DE69809930T2

DE69809930T2 - Isolierung und verwendung von nukleinsäuremolekülen, welche für mitglieder der ssx-familie kodieren

Info

Publication number: DE69809930T2
Application number: DE69809930T
Authority: DE
Inventors: Yao-Tseng Chen; O. Gure; Alexander Knuth; J. Old; Michael Pfreundschuh; Ugur Sahin; J. Scanlan; Solam Tsang; Ozlem Tureci
Original assignee: Cornell Research Foundation Inc; Memorial Sloan Kettering Cancer Center; Ludwig Cancer Research
Current assignee: Cornell Research Foundation Inc; Memorial Sloan Kettering Cancer Center; Ludwig Cancer Research
Priority date: 1997-05-05
Filing date: 1998-02-25
Publication date: 2003-09-04
Anticipated expiration: 2018-02-26
Also published as: PT1005532E; JP2001527408A; EP1005532B1; DK1005532T3; CN1264424A; ATE286968T1; CA2287902C; ZA982009B; EP1005532A4; AU6439298A; WO1998050528A1; DE69828654D1; US6339140B1; DE69828654T2; EP1005532A1; US6291658B1; ATE229069T1; EP1300463B1; CA2287902A1; ES2187939T3

Description

GEBIET DER ERFINDUNG

Die vorliegende Erfindung betrifft das Isolieren und Klonieren von Genen, die Mitglieder der "SSX"-Familie sind, die hierin erörtert wird, sowie deren Verwendungen.

