DE3587465T2

DE3587465T2 - Vielfache Drogen-Resistenz in Säugetierzellinien und Isolierung der determinanten Glykoprotein-DNS.

Info

Publication number: DE3587465T2
Application number: DE85306331T
Authority: DE
Inventors: John R Riordan
Original assignee: Hsc Research Development Corp
Current assignee: Hsc Research Development Corp
Priority date: 1984-09-10
Filing date: 1985-09-05
Publication date: 1994-01-20
Anticipated expiration: 2005-09-06
Also published as: DE3587465D1; US4912039A; EP0174810A3; EP0174810B1; EP0174810A2

Description

Die Erfindung betrifft lebende eucaryotische Zellen, die eine Resistenz gegenüber solchen Drogen entwickeln, die ihnen gegenüber normalerweise giftig sind, und insbesondere die Determinante von Drogen-Resistenz lebender Zellen und die nukleische Säuren-Sequenz, die für die Protein-Determinante encodiert.
Es ist bekannt, daß Brust-Zellen gegenüber Drogen eine Resistenz entwickeln. Dies wurde auf dem Gebiet der Krebsforschung entdeckt, wo Krebszellen gegenüber in der Chemotherapie angewendeten Drogen eine Resistenz entwickeln. Diese Resistenz verhindert die Effektivität von Drogen, die in der Chemotherapie zur Ausschaltung oder Verringerung der Vermehrung von Krebszellen angewendet werden. Wie kürzlich in Science, Band 221, Seiten 1285-1288, September 1983 berichtet wird, gibt es Hamster-, Mäuse- und menschliche Tumor-Zellinien, die eine Vielfach- Drogen-Resistenz zeigen. Es wurde entdeckt, daß ein erhöhter Ausdruck eines 170.000-Dalton-Oberflächen-Antigens besteht, der mit der Vielfach-Drogen-Resistenz, wie sie in der Zellenhaut gefunden wird, korreliert ist. Dieses Antigen wurde isoliert und kann als ein P-Glykoprotein verstanden werden.
Eine Vielfach-Drogen-Resistenz (MDR = Multi-drug-resistance) ist der Phenotyp, der durch Brust-Zellen-Mutanten auftritt, die für eine Resistenz gegenüber einer bestimmten Anti-Krebsdroge besonders ausgewählt wurden, aber ebenso eine Resistenz gegenüber einem breiten Spektrum von anderen Krebsdrogen entwickeln, die unterschiedliche chemische Zusammensetzungen und Wirkungen haben. Zellen von diesem Phenotyp enthalten reduzierte intrazellulare Drogenpegel als offensichtlicher Vorgang der Resistenz. Bezogen auf diese veränderte Drogen-Transport- Funktion enthalten die Plasma-Häute dieser Zellen erhöhte Beträge von Polypeptid, das insbesondere als P-Glykoprotein bezeichnet wird.
Eine Veröffentlichung von Roninson I.B. et al (1984) Nature, Band 309, Seiten 626-628 beschreibt eine klonische DNA- Sequenz, und zwar ein 170 KD-Glykoprotein, Drogen-Resistenz in CHO-Zellen vereinigt wurde. Diese Sequenz ist jedoch nicht das P-Glykoprotein der vorliegenden Erfindung.
Es war möglich, eine Vielzahl von mutanten Zellinien mit unterschiedlichen Werten der Drogen-Resistenz auszuwählen. Der Betrag des P-Glykoproteins in den Plasma-Häuten dieser unterschiedlichen Zellinien steht quantitativ im Zusammenhang mit dem Maß der Drogen-Resistenz.
Eine Über-Expression von P-Glykoprotein scheint ein beständiges und charakteristisches Merkmal des Multidrogen-Resistenz- Phenotyps zu sein.
Es wurden extensive Arbeiten durchgeführt, um zu zeigen, daß das P-Glykoprotein direkt oder indirekt das Multidrogen-Resistenz- Phenotyp vermittelt. Extensive genetische Studien wurden durchgeführt an Eierstockzellen chinesischer Hamster, wie z. B. beschrieben bei Ling V., Kartner, N., Sudo, T., Siminovitch, L. und Riordan, J.R. Cancer Treat. Rep. 67, 869-874 (1983). In diesen Studien wurde folgendes festgestellt:
(a) unabhängige Drogen-resistente Klonen, die in einem einzigen Schritt ohne Mutagenesis isoliert wurden, zeigen die Über-Expression in dem Multidrogen- Resistenz-Phenotyp und dem P-Glykoprotein;
(b) eine Auswahl für erhöhte Drogenresistenz, d. h. Colchicin, resultiert in einer Quer-Resistenz gegenüber anderen Drogen und einem erhöhten Ausdruck an P-Glykoprotein;
(c) Revertanten, die in einem einzigen Schritt für Drogen- Sensitivität zu einer in dem Multidrogen-Resistenz-Phenotyp involvierten Bindung isoliert wurden, zeigen einen Rückgang der anderen Aspekte des Phenotyps, enthaltend eine reduzierte P-Glykoprotein-Expression;
(d) Quer-Resistenz, Nebensensitivität und eine Überexpression an P-Glykoprotein werden konkordant ausgedrückt in Zellen: Zell-Hybriden.
Eine Veröffentlichung von Riordan, J. R. ture, Band 326, Seiten 817-819, die nach dem Prioritätstag der vorliegenden Anmeldung veröffentlicht wurde, beschreibt die Vermehrung von P-Glykoprotein-Genen in Multidrogen-resistenten Brust-Zellinien und zeigte, daß das P-Glykoprotein konserviert und möglicherweise durch eine Genfamilie enkodiert wird.
Der unbekannte Aspekt hinsichtlich der Isolation von P-Glykoprotein und seiner Determinanten in der Erzeugung von Multidrogen- Resistenz liegt darin, ob oder ob nicht ein Protein dieser Größe durch ein einziges Gen oder eine Genfamilie oder das Ergebnis von unabhängigen Ereignissen in den selektiven Expressionen eines Gens oder einer Genfamilie kodiert wird.
Bei einem gereinigten DNA-Molekül mit etwa 600 bp besteht die Erfindung darin, daß das DNA-Molekül aus einem Anteil von Polypeptiden von etwa 200 Aminosäuren eines P-Glykoproteins kodiert ist, das ein Gesamt-Molekulargewicht von etwa 170.000 Dalton und einen isoelektrischen Punkt von 7,4 hat, daß das DNA-Molekül DNA-Moleküle pcHp-1 und pCHp2-2 enthält, die ATCC-Zulassungszahlen 39839 bzw. 53234 haben, und daß das P-Glykoprotein eine Haupt-Determinante in einer Vielfach-Drogen-Resistenz lebender Zellen ist.
Das gereinigte DNA-Molekül kann die Form eines cDNA, mRNA oder eines DNA-Moleküls haben, das für einen Polypeptid-Anteil von ungefähr 200 Aminosäuren des P-Glykoproteins kodiert und in rekombinanter Form mit einer Bakteriophage oder einem Plasmid in rekombinanter Form enthalten sein kann. Die Phage oder das Plasmid können kloniert sein. Wenn sie in eine geeignete Gastzelle transformiert sind, kann die Gastzelle so gezüchtet werden, daß sie Polypeptid-Anteile von etwa 200 Aminosäuren des P-Glykoproteins enthält. Das DNA Molekül in Form einer Bakeriophage und/oder eines Plasmid kann als DNA-Probe mit einer auf der Phage oder dem Plasmid vorgesehenen Markierung verwendet werden.
Die Erfindung stellt auch ein Plasmid zur Verfügung, das in der beschriebenen Weise das DNA-Molekül in rekombinanter Form mit dem Plasmid enthält.
Die vorliegende Erfindung stellt außerdem eine Gastzelle zur Verfügung, die in der beschriebenen Weise ein Plasmid und einen Mikroorganismus enthält, der wiederum in der beschriebenen Weise ein Plasmid enthält.
Die vorliegende Erfindung schafft außerdem ein Verfahren zur Herstellung eines polypeptiden Teils eines P-Glykoproteins mit einem Gesamt-Molekulargewicht von etwa 170.000 Dalton, wobei ein Mikroorganismus in einem wässerigen Ernährungsstoff gezüchtet und das Polypeptid isoliert wird.
