DE3587597T2

DE3587597T2 - Lymphotoxin, dafür kodierende Nukleinsäure, die Nukleinsäure enthaltenden Vektoren und damit transformierte Zellen, Verfahren zum Erhalten von Lymphotoxin und Lymphotoxin neutralisierender Antikörper.

Info

Publication number: DE3587597T2
Application number: DE3587597T
Authority: DE
Inventors: Bharat Bhushan San Mateo California 94403 Aggarwal; Timothy Scott Oakland California 94611 Bringman; Patrick William San Francisco California 94127 Gray; Glenn Evan Guilford Connecticut 06437 Nedwin
Original assignee: Genentech Inc
Current assignee: Genentech Inc
Priority date: 1984-05-31
Filing date: 1985-05-30
Publication date: 1994-06-01
Anticipated expiration: 2005-05-31
Also published as: IL75318A0; RO100383A2; ES8802182A1; ATE95243T1; SK393085A3; IE63487B1; ATE195323T1; DK171531B1; PL155410B1; FI93025B; ES543695A0; DE3588225D1; NO179075C; SK278333B6; FI93025C; DK241385A; IE851321L; JPH07291995A; AR245219A1; EP0509553B1

Description

Die vorliegende Anmeldung betrifft Lymphokine. Insbesondere betrifft sie Lymphotoxin und Derivate desselben.
Lymphotoxin wurde erstmalig als biologischer Faktor mit antizellularer Aktivität auf neoplastischen Zellenlinien identifiziert. Eine Aktivität, die als Lymphotoxin identifiziert und aus mitogen-stimulierten Lymphozyten erhalten wurde, wird mit einem Spektrum von zytotoxischen Aktivitäten assoziiert, das von der Zytostase bestimmter Tumorzellenlinien zur ausgeprägten Zytolyse anderer transformierter Zellen reicht. Die Aktivität des Lymphotoxins ist jedoch durch wenig oder keine antizellulare Aktivität auf untersuchte primäre Zellkulturen und normale Zellenlinien gekennzeichnet. Diese vermutete diskriminierende antizellulare Eigenschaft des Lymphotoxins führte zu in vivo Untersuchungen, die darauf hindeuten, daß Lymphotoxin potente Antitumor-Aktivität aufweisen kann.
Der Ausdruck Lymphotoxin wird auf etwas angewendet, das bisher als Familie von Molekülen bezeichnet wurde. Lymphotoxinmoleküle wurden bisher als Glykoproteine identifiziert, die in fünf Molekulargewichtsklassen eingeteilt werden, von denen jede ihrerseits heterogen in bezug auf Ladung ist. Die menschlichen Alpha (MG 70-90.000)- und Beta (MG 25-50.000)-Klassen scheinen in den meisten Lymphozyten-Überständen zu überwiegen. Die Alpha-Molekulargewichtsklassen können durch ihre Ladung in wenigstens 7 Unterklassen eingeteilt werden, während die Beta-Unterklasse in zwei unterschiedliche Subklassen getrennt wurde (G. Granger et al., in Mozes et al., Herausg., Cellular Responses to Molecular Modulators ff 287-310). Ebenso wurden bisher komplexe und Gamma-Lymphotoxinformen identifiziert, erstere mit einem Molekulargewicht von > 200.000, letztere mit einem Molekulargewicht von 10-20.000. Die verschiedenen Lymphotoxinformen und -klassen unterscheiden sich voneinander durch ihre Stabilität und Kinetik des Erscheinens bzw. Aussehens in der Kultur. Weiters können sie unter Bedingungen geringer Ionenstärke mit der komplexen Klasse miteinander aggregieren. Es wurde gefunden, daß die Lymphotoxinklassen mit geringem Molekulargewicht im Vergleich zu den Klassen mit höherem Molakulargewicht verhältnismäßig instabil und schwach zellenlytisch sind. (Hiserodt et al., 1976, "Cell.Immun.", 26 : 211; Granger et al., in De Weck et al., Herausg., 1980 Biochemical Characterization of Lymphokines ff 279-283). Die Aktivität der Gamma-Klasse wurde bisher wegen ihrer Instabilität nicht eingehend untersucht (G. Granger et al., 1978 "Cellular Immunology" 38 : 388-402). Die Beta-Klasse wurde bisher ebenfalls als instabil befunden (Walker et al., "J. of Immun." 116/3 : 807-815 (März 1976).
Es wird vorausgesetzt, daß die Lymphokin-Terminologie nicht einheitlich ist. Gegenwärtig sind die Namen, die Zellkulturprodukten gegeben werden, größtenteils eine Funktion der Zellen, von denen angenommen wird, daß sie das Produkt hervorbringen, und der Leistung der Produkte in biologischen Analysen. Diese Produkte bleiben jedoch weiterhin weitgehend unzulänglich gekennzeichnet, da viele Untersuchungen mit teilweise reinen Präparaten durchgeführt wurden und weil die für die Kennzeichnung der Produkte angewendeten Analysen nicht molekülspezifisch sind und in jedem Fall beträchtlichen Variationen unterliegen. Die wahre Identität der verschiedenen zytotoxischen Faktoren bleibt bei Fehlen einer Norm-Terminologie, die auf klar analysierbaren unterscheidenden Merkmalen wie Aminosäuresequenzen oder Immun-Epitopen basiert, weiterhin unbekannt. Als Beispiele für andere Bezeichnungen, die für zytotoxische Zellkulturprodukte verwendet werden, seien Tumor-Nekrosefaktor, zytotoxischer Faktor für NK-Zellen, hämorrhagischer Nekrosefaktor und Makrophage-Zytotoxinfaktor oder zytotoxischer Faktor genannt.
In der EP-100.641A (am 15. Februar 1984 veröffentlicht) werden Aminosäuresequenzen für ein menschliches Lymphotoxin beschrieben, das aus der menschlichen Lymphoblastoid-Zellenlinie RPMI-1788 isoliert wurde.
Hayashi et al. beschreiben in der EP-132.125A (am 23. Januar 1985 veröffentlicht) die Gewinnung eines Proteins aus einem Kaninchen folgend auf die Stimulierung seines retikuloendothelialen Systems. Das Protein wurde als Antitumoraktivität und die N-terminale Aminosäuresequenz Ser-Ala-Ser-Arg-Ala-Leu-Ser-Asp-Lys-Pro-Leu-Ala-His-Val-Val-Ala-Asn--Pro- Gln-Val-Glu-Gly-Gln-Seu-Gln-Trp-Leu besitzend beschrieben.
D. Pennica et al. beschreiben in "Nature" 312 : 20-27 (1984) die Reinigung und rekombinante Synthese von zytotoxischem Humanpolypeptid, das als Tumornekrosefaktor und die N-terminale Aminosäuresequenz Val-Arg-Ser- Ser-Ser-Arg-Thr-Pro-Ser-Asp-Lys-Pro-Val-Ala-His-Val-Val-Ala-Asn-Pro aufweisend gefunden wurde.
Ohnishi et al. offenbaren in der US-PS 4,481,137 die Gewinnung einer Substanz mit einem Molekulargewicht von 7-9.000, die sie als CBx3 bezeichnen, aus BALL-1 Zellkultur, die das Wachstum von Tumorzellen unterdrückt und einen Ala-Ala N-Terminus aufweist.
Toth und Granger berichten in "Mol. Immun." 16 : 671-679 (1979), daß weder die Entfernung von Sialsäure aus lymphotoxinhältigen Lymphozyt-Überständen durch Neuraminodasebehandlung noch die Zugabe von N-Acetylglukosamin, Galaktose, Lactose, Mannose, α-Methylmannosid oder Fucose zu den Überständen irgend eine Wirkung auf die lytische Aktivität in vitro ausübte. Toth et al. schlossen daher, daß einfache Zucker keine Rolle in der Aktivität ihres Lymphotoxins zu spielen scheinen. Toth et al. stellten jedoch auch fest, daß Saccharide eine wichtige Rolle in der Wirkung anderer Lymphokine spielen und schlossen daraus, daß sie die Teilnahme komplizierterer Formen von Oligosacchariden an der zytotoxischen Aktivität von Lymphotoxin nicht ausschließen können.
In der Folge berichteten Proctor, Klostergaard und Granger (in "Clinical Research", 1982, 30(1):55A)), daß Humanlymphozyten, wenn sie durch PHA in Gegenwart von Tunicamycin aktiviert werden (um die Addition von N-gebundenen Kohlehydratanteilen an Lymphotoxinmoleküle zu hemmen), biologisch inertes Lymphotoxin frei setzten. Gemäß diesen Autoren zeigten immunochemische Untersuchungen, daß, während der Kohlehydratanteil von Lymphotoxin für seinen Transport und seine Freisetzung durch den aktivierten Lymphozyten in den Überstand nicht erforderlich war, das Kohlehydrat nötig war, um eine wirksame Zielzellenzerstörung aufzuweisen, da das Kohlehydrat die geeignete Konformation des (der) Lymphotoxinmolekül(e)s bewirkte.
Weitere Literaturstellen, die im Zusammenhang mit der vorliegenden Anmeldung studiert werden sollten, umfassen Evans, "Cancer Immunol.Immunother." 12 : 181-190(1982); Lee et al., "Cell. Immun." 48 : 166- 181 (1979); De Weck et al., Herausg., (1980) Biochemical Characterization of Lymphokines ff 279-312; Khan et al., Herausg., (30. Juni 1982) Human Lymphokines ff 459-477; Aggarwal et al., Presentation at the 3rd International Lymphokine Workshop in Haverford, PA., 1.-5-August 1982; Ransom et al., "Cancer Research" 43 : 5222-5227 (Nov.1983); Kull et al., "J.of Immun." 126(4): 1279-1283 (April 1981); J. Sawada et al., "Jpn.J.Exp.Med." 46 : 263-267 (1976); G. Granger et al., "Cell. Immunol." 38 : 388-402 (1978); J. Rundell et al., "Immunopharmacology" 3 : 9- 18 (1981); G. Granger et al., "J. Lymphokine Res." 1 : 45-49 (1982); N. Ruddle et al., "Lymphokine Res." 2 : 23-31 (1983); M. Mitsuhashi et al., U.K. Patentanmeldung Nr. 2.106.117; H. Enomoto, europäische Patentanmeldung Nr. 87.087A; B. Williamson et al., "P.N.A.S. USA" 80 : 5397- 5401 (1983) und S. Wright et al., "J.Immunol." 126 : 1516-1521 (1981).
Das Lymphotoxin (oder Substanzen, die als Lymphotoxin identifiziert werden), das bisher aus Lymphozytkulturen erhalten wurde, liegt in geringen Konzentrationen in der Größenordnung von 0,05-2·10&sup6; Einheiten/l in Überständen von RPMI-1788 Zellen oder primären Lymphozyten vor. Die geernteten Mengen variieren oft beträchtlich und primäre Lymphozyten sind kostspielig. Es besteht die Nachfrage nach einer wirtschaftlichen Methode zur Herstellung von Lymphotoxin (Yamamoto et al., "J. of Biological Response Modifiers" 3: (1)76-87(1984)).
Die bekannten Verfahren sind auch nicht dazu geeignet, Lymphotoxin zu erzeugen, das homogen in bezug auf Aminosäuresequenz ist, was eine wichtige Eigenschaft bei der Verwendung als Arzneimittel darstellt. Lymphotoxin, das aus einer Zellenlinienkultur gewonnen wird, ist, wahrscheinlich aufgrund proteolytischer Verarbeitung, heterogen in bezug auf Aminotermini.Kulturen von primären Lymphozyten, z. B. von Adenoiden oder peripherem Blut, enthalten aus wirtschaftlichen Gründen notgedrungen die Zellen von vielen Spendern. Die Produkte dieser Zellen spiegeln jedoch die genetischen Varianten der Spender wieder, so daß das entstandene "Lymphotoxin" tatsächlich eine Mischung aus allelen Gattungen sein kann. Offensichtlich sind die Mengenanteile und Identitäten solcher Allele von Charge zu Charge unbekannt. Es besteht die Nachfrage nach einem Verfahren zur Herstellung von Lymphotoxin, das einheitlich in bezug auf seine Aminosäuresequenz ist.
Die bekannten Verfahren sind auch beschränkt auf die Herstellung von Lymphotoxin, das primäre Aminosäuresequenzen aufweist, die den in der Natur vorkommenden entsprechen. Die Substitution, Löschung oder Einfügung verschiedener Aminosäuren in diesen Sequenzen würde umfassende und kostspielige chemische Modifizierungen erfordern, falls solche überhaupt durchführbar wären. Es besteht die Nachfrage nach Verfahren zur einfachen Einführung von Varianten in die Aminosäuresequenzen von Lymphotoxin.
Obwohl die Antitumorwirkungen und der offensichtliche therapeutische Wert der Lymphotoxinaktivität in der Literatur seit 1968 beschrieben werden, wurde Lymphotoxin aufgrund der kleinen Mengen und der heterogenen Beschaffenheit des Lymphotoxins, das nach bekannten Verfahren erhalten wurde, bisher nicht in umfassenden klinischen Protokollen untersucht oder in den Handel gebracht. Es besteht die Nachfrage nach Verfahren zur wirtschaftlichen Herstellung von Lymphotoxinmengen, die für klinische Untersuchungen ausreichen.
In der Literatur wurde bisher ein Kaninchen-Antiserum beschrieben, das dazu geeignet ist, die zytolytische Aktivität von verschiedenen Zytotoxinen einschließlich der Substanzen zu neutralisieren, die als Lymphotoxin identifiziert werden (Yamamoto et al., "Cell. Immun." 38 : 403-416 (1978); Gately et al., "Cell.Immun. 27 : 82.93 (1976); Hiserodt et al., "J. of Immun." 119(2): 374-380 (1977); Zacharchuk et al., "P.N.A.S. USA" 80, 6341-6345 (Oktober 1983); Ruddle et al. "Lymphokine Research" 2(1)23-31 (1983); Mannel et al., "Infection and Immunity" 33(1): 156-164 (1981); Wallach et al., E.De Maeyer et al., Herausg., The Biology of the Interferon System ff 293-302 (veröffentlicht September 1983) und Stone-Wolff et al., "J.Exp.Med." 159 : 828-843 (März 1984). Da dieses Antiserum polyklonal ist, enthält es eine Vielfalt von Antikörpern, die gegen das Immunogen Lymphotoxin gerichtet sind. Einer oder mehrere dieser Antikörper wirkt bzw. wirken, um die "Lymphotoxin"Aktivität zu neutralisieren. Weiters sind die Literaturberichte im allgemeinen unklar in bezug auf die molekulare Identität der Substanz, die die Lymphotoxinaktivität bewirkte, die als Immunogen eingesetzt wurde. Für Diagnose und Iininunaffinitätsreinigungsverfahren ist ein monospezifischer Antikörper erforderlich, der gegen ein klar und unzweideutig identifiziertes Lymphotoxinmolekül gerichtet ist. Eines der Ziele der vorliegenden Erfindung besteht darin, einen solchen Antikörper zu schaffen.
Ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung besteht darin, Verfahren zur wirtschaftlichen Synthese einer Lymphotoxinform in einer Zusammensetzung zu schaffen, in der die primäre Aminosäuresequenz im wesentlichen aller Lymphotoxinmoleküle die gleiche ist.
Ein weiteres Ziel der Erfindung besteht darin, vorgegebene Variationen der Aminosäuresequenz einer Lymphotoxinform zu schaffen, genauer gesagt, Aminosäurelöschungen, Einfügungen, Substitutionen oder Kombinationen davon.

ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG

Die Ziele der Erfindung wurden durch die erfolgreiche rekombinante Expression von Protein mit Lymphotoxinaktivität erreicht. Diese Lymphotoxingattung, die in der vorliegenden Beschreibung ausgedrückt in ihrer Aktivität und der natürlichen oder varianten Aminosäuresequenz beschrieben ist, wird in der Folge als Lymphotoxin bezeichnet. Überraschenderweise wurde die für Lymphotoxin kodierende DNA trotz der winzigen Mengen an Lymphotoxin, die in homologen Zellen exprimiert werden, und der Unbestimmtheit bezüglich des Zeitpunktes identifiziert, zu dem die für Lymphotoxin kodierende Messenger-RNA in homologen Zellen auftritt. Ebenso überraschend wird biologisch aktives Lymphotoxin in rekombinanten Zellen exprimiert, die das Lymphotoxin nicht glykosylieren (oder von denen nicht zu erwarten wäre, daß sie dies auf die gleiche Weise wie homologe Zellen tun) und wird das so exprimierte Lymphotoxin mit einer im wesentlichen einheitlichen Aminosäuresequenz ohne N-terminale enzymatische Hydrolyse gewonnen. Für Lymphotoxin kodierende DNA wird in Zellkulturen in großen Mengen von mehr als 0,1 bis 1·10¹¹ Einheiten pro Liter Kulturlysat exprimiert.
Das von einer rekombinanten Wirtszelle exprimierte Lymphotoxin hängt von der DNA, die zur Kodierung des Lymphotoxins oder seiner Vorläufer eingesetzt wird, sowie von der ausgewählten Wirtszelle ab. Die gemäß der vorliegenden Erfindung für die Lymphotoxinsynthese eingesetzten Nukleinsäuresequenzen sind neu. Sie sind durch Nukleotidsequenzen gekennzeichnet, die sich von der nativen oder in der Natur vorkommenden Sequenz auf eine oder mehrere der folgenden Weisen unterscheiden: Die DNA ist frei von Intronen, im Fall von Humanlymphotoxin dem zwischen den Nukleotiden 284 und 285 (Fig. 2a) vorliegenden Intron; die DNA ist frei von Nukleinsäure, die für andere Proteine des Organismus kodiert, aus dem die DNA herrührt; die für Lymphotoxin kodierende Nukleinsäure ist in einen Vektor ligiert; und/oder die Nukleinsäure ist dazu geeignet, mit für Lymphotoxin kodierender Nukleinsäure zu hybridisieren, jedoch mit der Maßgabe, daß eine solche hybridisierende Nukleinsäure nicht die Nukleotidsequenz von natürlicher DNA oder RNA aufweist, die für Lymphotoxin kodiert.
Mutante Nukleinsäuren, die für Lymphotoxin kodieren, sind das Produkt von rekombinanten Manipulationen. Latente (symptomlose) Mutationen in der 5'-untranslatierten oder translatierten Nukleinsäure für Lymphotoxin werden eingesetzt, um die Expressionsmengen in ausgewählten Wirten zu steigern, z. B. durch Verringerung der Wahrscheinlichkeit von Stem-and- Loop-Messenger-RNA-Strukturen in den 5'-Bereichen der Nukleinsäure oder durch Substitution vom Wirt bevorzugter Kodone für jene, die in natürlichen Nukleinsäureisolaten vorkommen.
Mutationen in den Nukleinsäuren, die exprimiert werden, anstatt latent zu bleiben, ermöglichen die Herstellung von Lymphotoxingattungen, die die Aminosäuresequenz von nativem Lymphotoxin oder primäre Sequenzvarianten derselben mit Aminosäuresequenzen aufweisen, die sich vom nativen Lymphotoxin unterscheiden. Das mutante Lymphotoxin wird so wie es ist gewonnen oder weiter durch die Wirtszelle verarbeitet, um die gewünschte Lymphotoxingattung zu erhalten.
Diese Nukleinsäuren oder Nukleinsäuren, die damit hybridisieren, oder Fragmente derselben, werden markiert und in Hybridisierungsanalysen für die Identifizierung oder Bestimmung von für Lymphotoxin kodierendem genetischem Material verwendet.
Bei Verfahren für die Synthese von Lymphotoxin wird für Lymphotoxin kodierende DNA in einen Vektor ligiert, der Vektor wird für die Transformation von Wirtszellen verwendet, die Wirtszellen werden kultiviert und Lymphotoxin wird aus der Kultur gewonnen. Dieses allgemeine Verfahren wird je nach der Vektorkonstruktion und der für die Transformation gewählten Wirtszelle für die Synthese von Lymphotoxin mit der Aminosäuresequenz von nativem Lymphotoxin oder für die Konstruktion von neuartigen Lymphotoxinvarianten eingesetzt. Die Lymphotoxingattungen, die für die erfindungsgemäße Synthese geeignet sind, umfassen leucylamino-terminales Lymphotoxin, histidylamino-terminales Lymphotoxin, Prälymphotoxin, und Lymphotoxinvarianten umfassend (a) Fusionsproteine, worin ein heterologes Protein oder Polypeptid durch eine Peptidbindung an die amino- und/oder carboxyl-terminalen Aminosäuren von Lymphotoxin gebunden ist, (b) Lymphotoxinfragmente, insbesondere Fragmente von Prälymphotoxin, in dem jede Aminosäure zwischen -34 und +23 die amino-terminale Aminosäure des Fragmentes ist, (c) Lymphotoxinmutanten, worin einer oder mehrere Aminosäurereste substituiert, eingefügt oder gelöscht ist bzw. sind, (d) Methionyl oder modifizierte Methionyl-(wie Formylmethionyl oder andere blockierte Methionylgattungen)-amino-terminale Derivate, und/oder (e) unglykosylierte oder variant glykosylierte Gattungen aller vorgenannten.
Wenn eine Säugetierzelle mit Nukleinsäure transformiert wird, die für Lymphotoxin kodiert, das operabel an einen eukaryoten Sekretionsleader (einschließlich des nativen Lymphotoxin-Sekretionsleaders) ligiert ist, oder wenn Nukleinsäure, die für Lymphotoxin kodiert, operabel in einem Vektor eines prokaryoten oder Hefe-Sekretionsleaders gebunden ist, der von der zu transformierenden Wirtszelle erkannt wird (üblicherweise dem Organismus, von dem die Leadersequenz erhalten wurde), der Wirt mit dem Vektor transformiert und kultiviert wird, werden dann gewöhnlich nichtmethionylierte amino-terminale Lymphotoxingattungen aus der Kultur gewonnen.
Wenn für Lymphotoxin kodierende DNA operabel ohne Sektretionsleadersequenz in einen Vektor ligiert ist und dann zum Transformieren einer Wirtszelle verwendet wird, werden die künstlich hergestellten Lymphotoxingattungen im allgemeinen durch ein amino-terminales Methionyl oder einen modifizierten Methionylrest wie Formylmethionyl substituiert.
Es werden Verfahren geschaffen, wodurch eine in vitro durchgeführte Mutagenese der für Lymphotoxin kodierenden Nukleinsäure zur Expression von bisher nicht verfügbaren Lymphotoxinvarianten führt. Erstens wird N-terminales Methionyl oder modifiziertes Methionyllymphotoxin durch Wirtszellen exprimiert, die durch für Lymphotoxin kodierende Nukleinsäure transformiert sind, die direkt exprimiert wird, d. h. nicht operabel an eine Sekretionsleadersequenz gebunden ist.
Zweitens wird eine ortsspezifische, vorgegebene oder zufällige Mutagenese dazu verwendet, Löschungen, Substitutionen und/oder Einfügungen in die für Lymphotoxin kodierende Nukleinsäure einzuführen. Auf diese Weise werden Lymphotoxinverschmelzungen erzeugt. Die durch Expression von mutanter Nukleinsäure erhaltenen Lymphotoxine weisen modifizierte Eigenschaften auf.
Schließlich werden unglykosylierte oder variant glykosylierte Lymphotoxine als neue Lymphotoxingattungen geschaffen. Unglykosyliertes Lymphotoxin wird durch prokaryote Expression von für Lymphotoxin kodierender DNA erhalten. Variant glykosylierte Lymphotoxingattungen sind das Produkt einer rekombinanten Kultur in transformierten höheren eukaryoten, üblicherweise Säugetier-Zellen.
Das erfindungsgemäß hergestellte Lymphotoxin wird aus Kulturüberständen oder Lysaten durch Immunaffinitätsadsorption unter Verwendung von unlöslich gemachtem, Lymphotoxin neutralisierendem Antikörper gereinigt. Dieser Antikörper, der am wirksamsten in monoklonaler Zellkultur hergestellt wird, wird in Mäusen durch Immunisierung mit alum-adsorbiertem Lymphotoxin gezüchtet.
Das erfindungsgemäße Lymphotoxin wird für die therapeutische Anwendung mit physiologisch unschädlichen Stabilisatoren und Excipientien kombiniert und in steriler Dosierungsform wie durch Lyophilisieren in Dosierungsphiolen oder Lagerung in stabilisierten wässerigen Zubereitungen hergestellt. Alternativ wird das Lymphotoxin in eine Polymermatrix für die Implantation in Tumore oder Stellen eingebracht, an denen chirurgische Eingriffe zur Exzision von Tumoren vorgenommen wurden, wodurch eine zeitlich festgelegte Freisetzung des Lymphotoxins in einer lokalisierten Hochgradientenkonzentration bewirkt wird.
Die in der vorliegenden Beschreibung angeführten therapeutischen Zusammensetzungen werden in therapeutisch wirksamen Dosierungen durch Implantation, Injektion oder Infusion an Tiere und insbesondere menschliche Patienten verabreicht, die von malignen Tumoren befallen sind.

KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN

Fig. 1a zeigt eine DNA-Sequenz und ihre vermutete Aminosäuresequenz, die für ein Lymphotoxin kodiert;
Fig. 1b stellt die Konstruktion der das in Fig. 1a dargestellte Fragment kodierenden synthetischen DNA dar;
Fig. 2a zeigt die vollständige Aminosäuresequenz für Prälymphotoxin, die für es kodierende DNA plus 5' und 3' flankierende untranslatierte Bereiche;
Fig. 2b veranschaulicht ein Verfahren zur Konstruktion eines
Expressionsvektors für methionyl leucylamino-terminales Lymphotoxin und seine amino-terminalen Methionylderivate;
Fig. 3 zeigt ein Verfahren zur Konstruktion eines Expressionsvektors für Methionylhistidyl amino-terminales Lymphotoxin;
Fig. 4 stellt die Aminosäuresequenzen für Human-, Mäuse- und Rinder-Lymphotoxin und die übereinstimmenden Säugetierlymphotoxinreste dar;
die Fig. 5a und 5b zeigen die Konstruktion eines Plasmids, das für eine Verschmelzung von Lymphotoxin und einer bakteriellen Signalsequenz kodiert.