HINTERGRUND UND STAND DER TECHNIK

Es ist einigermaßen gut belegt, dass viele pathologische Zustände, wie z. B. Infektionen, Krebs, Autoimmun-Erkrankungen usw. durch die unangemessene Expression bestimmter Moleküle gekennzeichnet sind. Diese Moleküle dienen somit als "Marker" für einen bestimmten pathologischen oder abnormalen Zustand. Abgesehen von ihrer Verwendung als Diagnose-"Targets", d. h. Materialien, die identifiziert werden müssen, um diese abnormalen Zustände zu diagnostizieren, dienen die Moleküle als Reagenzien, die verwendet werden können, um Diagnose- und/oder Therapiemittel zu erzeugen. Ein keineswegs einschränkendes Beispiel dafür ist die Verwendung von Krebsmarkern zur Erzeugung von Antikörpern, die für einen bestimmten Marker spezifisch sind. Wieder ein anderes nicht einschränkendes Beispiel ist die Verwendung eines Peptids, das mit einem MHC-Molekül komplexiert, um zytolytische T-Zellen gegen abnormale Zellen zu erzeugen.
Die Herstellung derartiger Materialien setzt natürlich eine Quelle der Reagenzien voraus, die verwendet werden, um diese zu erzeugen. Die Reinigung von Zellen ist ein mühevolles, alles andere als sicheres Verfahren, um dies zu erreichen.
Ein weiteres bevorzugtes Verfahren ist die Isolierung von Nucleinsäuremolekülen, die für einen bestimmten Marker kodieren, gefolgt von Verwendung des isolierten Kodierungsmoleküls, um das gewünschte Molekül zu exprimieren.
Bisher sind für den Nachweis derartiger Antigene beispielsweise in menschlichen Tumoren zwei Strategien eingesetzt worden. Diese werden als der genetische Ansatz und der biochemische Ansatz bezeichnet. Ein Beispiel für den genetischen Ansatz ist der von dePlaen et al., Proc. Natl. Sci. USA 85, 2275 (1988). Bei diesem Ansatz werden mehrere hundert Pools von Plasmiden einer cDNA-Bibliothek, die von einem Tumor erhalten wurden, in Rezipientenzellen, wie COS-Zellen, oder in Antigen-negative Varianten von Tumorzelllinien transfiziert. Transfektanden werden für die Expression von Tumor-Antigenen über ihre Fähigkeit gescreent, Reaktionen durch zytolytische Anti-Tumor-T-Zellenklone hervorzurufen. Der biochemische Ansatz, wie beispielsweise von Mandelboim et al., Nature 369, 69 (1994) beschrieben basiert auf Säureelution von Peptid, die sich an MHC-Klasse I-Moleküle von Tumorzellen gebunden haben, gefolgt von Umkehrphasen-Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC). Antigene Peptide werden identifiziert, nachdem sie sich an leere MHC-Klasse I-Moleküle mutierter Zelllinien gebunden haben, die bei der Antigen-Bearbeitung defektiv sind, und führen spezifische Reaktionen mit zytotoxischen T-Lymphozyten herbei. Diese Reaktionen umfassen die Herbeiführung von CTL-Vermehrung, TNF-Freisetzung und Lyse von Target-Zellen, die durch einen MTT-Test oder einen &sup5;¹Cr-Freisetzungstest messbar sind.
Diese beiden Ansätze für die Moleküldefinition von Antigenen haben die folgenden Nachteile: zunächst sind sie ungeheuer mühsam, zeitaufwendig und teuer; zweitens sind sie von der Schaffung zytotoxischer T-Zelllinien (CTLs) mit vordefinierter Spezifität abhängig; und drittens ist ihre Relevanz in vivo für den Verlauf der fraglichen Erkrankungspathologie noch nicht erwiesen, da die jeweiligen CTLs nicht von Patienten mit der jeweiligen Krankheit erhalten werden können, sondern je nach ihrem T-Zellen-Repertoire auch von gesunden Individuen.
Die Probleme, die den beiden bekannten Ansätzen für die Identifizierung und Moleküldefinition von Antigenen innewohnen, lassen sich am besten durch die Tatsache veranschaulichen, dass es mit beiden Verfahren bisher nur gelungen ist, sehr wenige neue Antigene in Tumoren beim Menschen zu definieren. Siehe z. B. von der Bruggen et al., Science 254, 1643-1647 (1991); Brichard et al., J. Exp. Med. 178, 489-495 (1993); Coulie et al., J. Exp. Med. 180, 35-42 (1994); Kawakami et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA 91, 3515-3419 (1994).
Weiters verlassen sich die beschriebenen Methodiken auf die Verfügbarkeit nachgewiesener permanenter Zelllinien der Krebstype, um die es geht. Es ist sehr schwierig, Zelllinien aus bestimmten Krebstypen nachzuweisen, wie beispielsweise von Oettgen et al., Immunol. Allerg. Clin. North. Am. 10, 607-637 (1990) gezeigt. Es ist auch bekannt, dass einige Krebse vom Epithelzelltyp für CTLs in vitro nur schlecht zugänglich sind, was eine Routineanalyse ausschließt. Diese Probleme haben Fachleute dazu veranlasst, weitere Methodiken zum Identifizieren von mit Krebs in Zusammenhang stehenden Antigenen zu entwickeln.
Eine Methodik, der eine Schlüsselfunktion zukommt, wird von Sahin et al., Proc. nat. Acad. Sci. USA 92, 11810-11913 (1995) beschrieben. Siehe auch US-Patente Nr. 6.025.191 und 5.698.396. Zusammenfassend umfasst das Verfahren die Expression von cDNA-Bibliotheken in einem prokaryotischen Wirt. (Die Bibliotheken werden aus einer Tumorprobe sichergestellt). Die exprimierten Bibliotheken werden dann mit absorbierten und verdünnten Seren Immunscreening unterzogen, um jene Antigene zu bestimmen, die höhere in der Körperflüssigkeit hervorrufen. Diese Methodik ist als SEREX-Verfahren bekannt ("Serological identification of antigens by Recombinant Expression Cloning"). Die Methodik ist eingesetzt worden, um die Expression zuvor identifizierter Tumor-assoziierter Antigene zu bestätigen sowie neue zu ermitteln. Siehe die oben angeführten Patente und Sahin et al., oben, sowie Crew et al., EMBO J. 144, 2333-2340 (1995).
Die SEREX-Methodik ist auf ösophageale Krebsproben angewandt worden, und mittlerweile ist ein mit Speiseröhrenkrebs assoziiertes Antigen identifiziert und das dafür kodierende Nucleinsäuremolekül isoliert und kloniert worden, wie durch US-Patent Nr. 5.804.381 belegt.
Die Beziehung zwischen einigen der Tumorassoziierten Gene und einer Triade von Genen, wie als SSX-Gene bekannt sind, wird gerade erforscht. Siehe Sahin et al., oben; Tureci et al., Cancer Res. 56, 4766-4772 (1996). Eines dieser SSX-Gene, das als SSX2 bezeichnet wird, wurde zunächst als eines von zwei Genen identifiziert, die an einem chromosomalen Translokationsereignis beteiligt sind (t(X; 18)(p11.2; q 11.2)), das in 70 % aller synovialen Sarkome vorkommt. Siehe Clark et al., Nature Genetics 7, 502-508 (1994); Crew et al., EMBO J. 14, 2333-2340 (1995). Später wurde festgestellt, dass es in einer Reihe von Tumorzellen exprimiert wird, und nun wird es als mit Tumor in Zusammenhang stehendes Gen betrachtet, das von Tureci et al., oben, als HOM-MEL-40 bezeichnet wird. Seine Expression ist bisher nur in Krebszellen und normalem Hoden beobachtet worden. Somit stellt es einen Parallelfall zu anderen Mitgliedern der "CT"-Familie der Tumorantigene dar, da sie nur in Krebs- und Hodenzellen exprimiert werden. Crew et al. haben auch das SSX1-Gen isoliert und kloniert, das zu 89% Nucleotidsequenzhomologie mit SSX2 aufweist. Siehe Crew et al., oben. Weitere Arbeit, die sich mit der Identifizierung von SSX-Genen beschäftigt, hat zur Identifizierung von SSX3 geführt, wie von DeLeeuw et al., Cytogenet. Genet 73, 179-183 (1996) beschrieben. Die Tatsache, dass die SSX-Präsentation anderen CT-Antigenen entspricht, ließ die Erfinder auf den Gedanken kommen, dass andere SSX-Gene isoliert werden könnten.
Die Anwendung einer Abwandlung der oben beschriebenen SEREX-Technik ist gemeinsam mit anderen Techniken eingesetzt worden, um ein weiteres SSX, das in der Folge als SSX4 bezeichnet wird, sowie eine alternative Spleißvariante des SSX4-Gens zu klonieren. Genauer gesagt wird, während bei der SEREX-Methodik autologes Serum eingesetzt wird, bei den nachstehend ausgeführten Verfahren allogenes Serum eingesetzt. Dies sowie andere Merkmale der Erfindung werden in der nachstehenden Offenbarung dargelegt.