Gemäß der Erfindung ist weiterhin ein Verfahren zur Isolierung des gereinigten DNA-Moleküls in einem Plasmid in der Form von cDNA vorgesehen, bei dem ein cDNA-Verzeichnis gebildet wird, das einen bekannten Baktieriophage-Ausdruck-Vektor und mRNA verwendet, die von hoch-drogenresistenten, das P-Glykoprotein überexpressierten Zellinien gewonnen sind, wobei die rekombinanten Phage-Vektoren identifiziert werden, die eine zu einem Antikörper antigene Proteinfusion ausdrücken, die spezifisch zu dem P-Glykoprotein ist, und ein rekombinantes Plasmid aus den identifizierten Phagen gebildet wird, und ferner das Plasmid in einer verträglichen lebenden Zelle ausgedrückt wird, um einen polypeptiden Anteil zu erzeugen, und durch Anwendung des Antikörpers sichergestellt wird, daß das Polypeptid der Teil des P-Glykoproteins ist.
Bevorzugte Ausführungsbeispiele der Erfindung werden anhand der Zeichnung erläutert. Darin zeigen:
Fig. 1 die Identifikation und Isolation einer cDNA-Sequenz, die einem Teil des P-Glykoproteins entspricht, unter der Anwendung von drei monoklonalen Antikörpern. Das Schaubild A zeigt die eingefärbte Protein-Fusion mit einem Molekulargewicht von 140.000 Dalton. Das Schaubild B zeigt die Reaktivität dieser Protein-Fusion mit den Monoklonalen Ab (C219), das benutzt wurde, um die Klone und zwei weitere, für P-Glykoprotein spezifische Monoklonale zu identifizieren;
Fig. 2a eine Northern-Fleck-Analyse des gesamten zellförmigen RNA von drogenempfindlichen Flußzellen B1 und hoch- Multidrogen-resistenten B30-Zellen, wobei die dritte Spalte, die RNA von einem normalen Rinderhirn enthält, zu Vergleichszwecken dient;
Fig. 2b eine Spalt-Fleck-Analyse von RNA aus einer Reihe von Zellen mit sich ändernden Werten von Drogenresistenz, ähnlich denen in Fig. 1, wobei die relativen Werte der Resistenz in jeder Spalte gegensinnig angedeutet sind;
Fig. 3a eine Southern-Spalt-Analyse von EcoR1-versetztem genomischen DNA aus derselben Serie von anwachsenden Multidrogen-resistenten CHO-Zellen wie in Fig. 2a;
Fig. 3b eine Southern-Fleck-Analyse von EcoR1 gezüchtetem DNA aus Drogen-sensitiven menschlichen leukemischen Zellinien (CEM) und einer Multidrogen-resistenten Variante (CEM/V1b1000). Das andere Paar stammt von Drogen-sensitiven Mäuse-L-Zellen (LMTK-) und einer MDR- Variante (ECHR). Das Verfahren war dabei wie in Fig. 2b; und
Fig. 4a, b, c zytologische Erscheinungen in der Lokalisierung von P-Glykoprotein-Sequenzen auf einem homogen eingefärbten Bereich auf den Z4-Chromosonen von CHO-Zellinien B-30.
Es wurden Verfahren entwickelt für die Isolation und die Charakterisierung von Plasma-Haut-Bläschen, die als Ausgangsmaterial für die Reinigung des P-Glykoproteins dienen. Das Protein wurde gereinigt und charakterisiert als ein innehaftendes Glykoprotein, enthaltend eine Polypetid-Hälfte mit einem Molekulargewicht von 140 Kilodalton und als ein entsprechendes P-Glykoprotein mit einem Molekulargewicht von 170 Kilodalton und einem isoelektrischen Punkt von ungefährt 7,4. Polyklonale und monoklonale Antikörper zu dem Protein wurden vermehrt.
Die entwickelten monoklonalen Antikörper, die spezifisch sind für das Glykoprotein aus verschiedenen Arten und mit diesem stark quer reagieren, werden benutzt, um lebende Zellen zu untersuchen, die das Glykoprotein als Teil der Haut enthalten. Ein komplementäres DNA (cDNA)-Verzeichnis kann aus dem Boten RNA (mRNA) aus den hoch Drogen-resistenten Zellinien konstruiert werden, die das Glykoprotein überexpressieren. Das Verzeichnis kann konstruiert werden durch Anwendung des Expressions-Vektors (λgt11). Phage-Platten, die β-galaktosidase Fusionsproteine antigen zu dem für das P-Glykoprotein spezifischen monoklonalen Antikörper ausdrücken, werden identifiziert, verkleinert und analysiert mit dem Zweck, ein für eine polypeptide Sequenz des P-Glykoproteins enkodierendes cDNA zu lokalisieren.
Hautproteine von verschiedenen Multidrogen-resistenten Linien wurden mit für P-Glykoproteine spezifischen polyklonalen Antikörpern immunbefleckt, wie es in Science Band 221 supra beschrieben ist. Es wurde herausgefunden, daß das Maß der P-Glykoprotein-Expression mit den relativen Drogen-Resistenzen der Zellinien korreliert. Auf diese Weise erscheint die Über- Expression des P-Glykoproteins die am meisten konsistente Molekular-Markierung, die dem Multidrogen-Resistenz-Phenotyp für lebende Zellen zugeordnet ist. Es wurde herausgefunden, daß eine Über-Expression von P-Glykoprotein in den biopsinen Proben vorhanden war, die direkt von Tumor-Zellen von Eierstock- Patienten mit fortgeschrittenen Eierstock-Tumoren gewonnen wurden, die auf eine chemotherapeutische Behandlung nicht mehr ansprachen.
Um die nukleische Säuren-Sequenz, die für das durch die Anwendung des monoklonalen Antikörpers isolierte Polypeptid enkodiert, zu isolieren, wurde das komplementäre DNA-Verzeichnis aufgestellt. Einer der vermehrten monoklonalen Antikörper (C219) an dem P-Glykoprotein wird verwendet, um dieses Verzeichnis für Klonen zu untersuchen und die β-galaktosidase P-Glykoprotein- Fussionsprodukte künstlich herstellen. Mehrere Phagen wurden identifiziert, und die Platten wurden gereinigt.
Eine der presumptiven Glykoprotein cDNA-Klonen, nun in der Form von λCHP-1, wurde isoliert und in dem Plasmid pUC-9 subkloniert, um das Plasmid pCHP-1 zu gewinnen. Dieses geklonte Plasmid hat einen Zusatz von ungefähr 600 Basispaaren, die als Probe für eine molekulare Kreuzungsanalyse von nukleischen Säuresequenzen von Drogen-resistenten und Drogen-sensitiven Zellen verwendet werden können. Der Zusatz des Plasmid pCHP-1 von etwa 600 Basispaaren enkodiert aus dem Karbon-Ende des Proteins wenigstens einen Teil des P-Glykoproteins, das in der isolierten, Drogen-resistenten Zelle überexpressiert ist. Bei der Anwendung der nukleischen Säuresequenz als Probe für die Bestimmung, ob die Zellen eine Drogenresistenz entwickeln, kann die nukleische Säuren-Sequenz mit einer erkennbaren Markierung ausgezeichnet werden. Die Markierung kann die Form eines Labels haben, das radioaktiv, fluoreszent oder biotiniert ist.
Gemäß der Erfindung kann, um das Plasmid pCHP-1 zu klonisieren, das Plasmid in einen Gast-Mikroorganismus umgeformt werden, mit dem Zweck, mehrfache Kopien des Plasmid anzufertigen. Der Mikroorganismus kann eine Beanspruchung von E. coli sein, das als Gastzelle für den klonierenden Träger wirkt. Das Polypeptid, das ein Teil des P-Glykoproteins als determinanter Faktor in der zu Drogen resistenten Zelle ist, kann dadurch erzeugt werden, daß der Gast-Mikroorganismus oder irgendein anderer Organismus, in den der klonierende Träger transformiert wird, gezüchtet wird.
Die Gastzelle für den klonierenden Träger gemäß einer Ausführungsform der Erfindung ist die Belastung JM83 von E. coli K-12, Messing, J., Recombinant DNA Technical Bulletin. NIH Veröffentlichung Nr. 79-99, 2, No. 2 (1979) 43-48. Die Gastzelle mit dem neuen Plasmid kann durch die am 07. September 1984 niedergelegte ATCC-Zulassungs-Nr. 39839 gewonnen werden. Diese Gastzelle enthält ein rekombinantes Plasmid pCHP-1. Dieses Plasmid wurde gewonnen durch den Zusatz einer cDNA-Sequenz entsprechend einem Teil der Codier-Sequenz des P-Glykoproteins in die einzige EcoR1-klonierende Stelle des Plasmid-klonierenden-Vektors pUC9 (Vieira, J. and Messing, J., Gene, 19 (1982) 259-268).