DETAILLIERTE BESCHREIBUNG

Lymphotoxin wird für die Zwecke der vorliegenden Anmeldung als ein biologisch aktives Polypeptid definiert, das einen Bereich aufweist, der wesentliche strukturelle Aminosäurehomologie mit wenigstens einem Abschnitt der in Fig. 2a dargestellten Lymphotoxinaminosäuresequenz aufweist. Biologische Aktivität wird als bevorzugte, zytotoxische Aktivität, wie nachstehend definiert, immunologische Kreuzreaktivität mit einem zytotoxischen Lymphotoxin oder die Fähigkeit definiert, mit zytotoxischem Lymphotoxin um Lymphotoxinzellenoberflächenrezeptoren zu konkurrieren. In den letzteren beiden Fällen muß das Lymphotoxin an sich nicht zytotoxisch sein. Immunologisch kreuzreaktive Mutanten sind nützlich als Immunogene für das Züchten von Anti-Lymphotoxin in Tieren, z. B. für die Herstellung von Reagenzien für Immunanalysen, während nichtzytotoxische konkurrierende Mutanten als markierte Reagenzien in Immunanalysen des Konkurrenztyps für biologisch aktives Lymphotoxin verwendet werden.
Bevorzugte zytotoxische Aktivität wird als die bevorzugte Zerstörung oder Wachstumshemmung von Tumorzellen in vivo oder in vitro im Vergleich zu normalen Zellen unter den gleichen Bedingungen definiert. Die Zerstörung von Tumorzellen durch Lyse in vitro oder Nekrose in vivo ist der bevorzugte Endpunkt der Analyse, obwohl Zytostase oder fortpflanzungshemmende Aktivität ebenfalls mit gutem Erfolg angewendet werden.
Geeignete Analysen für den Nachweis der antizellularen Aktivitäten von Lymphotoxin sind in B. Aggarwal et al., 1984, "J.Biol.Chem." 259 (1), 686-691 und E. Carswell et al., 1975, "Proc.Natl.Acad.Sci. USA" 72, 3666- 3670 beschrieben.
Lymphotoxinspezifische Aktivität wird in der vorliegenden Beschreibung als Zielzellenlyse anstelle von Zytostase definiert. Eine Einheit Lymphotoxin wird als die Menge definiert, die für die 50%-ige Lyse von Zielzellen erforderlich ist, die in jedem Napf plattiert sind, wie in Beispiel 1 näher erläutert wird. Es sind jedoch auch andere Verfahren zur Bestimmung der zytotoxischen Aktivität akzeptabel.
Wesentliche strukturelle Homologie bedeutet im allgemeinen, daß mehr als etwa 60% und üblicherweise mehr als etwa 70% der Aminosäurereste im Polypeptid gleiche oder konservative Substitutionen für den (die) entsprechenden Rest (Reste) in Sequenz gemäß Fig. 2a sind.
Nicht alle Sequenzen eines Lymphotoxinpolypeptids müssen mit der in Fig. 2a gezeigten Sequenz homolog sein. Nur ein Abschnitt derselben braucht mit einem beliebigen Abschnitt der in Fig. 2a gezeigten Sequenz homolog zu sein, wenn der Kandidat die erforderliche biologische Aktivität aufweist. Im allgemeinen sollte Homologie für Bereiche von etwa 20-100 Aminosäurereste nachweisbar sein, mit dem Bewußtsein, daß gelegentliche Lücken eingeführt werden müssen, um ein Maximum an Homologie zu erzielen.
Weniger Homologie ist für Polypeptide erforderlich, um unter die Definition zu fallen, wenn der Bereich der Homologie mit der Sequenz gemäß Fig. 2a nicht in einem der Lymphotoxin-Schlüsselbereiche liegt, d. h. jener Bereiche, die für die zytotoxische Aktivität wichtig sind. Es wird angenommen, daß die Schlüsselbereiche für die Sequenz nach Fig. 2a etwa die Reste 162-171, 52-83 und 127-148 sind.
Lymphotoxin wird als spezifisch den menschlichen Tumor-Nekrosefaktor oder seine natürlichen tierischen Analoge ausschließend definiert (D.Pennica et al., "Nature", 312-20/27 Dezember 1984, ff 724-729 und B. Aggarwal et al., "J.Biol. Chem." 260 (4): 2345-2354 (1985)).
Strukturell ähnlich bezieht sich auf dominante Eigenschaften der Aminosäureseitenketten wie basisch, neutral oder sauer, hydrophil oder hydrophob, oder das Vorliegen oder Fehlen von sterischer Masse. Die Substitution einer strukturell ähnlichen Aminosäure für eine andere ist auf dem Fachgebiet allgemein als konservative Substitution bekannt.
Ein signifikanter Faktor bei der Bestimmung der Identität eines Polypeptids als Lymphotoxin ist die Fähigkeit von Antiseren, die dazu geeignet sind, die zytolytische Aktivität im wesentlichen homogenen lymphoblastoiden (oder natürlichen) Lymphotoxins im wesentlichen zu neutralisieren, auch im wesentlichen die zytolytische Aktivität des in Frage stehenden Polypeptids zu neutralisieren. Es wird jedoch vorausgesetzt, daß immunologische Identität und zytotoxische Identität nicht unbedingt gleichlaufend sind. Ein neutralisierender Antikörper für das Lymphotoxin nach Fig. 2a mag ein Anwärterprotein nicht binden, weil der neutralisierende Antikörper auf eine Stelle am Lymphotoxin ausgerichtet ist, die nur einem Bereich benachbart ist, der entscheidend für die zytotoxische Aktivität des Lymphotoxins ist, aber als neutralisierender Antikörper durch sterische Hinderung der aktiven Stelle des Lymphotoxins wirkt. Ein Anwärterprotein, das in diesem nichtschädlichen Bereich mutiert ist, mag den neutralisierenden Antikörper nicht mehr binden, es wäre aber trotzdem Lymphotoxin in Hinsicht auf wesentliche Homologie und biologische Aktivität.
Lymphotoxin, das durch Kultivieren von lymphoblastoiden Zellenlinien erhalten wurde, wurde bisher als folgende Eigenschaften aufweisend bestimmt: Ein Molekulargewicht von 20.000 bis 25.000, je nach dem Grad der Glykosylierung und N-terminalen Heterogenität; Glykosylierung bei Asn+62 (Fig. 2a); eine Tendenz zur Aggregatbildung, insbesondere zur Bildung von Multimeren; einen isoelektrischen Punkt von etwa 5.8; pH- Labilität (Verlust von > 50% an zytolytischer Aktivität bei 24 Stunden langer Lagerung in Ammoniumbicarbonatpuffer bei 10 ug/ml Konzentration bei pH-Werten von weniger als etwa 5 oder mehr als etwa 10); und wesentliche Aktivitätsverluste bei 5 Minuten langer Inkubation in wässeriger Lösung bei 80ºC. Es wurden bisher zwei Molekulargewichtsgattungen von lymphoblastoiden Lymphotoxin identifiziert. Die Gattung mit 25.000 da von lymphoblastoidem Lymphotoxin weist einen amino-terminalen Leucinrest auf. Polypeptide mit der primären Aminosäuresequenz der Gattung mit 25.000 da werden als leucylamino-terminales Lymphotoxin bezeichnet. Die Gattung mit 20.000 da von lymphoblastoidem Lymphotoxin ist durch ein amino-terminales Histidin gekennzeichnet und die entsprechenden Sequenzen werden als histidylamino-terminales Lymphotoxin bezeichnet. Es ist wichtig, zu beachten, daß diese Merkmale das Humanlymphotoxin des nativen oder wilden Typs beschreiben, das aus lymphoblastoiden Zellkulturen erhalten wird. Während das hierin definierte Lymphotoxin natives, glykosyliertes Lymphotoxin umfaßt, können auch andere, verwandte zytotoxische Polypeptide in den Bereich der Definition fallen. So z. B. kann die Glykosylierung, die üblicherweise mit einem tierischen Lymphotoxin assoziiert ist, bei Expression in einer heterologen rekombinanten eukaryoten Wirtszelle modifiziert werden, wodurch das modifizierte Lymphotoxin aus dem Bereich der Molekulargewichte oder des isoelektrischen Punktes herausgebracht wird, die für menschliches lymphoblastoides Lymphotoxin festgelegt sind. Gänzlich unglykosyliertes Lymphotoxin wird in rekombinanten Bakterienkulturen hergestellt, wobei sein Molekulargewicht, sein isoelektrischer Punkt und seine anderen Eigenschaften entsprechend modifiziert sind. Zusätzlich kann die Verarbeitung von Prälymphotoxin nach der Translation von einer ersten Tiergattung in einer Zellenlinie, die von einer anderen Tiergattung abgeleitet wurde, einen anderen amino-terminalen Rest ergeben, als es üblicherweise für die erste Tiergattung der Fall ist. Auf ähnliche Weise werden es die erfindungsgemäß geschaffenen Mutageneseverfahren z. B. möglich machen, die Aminosäuresequenz und den N-Terminus von Lymphotoxin zu variieren, um dadurch die pH-Stabilität, den isoelektrischen Punkt u. dgl. zu modifizieren.
Die translatierte Aminosäuresequenz für Humanlymphotoxin ist in Fig. 2a dargestellt. Man beachte, daß diese Sequenz eine Präsequenz mit 34 Resten umfaßt, von der angenommen wird, daß sie während der normalen Verarbeitung des translatierten Transkripts in menschlichen Zellen entfernt wird, (in der vorliegenden Beschreibung zusammen mit seinen Mutanten als "Prälymphotoxin" bezeichnet) und zur leucylamino-terminalen Gattung führt. Die histidylamino-terminale Gattung ist homolog zur leucylamino-terminalen Gattung mit der Ausnahme, daß die ersten 23 Aminosäuren der leucylamino-terminalen Gattung fehlen. Alle drei Gattungen, d. h. Prälymphotoxin, leucylamino-terminales Lymphotoxin und histidylamino terminales Lymphotoxin, sowie ihre Methionyl-, modifizierten Methionyl-, mutanten und unglykosylierten Formen, fallen unter den Begriff Lymphotoxin. Die unglykosylierten leucyl- und histidylamino-terminalen Gattungen weisen geringere Molekulargewichte auf als jene, die vorstehend für die homologe Gattung von lymphoblastoiden Zellen beschrieben wurden.
Prälymphotoxin ist eine Gattung von Lymphotoxin, die unter die vorstehende Definition fällt. Es ist gekennzeichnet durch das Vorhandensein eines Signal-(oder Leader-)-Polypeptids am Aminoterminus des Moleküls. Im allgemeinen wird das native Signalpolypeptid von Lymphotoxin proteolytisch von Lymphotoxin als Teil des Sekretionsprozesses abgespalten, in dem das Protein von der Zelle ausgeschieden wird. Das Signalpeptid kann von Mikroben oder Säugetieren herrühren (einschließlich der Präsequenz mit 34 Resten), ist jedoch vorzugsweise ein Signal, das homolog zur Wirtszelle ist. Manche Signal-Lymphotoxin-Verschmelzungen werden von der Wirtszelle nicht erkannt oder zu N-Terminus met-freiem Lymphotoxin "verarbeitet". Solche mikrobielle Signale enthaltenden Verschmelzungen sind z. B. nützlich als Lymphotoxin-Immunogene.
Man beachte, daß der Ausdruck "fähig" in bezug auf zytotoxische Aktivität bedeutet, daß Lymphotoxin Polypeptide enthält, die z. B. durch enzymatische Hydrolyse von einem inaktiven Zustand analog zu einem Zymogen in ein Polypeptidfragment umgewandelt werden können, das die gewünschte biologische Aktivität besitzt. Der Ausdruck "fähig" in bezug auf in vitro oder in vivo zytotoxische Aktivität ist dazu bestimmt, nichtzytotoxische Polypeptide zu umfassen, die z. B. durch enzymatische Hydrolyse von einem inaktiven Zustand analog zu einem Zymogen in ein Polypeptidfragment umgewandelt werden können, das die definitionsgemäße biologische Aktivität besitzt. Typisch sind inaktive Vorläufer Verschmelzungsproteine, in denen Lymphotoxin durch eine Peptidbindung an seinem Carboxylterminus an ein anderes Protein oder Polypeptid gebunden ist. Die Sequenz an dieser Peptidbindung oder in deren Nähe ist so ausgewählt, daß sie für die proteolytische Hydrolyse anfällig ist, um entweder in vivo oder als Teil eines Herstellungsprotokolls in vitro Lymphotoxin freizusetzen. Typische Bindungssequenzen sind Lys-Lys oder Arg-Lys. Der Nichtlymphotoxin-Bestandteil für ein solches Prolymphotoxin ist vorzugsweise ein homologes Protein, um die Immugenizität der Verschmelzung auf ein Minimum zu beschränken. Das homologe Protein sollte unschädlich sein und sich nicht an die Zellenoberflächen binden. Das so erzeugte Lymphotoxin weist dann die definitionsgemäß erforderliche zytotoxische Aktivität auf.
Während Lymphotoxin üblicherweise Humanlymphotoxin bedeutet, ist in die Definition von Lymphotoxin auch solches von Quellen wie Mäusen, Schweinen Pferden oder Rindern eingeschlossen, mit der Maßgabe, daß es den vorstehend beschriebenen Standards für homologe Bereiche und biologische Aktivität entspricht. So z. B. wurde gefunden, daß Rinder- und Mäuse-Lymphotoxine sehr (etwa 80%) homolog zu Humanlymphotoxin sind. Lymphotoxin ist nicht gattungsspezifisch, so z. B. ist Humanlymphotoxin aktiv auf Mäusetumoren und neoplastischen Zellenlinien. Daher kann Lymphotoxin von einer Gattung in der Therapie einer anderen Gattung eingesetzt werden.
Lymphotoxin schließt auch multimere Formen ein. Lymphotoxin aggregiert spontan in Multimere, üblicherweise Dimere oder höhere Multimere. Multimere sind zytotoxisch und daher für die Anwendung bei in vivo Therapie geeignet. Lymphotoxin wird in rekombinanten Wirten als Monomer exprimiert, es zeigt jedoch die Tendenz, danach spontan Multimere zu bilden. Homogene Multimere oder eine Mischung von verschiedenen Multimeren sind therapeutisch nützlich.
Variantenlymphotoxine umfassen vorgegebene oder gezielte, d. h. stellenspezifische, Mutationen des in Fig. 2a dargestellten Moleküls oder seiner Fragmente. Variantenlymphotoxine werden als Polypeptide definiert, die ansonsten den definierten Merkmalen von Lymphotoxin entsprechen, aber durch eine Aminosäuresequenz gekennzeichnet sind, die sich von der in Fig. 2a dargestellten durch Weglassung, Substitution oder Einfügung von Resten unterscheidet. Die hierin beschriebenen nichthumanen Lymphotoxine und Allele von Humanlymphotoxin sind als ebenso wie stellenausgerichtete Mutanten mit keinem natürlichen Gegenspieler als Variantenlymphotoxine anzusehen. Das Ziel der Mutagenese besteht darin, DNA zu konstruieren, die für wie vorstehend beschriebenes Lymphotoxin kodiert, aber Eigenschaften aufweist, die die biologische Aktivität von natürlichem Lymphotoxin modifizieren oder die Herstellung von Lymphotoxin erleichtern. So z. B. wird das Lysin +89 Kodon mutiert, um einen Histidinrest anstelle des Lysinrestes zu exprimieren. Das Histidin +89 wird nicht mehr durch Trypsin hydrolysiert (das im allgemeinen Proteine an einer arg-X oder lys-X Bindung spaltet). Es wird erwartet, daß Proteaseresistenz dem Mutanten eine längere biologische Halbwertszeit verleiht als es bei Lymphotoxin mit der in Fig. 2a dargestellten Sequenz (oder einem Fragment desselben) der Fall ist. Andere Lymphotoxin-Lysin- oder Argininreste können zu Histidin mutiert werden, z. B. Lysin +28, Lysin +19 oder Arginin +15.
Wie vorstehend erwähnt wurde, weisen bestimmte Bereiche des Lymphotoxinmoleküls wesentliche Homologie mit einem ähnlichaktiven Protein auf, das als Tumornekrosefaktor bezeichnet wird. Aminosäurereste in den und unmittelbar flankierend diese(n) im wesentlichen homologe(n) Bereiche(n) werden für die Mutagenese bevorzugt, die darauf ausgerichtet ist, Lymphotoxinmutanten zu identifizieren, die variante biologische oder zytotoxische Aktivität aufweisen. Solche Mutanten werden nach an sich bekannten Verfahren hergestellt und dann in bezug auf die gewünschte biologische Aktivität gescreent, d. h. erhöhte Zytotoxizität gegenüber dem bestimmten in Behandlung stehenden Neoplasmus oder, im Falle von Lymphotoxingattungen, die für die Immunisierung von Tieren bestimmt sind, die Fähigkeit, eine stärkere Immunreaktion hervorzurufen. Beispiele für solche Lymphotoxinvarianten sind folgende: Ala+168 wird zu einer verzweigten Aminosäure (val, ile oder leu) mutiert; eine hydrophobe Aminosäure (z. B. phe, val, ile oder leu) wird zwischen thr+163 und val+164 eingefügt; thr+163 wird durch Tyrosin ersetzt; ser+82 wird durch Lysin ersetzt; Ser+42 wird durch Isoleucin, Leucin, Phenylalanin, Valin oder Histidin ersetzt; Lys+84 wird durch Glutamin, Tryptophan, Serin oder Histidin ersetzt; ser+82 wird gelöscht; ein hydrophobes Di- oder Tripeptid wird mit leu+171 verschmolzen; thr+163 wird durch Asparaginsäure oder Lysin ersetzt; ala-lys wird zwischen glu+127 und pro+128 eingefügt; ser+70 wird durch Lysin oder Glycin ersetzt; thr+69 wird durch Tyrosin ersetzt; lys+28 wird durch Arginin oder Histidin ersetzt; his+32 wird durch Arginin oder Lysin ersetzt; asp+36 wird durch Prolin, Serin, Threonin, Tyrosin oder Glutaminsäure ersetzt; ser+38 wird durch Tyrosin, Methionin oder Glataminsäure ersetzt; ser+61 wird durch Threonin, Tyrosin, Histidin oder Lysin ersetzt; gly+24 wird durch Asparaginsäure, Serin oder Tyrosin ersetzt; his+135 wird durch Arginin, Lysin, Tyrosin, Tryptophan oder Problin ersetzt; thr+142 wird durch Asparaginsäure ersetzt; und gln+146 wird durch Lysin oder Threonin ersetzt.
Eine besonders wünschenswerte Gruppe von Mutanten sind jene, in denen die Methioninreste in den Humanlymphotoxinresten +20, +120 und +133 gelöscht oder vorzugsweise durch die entsprechenden Reste substituiert sind, die in den Lymphotoxinen von anderen Gattungen als den an anderer Stelle hierin beschriebenen vorkommen. So z. B. werden met+20, +120 und +133 jeweils durch Threonin, Serin und Valin substituiert. Dies sind die entsprechenden Reste in Rinder-Lymphotoxin. Die Substitution erfolgt auf die in Beispiel 9 beschriebene Weise, mit der Ausnahme, daß met+133 durch einen weiteren Mutageneseschritt nach einem an sich bekannten Verfahren unter Verwendung von M13 Mp8 Phage zu val mutiert wird. Diese mutante tiergattungshybride-Lymphotoxin-DNA wird anstelle der leucylamino-terminalen DNA gemäß Beispiel 7 eingesetzt und als Verschmelzungsprodukt exprimiert. Nach bekannten Verfahren wird Cyanogenbromid dazu verwendet, das STII Signal vom hybriden Lymphotoxin abzuspalten und die reife Variante des leucylamino-terminalen Lymphotoxins zu gewinnen.
Andere nützliche Variantenlymphotoxine sind jene, bei denen entsprechende Lymphotoxinreste durch Reste von Tumornekrosefaktor ersetzt werden, um Varianten von hybridem Tumornekrosefaktor-Lymphotoxin herzustellen. Ein repräsentatives Beispiel ist die Substitution der ersten 27 Reste von leucylamino-terminalem Lymphotoxin durch die ersten 8, 9 oder 10 Reste von reifem Tumornekrosefaktor (z. B. val-arg-ser-ser-ser-arg-thr-pro-ser-asp). Von dieser Variante ist es wahrscheinlicher, daß sie bei direkter Expression in E.coli N-terminal entmethionyliert wird.
Während die Mutationsstelle vorgegeben ist, muß die Mutation an sich nicht unbedingt vorgegeben sein. So z. B. wird, um die Leistung des mutanten Histidin +89 Lymphotoxins zu optimieren, eine zufallsweise Mutagenese am Kodon für Lysin +89 durchgeführt und die exprimierten Lymphotoxinmutanten werden in bezug auf die optimale Kombination von zytotoxischer Aktivität und Proteaseresistenz gescreent.
Lymphotoxin kann auch Einfügungen, üblicherweise in der Größenordnung von etwa 1 bis 10 Aminosäureresten, oder Löschungen von etwa 1 bis 30 Resten enthalten. Substitutionen, Löschungen, Einfügungen oder jede beliebige Subkombination können kombiniert werden, um zu einem endgültigen Konstrukt zu gelangen. Einfügungen umfassen amino-oder carboxyl-terminale Verschmelzungen, z. B. eine hydrophobe Verlängerung, die am Carboxylterminus angefügt ist. Vorzugsweise wird jedoch nur eine Substitutionsmutagenese durchgeführt. Offensichtlich dürfen die Mutationen in der kodierenden DNA die Sequenz nicht aus dem Leseraster entfernen und schaffen vorzugsweise keine komplementären Bereiche, die eine sekundäre mRNA-Struktur bilden könnten. Extrakte von E. coli, die mit Vektoren transformiert wurden, die DNA enthielten die für Lymphotoxinmutanten mit einer Löschung der letzten 16 carboxy-terminalen Aminosäuren oder eine Löschung der ersten etwa 33 amino-terminalen Reste von leucylamino-terminalem Lymphotoxin kodiert, wiesen keine zytotoxische Aktivität auf. Die Gründe für das Fehlen der Aktivität sind jedoch nicht bekannt und könnten beliebige der im nachstehenden Beispiel 1 angeführten sein.
Nicht alle Mutationen in der DNA, die für das Lymphotoxin kodiert, werden im Endprodukt der rekombinanten Zellkultur exprimiert. So z. B. wird eine Hauptklasse von DNA-Substitutionsmutationen von jenen DNAs gebildet, in denen der in Fig. 2a dargestellte Sekretionsleader durch einen unterschiedlichen Sekretionsleader substituiert wurde entweder durch Löschungen innerhalb des 34 Reste-Leaders oder durch Substitutionen, die den nativen Leader größtenteils oder ganz für einen Leader austauschen, der mit größerer Wahrscheinlichkeit vom beabsichtigten Wirt erkannt wird. So z. B. wird bei der Konstruktion eines prokaryoten Expressionsvektors der Sekretionsleader nach Fig. 2a zugunsten der bakteriellen alkalischen Phosphatase- oder hitzebeständigen Enterotoxin II-Leader gelöscht, und für Hefe wird der Leader nach Fig. 2a zugunsten der Hefeinvertase-, Alphafaktor- oder Säurephosphatase-Leader substituiert. Dies soll jedoch nicht implizieren, daß der menschliche Sekretionsleader nicht von anderen Wirten als Humanzellenlinien erkannt wird. Wenn der Sekretionsleader vom Wirt "erkannt" wird, wird das Verschmelzungsprotein, das aus Lymphotoxin und dem Leader besteht, üblicherweise an der Leader-Lymphotoxin-Peptidbindung im gleichen Vorgang abgespalten, der zur Sekretion des Lymphotoxins führt. Obwohl also eine mutante DNA zur Transformation des Wirtes verwendet wird, kann das entstandene Produkt Lymphotoxin entweder ein verschmolzenes oder natives Lymphotoxin sein, je nach der Wirksamkeit der Wirtszelle bei der Verarbeitung der Verschmelzung.
Eine weitere Hauptklasse von DNA-Mutanten, die nicht als Lymphotoxinvarianten exprimiert werden, sind Nukleotidsubstitutionen, die zur Steigerung der Expression durchgeführt werden, primär, um Stem- Loop-Strukturen in der transkribierten mRNA zu vermeiden (siehe die gleichlaufende USSN 303,687, EP 75444) oder um Kodone bereitzustellen, die leichter durch den ausgewählten Wirt transkribiert werden, z. B. die wohlbekannten E.coli Vorzugskodone für die E.coli Expression.
Die mutante Nukleinsaure wird nach an sich bekannten Verfahren hergestellt (A. Hui et al., 1984, "The EMBO Journal" 3(3): 623-629; J. Adelman et al., 1983, "DNA" 2(3): 183-193; UK Patentanmeldung Nr. 2,130,219A; G. Winter et al., 1982, "Nature" 299 : 756-758; und R. Wallace et al., 1981, "Nucleic Acids Research" 9 (15): 3647-3656). Diese Verfahren umfassen M13 Phage-Mutagenese, Synthese des mutanten Lymphotoxingens wie in Beispiel 1 et seq. beschrieben oder andere Verfahren, die aus dem Stand der Technik bekannt sind oder werden.
Für Lymphotoxin kodierende Nukleinsäure ist jede beliebige DNA- oder RNA- Sequenz, die für ein Polypeptid kodiert, das unter die in der vorliegenden Beschreibung angeführte Definition von Lymphotoxin fällt, ungeachtet dessen, ob die Nukleotidsequenz derselben den in der Natur vorkommenden Sequenzen entspricht. Zusätzlich ist Nukleinsäure im Schutzumfang der vorliegenden Anmeldung eingeschlossen, die zur Hybridisierung mit für Lymphotoxin kodierender Nukleinsäure unter mindestens wenig strengen Bedingungen geeignet sind, selbst wenn die hybridisierende Nukleinsäure nicht für ein Protein kodiert, das ansonsten den Definitionserfordernissen für Lymphotoxin entspricht. Ein Beispiel für letzteres wäre eine Sonde, die wegen der kurzen Länge von Polypeptid, für das sie kodiert, unfähig ist, ein biologisch aktives Lymphotoxin zu exprimieren. Die Nukleinsäure, die fähig ist, für Lymphotoxin zu kodieren oder damit zu hybridisieren, wird durch organische Synthese, im wesentlichen wie in Beispiel 1 beschrieben, hergestellt, oder aus natürlichen Quellen durch Sondieren von genomen oder cDNA Sammlungen erhalten, wie sie in den Beispielen beschrieben sind.
Das erfindungsgemäße Lymphotoxin wird nach einem Verfahren hergestellt, das im allgemeinen die Transformation eines Wirtes mit einem Vektor umfaßt, der die Nukleinsäure trägt, die für das gewünschte Lymphotoxin kodiert. Ein Vektor ist ein replizierbares DNA Konstrukt. Vektoren werden gemäß der vorliegenden Anmeldung dazu verwendet, um DNA zu verstärken oder DNA zu exprimieren, die für Lymphotoxin kodiert. Ein Expressionsvektor ist ein DNA-Konstrukt, in dem eine für Lymphotoxin kodierende DNA-Sequenz operabel an eine geeignete Steuersequenz gebunden ist, die fähig ist, die Expression von Lymphotoxin in einem geeigneten Wirt zu bewirken. Solche Steuersequenzen umfassen einen Transkriptionspromotor, eine wahlweise Operatorsequenz für die Steuerung der Transkription, eine Sequenz, die für geeignete mRNA ribosomale Bindungsstellen kodiert, und Sequenzen, die die Beendigung von Transkription und Translation steuern.
Der Vektor kann ein Plasmid, ein Virus (einschließlich Phagen) oder ein integrierbares DNA-Fragment sein (d. h. ein solches, das in das Wirtsgenom durch Rekombination integrierbar ist). Wenn er einmal in einen geeigneten Wirt transformiert ist, repliziert und funktioniert der Vektor unabhängig vom Wirtsgenom oder kann in manchen Fällen in das Genom selbst integrieren. In der vorliegenden Beschreibung werden "Plasmid" und "Vektor" manchmal austauschbar verwendet, da das Plasmid gegenwärtig die am häufigsten verwendete Form des Vektors ist. Alle anderen Formen von Vektoren, die eine gleichwertige Funktion erfüllen und aus dem Stand der Technik bekannt sind oder werden, sind für die Verwendung gemäß der Erfindung geeignet.