DETAILLIERTE BESCHREIBUNG BEVORZUGTER AUSFÜHRUNGSFORMEN

BEISPIEL 1

Eine menschliche Hoden-cDNA-Expressionsbibliothek wurde mit Serum von einem Melanom-Patienten erhalten und gescreent, das als MZ2 identifiziert wurde. Siehe z. B. die Stammanmeldung US-Patent Nr. 5.698.396; siehe auch US-Patent Nr. 5.804.381; Sahin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92, 11810-11813 (1995). Dieses Serum war unter Einsatz von Methodik behandelt worden, die in diesen Dokumenten beschrieben wird. Kurz zusammengefasst wurde Serum 1 : 10 verdünnt und dann mit transfiziertem E.coli- Lysat vorabsorbiert. Nach diesem Vorabsorptionsschritt wurde das absorbierte Serum 1 : 10 verdünnt, was eine Endverdünnung von 1 : 100 ergab. Nach der Endverdünnung wurden die Proben über Nacht bei Raumtemperatur unter Einsatz der oben angeführten Methodik mit Nitrocellulosemembranen inkubiert, die Phagenplaques enthielten. Die Nitrocellulosemembranen wurden gewaschen, mit an alkalische Phosphatase konjugiertem Ziegen-anti-Human-Fγ-Sekundärantikörpern inkubiert, und die Reaktion wurde mit den Substraten 5-Brom-4-chlor-3-indolylphosphat und Nitroblau-Tetrazolium beobachtet. In einem sekundären Screening wurden jegliche Phagemide, die für Human-Immunglobulin kodierten, entfernt.
Es wurden insgesamt 3,6 · 10&sup5; pfus gescreent, was 8 positive Klone ergab. Es wurden Standard-Sequenzierungsreaktionen durchgeführt, und die Sequenzen wurden mit Sequenzbanken bekannter Sequenzen verglichen.
Von den 8 Klonen wurde bei 2 davon festgestellt, dass die für bekannte mit Autoimmunerkrankung assoziierten Molekülen kodieren, d. h. Golgin - 95 (Fritzler et al., J. Expression. Med. 178-49-62 (1993)), und Human-Upstream-Bindungsfaktor (Chan et al., J. Exp. Med. 174, 1239-1244 (1991)). Von drei anderen Klonen wurde festgestellt, dass sie für Proteine kodieren, die weithin in menschlichem Gewebe exprimiert werden, d. h. Ribosomalrezeptor, Collagen-Typ VI-Globulardomäne und Repamycin-Bindungsprotein. Von den verbleibenden drei Sequenzen erwies sich eine als mit keiner bekannten Sequenz homolog, diese wurde aber überall in menschlichem Gewebe exprimiert (das wurde durch RT-PCR-Analyse festgestellt, es werden hier aber keine Details angeführt). Die verbleibenden beiden erwiesen sich als identisch mit HOM-MEL-40 voller Länge, wie in 08/479.328 beschrieben, während festgestellt wurde, dass die 8 Klone annähernd identisch mit "SSX3" sind, wie von DeLeeuw et al., Cytogenet. Cell Genet. 73, 179-183 (1996) beschrieben, da sie sich davon nur durch zwei Basenpaar-Unterschiede in der Kodierungsregion unterscheiden. Diese Unterschiede sind vermutlich von künstlicher Art; der Klon umfasste jedoch auch eine untranslatierte 3'-Region mit 43 Basenpaaren.