Die cDNA-Klone pCHP-1 kodiert für ein C-Terminal-Segment von P- Glykoprotein, das aus etwa 200 Aminosäure-Resten besteht. Der DNA-Zusatz in dieser Klone wird auf etwa 650 bp in der Länge geschätzt. Das Fussionsprodukt, das aus dem für wenigstens einen Teil dieser Sequenz kodierten Polypeptid plus β-Galactosidase besteht, hat eine Abmessung von ungefähr 140.000 Dalton. Eine Subtraktion des β-galactosidasen Molekulargewichts von 116.600 Dalton ergibt 23.400 Dalton als Molekulargewicht des Peptides, das durch die Zusatzsequenz kodiert ist. Dieses enthält ungefähr 190 Aminosäure-Reste oder 570 bp. Daher werden alle außer 80 bp des Zusatzes benötigt, um für das Peptid zu kodieren. Diese 80 bp müssen einen Anteil des 3' der nicht umgesetzten Folge darstellen.
Das pCHP-1 wurde benutzt, um dasselbe Lamda-Verzeichnis wieder zu untersuchen, und es wurden fünf zusätzliche cDNA-Klonen gewonnen. Diese hatten Abmessungen von 1,2; 1,3; 1,65; 2,0 und 2,5 kb. Die längste, die für ungefähr eine Hälfte des vollständigen P-Glykoprotein-Polypetides kodiert, wurde mit pCHP-2 bezeichnet, am 30. Juli 1985 bei ATCC niedergelegt und mit der Zulassungszahl 53234 versehen.
Es sei jedoch anerkannt, daß mit extensiven anspruchsvollen Verfahren die nukleische Säuren-Sequenz für den Polypeptid-Anteil des P-Glykoproteins dadurch isoliert wird, daß Brust-Zellinien selektiert werden, die eine Resistenz gegenüber Drogen ausüben, wie z. B. Adriamycin, Actinomycin D, Colchicin, Daunorubicin, Emetin, Podophyllotoxin, Puromycin, Taxol, Vinblastin oder Vincristin, von denen alle häufig ein pleiotropisches Phenotyp einer Multidrogen-Resistenz ausüben. Dieser komplexe Phänotyp enthält eine Querresistenz zu strukturell und funktionell nicht zusammenhängenden Zusammensetzungen. Wenngleich die Plasma-Haut der Zelle in diesem komplexen Phänotyp von Drogenresistenz durch die Zelle impliziert ist, ist der wirkliche involvierte Vorgang nicht vollständig zu verstehen. Gemäß einer Ausführungsform der Erfindung enthalten die extensiven Verfahren für die Isolation der nukleischen Säuresequenz der P-Glykoprotein-Gene die Auswahl von Multidrogen-resistenten mutanten Zellen; ihre genetische Kennzeichnung; Untersuchungen über den Drogen-Transport; Plasma- Haut-Kennzeichnung einschließlich der Isolation eines P- Glykoproteins, auf die die Antikörper vorbereitet werden. Die Antikörper werden dann verwendet, um ein Bakteriophage cDNA Ausdrucks-Vektor-Verzeichnis, das von dem hoch Multidrogenresistenten mutanten isolierten mRNA vorbereitet wurde, zu untersuchen. Die identifizierten, positiv rekombinanten Bakteriophage-Klonen können dann benutzt werden, die P- Glykoprotein spezifische DNA-Sequenz getrennt in einen Plasmid- Vektor zu subklonisieren. Auf diese Weise kann das vollständige P-Glykoprotein-Gen isoliert und gekennzeichnet werden.
Es sei anerkannt, daß ein isoliertes und in Plasmid pCHP-1 geklontes Segment Enkodier-Gebiete aufweisen kann, die in der Kodierung für das Polypeptid-Segment des P-Glykoprotein nicht wirksam sind. Es wird angenommen, daß der wirksame Anteil des nukleischen Säure-Zusatzes etwa 600 Basis-Paare von den etwa 650 Basis-Paaren aufweist, die in dem rekombinanten Plasmid pCHP-1 sein können. Wie festgestellt und in Fig. 1 gezeigt, beträgt die Protein-Hälfte des P-Glykoproteins ungefähr 140.000 Dalton, was einen RNA-Träger mit einem Kodiergebiet von ungefähr 4 kb erfordern würde. In Zellen mit einer Über-Expression des P- Glykoprotein beträgt die einzelne Haupt-nRNA-Komponente ungefähr 5 kb. Die Differenz im Gewicht ist bedingt durch die 5' und 3' nicht übersetzten Gebiete des mRNA, die die Abmessung des P-Glykoproteins mRNA auf etwa 5 kb erhöhen wurde.
Die Polypeptid-Determinante für die Drogen-Zellen-Resistenz wird als ein P-Glykoprotein identifiziert, das ein Molekulargewicht in der Größenordnung von 170.000 Dalton aufweist. Die Konzentration des Zellen-Oberflächen-Glykoproteins steht quantitativ im Zusammenhang mit dem Multidrogen-Resistenz-Phänotyp in dem CHO- Zellen-System unter einer Vielzahl von Bedingungen. Hochresistente Linien haben eine erhöhte Expression von P-Glykoprotein in der Zellenhaut. Diese Haut-Komponente erscheint überexpressiert zu sein in anderen, in tierischen und menschlichen Zellen isolierten Multidrogen-resistenten Linien. Wenigstens ein Teil des P-Glykoprotein-Moleküls wird im hohen Maße konserviert, d. h. ist konstant innerhalb des P-Glykoprotein in verschiedenen Sorten. Die stark angewachsenen monoklonalen Antikörper reagieren quer mit den P-Glykoproteinen von verschiedenen tierischen und menschlichen Zellen.
Der monoklonale Antikörper (C219), der benutzt wurde, um P- Glykoprotein-Sequenzen enthaltende λgt11-Klonen zu identifizieren, wurde durch Anwendung isolierter Plasma-Haut- Träger erhöht, die, wie es bei Riordan J.R. and Ling, V. (1979) "Purification of P-Glykoprotein from Plasma Membrane Vesicles of Chinese Hamster Ovary Cell Mutants with Reduced Colchine Permeability", J. Biol. Chem, 254 : 12701-12705 beschrieben wurde, aus einer hochcolchinen resistenten CHO-Zellinie (B30) als Immunogen vorbereitet wurden. Mäuse wurden mit diesen Trägern immunisiert. Nach mehreren Zusatz-Injektionen wurden Zellen aus der Milz mit einer Myelom-Zellinie verschmolzen, um eine Batterie von Hybridom-Zellen zu erzeugen. Diese wurden für die Herstellung von Antikörpern gegenüber den P-Glykoprotein- Trägern der Multidrogen-resistenten Zellen untersucht, aber nicht diejenigen von Drogen-sensitiven Zellen.
Zellinien mit erhöhter Drogen-Resistenz haben eine erhöhte P- Glykoprotein-Expression. Fig. 2b zeigt Slot Blots von mRNA, die aus in Zusammenhang stehenden Reihen von CHR Klonen mit anwachsender Drogen-Resistenz vorbereitet wurden, AuxB1 →, CHRB3 →, CHRC5 →, CHRB30 ebenso wie die umgekehrte Klone 110, die aus dem CHRC5 selektiert wurde. Der Betrag von mRNA, das durch die pCHP- 1-Probe in diesen Zellinien gewonnen wurde, stimmt mit den für den Fall erwarteten Werten überein, wenn die pCHP-1 Sequenzen einen Teil des P-Glykoproteins enkodiert hätten.
Eine Southern-Fleck-Analyse eines genomen DNA von der Drogen- Sensitivität und Reihen von miteinander in Beziehung stehenden Multidrogen-resistenten CHRCHO-Zellinien von Fig. 2b ist in Fig. 3a dargestellt. Es ist ersichtlich, daß zu pCHP-1 homologen Sequenzen verglichen mit den Drogen-sensitiven oder umgekehrten Linien in den resistenten Linien verstärkt werden. Außerdem steht der Betrag der Verstärkung im Zusammenhang mit der erhöhten Drogen-Resistenz. Dies zeigt, daß eine Überexpression des P-Glykoproteins in diesen Linien aus der Gen-Verstärkung resultierte. Es scheinen dort zehn EcoR1 Fragmente im Größenbereich von 1-15 kb zu existieren, homologen zu dem pCHP-1 in dem Genom der Drogen-sensitiven Zellinien. Vielfache Bereiche wurden ebenso untersucht, wenn anderen Enzym-Beschränkungen angewendet wurden (Daten sind in Fig. 3a nicht enthalten). Verschiedene Bereiche können entstehen, wenn die pCHP-1-Probe mehr als ein Exon überstreicht; jedoch, sofern die pCHP-1-Probe keine internen EcoR1-Seiten aufweist und die Zugabemenge nur etwa 600-700 kb beträgt, sind die mehrfachen, in den Fig. 3a und 3b gezeigten Bereiche wahrscheinlich das Ergebnis der Anwesenheit einer Familie von Genen, die für entsprechende P- Glykoproteine alle etwa mit demselben Molekulargewicht kodieren. Die P-Glykoprotein-Gen-Familie scheint innerhalb einer Verstärkungs-Einheit (ein Amplicon) zusammengedrängt zu sein.
