DE3638062A1

DE3638062A1 - Bakterielles verfahren fuer die herstellung von dispersionsmitteln

Info

Publication number: DE3638062A1
Application number: DE19863638062
Authority: DE
Inventors: Eliora Z Ron; Eugene Rosenberg
Original assignee: Ramot at Tel Aviv University Ltd
Current assignee: Ramot at Tel Aviv University Ltd
Priority date: 1985-11-07
Filing date: 1986-11-07
Publication date: 1987-06-11
Anticipated expiration: 2006-11-08
Also published as: GB2183665A; FR2589881A1; US4921793A; IL76981A0; CA1301683C; ZA868050B; GB8626693D0; DK530186D0; DE3638062C2; DK530186A; FR2589881B1; GB2183665B; IL76981A; CH672500A5; ES2003745A6

Description

Die Erfindung betrifft polymere Substanzen, die durch Bakterien gebildet werden und welche als Dispersionsmittel für wasserunlösliche feinverteilte Feststoffe in einem wäßrigen Medium verwendet werden. Die neuen Dispersionsmittel können für die Dispersion einer Vielzahl von Mineralien verwendet werden. Die Erfindung betrifft weiterhin Zubereitungen, die solche polymeren Dispersionsmittel enthalten, und Verfahren zur Herstellung und Reinigung solcher polymerer Dispersionsmittel.

Mikroorganismen, die ein großes Verhältnis von Oberfläche zu Volumen aufweisen, bilden eine Vielzahl von oberflächenaktiven Mitteln. Eine große Vielzahl von oberflächenaktiven Mitteln mit einem Molekulargewicht unter ungefähr 2000 Dalton wird durch Mikroben gebildet. Unter diesen können Substanzen erwähnt werden, welche oberflächenaktiv sind und welche durch Spezies, wie Rhodococcus, Torulopsis, Pseudomonas, Corynebacterium, B. subtilis etc. gebildet werden.

Eine Vielzahl von mikrobiellen oberflächenaktiven Mitteln, welche im allgemeinen Gemische von Proteinen und Polysacchariden sind, werden von Acinetobacter calcoaceticus gebildet. Andere oberflächenaktive Mittel werden von Candida tropicalis, Pseudomonas aeruginosa, Phormidium J-1 gebildet. Keines der bekannten oberflächenaktiven Mittel, das durch Bakterien gebildet wird, und keiner der oben erwähnten Mikroorganismen sind als Dispersionsmittel für feinverteilte Materialien wirksam.

Dispersionsmittel sind spezifische oberflächenaktive Substanzen, welche so ausgebildet sind, daß sie die Bildung und Stabilisierung von feinverteilten Feststoffen in einer Flüssigkeit, im allgemeinen in einem wäßrigen System, erleichtern. Dispersionsmittel werden in großer Vielzahl bei verschiedenen Herstellungsverfahren, wie bei der Herstellung von Papier, Druckfarben, Anstrichmitteln, Pharmazeutika, Kunststoffen, Farbstoffen, Nahrungsmitteln, keramischen Materialien, Kautschuk, Zement und ähnlichen, verwendet. Dispersionsmittel werden viel in den Bergbau-Industrien verwendet. Solche Dispersionsmittel zeigen im allgemeinen ihre Aktivität, indem sie an festen Teilchen absorbiert werden, was eine elektrische Ladung dieser bewirkt und wobei sie anschließend von Gegenionen umgeben werden, was eine Abstoßung benachbarter Teilchen voneinander bewirkt, wodurch eine Ausflockung vermieden wird und wodurch die feinverteilten Teilchen in Suspension gehalten werden.

Bis heute sind keine bakteriell gebildeten polymeren Dispersionsmittel für feinverteilte Mineralien bekannt. Die vorliegende Erfindung betrifft neue polymere Substanzen, welche als Dispersionsmittel in vergleichsweise geringen Konzentrationen wirksam sind. Diese können in vergleichsweise reiner Form nach Fermentationsverfahren hergestellt werden.

Die Erfindung betrifft Dispersionsmittel, welche mittels Bakterien gebildet wurden und welche polymere Substanzen sind. Sie können als Dispersionsmittel bei einer Vielzahl von Industrien, wie oben angegeben, verwendet werden. Sie sind wirksame Dispersionsmittel für die Dispersion in Wasser von Substanzen, wie feinverteiltem Kalkstein, Calciumcarbonat, Phosphaten (Apatiten), Titandioxid etc.

Gemäß einer bevorzugten erfindungsgemäßen Ausführungsform werden polymere Substanzen zur Verfügung gestellt, welche nützliche Dispersionsmittel für eine Vielzahl von anorganischen Materialien, wie sie oben definiert wurden, sind, die durch bestimmte Stämme von Acinetobacter calcoaceticus gebildet werden. Diese sind bakteriell gebildete, hochmolekulare Substanzen des Polysaccharidtyps. Die Substanzen, welche in im wesentlichen reinem homogenem Zustand isoliert wurden, zeichnen sich durch eine hohe spezifische Aktivität als Dispersionsmittel aus.