Geeignete Vektoren enthalten Replikon- und Steuersequenzen, die von mit für den beabsichtigten Expressionswirt kompatiblen Gattungen abgeleitet sind. Transformierte Wirtszellen sind Zellen, die mit Lymphotoxinvektoren transformiert oder transfiziert wurden, die unter Anwendung rekombinanter DNA-Techniken konstruiert wurden. Transformierte Wirtszellen exprimieren üblicherweise Lymphotoxin. Das exprimierte Lymphotoxin wird je nach der ausgewählten Wirtszelle intrazellular abgelagert oder entweder in den periplasmischen Raum oder den Kulturüberstand ausgeschieden.
DNA-Bereiche sind operabel miteinander verbunden, wenn sie funktionell miteinander verwandt sind. So z. B. ist DNA für eine Präsequenz oder einen Sekretionsleader operabel mit DNA für ein Polypeptid verbunden, wenn sie als Präprotein exprimiert wird, das an der Ausscheidung des Polypeptids teilnimmt; ein Promotor ist operabel mit einer Kodierungssequenz verbunden, wenn er die Transkription der Sequenz steuert; oder eine Ribosomenbindungsstelle ist operabel mit einer Kodierungssequenz verbunden, wenn sie so positioniert ist, daß sie die Translation ermöglicht. Im allgemeinen bedeutet operabel verbunden zusammenhängend und im Falle von Sekretionsleadern zusammenhängend und in Lesephase.
Geeignete Wirtszellen sind Prokaryoten, Hefe oder höhere eukaryote Zellen. Prokaryoten umfassen gramnegative oder grampositive Organismen, z. B. E. coli oder Bacilli. Höhere eukaryote Zellen umfassen festgelegte Zellenlinien von Säugetierursprung, wie sie nachstehend beschrieben sind. Eine bevorzugte Wirtszelle ist der phageresistente E.coli W3110 (ATCC 27.325) Stamm, der in den Beispielen beschrieben ist, obwohl andere Prokaryoten wie E.coli B, E.coli X1776 (ATCC 31.537), E.coli 294 (ATCC 31.446), Pseudomonasgattungen oder Serratia Marcesans ebenfalls geeignet sind.
Prokaryote Wirt-Vektor-Systeme werden für die Expression von Lymphotoxin bevorzugt. Es steht eine Vielzahl von geeigneten mikrobiellen Vektoren zur Verfügung. Im allgemeinen enthält ein mikrobieller Vektor einen Replikationsursprung, der vom beabsichtigten Wirt erkannt wird, einen Promotor, der im Wirt funktioniert und ein phänotypisches Selektionsgen, z. B. ein Gen, das für Proteine kodiert, die Antibiotikaresistenz verleihen oder einem auxotrophen Erfordernis entsprechen. Ahnliche Konstrukte werden für andere Wirte hergestellt. E.coli wird typisch unter Verwendung von pBR322 transformiert, einem Plasmid, das von einer E.coli Gattung abgeleitet ist (Bolivar et al., 1977, "Gene" 2 : 95). pBR322 enthält Gene für Ampicillin- und Tetracyclinresistenz und schafft daher ein einfaches Mittel zur Identifizierung von transformierten Zellen.
Expressionsvektoren müssen einen Promotor enthalten, der vom Wirtsorganismus erkannt wird, Klonierungsvektoren müssen dies aber nicht. Der Promotor ist im allgemeinen homolog zum beabsichtigten Wirt. Die bei der Konstruktion von rekombinanter DNA am häufigsten verwendeten Promotoren umfassen die β-Lactamase (Penicillinase) und Lactosepromotorsysteme (Chang et al., 1978, "Nature", 275 : 615; und Goeddel et al., 1979, "Nature" 281 : 544), ein Tryptophan (trp) Promotorsystem (Goeddel et al., 1980, "Nucleic Acids Res." 8 : 4057 und veröffentlichte europäische Patentanmeldung Nr. 36.776) und den tac Promotor (H. De Boer et al., "Proc.Nat'l. Acad.Sci.U.S.A." 80 : 21-25(1983)). Obwohl diese am häufigsten verwendet werden, sind auch andere bekannte mikrobielle Promotoren geeignet. Einzelheiten bezüglich ihrer Nukleotidsequenzen wurden veröffentlicht, so daß es dem Fachmann möglich ist, sie an für Lymphotoxin kodierende DNA in Plasmidvektoren (Siebenlist et al., 1980, "Cell" 20 : 269) und die für Lymphotoxin kodierende DNA zu ligieren. Gegenwärtig ist der bevorzugte Vektor ein pBR322 Derivat, das den E.coli alkalischen Phosphatasepromotor mit der trp Shine-Dalgarno-Sequenz enthält. Der Promotor und die Shine-Dalgarno-Sequenz sind operabel mit der für Lymphotoxin kodierenden DNA verbunden, d. h. sie sind so positioniert, daß sie die Transkription von Lymphotoxin mRNA von der DNA fördern.
Außer Prokaryoten werden auch eukaryote Mikroben wie Hefekulturen mit für Lymphotoxin kodierenden Vektoren transformiert. Saccharomyces cerevisiae oder gewöhnliche Backhefe wird am häufigsten unter den niederen eukaryoten Wirtsorganismen eingesetzt, obwohl eine Anzahl von anderen Stämmen allgemein verfügbar ist. Hefevektoren enthalten im allgemeinen einen Replikationsursprung vom 2 u Hefeplasmid oder eine autonom replizierende Sequenz (ARS), einen Promotor, für Lymphotoxin kodierende DNA (einschließlich insbesondere Human-Prälymphotoxin), Sequenzen für Polyadenylierung und Transkriptionsabbruch und ein Selektionsgen. Ein geeignetes Plasmid für die Expression von Lymphotoxin in Hefe ist YRp7 (Stinchcomb et al., 1979, "Nature" 282 : 39; Kingsman et al., 1979, "Gene" 7 : 141; Tschemper et al., 1980, "Gene" 10 : 157). Dieses Plasmid enthält bereits das trp1 Gen, das eine Selektionsmarkierung für einen mutanten Hefestamm aufweist, der nicht fähig ist, in Tryptophan zu wachsen, z. B. ATCC Nr. 44076 oder PEP4-1 (Jones, 1977, "Genetics" 85 : 12). Die Gegenwart der trp1 Läsion im Hefezellengenom schafft dann eine wirksame Umgebung für den Nachweis von Transformation durch Wachstum in Abwesenheit von Tryptophan.
Geeignete Promotorsequenzen in Hefevektoren umfassen die Promotoren für Metallothionein, 3-Phosphoglyceratkinase (Hitzeman et al., 1980, "J.Biol.Chem."255 : 2073) oder andere glykolytische Enzyme (Hess et al., 1968, "J.Adv.Enzyme Reg." 7 : 149; und Holland et al., 1978, "Biochemistry" 17 : 4900), wie Enolase, Glyceraldehyd-3-phosphatdehydrogenase, Hexokinase, Pyruvatdecarboxylase, Phosphofructokinase, Glukose-6-phosphatisomerase, 3-Phosphoglyceratmutase, Pyruvatkinase, Triosephosphatisomerase, Phosphoglukoseisomerase und Glukokinase. Geeignete Vektoren und Promotoren für die Verwendung bei der Hefeexpression sind weiters bei R. Hitzeman et al., in der veröffentlichten europäischen Patentanmeldung Nr. 73.657 beschrieben.
Andere Promotoren, die den zusätzlichen Vorteil der durch Wachstumsbedingungen gesteuerten Transkription aufweisen, sind die Promotorbereiche für Alkoholdehydrogenase 2, Isocytochrom C, Säurephosphatase, abbauende Enzyme, die mit dem Stickstoffstoffwechsel assoziiert sind, und die vorgenannten Metallothionein und Glyceraldehyd-3-phosphatdehydrogenase sowie Enzyme, die die Verwendung von Maltose und Galactose bewirken. Bei der Konstruktion von geeigneten Expressionsplasmiden werden die mit diesen Genen assoziierten Abbruchsequenzen ebenfalls in den Expressionsvektor 3' der für Lymphotoxin kodierenden Sequenzen ligiert, um die Polyadenylierung der mRNA und den Abbruch herbeizuführen.
Außer Mikroorganismen können auch Kulturen von Zellen, die von mehrzelligen Organismen abgeleitet sind, als Wirte eingesetzt werden. Dies wird jedoch nicht bevorzugt, da bisher ausgezeichnete Ergebnisse mit Lymphotoxin exprimierenden Mikroben erzielt wurden. Grundsätzlich ist jede höhere eukaryote Zellkultur sowohl von Wirbeltierkulturen als auch den Kulturen von wirbellosen Tieren geeignet. Das größte Interesse bestand bisher jedoch in Wirbeltierzellkulturen und die Fortpflanzung von Wirbeltierzellen in Kulturen (Gewebekulturen) ist in den letzten Jahren zur Routine geworden (Tissue Culture, Academic Press, Kruse and Patterson, Herausg., 1973). Beispiele für geeignete Wirtszellenlinien sind VERO und HeLa Zellen, die Zellenlinien der Eierstöcke von Chinesischen Hamstern (CHO) und WI38, BHK, COS-7 und MDCK Zellenlinien. Expressionsvektoren für solche Zellen umfassen üblicherweise (falls nötig) einen Replikationsursprung, einen Promotor, der strangaufwärts vom zu exprimierenden Gen gelegen ist, zusammen mit einer Ribosomenbindungsstelle, eine RNA Spleißstelle (wenn intronhältige genome DNA verwendet wird), eine Polyadenylierungsstelle und eine Transkriptionsabbruchsequenz.
Die Steuersequenzen für Transkription und Translation in Expressionsvektoren, die bei der Transformation von Wirbeltierzellen eingesetzt werden sollen, werden oft durch Virusquellen geboten. So z. B. werden häufig verwendete Promotoren von Polyoma, Adenovirus 2, und am meisten bevorzugt Affenvirus 40 (SV40) abgeleitet. Die frühen und späten Promotoren sind besonders nützlich, da beide ohne Schwierigkeiten aus dem Virus als Fragment erhalten werden, das auch den Replikationsursprung des SV40 Virus enthält (Fiers at al., 1978, "Nature", 273 : 113). Es können auch kleinere oder größere SV40 Fragmente eingesetzt werden, mit der Maßgabe, daß die Sequenz mit etwa 250 Basenpaaren eingeschlossen ist, die sich von der Hind III Stelle auf die Bgl I Stelle zu erstreckt, die im Replikationsursprung des Virus gelegen ist. Weiters ist es auch möglich und oft wünschenswert, die menschlichen genomen Promotor-, Steuer- und/oder Signalsequenzen zu verwenden, die üblicherweise mit Lymphotoxin assoziiert sind, mit der Maßgabe, daß solche Steuersequenzen mit dem Wirtszellensystem kompatibel sind.
Ein Replikationsursprung kann entweder durch Konstruktion des Vektors geschaffen werden, um einen exogenen Ursprung zu umfassen, wie er von SV40 oder anderen Virusquellen (z. B. Polyoma, Adenovirus, VSV oder BPV) abgeleitet werden kann, oder er kann durch den chromosomalen Replikationsmechanismus der Wirtszelle geschaffen werden. Wenn der Vektor in das Wirtszellenchromosom integriert ist, reicht letzteres oft aus. Lymphotoxin wird ohne ein amino-terminales Methionyl durch Transformation höherer eukaryoter Zellen mit der menschlichen Prälymphotoxin-DNA hergestellt.
Bei der Wahl einer bevorzugten Säugetierwirtszelle für die Transfektion durch Vektoren, die DNA-Sequenzen umfassen, die sowohl für Lymphotoxin als auch für Dihydrofolatreductase (DHFR) kodieren, ist es günstig, den Wirt entsprechend dem Typ von eingesetztem DHFR-Protein zu wählen. Wenn DHFR Protein des Wildtyps eingesetzt wird, ist die Wahl einer Wirtszelle zu bevorzugen, die einen Mangel an DHFR aufweist, wodurch die Verwendung einer DHFR-Kodierungssequenz als Markierung für die erfolgreiche Transfektion in selektivem Medium ermöglicht wird, das kein Hypoxanthin, Glycin und Thymidin aufweist. Eine geeignete Wirtszelle in diesem Fall ist die CHO-Zellenlinie (von den Eierstöcken von chinesischen Hamstern abgeleitet), der es an DHFR-Aktivität mangelt und die wie von Urlaub und Chasin in "Proc.Natl.Acad.Sci." 1980 (USA) 77 : 4216 beschrieben hergestellt und fortgepflanzt wird.
Wenn anderseits für DHFR-Protein kodierende DNA mit geringer Bindungsaffinität für Methotrexat (MTX) als Steuersequenz eingesetzt wird, ist es nicht nötig, gegen DHFR resistente Zellen einzusetzen. Da mutante DHFR resistent gegen MTX ist, können MTX enthaltende Medien als Mittel zur Selektion eingesetzt werden, mit der Maßgabe, daß die Wirtszellen selbst empfindlich gegenüber MTX sind. Die meisten eukaryoten Zellen, die zur Absorption von MTX fähig sind, scheinen empfindlich gegenüber Methotrexat zu sein. Eine solche nützliche Zellenlinie ist eine CHO-Linie, CHO-K1 (ATCC Nr. CCL 61).
Transformierte Wirtszellen sind Zellen, die mit Lymphotoxinvektoren transformiert oder transfiziert wurden, die unter Verwendung von rekombinanten DNA-Techniken konstruiert wurden. Transformierte Wirtszellen exprimieren üblicherweise Lymphotoxin. Das exprimierte Lymphotoxin wird üblicherweise intrazellular abgelagert.
Lymphotoxin wird aus rekombinanten Kulturen in nicht sekretionsfähigen Zellen durch Lyse der Zellen und Entfernung des teilchenförmigen Materials durch Zentrifugieren od. dgl. gewonnen. Lymphotoxin ausscheidende Zellen werden vom Kulturüberstand durch Zentrifugieren getrennt. Die kontaminierte Lymphotoxinlösung wird dann nach den vorstehend angeführten Verfahren oder mittels Immunaffinität wie im nachstehenden Beispiel 4 beschrieben gereinigt. Das Lymphotoxin wird auf Werte gereinigt, die für die pharmakologische Verwendung geeignet sind, und in herkömmliche Dosierungsformen wie z. B. Phiolen oder Injektionsspritzen übergeführt. Mischungen von Lyphotoxinvarianten werden eingesetzt, z. B. eine Bank von zytotoxischen mutanten Lymphotoxingattungen. Optimal wird Lymphotoxin für die Langzeitlagerung lyophilisiert, es kann auch in wässerige Lösung mit Stabilisatoren und Excipientien wie z. B. isotoner Salzlösung eingebracht werden und an Patienten wie von B. Aggarwal et al. in der europäischen Patentanmeldung Nr. 100641 beschrieben verabreicht werden.
Lymphotoxinzusammensetzungen werden an von Tumoren befallene Tiere verabreicht. Die Verabreichungsart entspricht bekannten Verfahren, sie ist z. B. eine intravenöse, intraperitoneale, subkutane, intramuskuläre, intraläsionale Infusion oder Injektion von sterilen Lymphotoxinlösungen oder erfolgt mittels der nachstehend beschriebenen Systeme mit zeitlich vorgegebener Freisetzung.
Lymphotoxin wird intraläsional, d. h. durch direkte Injektion in feste bzw. massive Tumore verabreicht. Im Falle von verstreuten Tumoren wie Leukämie erfolgt die Verabreichung vorzugsweise intravenös oder in das Lymphsystem. Tumoren der Unterleibsorgane wie Eierstockkrebs werden vorteilhaft durch intraperitoneale Infusion unter Verwendung von peritonealen Dialysegeräten und mit dem Peritoneum kompatiblen Lösungen behandelt. Üblicherweise wird Lymphotoxin jedoch kontinuierlich mittels Infusion verabreicht, obgleich Bolusinjektionen ebenfalls akzeptabel sind.
Lymphotoxin wird vorteilhaft über einen implantierbaren Gegenstand mit zeitlich vorgegebener Freisetzung verabreicht. Beispiele für geeignete Systeme für Proteine mit dem Molekulargewicht von Lymphotoxindimeren oder -trimeren umfassen die Copolymere von L-Glutaminsäure und Gammaäthyl L-glutamat (U.Sidman et al., 1983, "Biopolymers" 22:(1):547-556), Poly(2- hydroxyäthylmethacrylat) (R. Langer et al., 1981, "J. Biomed. Mater. Res." 15 : 167-277 und R. Langer, 1982, "Chem.Tech." 12 : 98-105) oder Athylenvinylacetat (R.Langer et al, id.). Lymphotoxin enthaltende Gegenstände werden an chirurgischen Eingriffsstellen implantiert, von denen Tumoren exisiert wurden. Alternativ wird Lymphotoxin in semlpermeable Mikrokapseln oder Liposome für Injektion in den Tumor eingebracht. Diese Art der Verabreichung ist besonders für chirurgisch nicht exisierbare Tumoren, z. B. Gehirntumoren, geeignet.
Die Menge an verabreichtem Lymphotoxin hängt z. B. von der Art der Verabreichung, dem in Frage stehenden Tumor und dem Zustand des Patienten ab. Der Therapeut muß die Dosierung bestimmen und die Art der Verabreichung den Erfordernissen entsprechend modifizieren, um optimale zytotoxische Aktivität gegenüber dem Zieltumor zu erzielen, dies kann z. B. durch Biopsie des Tumors oder diagnostische Analysen im Hinblick auf rekombinante Toxizität mit angenommenen Krebsmarkierungen wie carcinoembryonischem Antigen bestimmt werden, die bei erhöhten Dosierungen auftritt. Üblicherweise wurde gefunden, daß rekombinante Lymphotoxindosierungen bei Mäusen von etwa 50 bis 200 ug/kg Körpergewicht pro Tag bei intravenöser Verabreichung in vivo im wesentlichen nichttoxisch und wirksam sind. Selbstverständlich variiert die Dosierung für verschiedene Tiere.
Gemäß der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zur Schaffung von Lymphotoxin neutralisierendem Antikörper geschaffen. Neutralisierender Antikörper wird als Antikörper definiert, der fähig ist, wie hierin definiertes Lymphotoxin immunologisch auf solche Weise zu binden, daß seine Aktivität in zytostatischen oder zytolytischen Lymphotoxinaktivitätsanalysen wie der nachstehend beschriebenen Analyse mit L929 Mäusen wesentlich verringert wird. Die Tatsache, daß der Antikörper dazu geeignet ist, die Lymphotoxinaktivität zu neutralisieren, bedeutet nicht, daß der Antikörper direkt an die aktive oder Rezeptorbindungsstelle des Lymphotoxins binden muß. Der Antikörper kann immer noch die Lymphotoxinaktivität wesentlich neutralisieren, wenn er sterisch an einen Bereich bindet, der an die kritische Stelle angrenzt, d. h. angrenzend im Sinne von übereinstimmungsgemäß angrenzend und nicht unbedingt angrenzend vom Standpunkt der Aminosäuresequenz.
Beim Versuch, einen neutralisierenden monoklonalen Antikörper gegen Lymphotoxin herzustellen, erwies es sich als schwierig, Mäuse auf solche Weise zu immunisieren, daß Lymphotoxin neutralisierender Antikörper in den Tieren erzeugt oder gezüchtet wird. Weder die Immunisierung mit lymphoblastoidem Lymphotoxin noch mit mit Glutaraldehyd vernetztem Lymphotoxin führte zu einem nachweisbaren neutralisierenden Antikörper im Serum der immunisierten Mäuse, obwohl die Mäuse nichtneutralisierenden Anti-Lymphotoxin-Antikörper erzeugten, der durch Enzymimmunanalyse nachweisbar war. Die Immunisierung mit einem Lymphotoxin-Alum (Aluminiumhydroxid oder Aluminiumoxid, Al&sub2;O&sub3;·3H&sub2;O)-Adsorptionskomplex erzeugt neutralisierenden Antikörper selbst in Tieren, die keine Aktivität vor der Immunisierung mit dem Alumkomplex erzeugten. Die Herstellung von Alum und seine Verwendung bei der Produktion von Antiserum sind bei C. Williams et al., Herausg., 1967, Methods in Immunology and Immunochemistry I, ff 197-229 beschrieben.
Es werden Verschmelzungen von Milzzellen von Tieren, die neutralisierenden Antikörper produzieren, mit Mäusemyelomzellen vorgenommen. Durchschnittlich müssen etwa 50 bis 100 Klone gescreent werden, um einen zu identifizieren, der neutralisierenden Antikörper erzeugt. Das Verfahren zum Screenen der Klone in bezug auf die gewünschte Aktivität ist Routine und dem Durchschnittsfachmann geläufig und kann mit einem Minimum an Versuchsmühe reproduziert werden.
Die Serum-, Plasma- oder IgG-Fraktionen des immunisierten Tieres sowie Immunoglobuline, die von Hybridoma ausgeschieden werden, die durch die Milz- oder Lymphzellen von immunisierten Tieren erzeugt werden, sind für Zwecke der vorliegenden Erfindung zufriedenstellend. Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform wird der neutralisierende Antikörper im wesentlichen frei von anderem anti-Lymphotoxin-Antikörper in Hybridomakulturen erhalten.
Der neutralisierende Antikörper wird durch Adsorption an Oberflächen, z. B. Thermoplasten wie Polystyrol, immobilisiert oder kovalent an Matrizen wie durch Cyanogenbromid aktivierte Sepharose gebunden. Er wird dann in Immunanalysen oder Immunaffinitätsreinigungsverfahren eingesetzt. Da der Antikörper ein neutralisierender Antikörper ist, ist es wahrscheinlich, daß er nur biologisch aktives Lymphotoxin oder Fragmente desselben adsorbiert oder nachweist. Der Antikörper ist besonders nützlich für immunradiometrische ("Sandwich")-Immunanalysen im Verein mit einem nichtneutralisierenden monoklonalen anti-Lymphotoxin Antikörper oder einem polyklonalen Antiserum, das nichtneutralisierendes anti-Lymphotoxin enthält. Die Immunanalyse wird unter Verwendung entweder des neutralisierenden oder nichtneutralisierenden Antikörpers als markiertem Bestandteil durchgeführt, die Markierung wird mit einer nachweisbaren Substanz wie einer fluoreszierenden, chemilumineszenten oder radioisotopen Markierung nach aus dem Stand der Technik bekannten Verfahren vorgenommen. Für Lymphotoxin-Immunanalysen des konkurrierenden Typs wird Lymphotoxin auf die gleiche Weise markiert. Chloramin-T-Radiojodierung ist für Tracerpräparation für Lymphotoxin als auch Lymphotoxin-Antikörper geeignet, es kann auch das von J. Klostergaard et al. in "Mol.Immun." 18 : 455 (1980) beschriebene Verfahren angewendet werden.
Um die Beispiele zu vereinfachen, wird auf gewisse häufig vorkommende Verfahren in Schlagworten hingewiesen.
Plasmide werden durch ein kleines p bezeichnet, dem Großbuchstaben und/oder Zahlen vor- oder nachgestellt sind. Die erfindungsgemäß eingesetzten Ausgangsplasmide sind handelsüblich und uneingeschränkt öffentlich zugänglich oder können aus solchen zugänglichen Plasmiden nach bekannten Verfahren konstruiert werden. Zusätzlich sind andere äquivalente Plasmide aus dem Stand der Technik bekannt und dem Durchschnittsfachmann geläufig.
"Digestion" von DNA bezieht sich auf die katalytische Spaltung der DNA mit einem Enzym, das nur an bestimmten Stellen in der DNA wirkt. Solche Enzyme werden als Restriktionsenzyme bezeichnet und die Stelle, für die jedes von ihnen spezifisch ist, wird als Restriktionsstelle bezeichnet. "Teilweise" Digestion bedeutet unvollständige Digestion durch ein Restriktionsenzym, d. h., daß Bedingungen gewählt werden, die zur Spaltung von einigen, aber nicht allen Stellen für eine bestimmte Restriktionsendonuklease in einem DNA-Substrat führen. Die verschiedenen erfindungsgemäß eingesetzten Restriktionsenzyme sind handelsüblich und ihre Reaktionsbedingungen, Kofaktoren und anderen von den Enzymlieferanten vorgegebenen Erfordernisse wurden eingehalten. Restriktionsenzyme werden üblicherweise mit Abkürzungen bezeichnet, die aus einem Großbuchstaben gefolgt von anderen Buchstaben und dann im allgemeinen einer Zahl bestehen, die den Mikroorganismus darstellt, von dem jedes Restriktionsenzym ursprünglich erhalten wurde. Im allgemeinen wird etwa 1 ug Plasmid oder DNA-Fragment mit etwa 1 Einheit Enzym in etwa 20 ul Pufferlösung verwendet. Geeignete Puffer und Substratmengen für bestimmte Restriktionsenzyme werden vom Hersteller angegeben. Inkubationszeiten von etwa 1 Stunde bei 37ºC werden üblicherweise angewendet, können jedoch je nach den Instruktionen des Lieferanten variieren. Nach der Inkubation wird das Protein durch Extraktion mit Phenol und Chloroform entfernt und die digerierte Nukleinsäure wird aus der wässerigen Fraktion durch Ausfällen mit Aethanol gewonnen. Auf die Digestion mit einem Restriktionsenzym folgt selten eine Hydrolyse der terminalen 5' Phosphate mit bakterieller alkalischer Phosphatase, um zu verhindern, daß die beiden durch Restriktion abgespaltenen Enden eines DNA-Fragmentes "zirkularisieren" oder eine geschlossene Schleife bilden, die die Einfügung eines anderen DNA-Fragmentes an der Restriktionsstelle behindern würde.
Falls nicht anders angeführt, folgt auf die Digestion von Plasmiden nicht die 5'-terminale Dephosphorylierung. Verfahren und Reagentien für die Dephosphorylierung sind herkömmlich (T. Maniatis et al., 1982, Molecular Cloning ff 133-134).
"Gewinnung" oder "Isolierung" eines bestimmten DNA-Fragments aus einem Restriktionsdigest bedeutet die Trennung des Digests an Polyacrylamidgel durch Elektrophorese, Identifizierung des Fragments von Interesse durch Vergleich seiner Mobilität zu jener von Markierungs DNA-Fragmenten von bekanntem Molekulargewicht, Entfernung des Gel-Abschnittes, der das gewünschte Fragment enthält und Abtrennung des Gels von der DNA. Dieser Prozeß ist allgemein bekannt. Siehe z. B. R. Lawn et al., 1981, "Nucleic Acids Res." 9 : 6103-6114 und O. Goeddel et al., 1980, "Nucleic Acids Res." 8 : 4057.
"Southern-Analyse" ist ein Verfahren, durch das die Gegenwart von DNA-Sequenzen in einem Digest oder einer DNA enthaltenden Zusammensetzung durch Hybridisierung mit einem bekannten, markierten Oligonukelotid- oder DNA-Fragment bestätigt wird. Für die Zwecke der vorliegenden Beschreibung bedeutet Southern-Analyse, falls nicht anders vorgesehen, die Trennung von Digesten auf 1%-iger Agarose, Denaturierung und Übertragung auf Nitrozellulose nach dem Verfahren von E. Southern, 1975, "J. Mol. Biol." 98 : 503-517 und Hybridisierung wie von T. Maniatis et al. 1978 in "Cell" 15 : 687-701 beschrieben.
"Transformation" bedeutet das Einbringen von DNA in einen Organismus, so daß die DNA replizierbar entweder als extrachromosomales Element oder chromosomaler Integrant ist. Falls nicht anders vorgesehen, wird gemäß der vorliegenden Beschreibung zur Transformation von E.coli das CaCl&sub2; Verfahren von Mandel et al. angewendet, das 1970 in "J.Mol.Biol." 53 : 154 beschrieben wurde.
"Ligierung" bezieht sich auf das Verfahren zur Bildung von Phosphodiesterbindungen zwischen zwei doppelstrangigen Nukleinsäurefragmenten (T. Maniatis et al., Molecular Cloning, S. 146). Falls nicht anders vorgesehen, kann die Ligierung unter Verwendung von bekannten Puffern und Bedingungen mit 10 Einheiten T4 DNA Ligase ("Ligase") pro 0,5 ug annähernd äquimolaren Mengen der zu ligierenden DNA-Fragmente vorgenommen werden.
"Herstellung" von DNA aus Transformanten bedeutet das Isolieren von Plasmid DNA aus Mikrobenkulturen. Falls nicht anders vorgesehen, wird das alkalische/SDS-Verfahren von Maniatis et al. eingesetzt, das in Molecular Cloning auf S. 90 beschrieben ist.
"Oligonukleotide" sind kurze, ein- oder doppelstrangige Polydesoxynukleotide, die chemisch nach dem Verfahren hergestellt werden, das durch Verweis in Beispiel 1 aufgenommen ist, und dann an Polyacrylamidgelen gereinigt werden.
Alle zitierten Literaturstellen werden ausdrücklich hierin durch Verweis eingeschlossen.