Dieses wird durch die Feststellung gestützt, daß in der klonalen Linie, die in einem einzigen diskreten Schritt, z. B. CHRA3 von Fig. 2b, für die Resistenz zu Colchicin ausgebildet wurde, eine gleichzeitige Verstärkung der zehn Restriktons-Fragmente auftrat. Außerdem wird jedes Fragment etwa gleichermaßen um einen Faktor von 10-20 verstärkt, verglichen mit dem äquivalenten Fragment in der Drogen-sensitiven Linie. In anderen Systemen wurden Amplicons geschätzt mit einem Wert von etwa 100- 1000 kbp in der Größe. Daher wird angenommen, daß die P- Glykoprotein-Gen-Familie in einer Tandem-Ordnung innerhalb eines derartigen Gebietes organisiert ist. Ein ähnlicher koordinanter Anstieg in der Verstärkung der P-Glykoprotein-Gene wird in der Klone vom zweiten Schritt (CHRB3), der Klone vom dritten Schritt (CHRC5) oder der Multischritt-Linie (CHRB30) nicht beobachtet. Das Restriktions-Muster wird komplizierter, und das Maß der Verstärkung zwischen den verschiedenen Restriktions-Fragmenten scheint im größeren Ausmaß zu variieren. In CHRB30 z. B. wurden Restriktions-Fragmente 4, 6 und 9 um den Faktor 10-20 verstärkt, während Fragmente 7, 10, 11, 12 um einen Faktor von 50 oder mehr verstärkt wurden, wie in Fig. 3a gezeigt. Diese Zahlen wurden abgeschätzt durch eine quantitative fotografische Dichtemessung mit geeignet belichteten Filmen in einem getrennten Experiment. Von Interesse war das Auftreten von verstärkten Fragmenten in den mehr resistenten Linien, die in dem ursprünglichen DNA nicht vertreten waren. Beispiele dafür sind die Fragmente 2 und 5 von Fig. 3a. Diese können "neu verbundene" Gebiete darstellen, die sich in tandemähnlichen verstärkten Sequenzen anfinden, wie von Stark, F.R. und Wahl, G.M. Ann. Rev. Biochem. 53, 447-491 (1984) beschrieben wurde.
Die obigen Beobachtungen zeigen, daß das CHO-Zellen-Genom eine Familie aus so vielen von zehn P-Glykoprotien-Genen enthält, die miteinander verkettet sind, und daß diese Familie in Colchicinresistenten, Multidrogen-resistenten Zellinien verstärkt wird. Eine Southern-Fleck-Analyse von Multidrogen-resisenten Mäuse- und menschlichen, pCHP-1 verwendenden Linien zeigt, daß die P- Glykoprotein-Sequenzen in diesen Arten auch durch eine Familie von Genen encodiert sind und daß einige Mitglieder der Familie in den resistenten Linien verstärkt werden, wie es in Fig. 3b dargestellt ist. Acht EcoR1-Fragmente, die verschiedene P- Glykoprotein-Gen-Sequenzen der Familie enthalten, wurden in dem Mäuse-Genom beobachtet. Fünf dieser Fragmente wurden in der resistenten Linie deutlich verstärkt; die anderen drei Fragmente, die gerade unterhalb der 9,6 kb und der 4,3 kb Marke und gerade oberhalb der 2,3 kb Marke lagen, wurden offensichtlich nicht verstärkt. Auf ähnliche Weise wurden in dem menschlichen Genom acht Fragmente beobachtet, jedoch wurden nur vier der acht Fragmente in der resistenten Linie deutlich verstärkt. Die Erkenntnis, daß einige der EcoR1 Fragmente sowohl in Mäuse- wie in menschlichen resistenten Zellinien offensichtlich nicht verstärkt werden, läßt vermuten, daß die P-Glykoprotein-Gene in diesen Linien nicht in einem einzigen Amplicon enthalten sein und verstreut sein können, im Gegensatz zu dem, was in den CHO- Zellen beobachtet wurde. In den resistenten Mäuse-Zellen wurde ein neues Fragment von ungefähr 3 kb beobachtet, das in den sensitiven Zellen nicht vorhanden war, wie in Fig. 3b gezeigt. Diese ist konsistent mit einem "Neuerverbund"-Bereich in den tandemähnlich verstärkten Sequenzen, wie oben erwähnt. Ein derartiges Fragment wird in der resistenten menschlichen Linie nicht beobachtet. Die Tatsache, daß das pCHP-1 geeignet ist, unter strengen Bedingungen in starkem Maße mit den angenommenen menschlichen P-Glykoprotein-Sequenzen zu kreuzen, enthält eine weitere Betätigung, daß das P-Glykoprotein sowohl bei dem Protein- als auch dem DNA-Wert konserviert wird.
Karyotypische Merkmale einer Gen-Verstärkung, die in einer Zahl von Systemen beobachtet wurde, sind chromosomale, homogen eingefärbte Gebiete (HSRs) oder die Anwesenheit von doppelt kleinen Chromosomen (DMs), die in metaphasischen Zellen beobachtet wurden. Derartige Merkmale sind in Multidrogen-resistenten Zellinien bekannt. In DNA-vermittelten transfektanten Zellen stimmt die Zahl von DMs mit der Resistenz des Colchicins und der Multidrogen und dem Maß der Expression an P-Glykoprotein überein. In dem CHO-Zellen-System wird ein extensives HSR in den CHRB30 Zellen beobachtet, wie in Fig. 4 gezeigt, was in den Drogen-sensitiven ursprünglichen Zellinien nicht festgestellt wurde. Dieser Bereich ist in der Länge variabel, kann gelegentlich beinahe die Abmessung der Z4-Chromosomen aufweisen, auf der es untergebracht ist. Um festzustellen, ob die verstärkten P- Glykoprotein-Sequenzen in den CHRB30-Zellen in diesem HSR enthalten waren, wurde eine in situ-Kreuzung durchgeführt unter Verwendung einer ³H-ausgezeichneten pCHP-1-Probe. Von 25 geprüften Zellen ergaben 20 eine oder mehrere autoradiographische Körner, die an dem HSR von Chromosomen Z4 lokalisiert waren, wie in den Fig. 4b und 4c gezeigt. Wenn alle Chromosomenkörner ausgebrannt sind, wurden 45% (60/133) aller Körner in dem HSR lokalisiert. Im Gegensatz dazu war keine signifikante Körnerlokalisierung in 25 Zellen ersichtlich, die unter Anwendung der Drogen-sensitiven ursprünglichen Linie AuxB1 geprüft wurden, für die die Daten in Fig. 4 nicht gezeigt sind.
Die Charakterisierung von einem oder mehreren der Gene der für das Polypetid des P-Glykoproteins kodierenden Familie wird in Übereinstimmung mit dem oben beschriebenen Verfahren durchgeführt, die isolierte Teile von cDNA verwenden. Die DNA- Sequenz für die Codierung der Polypeptid Mehrheit von P-Glykoprotein ist etwa 5 kb Paare. Dieses DNA oder irgendein Segment davon kann in einer Vielzahl von Wegen dazu benutzt werden, die Multidrogen-Resistenz von Zellen zu untersuchen. Außerdem können ein oder mehrere Gene der Familie oder ein Segment eines der Gene der Familie als DNA-Probe verwendet werden, um die Existenz von Multidrogen-Resistenz in lebenden Zellen zu bestimmen. Das Gen oder ein Segment davon kann in der beschriebenen Weise in einen geeigneten Träger eingebracht und in eine geeignete Gastzelle transformiert werden, um ein P-Glykoprotein oder ein Teil davon zu erzeugen.
Bevorzugte Ausführungsformen der Methodik zur Durchführung der Erfindung werden anhand der folgenden Beispiele erläutert.

