobei jede Kolonie der Stelle entsprach, an der der spezifische Antikörper aufgetragen worden war.

Beisdiel II

In diesem Beispiel ist die für den Analyten spezifische Einheit (S. aureus) zur Vergrößerung befähigt. Die Analyteinheit ist IgG, an welches der Organismus mittels seines Protein A-Bestandteils bindet.
1. Drei 1 µl-Proben von Kaninchen-IgG in PBS (1 mg/ml) werden auf eine 4x4 cm große Nitrocellulose-Membran in einem Dreieck-Muster aufgetragen. Die Membran läßt man an der Luft trocknen.
2. Die Membran wird wie in Schritt 2 von Beispiel 1 blockiert.
3. Die Membran wird dreimal mit PES gewaschen. Das IgG auf der Membran wird sodann folgendermaßen nachgewiesen:
4. Eine Suspension von S. aureus in PES (O.D.&sub5;&sub0;&sub0; nm = 1,0) wird 1:1000 in Probenpuffer verdünnt. Die blockierte Membran wird mit 1 ml der verdünnten Suspension 20 Minuten unter intermittierender leichter Bewegung in Kontakt gebracht.
5. Die Membran wird gewaschen, auf die Oberfläche einer Nähragarplatte aufgebracht und über Nacht inkubiert, wie in Schritt 5 von Beispiel 1 beschrieben.
6. Kolonien von S. aureus werden an der Stelle festgestellt, an der das IgG aufgetragen worden war.

Beisdiel III

In diesem Beispiel ist weder die Analyteinheit (Kaninchen-IgG) noch die für den Analyten spezifische Einheit (Ziegen-Anti-Kaninchen-IgG, Fab'2) zur Vergrößerung befähigt. Die Signaleinheit, S. aureus, wird mit der Analyteinheit verknüpft.
1. Drei 1 µl-Proben von Ziegen-Anti-Kaninchen-IgG (Fab'2) in PBS werden auf eine 4x4 cm große Nitrocellulose-Membran in einem Dreieck-Muster aufgetragen. Die Membran läßt man an der Luft trocknen.
2. Die Membran wird wie in Schritt 2 von Beispiel 1 blockiert.
3. Die Membran wird dreimal mit PBS gewaschen. Das Kaninchen-IgG wird folgendermaßen nachgewiesen:
4. Die blockierte Membran wird mit einer Lösung des Kaninchen-IgG in Verdünnungspuffer, 10 µg pro ml, 20 Minuten unter intermittierender leichter Bewegung in Kontakt gebracht.
5. Die Membran wird dreimal mit PBS gewaschen.
6. Eine Suspension von lebensfähigem S. aureus in PES wird wie in Schritt-4 von Beispiel II hergestellt. Die Membran wird mit der Suspension in Kontakt gebracht, wie beschrieben.
7. Die Membran wird behandelt, wie in Schritt 5 von Beispiel II beschrieben.
8. Kolonien von 5. aureus werden nur dann an der Stelle festgestellt, an der das Ziegen-Anti-Kaninchen-IgG (Fab'2) aufgetragen worden war, wenn die Lösung in Schritt 4 Kaninchen-IgG enthält. Wenn kein IgG vorliegt oder wenn Ziegen-IgG vorliegt, werden keine Kolonien festgestellt.

Beisdiel IV

In diesem Beispiel war weder der Analyt (biotinyliertes Rinderserumalbumin) noch die für den Analyten spezifische Einheit (Avidin) zur Vergrößerung befähigt. S. marcescens diente als Signaleinheit. Die Letztere wurde mittels einer Brückeneinheit (biotinylierter Antikörper gegen S. marcescens) mit der für den Analyten spezifischen Einheit verknüpft.
1. Drei 1 µl-Proben von biotinyliertem Rinderserumalbumin (1,5 mg/ml in PBS) wurden auf eine 4x4 cm große Nitrocellulose-Membran in einem Dreieck-Muster aufgetragen. Die Membran ließ man an der Luft trocknen.
2. Die Membran wurde wie in Schritt 2 von Beispiel 1 blockiert.
3. Die Membran wurde mit PBS gewaschen. Zum Nachweis des biotinylierten Rinderserumalbumins wurden die folgenden Schritte durchgeführt:
4. Zuerst wurde die Membran mit einer Lösung von Avidin (10 µg/ml in Probenpuffer) 30 Minuten unter intermittierender leichter Bewegung in Kontakt gebracht.
5. Die Membran wurde viermal mit PES gewaschen, um ungebundenes Avidin zu entfernen.
6. Anschließend wurde die Membran mit 1 ml des biotinylierten Anti-S. marcescens-Antikörpers, 10 µg/ml in Probenpuffer, 30 Minuten bei Raumtemperatur unter intermittierender leichter Bewegung in Kontakt gebracht.
7. Die Membran wurde viermal mit PES gewaschen, um ungebundenen Antikörper zu entfernen.
8. Schließlich wurde die Membran mit 1 ml einer Suspension von 5. marcescens (1:1000 Verdünnung in Probenpuffer einer Originalsuspension O.D.&sub5;&sub0;&sub0; nm = 1,0) 30 Minuten bei Raumtemperatur unter intermittierender leichter Bewegung in Kontakt gebracht.
9. Die Membran wurde viermal mit PBS gewaschen, um ungebundene Organismen zu entfernen. Sie wurde mit dem Gesicht nach oben auf die Oberfläche einer Nähragarplatte aufgelegt. Die Platte wurde umgedreht und über Nacht bei Raumtemperatur inkubiert.
10. Drei charakteristische rote Kolonien von S. marcescens im Muster eines Dreiecks wurden an den Stellen festgestellt, an denen das biotinylierte BSA aufgetragen worden war.
Der Fachmann weiß, daß verschiedene Anderungen, Modifikationen und Variationen durchgeführt werden können, ohne daß Sinn und Umfang der in den vorliegenden Patentansprüchen definierten Erfindung verlassen werden.