Die erfindungsgemäßen Dispersionsmittel sind im allgemeinen Heteropolysaccharide, welche Carboxygruppen enthalten, und Salze davon mit Kationen, wie auch Amino- und/oder Acylaminomonosaccharid-Molekülteile, einschließlich der sauren Additionssalze von solchen Aminogruppen. Beispiele von Kationen sind Natrium-, Kalium- oder Ammoniumionen, und die Säureadditionssalze können solche mit Chlorwassersäure oder einer ähnlichen Säure sein.

Solche polymeren Produkte, die durch Bakterien gebildet werden, sind ein Gemisch aus Verbindungen mit individuellen Molekulargewichten.

Die Erfindung betrifft die Carboxyl enthaltenden und Amino (oder/und Acylamino) enthaltenden Heteropolysaccharide, welche Dispersionsmittel für Mineralien sind, welche niedrigere oder höhere Molekulargewichte aufweisen als die, die in den spezifischen Beispielen aufgeführt sind.

Ohne daß dies eine Beschränkung der vorliegenden Erfindung sein soll, nimmt man an, daß solche Dispersionsmittel im allgemeinen ein durchschnittliches Molekulargewicht entweder im Bereich von etwa 46.000 bis etwa 57.000, bestimmt durch Sedimentations-Geschwindigkeitsanalyse, oder im Bereich von etwa 55.000 bis etwa 68.000, bestimmt durch die Intrinsikviskosität bzw. grundmolare Viskositätszahl, besitzen.

Das polymere Produkt wird durch Fermentation eines geeigneten Stammes von Bakterium Acinetobacter calcoaceticus (hinterlegt am 4.November 1986 unter den Nummern A2 DSM 3894 und HE5 DSM 3895.) gebildet und insbesondere durch die Stämme A2 und HE5, welche im folgenden beschrieben werden.

Die erfindungsgemäßen Produkte besitzen weiterhin die Eigenschaft, daß sie in bestimmten Konzentrationen als Ausflockungsmittel für Mineralien in wäßrigem Medium und insbesondere für Kalkstein, präzipitiertes Calciumcarbonat und insbesondere für Kalkstein, präzipitiertes Calciumcarbonat, wasserunlösliche Phosphate und Titandioxid sind. Die Produkte müssen, damit sie als Dispersionsmittel für Mineralien aktiv sind, nicht isoliert werden. Die Erfindung betrifft ebenfalls ein Dispersionsmittel für anorganische Mineralien in wäßrigem Medium, das dadurch gekennzeichnet ist, daß es entweder die rohe Brühe enthält, die bei dem Bakterienfermentationsverfahren gebildet wird, oder daß es das teilweise gereinigte Produkt enthält. Die Erfindung betrifft weiterhin wäßrige Dispersionen von Mineralien, insbesondere von Kalkstein, präzipitiertem Calciumcarbonat, einem wasserunlöslichen Phosphat (insbesondere Apatit) oder Titandioxid, in denen das Dispersionsmittel das oben beschriebene polymere Produkt ist.

Die Erfindung betrifft weiterhin ein Verfahren zur Herstellung des erfindungsgemäßen Dispersionsmittels, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man in Anwesenheit von Nährstoffen ein Bakterium (bevorzugt einen Stamm von Acinetobacter calcoaceticus, wie A2 oder HE5, wie im folgenden beschrieben) aerob züchtet, der, wenn er wächst, die gewünschten neuen Polysaccharide ausscheidet. Das Rohprodukt kann gegebenenfalls durch Zentrifugieren oder Filtrieren abgetrennt werden und gegebenenfalls weiteren Behandlungsstufen unterworfen werden, die beispielsweise die Ausfällung mit Ammoniumsulfat, die Lösungsmittelextraktion zur Entfernung von nicht kovalent gebundenen Lipiden, einen Ionenaustausch zum Ersatz der Gegenionen, die Dialyse zur Entfernung von zellularen Materialien und/oder die Behandlung mit Enzymen zur Entfernung von Proteinen umfassen.

Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform wird das polymere Produkt nach einem Verfahren hergestellt, welches umfaßt:

(a) Herstellung des Rohmaterials nach dem oben beschriebenen Verfahren, wobei die Abtrennung bevorzugt durch Zentrifugieren erfolgt,

(b) Unterwerfen des Rohmaterials der Präzipitation mit Ammoniumsulfat und/oder der Lösungsmittelextraktion und/oder des Ionenaustausches und/oder der Dialyse und/oder der Behandlung mit Enzymen,

(c) Extraktion einer wäßrigen Lösung des bei Stufe (b) erhaltenen Materials mit Phenol bei erhöhter Temperatur und bevorzugt Abtrennung der Phasen durch Dekantieren und anschließendes Zentrifugieren,

(d) Dialyse der so extrahierten wäßrigen Lösung und

(e) Entfernung des Wassers aus der so dialysierten Lösung, bevorzugt durch Gefriertrocknung.