Beispiel 1

Vollständig zellulares RNA wurde von hoch Colchicin-resistenten CHO-Zellen isoliert, B30 entsprechend Chirgwin et al BIOCHEMI- STRY 18, 5294-5299 (1979). Ein Poly A&spplus;RNA wurde daraus durch Farbenmessung auf einer oligo dT-Zellulose (Typ 3, Collaborative Research) entsprechend Aviv H. und Leder, P., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.69, 1408-1412 (1972) ausgewählt. Das Produkt dieses Schrittes wurde als Vergleichsmuster für die Synthese von cDNA unter Anwendung von oligo-dT als Primer verwendet. 1 ug von Poly A&spplus;RNA wurde für fünf Minuten auf 70ºC erhitzt, auf Eis gekühlt und dann für eine Stunde bei 42ºC in 50 mM Tris-HCl, pH 8.3, 40 mM KCl, 8 mM MgCl&sub2;, 0.4 mM DTT, 0.5 ug oligo dT (12-18; Collaborative Research), je 2 mM Deoxynucleotid, 1 ul eines (³²P)dCTP (Amersham, 800 Ci/mmol) und fünf Einheiten von AMV-revertierten Übertragung (gereinigt durch eine Saphacryl S-200-Farbmessung) enkodiert. Die zweite Strangsynthese wurde durchgeführt bei 14ºC für fünf Stunden in der Anwesenheit von 100 mM HEPPES, pH 6.9, 200 mM KCl, 0.2 mM von jedem Deoxynucleotid und 2 ug einer homogenen DNA-Polymerase 1. In einer folgenden Sephadex G-100 Chromatographie in 1 mM Tris-HCl, pH 7.5, 10 uM EDTA, wurden doppelt gestrandete cDNA enthaltende Bruchteile durch eine Cherenkov-Strahlung gesammelt und lyophilisiert. Die Haarnadel- Schleife wurde für ½ Stunde bei 34ºC versetzt mit einem 1000 U von S1 Nuclease (Boehringer Mannheim). Im Anschluß an die Phenol/Chloroform-Extraktion wurde der Vorgang der Sephadex G-100 Farbmessung wiederholt. Die Methylierung an den EcoR1-Stellen wurde durchgeführt, nachdem die gesammelten lyophilierten Anteile in 40 mM Tris-HCl, pH 7.5, 1 mM EDTA, 5 mM DTT, 10 uM S- Adenosyl Methionin aufgelöst wurden. Eine Inkubation mit EcoR1 Methylase (0,1 u) erfolgte bei 37ºC für 15 Minuten. Stumpfe Enden wurden gebildet durch den Zusatz von MgCl&sub2; zu 10 mM und allen Deoxynucleotiden bei 20 uM. Nach dem Zusatz von 0,25 ug einer homogenen DNA-Polymerase 1 erfolgte eine Inkubation bei Raumtemperatur für 10 Minuten. Der Sephadex G-100 Entsalzungs- Schritt wurde wiederholt, und Spitzenbruchteile wurden gesammelt und vor der Verknüpfungsaddition lyophiliert. EcoR1 Linker (12 mer; Collaborative Research) wurden phosphoryliert, und zwar vor der Anwendung durch die Inkubation von 3 ug für eine Stunde bei 37ºC in 10 mM Tris-HCl, pH 7,5, 10 mM MgCl&sub2;, 10 mM ATP und 6 U von 4 Polynucleotid-Kinase (Boehringer-Mannheim).
γ-(³²p)ATP wurde eingefügt, so daß die Reaktivität der phosphorylierten Linker in einer abfallenden Ligation getestet werden konnten, von denen die Produkte durch eine Electrophoresis in einem 10% Polyacrylamid-Gel dargestellt wurden. Das cDNA mit stumpfen Enden wurde dann resuspendiert in ul der phosphorylierten Linker (0,5 ug) für eine Ligation über Nacht bei 12ºC durch 0,3 ug einer homogenen T4-Ligase. Eine EcoR1 Digestion wurde für 1 Stunde bei 37ºC in 25 mM Tris-HCl, pH 7,5, 100 mM NACl, 5 mM MgCl&sub2; mit 1 Einheit eines homogenen EcoR1 durchgeführt. Das cDNA wurde auf einem Sephacryl 5-100 column (2 mm·15 cm in 1 mM Tris-HCl, pH 7,5, 10 uM EDTA) fraktioniert. Bruchteile, die die ansteigende Kante der cDNA Spitze darstellen, wurden gesammelt und lyophilisiert. Dieses Material (ungefähr 30 ng) wurde mit 1 u g von γgt11 erhitzt, das mit EcoR1 eingeweicht wurde, und dann mit Calf Intenstine Alkaline Phosphatase (Boehringer Mannheim) behandelt, bis die Steuerbündeleffizienz von 10&sup7; auf 10&sup5; Phage je ug reduziert war. Die Ligation erfolgte dann über Nacht bei 10ºC mit 0,1 ug einer homogenen T4 Ligase. Das in vitro Bündeln wurde durchgeführt entsprechend Protokoll II von Maniatis, T., Fritsch, E.F. und Sambrook, J., Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory, New York, (1982) unter Verwendung von Extrakten, die in der hier beschriebenen Weise präpariert wurden. Der Belag mit einer Bakterienbelastung Y1090 zeigte 1,3·10&sup6; Rekombinanten, von denen 65% Einfügungen von cDNA enthielten, wie sie durch die Inaktivierung von β-Galactosidase bestimmt sind.
Für die Untersuchung wurden 600.000 Mitglieder des verstärkten Verzeichnisses auf einer Belastung Y1089 bei einer Dichte von 100.000 pro 15 cm Platte plaziert und bei 42ºC für 3 bis 4 Stunden gezüchtet. Nitrocellulose-Filter (BA85, Schleicher und Schuell), die vorher in 10 mM IPTG (isopropyl thiogalctoryranosid) getränkt und getrocknet wurden, wurden auf die Platten gelegt, und die Inkubation wurde für 2 Stunden bei 37ºC fortgesetzt, um eine Synthese des induzierten galactosidasen Fusionprotein zu ermöglichen. Die Filter wurden entfernt, für 3·10 Min. in PBS gewaschen und konnten dann für 1 Stunde bei 37ºC trocknen. Die getrockneten Filter wurden in 3% BSA für 4 bis 6 Stunden bei 37ºC inkubiert. Die Filter wurden zu einer frischen Lösung mit derselben Zusammensetzung transferiert, die redioiodinates ( 10 uCi/ug) eines monoklonalen Antikörpers C219 enthielt, und dann bei 23ºC für 10 Stunden inkubiert. Waschvorgänge von 10 Minuten wurden nacheinander folgendermaßen durchgeführt: 2 mal in PBS, 2 mal 0,1% NP 40 in PBS und 3 mal in PBS. Nach dem Trocknen wurden die Filter autoradiographiert. Die in der primären Untersuchung detektierten Positive wurden über mehrere Schritte einer Plattenreinigung zugeführt, um eine homogene Population mit positiver Phage zu erzielen.