Beispiel 1

Reinigung und Sequenzierung von Lymphotoxin

Die menschliche lymphoblastoide Zellenlinie RPMI-1788 (ATCC Nr. CCL-156) wurde in 15L Spinnerkolben auf eine Zellendichte von 4·10&sup5; Zellen pro ml unter Verwendung eines serumfreien Kulturmediums (RPMI-1640) kultiviert. Lymphotoxin wurde 10-20-fach (auf 500-1000 Lymphotoxineinheiten/ml wie nachstehend beschrieben bestimmt) über die Grundwerte hinaus durch Aufnahme von 20 ng/ml Phorbolmyristatacetat in das serumfreie RPMI-1640 Medium eingebracht. Nach 65 Stunden langem Kultivieren wurden die Zellen abgefiltert und die Lymphotoxinaktivität im Filtrat wurde auf Glasperlen mit gesteuerter Porosität (Electronucleonics) in einer Säule (5 cm · 20 cm) absorbiert, mit 5mM Phosphatpuffer (pH 7.4) äquilibriert und mit 50-%-igem Athylenglykol in 5 mM Phosphatpuffer (pH 7.4) eluiert. Allen Puffern während der gesamten Reinigung wurden 0,1 mM Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF), ein Proteasehemmstoff, und 1 mM Natriumazid zur Hemmung des Mikrobenwachstums zugegeben. Das Eluat von den Glasperlen enthielt 84.000 Einheiten Lymphotoxin/mg Protein. Darauf folgte DEAE-Zellulosechromatographie, Lentil-Lectin-Sepharose-Chromatographie und präparative native PAGE, wie bei B. Aggarwal et al., 1984 in "J. Biol. Chem." 259 (1) :686-691 beschrieben. Die Homogenität des Proteins, das die zytotoxische Aktivität bewirkt, wurde mittels SDSPAGE, Phasenumkehr-HPLC an einer Lichrosorb RP-18 Kolonne und amino-terminalem Sequenzieren bestimmt.
Dieses Lymphotoxinpraparat enthielt mehr als 95 Gew.-% des leucylaminoterminalen Lymphotoxins mit einem ungefähren Molekulargewicht von 25.000 bei SDS-PAGE. Das theoretische Molekulargewicht des Proteinbestandteils der N-terminalen Leucylspezies beträgt 18.664 Dalton; die verbleibenden etwa 6.500 Dalton wurden einer Glykosylseitenkette bei Asn+62 und möglicherweise anderen 0-gebundenen Zuckerresten zugeschrieben. Der Gewebekulturüberstand enthielt vermutete Multimere dieser Gattung (60.000 Da bei TSK-HPLC oder 64.000 Da bei Sephadex G-100 Chromatographie).
Die verbleibenden 5% der Lymphotoxinmischung waren die N-terminale Histidylspezies mit einem Molekulargewicht von etwa 20.000. Beide Spezien wiesen im wesentlichen die gleiche zytolytische Aktivität wenigstens innerhalb der Grenzen der Variation auf, die der nachstehend beschriebenen Mäuse-Fibroblastzellenlyse-Analyse anhaftet.
Die tryptische Digestion der intakten Lymphotoxinmoleküle ergab nur einige wenige Fragmente. Histidyl-amino-terminales Lymphotoxin wurde zu zwei Fragmenten zwischen den Amionosäurepositionen 89 und 90 digeriert, während die leucylamino-terminale tryptische Digestion vier Fragmente ergab, die zwischen den Positionen 15 und 16, 19 und 20, und 89 und 90 abgespalten wurden.
Mikrosequenzieren nach dem Edman-Abbauverfahren ergab Sequenzinformation über das intakte Molekül und auch über die durch tryptische Spaltung produzierten Moleküle.
Weitere Sequenzinformationen wurden durch Fragmente von Lymphotoxin erhalten, die durch Carboxypeptidase P und Chymotrypsindigestion, Essigsäuredigestion und Spaltung mit Cyanogenbromid erzielt wurden. Fast die gesamte Sequenz des Humanlymphotoxins wurde nach diesem Verfahren bestimmt. 156 zusammenhängende Reste wurden vom Aminoterminus bestimmt. Aus dieser Sequenzierungsinformation ging klar hervor, daß der Unterschied zwischen den beiden Lymphotoxinspezien in der Gegenwart von 23 aminoterminalen Resten in der Leucylamino-terminalen Spezies bestand, die in der Histidyl amino-terminalen Spezies nicht gefunden wurden. Die carboxyl-terminale Sequenz über die ersten drei Reste hinaus erwies sich aufgrund bestimmter, in diesem Bereich vorhandener Peptidbindungen und der hydrophoben Beschaffenheit der Reste als schwierig zu bestimmen.
Es wurde ein synthetisches Gen geplant, das für die Proteinsequenz in dem Ausmaß kodiert, das durch Mikrosequenzieren bestimmt wird. Die Genplanung umfaßte eine allgemeine E.coli Kodon-Ausrichtung, d. h., daß selten eingesetzte E.coli Kodone in der Sequenz nicht verwendet wurden. Humanpräferenzkodone wurden substituiert, wo keine E.coli Kodon-Ausrichtung erkennbar war. Diese Ausrichtung wurde gewählt, um die Expression in E.coli zu unterstützen und auch, um das synthetische Gen nützlich als Sonde zu machen, um die natürliche DNA-Sequenz von Human-cDNA oder genomen Sammlungen zu identifizieren. Die einmaligen Restriktionsstellen XbaI, BamHI, HindIII und BglII wurden in die Sequenz hineingeplant, um die Konstruktion der Fragmente zu unterstützen und die zukünftige Manipulation des Gens zu ermöglichen.
Die 58 ursprünglichen Oligomere, die für das synthetische Lymphotoxingen geplant wurden, wurden nach dem Festphasen-Phosphitverfahren nach M. Matteucci et al. hergestellt, das 1981 in "J.Amer.Chem.Soc." 103 : 3185-3190 und von S. Beaucage et al. 1981 in "Tet.Letters" 22 : 1859-1862 beschrieben wurde. Die Größe dieser Oligomere reichte von 16 Basen bis 20 Basen und ist in Fig. 1a dargestellt. Überlappungen zwischen Oligomeren betrugen 6 Basen in Länge und waren als einzigartig geplant. Das gesamte Gen wurde wie in Fig. 1b gezeigt zusammengestellt.
Das Gen wurde in drei getrennten Stücken konstruiert. Das erste, Segment A, hatte eine Länge von 117 Basenpaaren und stellte den 5'-Kodierungsbereich des aminoterminalen Endes der leucylamino-terminalen Gattung dar. Segment B stellte die DNA dar, die für die Mitte des Lymphotoxinmoleküls kodierte, und hatte eine Länge von 145 Basenpaaren. Vom Segment C mit einer Länge von 217 Basenpaaren wurde angenommen, daß es für alle bis auf 16 Aminosäurereste am Lymphotoxincarboxyterminus kodiert. Die für die Synthese jedes der Segmente erforderlichen Oligomere wurden mittels Elektrophorese gereinigt und dann vereint. Die verhältnismäßig geringe Größe jedes Oligomers (d. h. 16-20 Basen) wurde gewählt, um Fehler bei der Synthese zu verringern.
Jede Gruppe von Oligomeren wurde in einer Reaktionsmischung phosphoryliert, die 20 mM Tris-HCl (pH 7,5), 10 mM MgCl&sub2;, 20 mM Dithiothreitol, 0,5 mM ATP und 15 Einheiten T4 Polynukleotidkinase in einem Volumen von 50 ul enthielt; etwa 50 umol jedes Oligomers waren im Reaktionsgemisch enthalten. Nach 30 Minuten bei 37ºC wurde die Reaktionsmischung auf 65ºC erwärmt, um die Kinaseaktivität zu zerstören, und dann langsam innerhalb eines Zeitraums von einer Stunde auf 20ºC abkühlen gelassen. Die phosphorylierten Oligomeren wurden dann durch Zugabe von 10 Einheiten T4 DNA-Ligase ligiert und die Reaktion wurde 2 Stunden lang bei 20ºC fortgesetzt. Die DNA-Ligase wurde mittels Wärme inaktiviert und die ligierten Oligomeren wurden dann 3 Stunden lang bei 37ºC mit Restriktionsendonukleasen digeriert, die die geplanten Terminusstellen (z. B. XbaI und BamHI für Segment A) erkannten. Fragmente jedes Segments wurden mittels Elektrophorese an einem 7-%-igen Polyacrylamidgel isoliert. Fragmente mit der richtigen Mobilität wurden für jedes Segment mittels Athidiumbromidfärbung identifiziert und aus dem Gel elektroeluiert. pFIFtrp69 (D. Goeddel et al., 1980, "Nature" 287 : 411-416 oder Crea et al., europäische Patentanmeldung Nr. 0048970) wurde mit XbaI und BamHI digeriert und das große Vektorfragment wurde mittels 6-%-iger Polyacrylamidgel-Elektrophorese isoliert. Etwa 50 ng von Segment A wurden an das pFIFtrp69-Fragment ligiert. Ahnlich wurde Segment B in mit BamHI und HindIII digeriertes pBR322 ligiert und Segment C wurde in mit HindIII und BglII digeriertes pLeIFA-125-1 ligiert (D.Goeddel et al., 19809, "Nuc. Acids Res." 8 : 4057-4073). Die Ligierungsreaktionsmischungen wurden in E.coli ATCC 31446 transformiert und die entstandenen rekombinanten Plasmide wurden mittels Restriktionsendonukleaseanalyse und DNA-Sequenzierung nach dem chemischen Abbauverfahren von Maxam und Gilbert gekennzeichnet. 5 von 6 Klonen von Segment A enthielten die geplante Sequenz. 4 Segment B- und 4 Segment C-Plasmide wurden isoliert, alle diese Einfügungen wiesen die richtigen Sequenzen auf. Jedes Segment wurde durch Digerierung mit Restriktionsendonukleasen isoliert, die die Terminusstellen erkannten, und dann in den mit XbaI und BglII digierierten Plasmidvektor pFIFtrp69 ligiert. Das entstandene rekombinante Plasmid, pLTXB1, wurde durch Sequenzieren des eingefügten XbaIBglII Fragmentes gekennzeichnet, das die in Fig. 1a dargestellte Sequenz enthielt.
Um zu bestimmen, ob das synthetische Gen tatsächlich biologisch aktives Lymphotoxin produziert, wurden die E.coli pLTxB1 Transformanten in Minimalmedien unter Bedingungen kultiviert, um den trp-Promotor zu dereprimieren und die Expression des synthetischen Lymphotoxingens zuzulassen. Kulturen wurden auf eine optische Dichte von 1,0 bei 550 nm gezüchtet und abzentrifugiert. Das Zellenpellet wurde in 1/10 Volumen suspendiert und dann mittels Ultraschall lysiert.
Die Lymphotoxinaktivität wurde nach dem modifizierten Zellenlyseverfahren von B. Spofford bestimmt (1974, "J.Immunol." 112 : 2111). Kurz gesagt wurden Mäuse L-929 Fibroblastzellen in Mikrotiterplatten in Gegenwart von Actinomycin D kultiviert. Nach 12 bis 18 Stunden wurden jedem in bezug auf Lymphotoxin zu analysierenden Napf 0,125 ml reihenverdünnte Probe zugegeben. Nach 18 Stunden wurden die Platten gewaschen und die durch an den Platten haftendes Lymphotoxin induzierte Lyse der Zellen wurde durch Färben der Platten mit einer 1-%-igen Lösung von Kristallviolett in Methanol:Wasser (1 : 4 v/v) nachgewiesen. Die Intensität der Färbung wurde sowohl visuell als auch spektrophotometrisch als dekadische Extinktion bei 450 nm und Durchlässigkeit bei 570 nm unter Verwendung eines Dynatech Spektrophotometers beobachtet. Die Zellen, die in einen Mikrotiternapf mit Kulturmedium allein plattiert wurden, wurden auf 0 % Lyse eingestellt, während jene mit 3M Guanidinhydrochloridlösung einen Endpunkt für 100-%-ige Lyse schufen. Eine Einheit Lymphotoxin wurde als jene Menge definiert, die für die 50-%-ige Zellenlyse von 12.000 Zellen erforderlich ist, die in jedem Napf plattiert sind. Man beachte, daß andere Analysen für zytotoxische Aktivität ebenfalls eingesetzt werden können. Siehe z. B. B. Aggarwal et al., in "Thymic Hormones and Lymphokines", 1983, Herausg. A. Goldstein, Spring Symposium on Health Sciences, George Washington Univ. Medical Center (die in diesem Material angeführte A549 Zellenlinie ist von der ATCC als CCL185 erhältlich). Kulturlysate zeigten unnachweisbare zytolytische Aktivität in der vorstehend beschriebenen Mäusezellenanalyse. Kontroll-Lysate von Gammainterferon exprimierenden Kulturen enthielten Gammainterferonaktivität. Dieses Ergebnis ließ darauf schließen, daß das synthetische Gen nicht für ein aktives Lymphotoxin kodierte. Es gab mehrere mögliche Erklärungen dafür. Z.B.: (1) der E.coli baute das Lymphotoxin ab, (2) das Lymphotoxingen wurde nicht in E.coli transkribiert, (3) die Lymphotoxinbotschaft wurde nicht in E.coli translatiert, (4) das Protein hatte aufgrund eines Proteinsequenzierungsfehlers nicht die richtige Sequenz, oder (5) die carboxy-terminale Sequenz mit 16 Resten oder ein Abschnitt derselben war tatsächlich für die Aktivität oder für die richtige Konfiguration des Lymphotoxinmoleküls erforderlich.