BEISPIEL 2

Um Southernblotting-Versuche durchzuführen, wie nachstehend beschrieben, wurden die SSX-Gene unter Einsatz von RT-PCR amplifiziert.
Zu diesem Zweck wurden zwei Primer unter Verwendung der veröffentlichten SSX2-Sequenz, d. h. MEL-40A:
5' - CACACAGGAT CCATGAACGG AGA
(Seq.-ID Nr. 3);
und
MEL-40B:
5' - CACACAAAGC TTTGAGGGGA GTTACTCGTC ATC
(Seq.-ID Nr. 4)
hergestellt.
Siehe Crew et al., EMBO J. 14, 2333-2340 (1995). Dann wurde Amplifizierung unter Einsatz von 0,25 Einheiten Taq-Polymerase in einem 25 ul-Reaktionsvolumen durchgeführt, wobei eine Annelierungstemperatur von 60ºC eingesetzt wurde. Es wurden insgesamt 35 Zyklen durchgeführt.

BEISPIEL 3

Die oben beschriebene RT-PCR-Methodik wurde an ein Hoden-Gesamt-RNA durchgeführt, und das Amplifizierungsprodukt wurde bei Southernblotting-Versuchen eingesetzt.
Genomische DNA wurde aus nicht-neoplastischen Gewebeproben extrahiert und dann Restriktionsenzymspaltung unter Einsatz von BamHl, Eco RI oder HindIII in eigenen Versuchen unterzogen und dann auf einem 0,7% Agarosegel getrennt, gefolgt von Blotting auf Nitrocellulosefilter. Die oben beschriebenen Amplifizierungsprodukte wurden unter Einsatz bekannter Verfahren mit 32P markiert, und die markierten Materialien wurden dann unter stark verschärften Bedingungen (65ºC, wässriger Puffer) als Sonden verwendet, gefolgt von Wäschen unter verschärften Bedingungen, was mit einer abschließenden Wäsche bei 0,2 · SSC, 0,2%SDS, 65ºC endete.
Das Southernblotting zeigte in jedem Fall mehr als 10 Banden (d. h. jedes der BamHI-, EcRI- und HindIII-Digeste), was stark darauf hindeutet, dass es eine Familie von SSX-Genen gibt, die mehr als die drei zuvor identifizierten enthält. In Anbetracht dieser Beobachtung wurde ein Ansatz entwickelt, bei dem PCR-Klonierung einerseits und Restriktionskarten-Analyse andererseits kombiniert wurden, um andere SSX-Gene zu identifizieren.