Beispiel 2

Um die Größe der Proteinfusion sichtbar zu machen und zu bestimmen, die sich als ein Ergebnis des Zusatzes der P-Glykoprotein cDNA-Folge in das β-Galactosidase-Gen von λgt11 ergab, wurde die rekombinante Phage auf einer Belastung Y1089 lytisch gezüchtet. Diese Zellen wurden infiziert mit der λgt11 rekobinanten Phage und bei einer geringen Dichte (ungefähr 100 je Platte) bei 32ºC plattiert. Um die Temperatur-Empfindlichkeit zu testen, wurden Zellen von einzelnen Kolonnen auf zwei Platten getupft und eine bei 32ºC inkubiert und die andere bei 32C. Klonen, die bei 32ºC wuchsen, aber nicht bei 42ºC, wurden dann benutzt, um 100 ml von LB zu okulieren. Nach dem Wachsen bei 32ºC bis OD 600=0,5 wurde die Temperatur schnell auf 43ºC erhöht und die Inkubation für 20 Min. fortgesetzt. IPTG wurde bis 10 mM hinzugefügt, und die Inkubation wurde bei 37ºC für 1 Stunde fortgesetzt, um eine Akkumulation des induzierten Fusionsprotein zu ermöglichen. Zellen wurden gewonnen durch eine Zentrifugation bei 25ºC, resuspendiert in 1/50 des Original-Volumens von PBS und in flüssigem Stickstoff eingefroren. Nach dem Auftauen wurden die Proben kurz sonikiert und elektrophosphorisiert auf einem 6,5% Polyacylamid Gel, das dann belastet wurde mit Coomassie brilliant blue oder durch Anwendung von monoklonalen Antikörpern immunoblottiert wurde.
Mit Bezugnahme auf Fig. 1 ist das Schaubild A ein Aliquot, enthaltend 75 ug Protein von Lysates von Y1089 Baktieren Infektion mit λgt11 (Spalte a) oder (λCHP-1 (Spalte b). Die Molekulargewicht-Markierungen in der ganz linken Spalte waren so, wie bereits vorher beschrieben. Pfeile zeigen das lacZ Fusions- Produkt des λCHP-1 (oberer Pfeil) und die ununterbrochene β-Galactosidase (unterer Pfeil) an. Das Schaubild B sind Western- Flecken von Spalten, die im Schaubild A gezeigt sind. Monoklonale Antikörper wurden isoliert und wurden eingeteilt in drei Gruppen auf der Basis ihrer Fähigkeit, drei unterschiedliche Epitope auf dem P-Glykoproteinmolekül zu erkennen. Drei identische Gruppen von Flecken wurden erprobt mit repräsentativen monoklonalen Antikörpern der Gruppe I (linke Spalten, C219 Probe), Gruppe II (mittlere Spalten, C32 Probe) und Gruppe III, (rechte Spalten, C494 Probe). Spalte a, Kontrollysate (λgt11); Spalte b, lacZ-Fusionsprodukt enthaltend Lysate (λCHP-1). Die Pfeile zeigen die erwartete Position des lacZ-Fusionsproduktes an. Die Einfärbung des lacZ-Fusionsproduktes mit Antikörpern identifiziert drei unabhängige Epitopen.
Das Plasmid (pCHP-1) oder seine Zusätze von ungefähr 600 Basispaaren können als DNA-Probe benutzt werden für die Molekular-Kreuzungs-Analyse von RNA und DNA von Drogen-resistenen und Drogen-sensitiven Zellen; z. B. in Übereinstimmung mit der DNA- Probentechnik, die allgemein als Northern- und Southern-Fleckentest bezeichnet wird.

Beispiel 3

Ein Vergleich des zu der λCHP-1 Phage homologen mRNA wurde unternommen unter Anwendung von Drogen-sensitiven AuxB1-Zellen und hoch Drogen-resistenten B30 Zellen. Die Ergebnisse sind in Fig. 2a gezeigt.
RNA wurde von einschichtigen Zellkulturen isoliert durch eine Disruption in einer Quanidium Thiocyanat und CsC1 gradienten Zentrifugation. Eine Agarose (1%) Gel-Elektrophorese, Transfer auf Nitrocellulose (BA85, Schleicher und Schuell) und Hybridisierung erfolgten gemäß Thomas. P.S., in Meth. Enzymol, (eds Wu, R., Grossman, L., Moldove, K.) Academis Press, New York, 100, 255-266 (1983). 15 ug Proben eines totalen RNA wurden in 1 M deionisierten mit Glyoxal, 50% DMSO, 10 mM Natriumphosphat, pH 6,8 aufgelöst und für 1 Std. bei 50ºC denaturiert. Nach dem Abkühlen wurde ein Probenspeicher (50% Glycerol, 10 mM Na- Phosphat und blaues Bromphenol) hinzugefügt und eine Elektrophorese für etwa 6 Std. bei 90 V mit einer Rezirkulation des Speichers durchgeführt. Für den Transfer wurde das Gel auf einem Whatman 3MM Filterpapier niedergelegt, das in 20·SCC getränkt war. Nitrozellulose wurde mit Wasser angefeuchtet, auf dem Gel niedergelegt und mit einem Papier von 3 mm abgedeckt. Nach dem Beflecken für etwa 10 Std. wurde die Nitrozellulose unter einer Lampe getrocknet und für 2 Std. bei 80ºC in einem Vakuumofen gebrannt.
Der Zusatz, der dem Anteil von P-Glykoprotein entspricht, das aus dem λgt11-Verzeichnis durch monoklonale Antikörper C219 identifiziert wurde wurde, vorbereitet für die Anwendung als eine Kreuzungsprobe durch Subklonierung in der EcoR1 Seite des Plasmid pUC9. Das derart gewonnene rekombinante Plasmid wurde mit pCHP-1 bezeichnet und direkt als Kreuzungsprobe oder als Zusatzquelle angewendet, die als Probe verwendet werden sollte.
Eine Vorkreuzung der Northern-Flecke erfolgte bei 42ºC für 16 Std. in 50% Formanid, 5xSCC, 50 mM Natriumphosphat, pH 6,5, 250 u g/ml von Lachs-Samen DNA, 0,02% BSA, 0,02% Ficoll und 0,02% Polyvinylpyridon. Für die Kreuzung wurden 10% Dextran-Sulfat hinzugefügt. Der Zusatz von pCHP-1, versehen mit einer Einkerbungstranslation wurde vor der Anwendung für die Kreuzung bei 42ºC für 18 Std. noch bei 100ºC für 5 Min. denaturiert. Der Waschvorgang war folgendermaßen: 4 mal 5 Min. in 2xSSC, 0,1% SDS bei 23ºC und 2 mal in 0,1·SSC, 0.1% SDS bei 50ºC. Die gewaschene Schicht wurde autoradiographiert, um das in Fig. 2a gezeigte Muster zu erzeugen. 285 und 185 zeigen die Lagen des ribosomalen RNAs an.
Aus der Northern-Fleckanalyse ist in Fig. 2a ersichtlich, daß eine einzige Majoritäts-Träger-Komponente RNA in den B30-Zellen in stark erhöhten Beträgen beobachtet wurde mit einem Molekulargewicht von etwas weniger als 5 Kilobasen. Sowohl die erhöhte Expression als auch die Abmessung des mRNA, die durch die pCHP-1 Probe gezeigt wurden, ist vollständig konsistent mit dem pCHP-1, das zu dem P-Glykoprotein-Genen komplementäre Sequenzen enthält. Die Protein-Mehrheit des P-Glykoproteins beträgt etwa 140.000 Dalton, was ein mRNA mit einem Minimum von ungefähr 3,5 bis 4,0 kb des Kodierbereiches erfordert. Es hat den Anschein, daß die 5' und 3' nicht transferierten Sequenzen die Abmessungen des P-Glykoproteins mRNA auf die des Bereiches in Fig. 2a erhöhen, das etwa bei 5,0 kb liegt.

Beispiel 4

Wie oben erwähnt, haben Zellinien mit erhöhter Colchicin- Resistenz die P-Glykoprotein-Expression erhöht. pCHP-1 wurde verwendet als eine Kreuzungsprobe, um zu bestimmen, ob ein derartiger Zusammenhang auch für den Betrag des P-Glykoproteins mRNAs in diesen Linien besteht. Fig. 2b zeigt eine Felckspalte von mRNA, das aus einer Serie von CH Klonen mit erhöhter Drogenresistenz präpariert wurde, nämlich AuxB1 →, CHRA3 →, CHRB3 →, CHRC5, bis zu B30 und eine revertante I10, die aus dem CHRC5 selektiert wurde. Das Fleckspalt-Gerät (ähnlich dem von Schleicher und Schnell) wurde zunächst in 200 ug/ml denaturierten Lachssamen DNA in 1M Ammonium-Azetat für 2 Std. denaturiert und mit 1M Ammonium-Azetat gespült. Die Nitrozellulose, auf die das RNA aufgetupft werden sollte, wurde in H&sub2;O und dann 20·SSC getränkt, wobei die Unterlage aus Whatman 3MM bestand. 200 ul von 20·SSC wurden auf jedem Spalt untergebracht, und man ließ es dann durch die Unterlage absorbieren. RNA Proben (15 ug), die wie in Fig. 2a nach der Denaturierung in Glyoxal vorbereitet wurden, wurden auf eine Menge von 200 ul verdünnt, dann geladen und mit weiteren 200 ul von 20·SSC gewaschen. Die Apparatur wurde auseinandergenommen und die Nitrozellulose getrocknet, gebrannt und wie in Fig. 2a mit pCHP-1 gekreuzt.
Die klonalen Linien CHRA3, CHRB3, CHRC5 wurden in sequentiellen Selektionen für eine Colchicin-Resistenz abgeleitet. CHRB30 wurde gewonnen durch ein Wachsen von CHRC5 in anwachsenden Colchicin-Konzentrationen, beginnend bei 5 ug/ml in einzelnen Schritten bis zu 30 ug/ml. Revertantes 110 wurde in einem einzigen Schritt aus CHRC5 selektiert. Die relative Resistenz zu Colchicin wurde bestimmt durch den Drogenbetrag, der notwendig war, die Fähigkeit für die relative Kolonnenformung um 10% zu verringern verglichen mit dem, der für die parentale Linie benötigt wurde.
Es ist ersichtlich, daß der Betrag von mRNA, der sich in diesen Linien von der pCHP-1 Probe zeigte, vollständig konsistent ist mit den pCHP-1 Sequenzen, die einen Teil der P-Glykoprotein-Gene encodieren. Alles zusammengenommen, machen alle obigen Daten ersichtlich, daß ein Fragment von cDNA für P-Glykoprotein kloniert ist.