Beispiel 2

Verfahren zum Erhalt von für Lymphotoxin kodierender cDNA

RNA wurde aus einer Kultur einer nichtklebenden Zellenfraktion von menschlichen peripheren Blutlymphozyten 48 Stunden nach der Induktion mit Phorbolmyristatacetat (10 ng/ml), Staphylokokkenenterotoxin B (1 ug/ml) und Thymosin-α-1 isoliert (S. Berger et al., 1979, "Biochemistry" 18 : 5143-5149). Diese Kultur produzierte 400 Einheiten Lymphotoxinaktivität pro ml Überstand. Die mRNA wurde durch Adsorption an immobilisiertem Oligo-dT konzentriert, eluiert und cDNA wurde durch Umkehrtranskription hergestellt (P. Gray et al., 1982, "Nature" 295 : 503- 508). Umkehrtranskriptase wurde dazu verwendet, eine cDNA-Kopie der Boten- RNA nach Standardverfahren herzustellen, ein zweiter Strang wurde (ebenfalls nach Standardverfahren) mittels Klenow-Behandlung hergestellt und die cDNA wurde mit S-1-Nuklease behandelt, um die Haarnadelschleife zu entfernen. Um diese cDNA in einen Vektor einzufügen, wurden die Enden an einen Adapter oder Linker ligiert, um 5'- und 3'Restriktionsenzymstellen oder vorzugsweise kohäsive Termini für eine vorgegebene Restriktionsenzymstelle zu schaffen. Das Oligonukleotid 5'-HO-AATTCATGCGTTCTTACAGGTACGCAAGAATGTC-P-5' wurde für diesen Zweck verwendet. Das Oligonukleotid wurde an die cDNA ligiert und die cDNA wurde mittels Polyacrylamidgel-Elektrophorese erneut isoliert. λgt10, ein öffentlich zugänglicher Phage (oder sein wesentliches Aquivalent, λgt11, das von der ATCC erhältlich ist), wurde mit EcoRI digeriert und das lineare Fragment wurde gewonnen (M. Wickens et al., 1978, "J.Biol. Chem." 253-2483-2495). Das gekoppelte Umkehrtranskript und der λgt10 Digest wurden ligiert und das Ligierungsgemisch wurde zur Transfektion von E.coli C-600 oder einem anderen bekannten Wirt verwendet, der für die XPhagen-Infektion anfällig ist. Etwa 10.000 rekombinante Phagen wurden auf einer Platte von 15 cm plattiert und nach einem Plattenhybridisierungsverfahren unter milden Bedingungen (T. Maniatis et al., 1978, "Cell" 15 : 687-701 und P. Gray et al., "PNAS" 80 : 5842-5846) unter Verwendung einer mit ³²p markierten Sonde gescreent, die aus dem Segment A nach Fig. 1a nach dem Verfahren von J. Taylor et al., 1976, in "Biochem.Biophys.Acta" 442 : 324-330 hergestellt wurde, in dem Kalbsthymus-DNA-Primer eingesetzt werden (PL Biochemicals). Nitrozelluloseduplikatfilter wurden nach dem Verfahren unter milden Bedingungen mit 5·10&sup7; cpm der Sonde in 20-%-igem Formamid hybridisiert. Die Filter wurden zweimal in 0,3 M Natriumchlorid, 0,03 M Natriumzitrat und 0,1% Natriumdodecylsulfonat (SDS) bei 37ºC gewaschen.
Zwei Phagen hybridisierten mit der Sonde und wurden durch Plattierung gereinigt. Die gereinigten Phagen hybridisierten sowohl mit der Segment A Sonde als auch einer aus Segment B hergestellten Sonde. Die cDNA Einfügungen der beiden hybridisierenden Phagen, λLT1 und λLT2, wurden in M13mp8 subkloniert und nach dem Didesoxykettenabbruchverfahren sequenziert (A. Smith, 1980, "Methods in Enzymology" 65 : 560-580). Die Einfügung in λLT2 bestand nur aus etwa 600 Basenpaaren und enthielt nicht den ganzen 3'Kodierungsbereich für Lymphotoxin. Die Einfügung in λLT1 enthielt den gesamten Kodierungsbereich für leucylamino-terminales Lymphotoxin plus einem 3'-untranslatierten Bereich von 650 Basenpaaren (der ein KonsensPolyadenylierungssignal enthielt) und Kodone für 18 Aminosäuren, die amino-terminal zum Leucylterminus waren. Da dies nicht den gesamten Lymphotoxinkodierungsbereich darstellte, wurde eine zusätzliche mit ³²p markierte Sonde aus der cDNA Einfügung von λLT1 hergestellt und dazu verwendet, zusätzliche 25.000 rekombinante Ägt10 Phagen unter strengen Bedingungen zu screenen (siehe T. Huynh et al., 1984, Practical Approaches in Biochemistry, IRL Press, Oxford). Zwölf zusätzliche hybridisierende Phagen wurden isoliert und die Sequenz der längsten Einfügung, von λLT11, ist in Fig. 2a dargestellt. Der längste offene Leseraster wurde ausgehend vom ersten beobachteten ATG translatiert. Die Zahlen über jeder Linie beziehen sich auf die Position der Aminosäure und die Zahlen unter jeder Linie bedeuten die Position des Nukleotids. Der mit "l" markierte Leucylrest stellt den ersten sequenzierten Rest von leucylamino-terminalem Lymphotoxin dar (Fig. 1a) und es wird angenommen, daß er der erste amino-terminale Rest der reifen Gattung von Lymphotoxin ist. Die ersten 34 Reste stellen eine Signalsequenz dar. Die Reste 156-171 waren bisher nicht durch Proteinsequenzierung von Lymphotoxin nachweisbar gewesen, sie wurden vielmehr aufgrund der Nukleotidsequenz vermutet.

Beispiel 3

Konstrukion eines hybriden synthetischen Gen/Natürlicher cDNA Expressionsvektors für leucylamino-terminales Lymphotoxin

Diese Konstruktion ist in Fig. 2b dargestellt. pLTXB1 (das das inaktive synthetische Gen enthält) wurde teilweise mit EcoRI und PstI digeriert und es wurde ein 685 bp Fragment gewonnen, das DNA enthielt, die für 125 N-terminale Reste von Lymphotoxin kodiert. Ein teilweiser PstI Digest wurde wegen des Vorliegens einer zusätzlichen PstI Stelle am Rest 10 durchgeführt (Fig. 1a). Ein 301 bp Fragment, das DNA enthielt, die für die C-terminalen 51 Aminosäuren von Lymphotoxin kodiert, wurde durch Digerieren der subklonierten cDNA von λLT1 mit EcoRI und PstI isoliert (diese Stellen sind vorstehend in Fig. 2a bei den Nukleotidpositionen 554 und 855 dargestellt). Diese Fragmente wurden durch Elektrophorese an 5-%-igem Polyacrylamid und Elektroelution isoliert. Die Fragmente wurden in pBR322 ligiert, das mit EcoRI digeriert und mit bakterieller alkalischer Phosphatase dephosphoryliert worden war, um die Hintergrundtransformanten zu reduzieren. Das entstandene Expressionsplasmid, pLTtrp1, wurde mittels Restriktionsendonuklease-Digestion und DNA-Sequenzieren als die richtige Ausrichtung und Sequenz aufweisend gekennzeichnet. Leucylamino-terminales Lymphotoxin wurde durch Transformieren von E.-coli 31446 mit pLTtrp1 und 4-6 Stunden langes Kultivieren der Transformanten bei 37ºC in Tetracyclin enthaltendem Medium exprimiert, bis eine optische Dichte von 1,0 erreicht war. Die Zellenlysate wiesen zytotoxische Aktivität auf. Der Leucylamino-Terminus der exprimierten Lymphotoxingattung erwies sich als mit einem blockierten Methionylrest substituiert. Es wird angenommen, daß das Produkt dieser Synthese die Formylmethionyl- anstelle der Methionylgattung ist.

Beispiel 4

Immunaffinitätsreinigung von Lymphotoxin

Eine monoklonale Mäusezellenlinie, die anti-Lymphotoxin ausschied, (Beispiel 8) wurde in Mäusen gezüchtet und von Aszitesfluid mittels Ionenaustauschchromatographie gereinigt. Das Anionentauscheluat wurde an mit Cyanogenbromid aktivierte Sepharose mit einer Konzentration von 2 mg/ml Harz gekoppelt. Eine Säule mit 20 ml Fassungsraum wurde aufeinanderfolgend mit TBS (mit einem Gehalt von 0,05 M Tris-HCl, pH 7,0, 0,15 M Natriumchlorid und 2mM EDTA); darauf mit Elutionspuffer (mit einem Gehalt von 0,1 M Essigsäure, pH 4,5, 150 mM Natriumchlorid); und schließlich mit TBS äquilibriert. Ein 40-%-iges, gesättigtes Ammoniumsulfatpräzipitat von mit pLTtrp1 transformiertem E.coli eines beschallten Lysats (das vorher durch Zentrifugieren geklärt wurde) wurde in 0,1 M Tris-HCl, pH 7,4, und 5 mM EDTA suspendiert und in die Säule mit einer Rate von einem Säulenvolumen pro Stunde eingebracht. Nach gründlichem Waschen mit 0,05% Tween 20 enthaltendem TBS wurde das spezifisch gebundene Material mit dem Elutionspuffer eluiert, der pH- Wert sofort mit 0,1 Volumen 1 M Tris-HCl mit pH 8,5 auf 7,8 eingestellt und bei 4ºC gelagert. Die spezifische Aktivität dieses gereinigten Lymphotoxins betrug 2-10·10&sup7; Einheiten/mg gemessen in der vorstehend beschriebenen Analyse mit L-929 Mäusezellen.
Das Eluat enthielt den Großteil der Aktivität, die in die Säule eingebracht worden war. Der Großteil des gesamten Eluatproteins migrierte als ein einzelnes Band sowohl unter reduzierenden als auch nichtreduzierenden Bedingungen bei Elektrophorese mit SDS-Polyacrylamidgel. Die Mobilität dieses Bandes entspricht etwa einem Molekulargewicht von 18.000, was in Übereinstimmung mit dem vorhergesagten Wert von 18.664 für unglykosyliertes leucylamino-terminales Lymphotoxin basierend auf der abgeleiteten Aminosäuresequenz ist. Zur weiteren Kennzeichnung seiner biologischen Aktivitäten wurde das gereinigte rekombinante Lymphotoxin in bezug auf zytolytische Aktivität in vitro und anti-Tumor-Aktivität in vivo untersucht.

Beispiel 5

Biologische Aktivität von rekombinantem Lymphotoxin in vivo

Rekombinantes und lymphoblastoides Lymphotoxin wurde in einer in vivo durchgeführten Tumornekrose-Analyse untersucht. MethA(a) Sarcoma wurden 7-10 Tage lang in anfälligen Mäusen (BALB/C · C57B1/6fl oder CB6fl) kultiviert und die Tumoren wurden dann direkt mit dem in Beispiel 4 beschriebenen Lymphotoxin, (wie vorstehend beschrieben hergestelltem und gereinigtem) lymphoblastoidem Lymphotoxin oder Kontrollproben injiziert. Nach 20-24 Stunden wurden die Mäuse getötet, die Tumoren wurden entfernt und histologisch in bezug auf das Ausmaß der Nekrose bewertet. Aus Tabelle 1 ist ersichtlich, daß sowohl rekombinantes als auch lymphoblastoides Lymphotoxin signifikante Nekrose von MethA(a) Sarcom in vivo bewirkten. Die Kontrollproben führten keine Nekrose der MethA(a) Sarcoma herbei. TABELLE 1 Nekrose von MethA(a) Sarcoma in vivo durch rekombinantes und natürliches Lymphotoxin Anzahl der Mäuse Sarcoma Nekrose Bewertung Behandlung Puffer 1 Kontrolle Lymphoblastoides Lymphotoxin, 25.000 Einheiten Lymphoblastoides Lymphotoxin, 10.000 Einheiten Rekombinantes Lymphotoxin, 200.000 Einheiten Rekombinantes Lymphotoxin, 25.000 Einheiten Rekombinantes Lymphotoxin, 10.000 Einheiten Puffer 2 Kontrolle
Lymphoblastoides Lymphotoxin wurde gelöst in Puffer 1 (0,01 M Tris-HCl, 0,05 M (NH&sub4;)&sub2;HCO&sub3;, pH 8,0) injiziert und rekombinantes Lymphotoxin wurde in Puffer 2 (0,15 M NaCl, 0,1 M Natriumacetat und 0,1 M Tris-HCl, pH 7,8) gelöst injiziert.
Das Fehlen von Kohlehydrat im rekombinanten Lymphotoxin scheint die biologische Aktivität nicht zu beeinflussen, da die spezifische Aktivität von durch rekombinante Kulturen produziertem Lymphotoxin (2-10·10&sup7; Einheiten/mg) etwa jener entspricht, die für lymphoblastoides Lymphotoxin berichtet wird (4·10&sup7; Einheiten/mg).
Die Aktivität von rekombinantem Lymphotoxin erwies sich auch als wärmeunbeständig ähnlich wie die von natürlichem Lymphotoxin, d. h. daß Inaktivierung in wässeriger Lösung nach 1 Stunde langem Erwärmen bei 80ºC einsetzte.

Beispiel 6

Konstruktion eines Expressionsvektors für methionylhistidylamino-terminales Lymphotoxin

Die Konstruktion eines Plasmids, das die Expression in E.coli von methionylhistidylamino-terminalem Lymphotoxin steuert, ist in Fig. 3 dargestellt. Ein synthetisches Oligonukleotid wurde in das Expressionsplasmid so eingefügt, daß es für einen Initiator-Methioninkodon angrenzend an den Histidylkodon von histidylamino-terminalem Lymphtotoxin kodierte (Rest 24 in Fig. 2a). Dies wurde durchgeführt, indem ein 4630 bp Vektorfragment von pLTtrp1 durch XbaI und ClaI Digestion, präparative Elektrophorese mit 1-%-igem Agarosegel und Elektroelution isoliert wurde. Ein 570 bp BamHI-ClaI Fragment, das den Großteil der Lymphotoxinkodierungssequenz enthielt, wurde ebenfalls auf die gleiche Weise aus pLTtrp1 isoliert. Zwei synthetische Oligonukleotide wurden nach vorstehend beschriebenen Verfahren synthetisch hergestellt und mit den Oligonukleotiden 6, 7, 52 und 53 nach Fig. 1a vermischt. Etwa 50 pmol jedes Oligonukleotids wurden mit Polynukleotidkinase wie in Beispiel 1 beschrieben behandelt. Die Oligonukleotide wurden verschmolzen und dann mit einer Mischung des 570 bp BamHI-ClaI-Fragments und des 4630 bp Xbal-ClaI-Vektorfragments ligiert. Die Ligierungsmischung wurde in E.coli ATCC 31446 transformiert und die Rekombinanten wurden auf der Basis von Tetracyclinresistenz ausgewählt. Plasmid p20KLT wurde aus einem der Transformanten gewonnen. Plasmid p20KLT wurde mittels Restriktionsenzymund DNA-Sequenz-Analyse gekennzeichnet.