Bei einer besonders bevorzugten Ausführungsform umfaßt die Verfahrensstufe (b) die darauffolgende Präzipitation mit Ammoniumsulfat, die Abtrennung des Präzipitats durch Zentrifugieren, die Dialyse gegenüber destilliertem Wasser und die Lyophilisierung.

Für die Herstellung wäßriger Dispersionen aus Mineralien kann das Dispersionsmittel als wäßrige Lösung oder Aufschlämmung oder in Form des trockenen Materials verwendet werden.

Die Erfindung betrifft weiterhin ein Gemisch aus Acinetobacter calcoaceticus A2- oder HE5-Stämmen in einem Nährmedium oder verarmten Nährmedien für das Wachstum solcher Bakterien und mindestens eine annehmbare Menge an Heteropolysaccharid, das durch ein solches Bakterium abgeschieden wird.

Die Erfindung betrifft inter alia Verfahren für die Herstellung von Dispersionsmitteln aus beispielsweise zwei unterschiedlichen Stämmen von Acinetobacter calcoaceticus, wobei die Biodispersionsmittel in das umgebende Medium während der Züchtung dieser Stämme in einem belüfteten flüssigen Medium abgeschieden werden. Die Biodispersionsmittel können aus dem verarmten Nährmedium konzentriert und gereinigt werden durch Dialyse, Ammoniumsulfatpräzipitation und Phenolextraktion. Die hochgereinigte Fraktion besteht aus einem anionischen Heteropolysaccharid (1,4 µmol Carboxylgruppe pro mg Trockengewicht) mit einem durchschnittlichen Molekulargewicht von ungefähr 50.000 Dalton. Dieses Heteropolysaccharid, welches einen Aminozucker enthält und ein potentes Dispersionsmittel ist, wird im folgenden als Biodispersan bezeichnet.

Die neuen Biodispersionsmittel können in teilweise gereinigten oder gereinigten Formen verwendet werden. Die Biodispersionsmittelherstellungen können mit Lösungsmittel extrahiert werden zur Entfernung von nichtkovalent gebundenen Lipiden, dem Ionenaustausch unterworfen werden zum Ersatz von Gegenionen und mit Enzymen behandelt werden, um inaktive Proteine zu zersetzen. Die Biodispersionsmittel können als flüssige Lösungen, Aufschlämmungen oder als getrocknetes Pulver verwendet werden. Es wurde gezeigt, daß sie bei der Dispersion und/oder Flokkulation unterschiedlicher Formen von Calciumcarbonat, Titandioxid und Phospatmineralien nützlich sind.

Die Dispersionseigenschaften der Biodispersionsmittel zeigen, daß sie ebenfalls bei vielen anderen Mineralien nützlich sind.

Isolierung und Charakterisierung von Acinetobacter calcoaceticus- Stämmen HE5 und A2:

Acinetobacter-Spezies sind in der Natur weit verbreitet. Die Quellen der beiden Acinetobacter, die bei der vorliegenden Erfindung verwendet werden, sind Menschenhaar (Stamm HE5) und Boden (Stamm A2).

Die erfindungsgemäßen Stämme HE5 und A2 wurden als A. calcoaceticus gemäß den folgenden Kriterien klassifiziert:

Die Zellen sind gramnegativ, nichtmobil, oxidasenegativ, aerob, kokkoide Stäbchen, die auf McConkey-Agar wachsen, aber Glucose nicht fermentieren. Ein weiterer Beweis, daß A2 und HE5 A. calcoaceticus-Stämme sind, wird erhalten, indem man das Interspezies-DNA-Transformationsverfahren von Juni (J. Bacteriol. 112: 917 (1972)) verwendet. DNA, extrahiert von entweder HE5 oder A2, transformiert kompetente auxotrophe A. calcoaceticus BD413.

Zusätzliche biochemische und Wachstumseigenschaften der Stämme HE5 und A2 sind in den folgenden Tabellen III und IV angegeben. Der Stamm A2 kann auf wesentlich mehr Kohlenstoffquellen wachsen und diese oxidieren als der Stamm HE5.

TABELLE III

TABELLE IV

Anhand der beigefügten Zeichnungen wird die Erfindung erläutert. Es zeigen:

Fig. 1 einen Standarddispersionsversuch. Das Biodispersionsmittel, das bei diesem Versuch verwendet wurde, war die ungereinigte dialysierte extrazellulare Kulturflüssigkeit des Stammes A2.

Fig. 2 das ¹³C-NMR-Spektrum von dem Biodispersionsmittel A2.

Fig. 3 die Dispersion von Kalkstein von Biodispersionsmitteln von HE5: dialysierte zellfreie Kulturbrühe (○), Ammoniumsulfat, präzipitiertes rohes Biodispersionsmittel (), gereinigtes Biodispersionsmittel (⚫). Diese Symbole werden ebenfalls in den Fig. 4 bis 8 verwendet.