Beispiel 5

Eine Southern Fleck-Analyse von genomischem DNA aus den Drogensensitiven und hoch Multidrogen resistenten CHO-Zellinien ist in Fig. 3a dargestellt. Fünfzehn ug von DNA von jeder Zelle wurden für eine Vervollständigung mit EcoR1 eingeweicht und dann in 0,6% Agarose Gel elektrophorisiert. Ein Transfer auf Nitrozellulose wurde im wesentlichen so durchgeführt ist, wie es von Southern. E.M. J. Mol.Biol, 98, 503-517 (1975) beschrieben wurde. Die Filter wurden 9 Std. bei 40º in 50% Formamid, 5·SCC, 20 mM Natriumphosphat, pH 6,5, 200 ug/ml von sonicierten Lachsversuchen DNA, 0,1% BSA, 0,1% Ficoll und 0,1% Polyvinylpyrrolidone vorgekreuzt. Eine Kreuzung der Filter erfolgte in derselben Lösung mit dem Zusatz von Dextran-Sulfat von 10%. Die Probe pCHp-1 wurde vorbereitet mit einer nick-Translation mit einem (a-(³²)p) dCTP zu einer spezifischen Aktivität von 3· 10&sup8; dpm/ug und wurde der Kreuzungsmischung nach 5 Min. bei 100ºC auf eine Konzentration von 10&sup6; cpm/ml hinzugefügt. Nach der Kreuzung für 35 Std. bei 40ºC wurden die Filter 2·5 Min. in 2xSCC, 0,1% SDS bei Raumtemperatur, 2· für 30 Min. in 2·SCC, 0,1% SDS und 0,1% Natrium-pyrophosphat bei 50ºC gewaschen, luftgetrocknet und autoradiographiert für 15 Std. bei -70ºC unter Anwendung von intensivierenden Untersuchungen. Die Molykulargewichte wurden bestimmt von Hind III-eingeweichten λ DNA, das ebenfalls elektrophoriziert wurde. AuxB1 (X12) zeigt die AuxB1 Spalte, die 12 mal länger behandelt wurde. Der Bereich 1 in AuxB1 ist in diesem Experiment unterrepräsentiert. In anderen Experimenten ist seine Intensität ähnlich zu dem Bereich 3 von AuxB1.
Aus den obigen Ausführungen ist ersichtlich, daß zwölf Bereiche von EcoR1 Fragmenten bestehen, reichend von 1 bis annähernd 13 kbp in drogensensitiven Zellen. Vielfache Bereiche wurden ebenso beobachtet, wenn andere Restriktionsenzyme benutzt werden. Da die pCHP-1.Probe keine interne EcoR1 Seiten hat und da der Zusatzbetrag nur ungefähr 600 bp beträgt, zeigen die vielfachen beobachteten Bereiche eine Familie mit nukleischen Säurefolgen an, die für die P-Glykoprotein-Gene in den CHO-Zellen kodieren. Diese Folgen werden in der Drogen-resistenten Zellinie B30 verstärkt. Dieses zeigt, daß die Über-Expression von P-Glykoprotein in dieser Linie bei den Protein- und mRNA-Pegeln aus der Gen-Verstärkung resultiert. Die Tatsache, daß die Bereiche offensichtlich unterschiedlich verstärkt werden, zeigt, daß das P-Glykoprotein durch eine Familie von Genen enkodiert wird. Von Interesse ist die Beobachtung von zusätzlichen verstärkten Bereichen in B30 DNA, die nicht durch AuxB1 DNA (X12) repräsentiert sind.

Beispiel 6

Eine Southern-Fleck-Analyse von DNAs von anderen Multidrogenresistenten Linien ist in Fig. 3b gezeigt. DNA wurde vorbereitet aus Drogen-sensitiven (S) oder Multidrogen-resistenten (R) Linien, und die Southern-Fleck-Analyse wurde unter denselben Bedingungen wie in Fig. 3a durchgeführt. Die Autoradiographie erfolgte für 7 Tage ausgenommen in den resistenten Mäuse-Linien (XO.1), wo eine Behandlung für 15 Std. ebenfalls gezeigt ist. Die resistenten Mäuse-Zellinien wurden aus L-Zellen abgeleitet und mit Colchicin selektiert. Die resistente menschliche Zellinie wurde von der menschlichen leukemischen Zellinie CCRF- CEM abgeleitet und für hohe Resistenz auf Vinblastin selektiert.
In Mäuse-Zellen wurde eine Familie von Bereichen beobachtet, die unterschiedlich sind von denen, die in den CHO-Zellen beobachtet wurden. In der Drogen-sensitiven Linie sind einige der Bereiche signifikant schwächer als andere. In den menschlichen Zellen wurden sechs Bereiche vermerkt. In den Drogen-resistenten Linien sind die in den Drogen-sensitiven Zellen beobachteten Bereiche in vervielfachter Zahl präsentiert, und sowohl in menschlichen als auch in Mäusesystemen wurde eine unterschiedliche Verstärkung beobachtet. In dem menschlichen System waren einige der Bereiche in den hochresistenten Linien deutlich erhöht relativ zu den sensitiven Linien, während andere das nicht waren.
Die Beobachtungen zeigen, daß das P-Glykoprotein durch eine Gen- Familie enkodiert wird und daß die Verstärkung von Mitgliedern dieser Familie mit der Über-Expression des P-Glykoproteins im Zusammenhang steht.