Beispiel 7

Herstellung einer Verschmelzungsvariante von zytotoxischem Lymphotoxin

Ein Plasmid, das eine DNA enthielt, die für eine Verschmelzung von Lymphotoxin mit einem bakteriellen Protein kodierte, wurde durch Klonieren einer Sequenz konstruiert, die für eine bakterielle Signalsequenz angrenzend an das strukturelle Gen für Lymphotoxin kodierte. Die Sequenz des Gens für das wärmebeständige Enterotoxin II (STII) von E.coli war bereits gekennzeichnet (R.N. Picken et al., 1983, "Infection and Immunity" 42 : 269-275) und kodiert für eine 23 Aminosäuren-Signalsequenz, die die Sekretion des STII in den periplasmischen Raum von E. coli steuert.
Das Plasmid pWM501 (Picken et al., 1983, "Infection and Immunity" 42(1):269-275) enthält das wärmebeständige Enterotoxin(STII)-Gen. Ein Abschnitt der DNA, die für das STII-Gen kodiert, wurde unter Anwendung der folgenden Schritte aus pWM501 gewonnen. pWM501 wurde mit Rsal digeriert und das 550 bp DNA Fragment wurde isoliert. Dieses Genfragment wurde an den Phagen M13mp8 ligiert (J. Messing et al. im Third Cleveland Symposium on Macromolecules: Recombinant DNA, Herausg. A. Walton, Elsevier, Amsterdam (1981) ff 143-153, der vorher mit Smal digeriert worden war. Die ligierte DNA wurde dazu verwendet, E.coli JM101 zu transformieren, einen handelsüblichen Stamm, der mit dem M13 Phagen eingesetzt wird. Es wurden klare Platten gewonnen. Das doppelstrangige M13mp8 STII Rsa Derivat wurde aus einem E.coli JM101 isoliert, der mit diesem Phagen unter Anwendung von Standardverfahren infiziert war (J.Messing et al., siehe oben). Durch Anwendung des vorstehend beschriebenen M13mp8 Subklonierungsverfahrens ist jetzt das Fragment mit etwa 550 Basenpaaren, das das STIl Leadergen enthält, durch eine Reihe von verschiedenen Restriktionsendonukleasestellen gebunden, die durch den Phagen geschaffen werden. Das Mi3mp8 STIl Rsa Derivat wurde dann mit EcoRI und Pstl digeriert und ein DNA Fragment, das etwas größer war als das 550 bp DNA-Fragment, wurde isoliert.
Das EcoRI-PstI Fragment wurde in pBR322 subkloniert. Dies wurde erzielt, indem pBR322 mit EcoRI und PstI digeriert und der Vektor isoliert wurde.
Der isolierte Vektor wurde an das EcoRI-PstI-DNA-Fragment ligiert. Diese DNA Mischung wurde zum Transformieren von E.coli ATCC 31446 verwendet und tetracyklinresistente Kolonien wurden ausgewählt. Ein Plasmid wurde aus einer resistenten E.coli Kolonie isoliert und als pSTII-partial bezeichnet.
pSTII-partial wurde mit MnlI und BamHI digeriert und ein 180 bp Fragment, das die STIl Shine-Dalgarno Sequenz, die STII Signalsequenz und die ersten 30 Kodone des reifen STII Gens enthielt, wurde isoliert. Das 180 bp DNA Fragment wurde an ein den trp Promotor enthaltendes Plasmid ligiert. Ein solches Plasmid, pHGH207-1, war vorbeschrieben (H. de Boer et al., 1982 in "Promoters: Structure and Function, Herausg. R. Rodreguez et al, Chamberlin, Praeger Verl., New York, NY, ff 462-481). Ein Derivat dieses Plasmids, pHGH207-1*, worin die EcoRI Stelle 5' zum trp Promotor zu EcoRl* durch Auffüllen mit DNA Polymerase I (DNA pol I) und Aneinanderfügen der stumpfen Enden mittels Ligieren umgewandelt worden war (S. Cabilly et al., 1984, "Proc.Natl. Acad.Sci.USA" 81 : 3273-3277), wurde in diesem Beispiel eingesetzt. Das den trp-Promotor enthaltende Plasmid wurde mit Xbal digeriert und mit DNA pol I und allen vier dNTPs behandelt, um die hervorragende Sequenz aufzufüllen. Die DNA-Zubereitung wurde dann mit BamHl digeriert und das den Vektor enthaltende Fragment wurde isoliert. Dieses Vektorfragment wurde dann an das vorstehend isolierte 180 bp STII signalhältige DNA-Fragment ligiert. Die Ligierungsmischung wurde dazu verwendet, E.coli ATCC 31446 zu Ampicillinresistenz zu transformieren. Ein als STII-Leader bezeichnetes Plasmid wurde aus einer ampicillinresistenten Kolonie isoliert.
Ein M13 Phage, der für STII kodierende Sequenzen enthielt, wurde zuerst konstruiert, indem das 180 bp XbaI-BamHI Fragment des pSTII-Leaders in mit XbaI und BamHI digeriertes M13mp10 ligiert wurde. Die entstandene Phagen-DNA, pSTII-shuttle, wurde durch Restriktionsendonuklease-Analyse und Nukleotidsequenzierung gekennzeichnet. Für LT kodierende Sequenzen wurden dann in diesen Vektor eingebracht, indem das HpaI-EcoRI 700 bp Fragment von pLTtrp1 in mit SmaI-EcoRI digeriertes pSTII-shuttle in DNA replikativer Form (RF, doppelstrangig) ligiert wurde; die Smal und Hpal Stellen sind beide stumpfendig und zusammen ligiert (was zum Verlust beider Stellen führt). Die entstandene Phagen-DNA, M13-STII-LT, wurde gekennzeichnet und dann wie folgt für die Mutagenese eingesetzt: der Primer 5'pCAAATGCCTATGCACTGCCAGGCGTAGG wurde kinasiert und mit der Schablone (M13-STII-LT) in Gegenwart von Ligasepuffer und mit XbaI-EcoRI digerierter M13mp10 RF DNA vermischt (um das Primen der DNA wie von J.P. Adelman et al., 1983, in "DNA" 2 : 183-193 berichtet, zu fördern); die Mischung wurde auf 95ºC erwärmt und dann bei Raumtemperatur 30 Minuten lang verschmelzen gelassen und darauf 30 Minuten auf Eis gelegt. Alle vier Desoxynukleotidtriphosphate wurden dann zusammen mit ATP, T4 DNA Ligase und dem großen Fragment (Klenow) von E.coli DNA Polymerase I zugegeben. Die Mischung wurde 1 Stunde lang bei 14ºC inkubiert und dann zum Transfizieren von kompetentem E.coli JM101, einem handelsüblichen Stamm, oder einem beliebigen anderen M13 Phagen-Wirt verwendet. Richtig mutagenierte Phagen wurden durch Hybridisierungs-Screenen unter Verwendung des ³²p-radiomarkierten Primers als Sonde identifiziert. Der entstandene Phage ST-LT-mut wurde durch DNA-Sequenzanalyse gekennzeichnet. DNA in replikativer Form wurde aus diesem Phagen hergestellt und zum Isolieren eines 761 bp XbaI-EcoRI Fragments verwendet, das DNA für die STII Signalsequenz angrenzend an die Kodierungssequenz von leucylaminoterminalem Lymphotoxin enthielt. Diese DNA wurde mit mit XbaI-BamHI digeriertem p20KLT (dem großen 4285 bp Vektorfragment) und dem 375 bp EcoRI-BamHI Fragment von pBR322 ligiert. Das entstandene Plasmid, pST18LT, wurde durch Restriktionsmappen und DNA- Sequenzieren gekennzeichnet. Eine ähnliche Konstruktion wurde hergestellt, die für eine Verschmelzung des STII Signals amino-terminal zum Histidinrest von histidylamino-terminalem Lymphotoxin kodierte. Die entstandenen Plasmide wurden in E.coli ATCC 31446 transformiert. Plasmide pSTLT18 und pSTLT16 wurden gewonnen. Durch Restriktionsenzymanalyse und Didesoxysequenzieren wurde bestätigt, daß sie für die STII Verschmelzung kodierten . E.coli transformiert mit Plasmiden pSTLT18 oder pSTLT16 erzeugt synthetisch STII Signalsequenzverschmelzungen mit leucylamino-terminalem und histidylamino-terminalem Lymphotoxin, die mittels Gel-Elektrophorese als mit den berechneten Molekulargewichten übereinstimmend nachgewiesen wurden. Die diese Verschmelzungsproteine enthaltenden E.coli Lysate wiesen zytotoxische Aktivität auf.

Beispiel 8

Verfahren zur Herstellung von monoklonalem Mäuse-Antikörper, der fähig ist, Lymphotoxin zu neutralisieren

Nach Beispiel 1 erhaltenes, gereinigtes, lymphoblastoides Lymphotoxin wurde gegen phosphatgepufferte Salzlösung (PBS) dialysiert. 200 ug Lymphotoxin/ml waren im Dialysat enthalten. Dem Dialysat wurde Glutaraldehyd auf eine Konzentration von 70 mM Glutaraldehyd zugegeben und die Mischung wurde 2 Stunden lang bei Raumtemperatur inkubiert, dann wurde weiteres Glutaraldehyd zugegeben, um die gesamte Konzentration auf 140 mM zu bringen, die Inkubation wurde weitere 6 Stunden lang fortgesetzt und die Mischung daraufhin gegen PBS dialysiert. 50 ug des mit Glutaraldehyd vernetzten Lymphotoxins, (das in der Folge als "Polylymphotoxin" bezeichnet wird), und 0,5 ml Freunds vollständiges Adjuvans wurden subkutan in Mäuse des Stammes BALB/c injiziert. Nach einer Woche wurden die Mäuse mit 50 ug Polylymphotoxin und 0,5 ml Freunds unvollständigem Adjuvans halb intramuskulär und halb in die Bauchhöhle verabreicht booster-immunisiert. Das Serum wurde nach 7 Tagen geerntet und mittels ELISA-Analyse in bezug auf anti-Lymphotoxinaktivität analysiert.
Die ELISA-Analyse wurde wie folgt durchgeführt: Eine gepufferte Lösung von gereinigtem Lymphotoxin wurde in Mikrotiternäpfe eingebracht und die Näpfe wurden jeweils mit etwa 100 ng Lymphotoxin beschichten gelassen. Die nicht adsorbierte Lymphotoxinlösung wurde von den Näpfen abgesaugt. 50 ul von entsprechend verdünnten Testproben wurden mit 100 ul PBS, das 5 mg/ml Rinderserumalbumin (PBS-BSA-Puffer) enthielt, kombiniert und jedem Napf zugegeben, 2 Stunden lang bei Raumtemperatur inkubiert, mit 0,05% Tween 20 enthaltendem PBS gewaschen, 100 ul mit Meerrettichperoxidase markiertes Ziegen-anti-Maus-IgG in PBS-BSA Puffer wurden jedem Napf zugegeben und 1 Stunde lang inkubiert. Jeder Napf wurde mit 0,05% Tween 20 enthaltendem PBS und dann mit Zitratphosphatpuffer, pH 5, mit einem Gehalt von 0,1 mg o-Phenylendiamin/ml (Substratlösung) gewaschen und wässeriger 30-%-iger H&sub2;O&sub2; (in einem Mengenverhältnis von 4 ul 30-%-igem v/v H&sub2;O&sub2; pro 10 ml Substratlösung) wurde jedem Napf zugegeben. Die Näpfe wurden 30 Minuten lang inkubiert, die Reaktion wurde mit 50 ul 2,5 M Schwefelsäure abgebrochen und die dekadische Extinktion wurde bei 492 nm gemessen. Näpfe, die eine dekadische Extinktion von mehr als 1 o.D.- zeigten, wurden als anti-Lymphotoxin-positiv angesehen.
Die Testproben wurden auch in einer Analyse mit Mäuse-L929 in bezug auf die Fähigkeit analysiert, die zytolytische Aktivität von Lymphotoxin zu neutralisieren. Serum, das von immunisierten Tieren oder Hybridoma-Überständen geerntet wurde, wurde nach Bedarf in RPMI-1640 Medium verdünnt, das 10-%-iges fötales Rinderserum und etwa 100 Lymphotoxineinheiten/ml enthielt, und in Mikrotiternäpfe plattiert, die kultivierte L929-Zellen enthielten, wie es ansonsten bei der Zytolyseanalyse herkömmlich ist. Bei der Kontrolle waren alle Zellen lysiert. Der neutralisierende Antikörper wurde durch die Unfähigkeit des Lymphotoxins nachgewiesen, die L929-Zellen zu lysieren.
Das mit mit Glutaraldehyd polymerisiertem Lymphotoxin immunisierte Tier bildete Antikörper, die aktiv bei der ELISA-Analyse waren, es wurde jedoch keine serumneutralisierende Aktivität nachgewiesen. Es wurde eine Suspension mit einem Gehalt von 100 ug Lymphotoxin und 1 ml einer 1,64-%-igen w/v Suspension von Aluminiumhydroxid (Al(OH)&sub3;)) hergestellt und zum Immunisieren der gleichen Maus verwendet. Der Maus wurden 100 ul der Suspension intramuskulär und 400 ul intraperitoneal injiziert. Nach einer Woche wurden der Maus 10 ug unpolymerisiertes und unadsorbiertes, lymphoblastoides Lymphotoxin in 100 ul PBS intravenös injiziert. Eine Untersuchung einer 1/80 Verdünnung des Serums des Tieres nach drei Tagen zeigte die Gegenwart von Lymphotoxin neutralisierendem Antikörper an.
Die Milz dieses Tieres wurde geerntet. 3·10&sup7; Milzzellen wurden mit 5·10&sup7; Mäusemyelomazellen verschmolzen und in Mikrotiternäpfe, die HAT-Medium enthielten, und etwa 3000 peritoneale Makrophagen/Mikrotiternäpfe nach dem Verfahren von S. Fazekas De St. Groth, 1980, "J.lmmunol.Meth." 35 : 1- 21 plattiert. Hybridoma aus Näpfen, die Überstände enthielten, die bei der vorstehend beschriebenen ELISA-Analyse positiv waren, wurden in 1 ml Volumen DMEM Medium mit 20% fötalem Kalbsserum, 10% NCTC-135 Medium, 5 · 10&supmin;&sup5; M Beta-Mercaptoäthanol und HAT kulviert, in Mikrotiternäpfe mit einem statistischen Durchschnitt von einer Zelle pro Napf verteilt und dann in 1 oder 5 ml Volumen des gleichen Mediums kultiviert. Die Oberstände wurden dann in bezug auf neutralisierenden Antikörper analysiert. Statistisch erzeugten etwa 2% der in der ELlSA-Analyse positiven Hybridomas aus der Aluminiumhydroxid-Immunisierung neutralisierenden Antikörper. Antikörper mit hoher Affinität für Lymphotoxin wird wahlweise aus dieser Gruppe von Hybridomas ausgewählt.

Beispiel 9

Stellenspezifische Mutagenese von Lymphotoxin

In diesem Beispiel wird das in Beispiel 3 beschriebene Verfahren genau nachvollzogen, mit der Ausnahme, daß das Segment 6 des synthetischen 0ligonukleotids modifiziert wurde, um die Sequenz 5'CTCAACTCTGCACCCA3' aufzuweisen, und sein komplementärer Strang (Segment 53) modifiziert wurde, um die Sequenz 3'AGACGTGGGTCGTCGT5' aufzuweisen.
Die modifizierten 0ligonukleotide werden mit den verbleibenden 0ligonukleotiden verschmolzen und wie in Beispiel 6 beschrieben in den Expressionsvektor ligiert. Dieser Vektor enthält eine 2 bp Substitution, die den Lysin +28 Kodon von Lysin zu Histidin änderte. Der Histidinmutant wird bei Transformation von E.coli ATCC 31446 exprimiert.
Andere stellenausgerichtete Mutanten werden auf die gleiche Weise hergestellt, vorzugsweise unter solcher Auswahl von Kodonen, daß keine EcoRl Restriktionsstelle eingeführt wird, die die Verwendung eines partiellen EcoRl Restriktionsdigests bei der Digestion von pLTXB1 erfordern würde, wie sie in Beispiel 3 nötig ist. Auch sollten die Mutationen keine zusätzlichen XbaI oder BamHI Stellen in das Fragment A (siehe Fig. 1b), BamHI oder HindIII Stellen in das Fragment B oder HindIII oder BglII Stellen in das Fragment C einführen. Ansonsten ist eine partielle Digestion erforderlich, um den pLTXB1 Mutanten richtig zusammenzustellen; die vollständige Digestion würde einen Löschungsmutanten anstelle des Substitutionsmutanten ergeben, der das Ziel in diesem Fall ist.

Beispiel 10

Identifizierung von für Mäuse- und Rinder-Lymphotoxin kodierender genomer DNA; Aminosäuresequenz von Mäuse- und Rinder-Lymphotoxin

Die Mäuse- und Rinder-Lymphotoxingene wurden aus genom- λ Sammlungen isoliert. Das menschliche Lymphotoxin cDNA Fragment (Pvull-EcoRl, 600 bp) wurde mit ³²p mittels NlCK-Translation radiomarkiert und als Sonde zum Screenen einer mäusegenomen DNA- λ Sammlung (M600 Stamm mäusegenomer DNA in λ Charon4A, T. Maniatis et al., Molecular Cloning, S. 31, 1982) und unabhängig davon einer rindergenomen DNA Sammlung (EP 88622A) verwendet. Die Hybridisierung wurde unter milden Bedingungen in 20- %igem Formamid durchgeführt (Gray und Goeddel "P.N.A.S. USA" 80 : 5842-5846 (1983) und die Filter wurden zweimal in einer wässerigen Lösung von 0,3 M Natriumchlorid, 0,03 M Natriumzitrat und 0,1% SDS gewaschen. Mehrere Phagen, die mit der menschlichen Lymphotoxinsonde hybridisierten, wurden plattengereinigt (T. Maniatis et al., "Cell",15 : 687-701 (1978)). Phagen DNA wurde hergestellt (T. Maniatis et al., "Cell" 15: 687-701 (1978), mit Restriktionsendonuklease digeriert und mittels Southern-Hybridisierung analysiert. Ein 3500 bp EcoRI Mäuse-DNA Fragment und ein 2200 bp EcoRI Rinder-DNA Fragment wurden jeweils mit der Sonde aus Humanlymphotoxin hybridisiert. Diese DNA-Fragmente wurden in Plasmid pBR322 subkloniert und dann nach dem Didesoxy-Kettenabbruchverfahren sequenziert (A.J.H. Smith, Methods in Enzymology 65 : 560-580 (1980)). Die abgeleitete Proteinsequenz von Mäuse- und Rinder-Lymphotoxin, zusammen mit der von Human-Lymphotoxin zum Vergleich, ist in Fig. 4 dargestellt.