Claims

1. Testverfahren zum Nachweis eines Analyten in einer Probe, wobei das Verfahren folgende Schritte umfaßt:

a. Anheften der vermutlich den Analyten enthaltenden Probe an einen festen Träger;

b. Kombinieren des angehefteten Analyten mit einer Zu sammensetzung, die (i) einen für den Analyten spezifischen Bestandteil, der mit dem Analyten einen spezifischen Komplex bilden kann, und (ii) einen nachweisbaren Bestandteil umfaßt, der einen Organismus, ausgewählt aus Mikroorganismen, Pilzzellen, Pflanzenzellen oder Tierzellen, die wachsen oder sich vermehren können, umfaßt, mit der Maßgabe, daß die Mikroorganismen keine Bacteriophagen sind, wobei der nachweisbare Bestandteil mit dem für den Analyten spezifischen Bestandteil zur Bildung eines dadurch erhaltenen Komplexes verknüpft wurde;

c. Abtrennen des nicht-komplexierten nachweisbaren Bestandteiles von dem Komplex; und

d. Einbringen des Komplexes in eine für die Förderung des Wachstums oder der Replikation des nachweisbaren Bestandteils geeignete Umgebung, wobei das Wachstum oder die Replikation proportional zu der Konzentration des Analyten sind.

2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei der feste Träger spezifisch an den Analyten bindet.

3. Testzusammensetzung zum Nachweis eines Analyten in einer Probe, wobei die Zusammensetzung (i) einen für einen Analyten spezifischen Bestandteil, der mit dem Analyten einen spezifischen Komplex bilden kann, und (ii) einen zur Vergrößerung fähigen nachweisbaren Bestandteil umfaßt, der einen Organismus, ausgewählt aus Mikroorganismen, Pilzzellen, Pflanzenzellen oder Tierzellen, die wachsen oder sich vermehren können, umfaßt, mit der Maßgabe, daß die Mikroorganismen keine Bacteriophagen sind, wobei der nachweisbare Bestandteil eine getrennt vorliegende Einheit ist und mit dem für den Analyten spezifischen Bestandteil verknüpft wurde.

4. Testzusammensetzung zum Nachweis eines Analyten in einer Probe, wobei die Zusammensetzung (i) einen für einen Analyten spezifischen Bestandteil, der mit dem Analyten einen spezifischen Komplex bilden kann, und (ii) einen zur Vergrößerung fähigen nachweisbaren Bestandteil um faßt, der einen Organismus, ausgewählt aus Mikroorganismen, Pilzzellen, Pflanzenzellen oder Tierzellen, die wachsen oder sich vermehren können, umfaßt, mit der Maßgabe, daß die Mikroorganismen keine Bacteriophagen sind, wobei der nachweisbare Bestandteil eine getrennt vorliegende Einheit ist und mit dem Analyten verknüpft wurde.

5. Zusammensetzung nach Anspruch 3, wobei der für den Analyten spezifische Bestandteil spezifisch an ein Makromolekül bindet, das direkt oder indirekt an den Organismus gebunden ist.

6. Zusammensetzung nach Anspruch 3, wobei der für den Analyten spezifische Bestandteil kovalent an den Organismus gebunden ist.

7. Zusammensetzung nach Anspruch 3, wobei die Verknüpfung das Ergebnis einer spezifischen Bindungsreaktion zwischen spezifischen Bindungspartnern ist, wobei einer der spezifischen Bindungspartner kovalent an den für den Analyten spezifischen Bestandteil gebunden ist, und der andere spezifische Bindungspartner kovalent an den Organismus gebunden ist.