Beispiel 7

Eine cytologische Evidenz für die Lokalisierung von P- Glykoprotein-Sequenzen an einem homogenen Einfärbebereich bei den Z4-Chromosonen der CHRB30 Zellen ist in den Fig. 4a, 4b und 4c gezeigt. Fig. 4a ist die Darstellung eines G-Bereiches einer CHRB30 Zelle, die ein HSR auf Z4-Chromosomen (Pfeil) zeigt. Ein derartiges HSR wurde in der Drogen-sensitiven AuxB1-Linie nicht beobachtet. In Fig. 4 sind die Ergebnisse der Lokalisierung von autoradiographischen Körnern an dem Z4-HSR-Bereich (Pfeil) dargestellt, der auf die Kreuzung in situ mit ³H- ausgezeichnetem pCHP-1 folgt. In Fig. 4c sind Beispiele der Körnerlokalisierung dargestellt, das Z4-HSR (Pfeile) stammt von fünf verschiedenen CHRB30-Zellen wie in Fig. 4b.
Die Ergebnisse von Fig. 4 wurden durch ein G-Banding und eine in situ-Kreuzungsanalyse gewonnen, die so durchgeführt wurde, wie es beschrieben ist von J.M., Olson, S., Lawn, R.M. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 79, 7809-7813 (1982) und Schwab, M., Alitalo, J., Klempnauer, K-H., Varmus, H.E., Bishop, M.J., Gilbert F., Brodeur, G., Goldstein, M. und Trent, J.M. Nature 305, 245-248 (1983). Die am meisten konsistente und charakteristische chromosomale Änderung zwischen der parentalen Linie AuxB1 und der hoch Colchicin-resistenten CHRB30-Linie ist die Anwesenheit eines HSR auf dem langen Arm des Z4 Chromosoms, wie es in Fig. 4a gezeigt ist. In dem in situ Kreuzungs-Verfahren wurden Zellen für 15,5 Stunden bei einer endgültigen DNA Konzentration von 0,65 ug ml gekreuzt, gefolgt von einer Behandlung für 7 Tage vor einer autoradiographischen Entwicklung wie in Fig. 4b und 4c. Die autoradiographische Analyse wurde mit ungebundenen Chromosomen durchgeführt; jedoch ermöglichten die Größe und das Arm/Längen-Verhältnis des Z4-HSR, daß sie eindeutig in den CHRB30 Zellen identifiziert werden konnten.
Gemäß der Erfindung wird eine Über-Expression von P-Glykoprotein-Genen in den Multidrogen-Linien durch eine Gen-Verstärkung begleitet. Die kürzliche Beobachtung, daß eine Über-Expression von P-Glykoprotein in fortgeschrittenen Eierstock-Tumor-Zellen erfolgt, läßt vermuten, daß dieser Vorgang auch bei menschlichen Krankheiten wirksam ist. Da eine Gen-Verstärkung, die sich durch HSRs auszeichnet, allgemein bei bösartigen Krankheiten beobachtet wurde, ist es möglich, daß Änderungen in der Multidrogen-Resistenz relativ allgemein sind und daß derartige Änderungen eine erfolgreiche Kombinations-Chemotherapie begrenzen können.
Die Auswahl von Zellen, die das P-Glykoprotein in ihren Hautschichten enthalten und in der Isolation einer nukleischen Säurenfolge resultieren, die für einen Polypeptid-Teil des P- Glykoproteins kodiert, ermöglicht eine Vielzahl von Anwendungsfällen. Das durch die Kreuzung mit dem cDNA identifizierte mRNA hat eine Abmessung von ungefähr 5,0 kb und einen Betrag in direktem Verhältnis zu den Beträgen des Proteins und dem Maß der Multidrogen-Resistenz in der Zelle. Das cDNA kann als DNA-Probe benutzt werden, um P-Glykoprotein-Sequenzen in menschlichen und tierischen Zellen zu erkennen und die Verstärkung dieser Gene in der Multidrogen-Resistenz zu bestimmen. Die P-Glykoprotein-Gene bilden eine Multi-Genfamilie, deren Mitglieder unterschiedlich verstärkt werden können.
Einige dieser Gen-Sequenzen für das P-Glykoprotein sind auf Drogen-sensitive Zellen übertragbar, wenn die Resistenz durch Transfektion mit genomischem DNA von resistenten Zellen transferiert wurde.
Das komplementäre DNA kann dazu benutzt werden, um funktionale Gen-Sequenzen des cDNA und des genomischen DNA zu isolieren. Die Funktionsfähigkeit kann durch die Quantifizierung der Drogen- Resistenz nach der Transfektion mit den geklonten Sequenzen dargestellt werden. Zusätzlich zu der Entwicklung der primären Drogen-resistenten Funktion können diese Transfektions- Experimente benutzt werden, um die Steuerung der Haut- Permeabilität und den Transport großer und kleiner Moleküle zu studieren. Die cDNA-Probe kann in der Diagnose der Entwicklung der Multidrogen-Resistenz bei Krebs-Patienten benutzt werden. Diese Ermittlungs-Möglichkeit schafft eine Basis für verbesserte chemotherapeutische Verfahren. Außerdem kann das System für die Ermittlung von Tumor-Zellen mit verstärkten P-Glykoprotein-Genen benutzt werden, um die Einwirkung von chemotherapeutischen Agenzen direkt auf diese Tumor-Zellen zu ermöglichen.

Claims

1. Gereinigtes DNA-Molekül mit etwa 600 bp, dadurch gekennzeichnet, daß das DNA-Molekül aus einem Anteil von Polypeptiden von etwa 200 Aminosäuren eines P- Glykoproteins kodiert ist, das ein Gesamt-Molekulargewicht von etwa 170.000 Dalton und einen isoelektrischen Punkt von 7,4 hat, daß das DNA-Molekül DNA-Moleküle pCHp-1 und pCHp2-2 enthält, die ATCC-Zulassungszahlen 39839 bzw. 53234 haben, und daß das P-Glykoprotein eine Haupt- Determinante in einer vielfachen Drogen-Resistenz lebender Zellen ist.

2. Gereinigtes DNA-Molekül nach Anspruch 1, in dem das DNA- Molkekül zu einem Gen oder einer Gen-Familie gehört, von der jede nach dem P-Glykoprotein kodiert ist.

3. Gereinigtes DNA-Molekül nach Anspruch 2, in dem die Gen- Familie eine Multi-Gen-Familie ist.

4. Gereinigtes DNA-Molekül nach Anspruch 1, in dem das DNA die Form von cDNA hat.

5. Gereinigtes DNA-Molekül nach Anspruch 1, in dem das DNA die Form von mRNA hat.

6. Gereinigtes DNA-Molekül nach Anspruch 1, in dem das DNA sich in einer rekombinanten Form mit einer Bakteriophage befindet.

7. Gereinigtes DNA-Molekül nach Anspruch 1, in dem das DNA sich in einer rekombinierten Form mit einem Plasmid befindet.

8. Gereinigtes DNA-Molekül nach Anspruch 6 oder 7, in dem das DNA-Fragment sich in der Form von cDNA befindet.

9. Gereinigtes DNA-Molekül nach Anspruch 5, in dem das mRNA etwa 5 kb beträgt und einen Kodierbereich für das P- Glykoprotein von etwa 3,5 bis 4,0 kb hat, der für eine Protein-Fusion von etwa 140.000 Dalton für das P- Glykoprotein kodiert ist, das einen β-Laktoglukose-Anteil von etwa 116.600 Dalton und einen C-Terminal Peptide- Anteil von 23.400 Dalton enthält.

10. Gereinigtes DNA-Molekül nach Anspruch 6, in dem die Bakteriophage für eine Anwendung als DNA-Probe vorgesehen ist.

11. Gereinigtes DNA-Molekül nach Anspruch 7, in dem das Plasmid für eine Anwendung als DNA-Probe vorgesehen ist.

12. Gereinigtes DNA-Molekül nach Anspruch 8, in dem das cDNA für eine Anwendung als DNA-Probe vorgesehen ist.

13. Gereinigtes DNA-Molekül nach einem der Ansprüche 1 bis 12, in dem das DNA-Molekül spezifisch mit einem Gen gekreuzt wird, das P-Glykoprotein und mRNA-Umsetzungen dieses Gens von Eierstockzellen chinesischer Hamster, Mäusezellen und menschlichen Zellen enthält.

14. Gereinigtes DNA-Molekül nach einem der Ansprüche 10, 11, oder 12, in dem die DNA-Probe mit einer detektierbaren Markierung etikettiert ist.

15. Gast-Zelle, enthaltend ein Plasmid nach Anspruch 7.

16. Mikroorganismus, enthaltend ein Plasmid nach Anspruch 7.

17. E. Coli-Mikroorganismus nach Anspruch 16 mit der ATCC- Zulassung Nr. 39839 oder 53234 und enthaltend das Plasmid nach Anspruch 7.

18. Verfahren zur Herstellung eines polypeptiden Teils eines P-Glykoprotein mit einem Gesamt-Molekulargewicht von etwa 170.000 Dalton, dadurch gekennzeichnet, daß ein Mikroorganismus nach Anspruch 15, 16 oder 17 in einem wässerigen Ernährungsstoff gezüchtet und das Polypeptid isoliert wird.

19. Verfahren zur Isolierung des cDNA nach Anspruch 4 in einem Plasmid, in dem ein cDNA-Verzeichnis gebildet wird, das einen bekannten Baktieriophage-Ausdruck-Vektor und mRNA enthält, die von hoch-drogenresistenten, das P- Glykoprotein überausdrückenden Zellinien gewonnen sind, daß die rekombinanten Phage-Vektoren identifiziert werden, die eine zu einem Antikörper antigene Proteinfusion ausdrücken, die spezifisch zu dem P-Glykoprotein ist, daß ein rekombinantes Plasmid aus den identifizierten Phagen gebildet wird, daß das Plasmid in einer verträglichen lebenden Zelle ausgedrückt wird, um einen polypeptiden Anteil zu erzeugen, und daß durch Anwendung des Antikörpers sichergestellt wird, daß das Polypeptid der Teil des P-Glykoproteins ist.

20. Verfahren nach Anspruch 19, bei dem die Bekteriophage λgt11 ist.

21. Verfahren nach Anspruch 19, bei dem das Plasmid pUC9 ist.