Fig. 4: Dispersion von Kalkstein mit den Biodispersionsmitteln von A2.

Fig. 5: Dispersion von Titandioxid mit den Biodispersionsmitteln von HE5.

Fig. 6: Dispersion von Titandioxid mit den Biodispersionsmitteln von A2.

Fig. 7: Dispersion von Apatit mit den Biodispersionsmitteln von HE5.

Fig. 8: Dispersion von Apatit mit den Biodispersionsmitteln von A2.

BEISPIELE Beispiel 1 Herstellung der Biodispersionsmittel mittels A. calcoaceticus-Stämmen HE5 und A2 Analytische Verfahren:

Sofern nicht anders angegeben, ist das feste Material, das für die Dispersionsanalysen verwendet wird, gepulverter Kalkstein aus der Umgebung von Jerusalem, zerkleinert und durch ein Sieb mit einer lichten Maschenweite von 0,044 mm (325 mesh) durchgesiebt.

Das Material enthält über 99% Calciumcarbonat. Das präzipitierte Calciumcarbonat ist ein chemisch reines Produkt von Merck, Art. 2066, Ansatz 52 04 195. Das Titandioxid ist ein im Handel erhältliches Pigment, das von einem lokalen Händler erhalten wird. Die Apatit(phosphat)Herstellung wird aus Phosphatgestein durch wiederholte Extraktion mit Citratpuffer hergestellt. Die letzte kalksteinfreie gewaschene Präparation wird getrocknet und gepulvert, so daß sie durch ein Sieb mit einer lichten Maschenweite von 0,044 mm (325 mesh) hindurchgeht.

Die Standardmineraldispersionsanalyse wird wie folgt durchgeführt:

(1) In einen 12 ml konischen Meßzylinder gibt man 400 mg von einem der gepulverten Mineralien (beispielsweise Kalkstein, Apatit oder Titandioxid).

(2) Zu dem gepulverten Mineral gibt man 3,8 ml einer wäßrigen Lösung, welche unterschiedliche Konzentrationen des Biodispersionsmittels enthält, und dann wird die Suspension durch Wirbeln während 30 Sekunden vermischt.

(3) Nachdem 30 Minuten für die Gleichgewichtseinstellung bei Raumtemperatur vergangen sind, wird die Suspension erneut durch Aufwirbeln während 30 Sekunden (Zeit Null) vermischt, und dann wird der Zylinder ungestört stehengelassen.

(4) Nach 30 Minuten werden die oberen 2 ml sorgfältig entfernt und auf verbleibendes dispergiertes Mineral durch die Trübigkeit in einem Klett-Summerson-Photometer mit einem Grünfilter untersucht (die Suspensionen werden mit Wasser verdünnt, so daß die letzte Ablesung unter 150 Klett-Einheiten (K.U.) liegt. Die Werte werden als End-K.U. × Verdünnung angegeben).

Unter Verwendung dieses Analysenverfahrens werden Standardkurven für die Biodispersionsmittelaktivität als Funktion der Konzentration unter Verwendung verschiedener Präparationen aus Biodispersionsmittel hergestellt. Ein Beispiel ist in Fig. 1 dargestellt. Eine Einheit der Dispersionsaktivität wird als 1000 K.U. unter Verwendung des Standardanalysenverfahrens definiert. Beispielsweise ergeben 0,065 mg/ml des dialysierten A2-Biodispersionsmittels, welches in Fig. 1 verwendet wird, 1 Einheit der Aktivität. Daher beträgt die spezifische Aktivität dieser Präparation 1 Einheit/(0,65) (4 ml) oder 3,85 Einheiten pro mg.

Sofern nicht anders angegeben, wurden die Wachstumsversuche in einem 1-l-Kolben durchgeführt, welcher 100 ml des folgenden Mediums enthielt: 100 mM Phosphatpuffer, pH 7,0, 0,4% Ammoniumsulfat, 0,04% Magnesiumsulfatheptahydrat und 2 ml Ethanol. Die Kolben werden durch Schütteln mit einem Gyratorygerät bei 30°C nach der Inokulation mit 1 ml Übernachtkulturen der Stämme A2 oder HE5 inkubiert. Die Kulturen werden nach 1, 2 und 3 Tagen für Kulturtrübigkeit (K.U.) und pH geprüft. Die Proben werden dann entfernt, zentrifugiert, um die Zellen zu sedimentieren, und die extrazellulare Flüssigkeit wird extensiv gegenüber destilliertem Wasser dialysiert.