Beispiel 11

Expression von Lymphotoxin in Hefe unter der Steuerung des ADH Promotors

Plasmid pLTtrp1 wird mit Xba1 digeriert, um das Plasmid an der Xba1 Stelle knapp proximal zum Lymphotoxin-Ausgangskodon zu öffnen. Die XbaI klebrigen Termini werden durch das Klenow-Fragment von E.coli DNA-Polymerase I mit 4 dNTPs abgestumpft. Ein EcoRI Adapter
wird an das abgestumpfte Plasmidfragment ligiert, die hervorragenden 5'-Hydroxyltermini werden unter Verwendung von Polynukleotidkinase phosphoryliert, die Ligierungsmischung wird dazu verwendet, E.coli ATCC 31446 zu transformieren und mittels Restriktionsanalyse wird ein Plasmid pLTtrp1R1 identifiziert, das eine zusätzliche EcoR1 Stelle proximal zum Lymphotoxin-Ausgangskodon enthält. Plasmid pLTtrp1R1 wird isoliert, mit EcoR1 digeriert und das die Lymphotoxin-DNA enthaltende Fragment SP wird gewonnen.
Plasmid pFRPn (EP 60.057A) wird mit EcoR1 digeriert, mit alkalischer Phosphatase behandelt, um die Rezirkularisierung zu verhindern, an das SP Lymphotoxinfragment unter Verwendung von T4 DNA-Ligase ligiert und die Ligierungsmischung wird dann zum Transformieren von E.coli ATCC 31446 verwendet. Ampicillinresistente Kolonien ergeben zwei Reihen von Plasmiden mit der SP-Einfügung in entgegengesetzten Ausrichtungen, wie durch Restriktionsanalyse an Elektrophorese-Agarosegelen festgestellt wurde. Die Plasmide werden aus E.coli Transformanten gereinigt und zur Transformation von Hefe verwendet, die die trp1 Mutation (z. B. Hefestamm RH218, unbeschränkte ATCC Hinterlegungsnummer 44076) zum trp + Phänotyp aufwies. Es wurde gefunden, daß Plasmide, die so ausgerichtet sind, daß der Ausgangskodon des Segments SP angrenzend an das Alkoholdehydrogenasepromotor-Fragment gelegen ist, die Hefe zur Lymphotoxin-Expression transformieren. Lymphotoxin wird aus Extrakten der Hefetransformanten gewonnen. Die Plasmidstabilität bei Fermentationen im industriellen Maßstab kann durch Verwendung eines Expressionsplasmids verbessert werden, das den 2 -u Replikationsursprung anstelle des pFRPn chromosomalen Replikationsursprungs (ars 1) und einen kompatiblen Wirtsstamm enthält (J. Beggs, 1978, "Nature" 275 : 104-109).

Beispiel 12

Expression von Lymphotoxin in Säugetierzellen

λLT11 (Beispiel 2) wird mit EcoRl digeriert und das Lymphotoxin enthaltende DNA Fragment (das Umkehrtranskript) wird gewonnen. Plasmid pEHER (EP 117.060A) wird mit EcoRI digeriert, mit Kalbsdarm-alkalischer Phosphatase behandelt und an das Eco-RI-gebundene Umkehrtranskript von λLT11 ligiert. Die entstandenen Plasmide wachsen auf E.coli ATCC 31446 (EP 117.060A) und wurden als pEHERLT I und pEHERLT II bezeichnet. Sie enthielten die Lymphotoxin-DNA in entgegengesetzten Orientierungen, was durch Restriktionsanalyse an Polyacrylamidgelen nachgewiesen wurde. Diese Plasmide werden dazu verwendet, CHO DHFR-DUX-B11-, CHO 1 und Ltk&supmin;-Zellen zu transfizieren und auszuwählen.
Gewebekulturzellen werden transfiziert, indem 1 ug wie vorstehend beschrieben erhaltenes pEHERLT I oder pEHERLT II mit 10 ug Ratten-Träger- DNA in einem Volumen von 250 ul, 0,25 M CaCl&sub2;, vermischt wird, gefolgt von Zutropfen von 250 ul mit HEPES gepufferter Salzlösung (280 mM NaCl, 1,5 mM Na&sub2;PO&sub4;, 50 mM HEPES, pH 7,1). Nach 30 Minuten bei Raumtemperatur wird die Lösung Gewebekulturzellen zugegeben, die in Kunststoffgewebekulturschalen mit einem Durchmesser von 60 mm gezüchtet werden. Es werden CH0 1, CH0 DHFR-DUX-BII-, und Ltk&supmin;Zellen verwendet. Die Schalen enthalten 3 ml für die Wirtszelle geeignetes Kulturmedium.
Für CHO 1 und CHO DHFR-DUX-B11-Zellen ist das Medium Ham F-12 Medium (Gibco) ergänzt mit 10-%-igem Kalbsserum, 100 u/ml Penicillin, 100 ug/ml Streptomycin und 2 umM L-Glutamin. Für die Ltk&supmin;Zellenlinie ist das Medium wie vorstehend beschrieben ergänztes Dulbecco-modifiziertes Eagle's Medium.
Nach 3-16 Stunden wird das Medium entfernt und die Zellen werden mit 20-%-igem Glyzerin in phosphatgepufferter Salzlösung gewaschen. Jeder Platte wird frisches Medium zugegeben und die Zellen werden zwei weitere Tage lang inkubiert.
Die Auswahl der transfizierten Wirtszellen wird durch Trypsinierung der Zellen nach zwei Tage langem Wachstum durchgeführt (das Behandlung der Zellen mit sterilem Trypsin 0,5 mg/ml enthaltend 0,2 mg/ml EDTA umfaßt) und Zugabe von etwa 3·10&sup5; Zellen zu 10 mm Gewebekulturplatten mit selektivem Medium durchgeführt. Für dhfr-Zellen ist das Medium eine Formulierung von (F-12 GIBCO) Medium, dem Glycin, Hypoxanthin und Thymidin fehlt (GHT- Medium). Für DHFR&supmin;Wirtszellen werden dem normalen Wachstumsmedium 100-1.000 nM Methotrexat zugegeben. Kontrollversuche werden unter Transfektionsbedingungen durchgeführt, bei denen kein Plasmid und pFD-11 (EP 117.060A) enthaltendes Plasmid mit normalem DHFR verwendet wird. Innerhalb von 1-2 Wochen zeigen sich Kolonien aus Zellen, die das DHFR-Plasmid aufnehmen und exprimieren. Es werden Transformanten identifiziert, die reifes Lymphotoxin exprimieren.

Claims

1. Rekombinantes Nukleinsäurekonstrukt, umfassend:

(i) für Lymphotoxin kodierende Nukleinsäure, wie in Fig. 2A hierin dargestellt, oder

(ii) Nukleinsäure, wie durch Hybridisierung mit der in Fig. 2A hierin dargestellten erhältlich, und die für ein Lymphotoxinpolypeptid kodiert; oder

(iii) Nukleinsäure, die für ein Lymphotoxinpolypeptid kodiert, das im wesentlichen Strukturhomologie mit zumindest einem Abschnitt der in Fig. 2A hierin dargestellten Lymphotoxinaminosäuresequenz aufweist;

wobei das genannte Lymphotoxinpolypeptid in (ii) oder (iii) bevorzugte zytotoxische Aktivität von und/oder immunologische Kreuzreaktivität mit und/oder Fähigkeit zum Wettbewerb um Lymphotoxinzell-0berflächenrezeptoren mit zytotoxischem Lymphotoxin zeigt.

2. Rekombinantes Nukleinsäurekonstrukt nach Anspruch 1, worin die genannte kodierende Nukleinsäure frei von jeder untranslatierten intervenierenden Sequenz (Intron) ist.

3. Rekombinantes Nukleinsäurekonstrukt nach Anspruch 2, worin die genannte kodierende Nukleinsäure durch cDNA gebildet wird.

4. Rekombinantes Nukleinsäurekonstrukt nach einem der Ansprüche 1, 2 oder 3, worin die Lymphotoxinaminosäuresequenz, für die kodiert wird, sich von der von Fig. 2A durch Aminosäurelöschung, -substitution oder -einfügung unterscheidet.

5. Rekombinantes Nukleinsäurekonstrukt nach einem der Ansprüche 1-4, worin die genannte Nukleinsäure für Leucylamino-terminales Lymphotoxin kodiert.

6. Rekombinantes Nukleinsäurekonstrukt nach einem der Ansprüche 1-5, worin die genannte Nukleinsäure für ein menschliches Allel der Sequenz aus Fig. 2A kodiert.

7. Rekombinantes Nukleinsäurekonstrukt nach einem der Ansprüche 1-5, worin die Nukleinsäure für ein nicht-menschliches Tierlymphotoxin kodiert.

8. Rekombinantes Nukleinsäurekonstrukt nach Anspruch 7, worin das Tierlymphotoxin vom Rind stammt.

9. Rekombinantes Nukleinsäurekonstrukt nach Anspruch 5, worin die Nukleinsäure für zumindest einen Aminosäurerest zusätzlich zu Lymphotoxin kodiert.

10. Rekombinantes Nukleinsäurekonstrukt nach Anspruch 9, worin die genannte Nukleinsäure für eine Verschmelzung eines Polypeptids mit dem Carboxylterminus von Lymphotoxin kodiert.

11. Rekombinantes Nukleinsäurekonstrukt nach Anspruch 10, worin das genannte Polypeptid über eine proteolytische Enzymhydrolysestelle mit einem Lymphotoxin verschmolzen ist.

12. Rekombinantes Nukleinsäurekonstrukt nach Anspruch 11, worin die genannte Stelle lys-lys oder lys-arg umfaßt.

13. Rekombinantes Nukleinsäurekonstrukt nach einem der Ansprüche 10 bis 12, worin das kodierte Verschmelzungsprodukt vor der proteolytischen Hydrolyse zytolytisch inaktiv ist.

14. Rekombinantes Nukleinsäurekonstrukt nach Anspruch 4, worin die genannte kodierende Nukleinsäure für eine Verschmelzung eines bakteriellen Sekrektionsleaders mit dem Lymphotoxinpolypeptid kodiert.

15. Rekombinantes Nukleinsäurekonstrukt nach Anspruch 9, das Nukleinsäure umfaßt, die für ein mit leu +171 verschmolzenes hydrophobes Di- oder Tripeptid kodiert.

16. Rekombinantes Nukleinsäurekonstrukt nach Anspruch 9, worin die kodierende Nukleinsäure Kodone für ala-lys umfaßt, die zwischen gly +127 und pro +128 eingefügt sind.

17. Rekombinantes Nukleinsäurekonstrukt nach Anspruch 9, worin die kodierende Nukleinsaure ein Kodon für einen hydrophoben Aminosäurerest umfaßt, der zwischen thr +163 und val +164 eingefügt ist.

18. Rekombinantes Nukleinsäurekonstrukt nach Anspruch 4, worin für die Reste -34 bis -1 innerhalb von Fig. 2A kodierende Nukleinsäure durch das Kodon für Methionyl oder Formylmethionyl substituiert worden ist.

19. Rekombinantes Nukleinsäurekonstrukt nach Anspruch 4, worin für die Reste -34 bis +22 innerhalb von Fig. 2A kodierende Nukleinsäure durch das Kodon für Methionyl oder Formylmethionyl substituiert worden ist.

20. Rekombinantes Nukleinsäurekonstrukt nach Anspruch 4, worin für die Reste

-34 bis -1 kodierende Nukleinsäure gelöscht worden ist, und die verbleibende Kodierungssequenz eine beliebige der folgenden Substitutionen enthält:

(a) Lysyl + 89 substituiert durch Histidyl,

(b) Alanyl + 168 substituiert durch Valyl, Isoleucyl oder Leucyl;

(c) Threonyl + 163 substituiert durch Tyrosyl;

(d) Seryl + 82 substituiert durch Lysyl;

(e) Seryl + 42 substituiert durch Isoleucyl, Leucyl, Phenylalanyl, Valyl oder Histidyl;

(f) Lysyl +84 substituiert durch Glytamyl, Tryptophanyl, Seryl oder Histidyl;

(g) Threonyl +163 substituiert durch Aspartyl oder Lysyl;

(h) Seryl +70 substituiert durch Lysyl oder Glycyl;

(i) Threonyl +69 substituiert durch Tyrosyl;

(j) Lysyl +28 substituiert durch Arginyl oder Histidyl;

(k) Histidyl +32 substituiert durch Arginyl oder Lysyl;

(1) Aspartyl +36 substituiert durch Prolyl, Seryl, Threonyl, Tyrosyl oder Glutamyl;

(m) Seryl +38 substituiert durch Tyrosyl, Methionyl oder Glutamyl;

(n) Seryl +61 substituiert durch Threonyl, Tyrosyl, Histidyl oder Lysyl;

(o) Glycyl +124 substituiert durch Aspartyl, Seryl oder Tyrosyl;

(p) Histidyl +135 substituiert durch Arginyl, Lysyl, Tyrosyl, Tryptophanyl oder Prolyl;

(q) Threonyl +142 substituiert durch Aspartyl; oder

(r) Glutamyl +146 substituiert durch Lysyl oder Threonyl.

21. Rekombinantes Nukleinsäurekonstrukt nach Anspruch 4, worin die Nukleinsäure für ein Hybrid-Tier-Mensch-Lymphotoxin kodiert.

22. Rekombinantes Nukleinsäurekonstrukt nach Anspruch 21, worin die Kodone für die Methionylreste +20, +120 und +133 jeweils durch diejenigen für Threonyl-, Seryl- und Valylreste substituiert sind.

23. Rekombinantes Nukleinsäurekonstrukt nach Anspruch 4, worin das Lymphotoxinpolypeptid, für das die Nukleinsäure kodiert, ein Tumornekrosefaktorfragment enthält.

24. Rekombinantes Nukleinsäurekonstrukt nach Anspruch 23, worin die Nukleinsäure, die für die ersten 27, 26 oder 25 aminoterminalen Reste von Leucylaminoterminallymphotoxin kodiert, jeweils durch Nukleinsäure substituiert sind, die für ein Polypeptid kodiert, das aus

Val-arg-ser-ser-ser-arg-thr-pro-ser-asp-;

val-arg-ser-ser-ser-arg-thr-pro-ser-; oder

val-arg-ser-ser-ser-arg-thr-pro

ausgewählt ist.

25. Rekombinantes Nukleinsäurekonstrukt nach Anspruch 4, worin das kodierte Lymphotoxin eine Substitution eines einzelnen Aminosäurerestes enthält.

26. Rekombinantes Nukleinsäurekonstrukt nach Anspruch 4, worin das kodierte Lymphotoxin eine einzelne Löschung aus von 1 bis etwa 30 Aminosäureresten enthält.

27. Rekombinantes Nukleinsäurekonstrukt nach Anspruch 4, worin das kodierte Lymphotoxin eine Einfügung aus einem einzelnen Aminosäurerest enthält.

28. Rekombinantes Nukleinsäurekonstrukt nach Anspruch 4, worin die Substitution, Löschung oder Einfügung innerhalb von etwa 30 Resten von Leucyl +1 vorliegt.

29. Rekombinantes Nukleinsäurekonstrukt nach Anspruch 4, worin das kodierte Lymphotoxin eine vorbestimmte Aminosäurerestsubstitution innerhalb von 25 Resten von der carboxyterminalen Aminosäure enthält.

30. Rekombinantes Nukleinsäurekonstrukt nach Anspruch 4, worin die Substitution eine Substitution eines Restes aus der Klasse neutraler, saurer oder basischer Aminosäurereste für einen Rest ist, der nicht der Klasse angehört, zu der die substituierte Aminosäure gehört.

31. Rekombinantes Nukleinsäurekonstrukt nach Anspruch 4, worin das kodierte Lymphotoxin zytotoxisch ist.

32. Rekombinantes Nukleinsäurekonstrukt nach einem der vorhergehenden Ansprüche in der Form eines replizierbaren Vektors.

33. Vektor nach Anspruch 32, der in Prokaryoten replizierbar ist.

34. Vektor nach Anspruch 32, der in Eukaryoten replizierbar ist.

35. Vektor nach Anspruch 33,der zusätzlich einen bakteriellen Promotor umfaßt, der operabel mit der genannten kodierenden Nukleinsäure verbunden ist.

36. Zelle, die mit der Nukleinsäure oder dem Vektor nach einem der vorhergehenden Ansprüche transformiert ist.

37. Zelle nach Anspruch 36, die ein Prokaryot ist.

38. Zelle nach Anspruch 36 oder 37, worin die genannte kodierende Nukleinsäure darin exprimierbar ist.

39. Verfahren, welches das Kultivieren der Zelle nach Anspruch 37 oder 38, das Ansammelnlassen von Lymphotoxin in der Kultur und das Gewinnen des Lymphotoxins aus der Kultur umfaßt.

40. Verfahren nach Anspruch 39, worin die Zelle eine Hefe- oder eine nicht-menschliche Säugetierzelle ist, die genannte Nukleinsäure für menschliches Prälymphotoxin kodiert und Lymphotoxin, das bezogen auf in homologen Zellen erzeugtes Lymphotoxin Variantenglykosylierung aufweist, aus der Kultur gewonnen wird.

41. Verfahren nach Anspruch 39, worin die Zelle ein Prokaryot ist.

42. Polypeptid wie nach dem Verfahren nach einem der Ansprüche 39 bis 41 erhältlich, das nicht glykosyliert ist oder bezogen auf in homologen Zellen erzeugtes Lymphotoxin Variantenglykosylierung aufweist, und das bevorzugte zytotoxische Aktivität von zytotoxischem Lymphotoxin und/oder die Fähigkeit aufweist, mit zytotoxischem Lymphotoxin um Lymphotoxinzel loberflächenrezeptoren zu konkurrieren.

43. Polypeptid wie nach dem Verfahren nach einem der Ansprüche 39 bis 41 erhältlich, das unglykosyliert ist oder bezogen auf in homologen Zellen erzeugtes Lymphotoxin Variantenglykosylierung aufweist, und das eine Aminosäuresequenz aufweist, die sich von der in Fig. 2A hierin gezeigten aufgrund von Aminosäurelöschung, -substitution oder -einfügung unterscheidet.

44. Polypeptid nach Anspruch 42 oder 43 zur pharmazeutischen Verwendung.

45. Verfahren das, nach dem Verfahren nach einem der Ansprüche 39 bis 41, die Verwendung des Polypeptidexpressionsprodukts bei der Herstellung eines Medikaments umfaßt.

46. Diagnose- oder Screeningsonde für Lymphotoxinnukleinsäure, die Nukleinsäure umfaßt, die mit der in Fig. 2A hierin gezeigten Nukleinsäure hybridisierbar ist und kovalent mit einer nachweisbaren Substanz markiert ist.

47. Polypeptid wie nach dem Verfahren nach einem der Ansprüche 39 bis 41 erhältlich, das unglykosyliert ist oder bezogen auf in homologen Zellen erzeugtes Lymphotoxin Variantenglykosylierung aufweist, in Glutaraldehyd-polymerisierter Form oder in der Form eines Adsorptionskomplexes mit Alaun.