Beispiel 2 Herstellung der Biodispersionsmittel in 4-l-Schüttelkolben und die Konzentration durch Ammoniumsulfatpräzipitation:

Zwanzig 4-l-Kolben, wovon jeder 1 l Standardmedium enthält, werden mit 7,0 ml Starterkultur von entweder A2 (10 Kolben) oder HE5 (10 Kolben) inokuliert. Die Starterkulturen werden während 1 Tages auf dem gleichen Medium gezüchtet, ausgenommen, daß sie 1% Ethanol anstelle von 2% Ethanol enthielten. Die Trübigkeiten der Starterkulturen zum Zeitpunkt der Inokulation sind 425 bzw. 134 Klett-Einheiten für die Stämme A2 und HE5. Die Kulturen werden bei 30°C während 3 Tagen unter Gyratory-Schütteln (150 Upm) inkubiert. Die Zellen werden durch Zentrifugieren geerntet, einmal gewaschen und das Zelltrockengewicht wird bestimmt. Die flüssigen Überstände werden auf 55% Ammoniumsulfat-Sättigung zur Präzipitation des aktiven Biodispersionsmittels eingestellt. Die Präzipitate von jeder der 10-l-Fermentationsversuche werden durch Zentrifugieren gesammelt und dann in 450 ml Wasser gelöst. Nach einer extensiven Dialyse gegenüber destilliertem Wasser bei 4°C werden die Lösungen lyophilisiert. Die Endausbeuten an extrazellularen Materialien betragen 3,7 g für A2 und 2,7 g für HE5.

Die spezifischen Aktivitäten der Biodispersionsmittel betragen 6,2 Einheiten/mg und 6,3 Einheiten/mg für A2 bzw. HE5. In der Tabelle VII sind die Werte der 10-l-Fermentationsversuche zusammengefaßt.

Tabelle VII

Bei den oben beschriebenen Beispielen werden Biodispersionsmittel durch Anwendung der Gyratory-Schüttlung von A. calcoaceticus- Kulturen in Kolben, welche ein minimales Salzmedium mit 2 Vol-% Alkohol enthalten, erhalten. Gute Ausbeuten an Biodispersionsmitteln werden aus Stämmen HE5 und A2 auf diese Weise erhalten, jedoch kann der Fachmann zahlreiche andere Wege auswählen, um die Bildung zu bewirken. Beispielsweise kann man die bekannten submersen Fermentationen in Rührtanks durchführen.

Beispiel 3 Isolierung und Charakterisierung der Biodispersionsmittel Deproteinisierung:

Die mit Ammoniumsulfat präzipitierten Biodispersionsmittel, beschrieben wie in Beispiel 1 oben, werden als rohes A2- Biodispersionsmittel und rohes HE5-Biodispersionsmittel bezeichnet. Diese rohen Materialien werden weiter mittels heißem Phenol gemäß dem Verfahren von Zuckerberg et al. gereinigt (Appl. Environ. Microbiol. 37: 414 (1979)).

Die aus den rohen Biodispersionsmitteln A2 und HE5 erhaltenen vereinigten Wasserextrakte werden extensiv gegenüber destilliertem Wasser dialysiert und gefriergetrocknet, wobei man weiße flockenartige Feststoffe, die als Biodispersan A2W bzw. Biodispersan HE5W bezeichnet werden, erhält. Die Ausbeuten an A2W und HE5W betragen 0,72 g bzw. 0,51 g. Die spezifischen Dispersionsaktivitäten von A2W und HE5W betragen jeweils 15 Einheiten pro mg entsprechend einer 2,4fachen Reinigung, verglichen mit den rohen Biodispersionsmitteln.

Chemische und physikalische Eigenschaften der Biodispersionsmittel A2 und HE5 Allgemeine analytische Verfahren:

Die Proteinkonzentrationen wurden gemäß dem Verfahren von Lowry et al. (J. Biol. Chem. 193: 265 (1951)) unter Verwendung von Rinderserumalbumin als Standard bestimmt. Die Kohlehydrate werden nach dem Phenolschwefelsäureverfahren (Dubois et al., Anal. Chem. 28: 350 (1956)) unter Verwendung von Glucose als Standard bestimmt. Die reduzierenden Zucker werden nach dem Arsenomolybdatverfahren (Spiro, Meth. in Enzymol. 8: 7 (1966)) unter Verwendung von Glucose als Standard bestimmt. Die Hexuronsäuren werden gemäß der Carbazolreaktion (Dische, Methods of Biochemical Analysis 2: 313 (1955)) unter Verwendung von Glucuronsäure als Standard geschätzt. Die Hexosamine werden gemäß dem Indol-HCl-Verfahren und anschließender Deaminierung entsprechend Dische und Borenfreund (J. Biol. Chem. 192: 583 (1951)) bestimmt. Die Titrationen erfolgten mit einem pH-Meter durch ein Mikroverfahren, bei dem 0,01 ml Teile von 0,1 N HCl- oder NaOH-Lösungen unter gutem Mischen unter Stickstoffgas (zum Ausschluß von Kohlendioxid) zu 3,0 ml Lösungen, die titriert wurden, zugegeben wurden.

Die Viskosität wird mit 1,0-ml-Proben in einem Ostwald- Fenske-Mikroviskometer bei 30°C gemessen. Eine analytische Ultrazentrifuge, Beckman Modell E, die mit einem optischen Schlierensystem ausgerüstet war, wird für die Messung der Sedimentationsgeschwindigkeit und Diffusionskonstanten bei 20°C verwendet. Die Absorption wurde an einem Gilford-Modell- 240-Spektrophotometer abgelesen. Die NMR-Spektren wurden von S. Carmeli, Chemistry Department, Tel Aviv University, aufgenommen und auf einem Bruker-AM-360-Spektrometer mit einem Aspect-3000-Computer aufgezeichnet, und es wurde bei 360,1 MHz und 90,5 MHz für ¹H bzw. ¹³C gearbeitet. Die Dünnschichtchromatographie (TLC) wurde an vorbeschichteten Celluloseplatten (Merck) unter Verwendung von Lösungsmittel 1: Ethylacetat, Pyridin, Essigsäure, Wasser (5:5:3:1, Volumenverhältnisse) durchgeführt. Die Zucker und Polyole wurden mit alkalischen Silbernitrat (Gal, Anal. Biochem. 24: 452 (1968)) nachgewiesen. Die Aminozucker wurden mit einem Ninhydrin-Sprayreagenz nachgewiesen.

Ergebnisse:

Die ¹³C- und ¹H-NRM-Spektren von gereinigten Biodispersanen A2 und HE5 sind im wesentlichen identisch. Die beiden Materialien ergeben ebenfalls identische Titrationskurven und TLC-Muster nach der Säurehydrolyse. Weiterhin zeigten die Biodispersane A2 und HE5 ähnliche Dispersionsaktivitäten bei verschiedenen Mineralien (vide infra). Die gereinigten Biodispersane A2 und HE5 erschienen identisch zu sein, obgleich sie von verschiedenen Acinetobacter-Stämmen gebildet wurden. Die in diesem Teil dargestellten Werte sind die für Biodispersan A2, obgleich äquivalente Ergebnisse für HE5 erhalten wurden.

Gereinigtes Biodispersan A2 enthält weniger als 2% Protein, ergibt einen negativen Test für Hexuronsäuren und eine schwache Reaktion mit Phenolschwefelsäure. Nach der Hydrolyse in 3 N HCl bei 100°C während 4 Stunden gab es Material starke Tests für reduzierende Zucker und Aminozucker. Somit ist Biodispersan A2 ein Aminozucker enthaltendes Biopolymeres. Das gereinigte Biopolymere (1 mg/ml) zeigt keine signifikante Absorption im Bereich von 225 bis 800 nm.

Die Titration von Biodispersan A2 zwischen pH 2 und 12 zeigt einen einzigen Wendepunkt, entsprechend pK¹ = 3,2 (typisch für eine Uronsäure). Das Material enthält 1,4 Mol Carboxylgruppen pro mg Polymerem. Somit ist A2 ein anionisches Biopolymeres. Die titrierbaren Aminogruppen (pH 7 bis 9) betragen weniger als 0,3 µMol pro mg, was anzeigt, daß die Aminozucker hauptsächlich N-acyliert sind, was üblicherweise bei bakteriellen Polysacchariden der Fall ist.

Das ¹³C-NMR-Spektrum von Biodispersan A2 zeigt 27 ausgeprägte Signale (Fig. 2). Die vier Signale zwischen 99 ppm und 103 ppm treten in dem anomerischen Bereich der Kohlehydrate auf (Gorin, Adv. Carbohydrate Chem. and Biochem. 38: 13 (1981)), was nahelegt, daß A2 vier unterschiedliche Monosaccharideinheiten enthält. Die fünf Signale zwischen 176 ppm und 178 ppm zeigen die Anwesenheit von Carbonyl-C-Atomen an. Eine dieser Carbonylgruppen ist wahrscheinlich in dem Carboxylion enthalten, und die vier restlichen sind wahrscheinlich Carbonylmolekülteile der Acetylgruppen. Daraus folgt, daß die mehrfachen Signale zwischen 23 ppm und 25 ppm den Methyl- C-Atomen der Acetylgruppen entsprechen. Da das identische Spektrum nach der Behandlung des Polymeren mit 0,5 M NaOH bei 100°C während 15 Minuten erhalten wird, enthält das Polysaccharid keine O-Acetylgruppen. Die Acetylsignale kommen daher höchstwahrscheinlich von N-Acetylgruppen. Das Signal bei 18 ppm ist typisch für die Methylgruppe von 6-Deoxyhexosen.

Das TLC-Muster des säurehydrolysierten Biodispersans A2 (3 N HCl, 100°C, 4 Stunden), entwickelt im Lösungsmittel 1, ist in Tabelle VIII zusammengefaßt. Drei ninhydrinpositive Hauptkomponenten werden mit Beweglichkeiten, bezogen auf Glucosamin, von 1,38, 1,03 und 0,69 beobachtet. Zusätzlich tritt ein Streifen von ninhydrinpositivem und reduzierendem Material vom Ursprung bis zur Komponente C auf. Die Komponenten A und B sind eindeutig Aminozucker, da sie starke Ninhydrin- und Reduktionsreaktionen zeigen. Die Verbindung C ergibt eine blaue Ninhydrinreaktion und einen schwachen Silbernitrattest.

TABELLE VIII

a. Erhalten nach 4 Stunden Hydrolyse in 3 N HCl bei 100°C.

b. Bewegungsgeschwindigkeit von jedem Zucker relativ zu Glucosamin.

Die Sedimentationsgeschwindigkeitsanalyse von 2 mg/ml Biodispersan A2 zeigt eine einzige Bande entsprechend einem S₂₀ von 1,39 × 10^-13S oder 1,39 Svedberg-Einheiten. Der Diffusionskoeffizient D, ebenfalls bestimmt in der analytischen Zentrifuge, beträgt 18,8 × 10^-8cm²sek^-1. Eine Schätzung des Molekulargewichts von Biodispersan A2 aus der Gleichung:

M = RTs D ^-1 (1-V _p)^-1,

worin R die Gaskonstante, T die absolute Temperatur, p die Dichte der Lösung und V das spezifische Partialvolumen von A2 bedeuten (welches also 0,65 cm³ g^-1 angenommen wird, typisch für Polysaccharide), ergibt ein gewichtsdurchschnittliches Molekulargewicht von 51.400. Alternativ kann das Molekulargewicht unter Verwendung der bestimmten Werte der grundmolaren Viskositätszahl, 440 cm³ g^-1, und des Sedimentationskoeffizienten entsprechend der Gleichung von Scheraga und Mandelkern (J. Am. Chem. Soc. 75: 179 (1953)) bestimmt werden. Das aus der Viskosität berechnete durchschnittliche Molekulargewicht für Biodispersan A2 beträgt 61.800. Obgleich die chemische Struktur von Biodispersan A2 bis jetzt noch nicht bestimmt wurde, definieren die chemischen und physikalischen Eigenschaften, die in diesem Teil aufgeführt wurden, die Substanz als neues, anionisches, Aminozucker enthaltendes Heteropolysaccharid.

Beispiel 4 Verwendung der Biodispersionsmittel:

Die erfindungsgemäßen Biodispersionsmittel können die Dispersionen bestimmter Mineralpulver in Wasser dispergieren und/oder stabilisieren. Die Wirksamkeit des Dispersionsmittels kann leicht beobachtet werden, indem man eine 10%ige Aufschlämmung des Pulvers in Wasser durch Mischen herstellt und die Suspensionen dann ungestört stehenläßt. Abhängig von der Größe der Teilchen, die das Pulver darstellen, und ihrer Dichte, werden sich die Teilchen mit einer bestimmten Geschwindigkeit absetzen, und es verbleibt eine klare obere Wasserphase. Das Dispersionsmittel wird die Geschwindigkeit beim Absetzen verlangsamen. Eine quantitative Messung der Wirksamkeit des Dispersionsmittels kann erhalten werden, indem man die Sedimentationsgeschwindigkeit der Teilchen (Abnahme in der Trübe der oberen Phase) bei unterschiedlichen Konzentrationen des Dispersionsmittels bestimmt. Die Fähigkeit unterschiedlicher Präparationen, von Dispersionsmitteln aus A2 und HE5 Kalkstein zu dispergieren, sind in den Fig. 3 und 4 dargestellt, Titandioxid zu dispergieren in den Fig. 5 und 6 und Apatit zu dispergieren in den Fig. 7 und 8. Diese Werte zeigen, daß die am meisten gereinigten Präparationen, Biodispersan HE5 und A2, Kalkstein bei Konzentrationen von weniger als 0,2 mg/ml dispergieren, was einem Gewichtsverhältnis von Kalkstein zu Biodispersan von über 5.000:1 entspricht. Die schlechtere Dispersionskraft der rohen Biodispersionsmittel kann ihren niedrigeren Gehalt an aktivem Biopolymerem zugeschrieben werden. Die wirksame Dispersion des weißen Pigments Titandioxid erforderte etwa das 10fache mehr von Biodispersan A2 und HE5. Schließlich waren die gereinigten Biodispersane A2 und HE5 unfähig, Apatit zu dispergieren, wohingegen die rohen Präparationen von Biodispersionsmitteln A2 und HE5 bei der Dispersion der künstlich hergestellten Apatitpräparation (Citratextraktion von Phosphatgestein) sehr wirksam waren.

Niedrige Konzentrationen an Biodispersionsmitteln A2 und HE5 flocken Calciumcarbonat aus (Tabelle IX). Die Absetzgeschwindigkeit von Calciumcarbonat in Wasser wurde um 20% bzw. 75% durch 5 µg/ml bzw. 15 µg/ml rohes Biodispersionsmittel A2 erhöht. Bei 5 µg/ml beträgt das Gewichtsverhältnis von Bioausflockungsmittel zu Calciumcarbonat 1:20.000. Die rohe HE5-Biodispersionsmittelpräparation ist bei der Ausflockung von Calciumcarbonat weniger wirksam, und es sind 40 µg/ml (1:2500) erforderlich, um die Absetzgeschwindigkeit um 75% zu erhöhen.

TABELLE IX

Die Erfindung wurde unter Bezugnahme bestimmter spezifischer Ausführungsformen beschrieben. Es ist für den Fachmann offensichtlich, daß viele Modifikationen und Variationen durchgeführt werden können. Die Erfindung ist daher nicht auf das, was besonders beschrieben wurde, beschränkt, sondern sie wird durch die folgenden Ansprüche erläutert.

Beispiel 5

Biodispersan ist ebenfalls bei der Dispersion von Kaolinittonen wirksam. Beispielsweise setzen sich ohne Dispersionsmittel 0,8 g Kaolin (BDH, schwer), suspendiert in 10 ml Wasser, in einem Meßzylinder in solcher Geschwindigkeit ab, daß nach 30 min eine klare obere Schicht von 5,6 ml gebildet wird. In Anwesenheit von 0,8 mg Biodispersan (Verhältnis von Kaolin zu Biodispersan von 1000:1) setzt sich das Kaolin wesentlich langsamer ab. Nach 30 min hat sich nur ein Sediment von 0,7 ml mit einer trüben oberen Phase von 11.000 Klett-Einheiten gebildet. Selbst nach 16 Stunden Stehen ist die obere Phase noch trüb (K.U. von 4.600).

Beispiel 6

Biodispersan ist ebenfalls wirksam, um bestimmte organische Verbindungen zu suspendieren. Werden beispielsweise 65 mg große amorphe Teilchen von Ölrot (BDH) vorsichtig mit 5 ml Wasser vermischt, so flotieren die Ölrotteilchen an der Luft/Wasserfläche innerhalb von 5 sek. Wird der gleiche Versuch in Anwesenheit von 15 mg Biodispersan durchgeführt, so bleiben die Ölrotteilchen in Wasser während 20 bis 30 Minuten suspendiert.

Claims

1. Eine als Dispersionsmittel für wasserunlösliche feinverteilte Feststoffe in einem wäßrigen Medium geeignete polymere Substanz, dadurch gekennzeichnet, daß sie das gereinigte Fermentationsprodukt eines geeigneten Bakterienstamms ist.

2. Polymere Substanz nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Bakterien zu Acinetobacter calcoaceticus gehören.

3. Polymere Substanz nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß der verwendete Acinetobacter calcoaceticus-Stamm Stamm A2 oder HE5 ist.

4. Polymere Substanz nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß es in Form der rohen Fermentationsbrühe, teilweise gereinigter Fermentationsbrühe oder im wesentlichen in gereinigter Form vorliegt.

5. Polymere Substanz nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß sie ein Polysaccharid, das Carboxygruppen enthält und Salze davon, wie auch Amino- oder Acylaminomonosaccharid-Moleküleinheiten und Säureadditionssalze von diesen, ist, mit einem durchschnittlichen Molekulargewicht des Polysaccharidmoleküls von 45.000 bis 57.000, bestimmt durch Sedimentationsanalyse, und etwa 55.000 bis 68.000, bestimmt durch Messung der grundmolaren Viskositätszahl.

6. Polymere Substanz, die als Dispersionsmittel geeignet ist, nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß sie durch den in Anspruch 3 beschriebenen Stamm hergestellt worden ist und das in Fig. 2 dargestellte Spektrum aufweist.

7. Polymeres Biodispersionsmittel, hergestellt durch Fermentation eines geeigneten Stamms von Acinetobacter calcoaceticus, die als Dispersionsmittel für Mineralien mit feinen Teilchen geeignet sind, hergestellt wie in den Beispielen beschrieben.

8. Verfahren zur Herstellung eines polymeren Dispersionsmittels nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man unter aeroben Bedingungen einen geeigneten Stamm von Acinetobacter calcoaceticus züchtet, bis eine geeignete Konzentration des polymeren Produkts in dem Kulturmedium erhalten worden ist, und gegebenenfalls das Produkt reinigt.

9. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß das Rohprodukt durch Sedimentation oder Zentrifugation, Präzipitation mit Ammoniumsulfat, Lösungsmittelextraktion, Dialyse zur Entfernung von zellularem Material oder Behandlung mit einem Enzym zur Entfernung von proteinhaltigem Material aufgearbeitet wird.

10. Acinetobacter Calcoaceticus A2.

11. Acinetobacter Calcoaceticus HE5.

12. Dispersionsmittel für feste Mineralien mit kleiner Teilchengröße, ausgewählt unter Kalkstein, Calciumcarbonat, wasserunlöslichem Phosphat, Titandioxid und Tonen, dadurch gekennzeichnet, daß es eine wirksame Menge einer polymeren Substanz nach einem der Ansprüche 1 bis 7 enthält.

13. Biodispersionsmittelsystem nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß die Konzentration der polymeren Substanz von 1 bis 500 bis 1 bis 5000, ausgedrückt durch das Gewicht, berechnet auf das wäßrige System, variiert.