BEISPIEL 4

Beim Vergleich der Sequenzen von SSX1, 2 und 3 wurde festgestellt, dass sie in hohem Maße konservierte 5'- und 3'-Regionen gemeinsam haben, was erklärte, warum die Oligonucleotide von Seq.-ID-Nr. 3 und 4 in der Lage waren, unter den genannten Bedingungen alle drei Sequenzen zu amplifizieren, und darauf hindeutet, dass diese Homologie der Familie von SSX-Genen unabhängig von ihrer Größe gemeinsam ist. Somit würden die Oligonucleotide von Seq.-ID-Nr. 3 und 4 ausreichen, um die anderen Mitglieder der SSX-Genfamilie zu amplifizieren.
Eine Analyse der Sequenzen von SSX1, 2 und 3 zeigte, dass SSX1 und 2 eine BgIII-Stelle enthielten, die SSX3 nicht aufwies. Auf ähnliche Weise enthielt Ssx3 eine EcoRV-Stelle, die die anderen Gene nicht enthielten.
In Anbetracht dieser Informationen wurde Hoden-cDNA unter Verwendung von Seq.- ID-Nr. 3 und 4 wie oben beschrieben amplifiziert und wurde dann BgIII-Spaltung unterzogen. Es wurden dann alle BgIII-resistenten Sequenzen kloniert, sequenziert und mit den bekannten Sequenzen verglichen.
Das führte zur Identifizierung einer zuvor nicht identifizierten Sequenz, die in der Folge als SSX4 bezeichnet wird und hier als Seq.-ID-Nr. 1 dargelegt ist. Bei einer Suche der GenBank-Datenbank wurden zwei Klone gefunden, die die Eintragungsnummern N24445 und W00507 haben, die beide aus von Sequenz-Tag stammenden cDNA-Segmenten bestanden. Der durch N2445 identifizierte Klon enthielt die untranslatierte 3'- Region von SSX4 und einen Teil seiner Kodierungssequenz, während der als W00507 bezeichnete ein kürzeres Fragment aus der untranslatierten 3-Region von SSX4 und einen längeren Teil aus der Kodierungssequenz enthielt. Spezifisch besteht N24445 aus Base 344 von SSX4 (Seq.-ID-Nr. 1) bis zum 3-Ende plus 319 Basen 3' vom Stopcodon. Die W00507-Sequenz besteht aus einer Sequenz mit 99 Basen paaren, die keine Homologie zu SSX-Genen aufweist, gefolgt von einer Region, die mit den Nucleotiden 280 bis zum Ende der Seq.-ID-Nr. 1 identisch ist, über 67 Basen 3' zum Stopcodon von Seq.-ID- Nr. 1.
Es wurden zwei Formen von SSX4 (Seq.-ID-Nr. 1) identifiziert. Einer davon fehlten die Nucleotide 331 bis 466, sie war aber ansonsten mit SSX4 wie in Seq.-ID-Nr. dargestellt identisch. Wie nachstehend beschrieben ist die kürzere Form eine alternativ gespleißte Variante.
In der nachstehenden Tabelle 1 werden die Nucleotid- und Aminosäuresequenzen der 5 bekannten Mitglieder der SSX-Familie verglichen. Die Nucleotid-Homologie ist der Tabelle horizontal gelesen zu entnehmen, und die Aminosäure-Homologie durch vertikales Lesen. TABELLE 1 - NUCLEOTID- UND AMINOSÄURE-HOMOLOGIE UNTER MITGLIEDERN DER SSX-FAMILIE
Somit weisen SSX1 und SSX4 zu 89,4% Homologie auf Nucleotid-Ebene auf und zu 78,3% Homologie auf Aminosäure-Ebene.
Wenn die verkürzte Form von SSX4 analysiert wird, weist sie aufgrund des abwechselnden Spleißens und Verschiebenes eines stromab gelegenen offenen Leserahmens eine vollständig andere Aminosäuresequenz auf als andere. Das mutmaßliche Protein ist 153 Aminosäuren lang, und die 42 carboxyterminalen Aminosäuren weisen keine Homologie mit den anderen SSX-Proteinen auf.

BEISPIEL 5

Dann wurde die genomische Organisation der SSX2-Gene untersucht. Zu diesem Zweck wurde eine genomische Humanplazenta-Bibliothek (in λ-Phagen) gescreent, wobei die gleiche Vorschrift und die gleichen Sonden wie oben bei der Erörterung der Southernblotting-Arbeit beschrieben verwendet wurden. Alle positiven primären Klone wurden über zwei zusätzliche Klonierungsrunden gereinigt.
Es wurden mehrere positive Klone isoliert, von denen einer teilweise sequenziert und als genomischer Klon von SSX2 identifiziert wurde. Es folgte eine Reihe von Versuchen, bei denen Standard-Subklonierungs- und Sequenzierungsarbeit durchgeführt wurde, um die Exon-Intron-Grenzen zu definieren.
Die Analyse zeigte, dass das SSX2-Gen 6 Exons enthält und zumindest 8 Kilobasen umspannt. Es erwies sich, dass alle definierten Grenzen die Konsenssequenz von Exon/Intron-Verbindungen, d. h. GT/AG, beachten.
Es wurde festgestellt, dass der alternativen Spleißvariante von SSX4, wie oben erörtert, das 5. Exon in der Kodierungsregion fehlt. Das wurde bestätigt, indem sie mit dem genomischen SSX2-Klon verglichen und Korrelationen daraus abgeleitet wurden.

BEISPIEL 6

Dann wurde die Expression einzelner SSX-Gen in normalen und Tumor-Geweben untersucht. Das erforderte die Konstruktion spezifischer Primer auf Basis der bekannten Sequenzen, und diese sind nachstehend als Seq.-ID Nr. 5-14 angeführt: Tabelle 2 - GEN-SPEZIFISCHE PCR-PRIMERSEQUENZEN FÜR EINZELNE SSX-GENE
Die Spezifität der Kkone wurde durch Amplifizieren der zuvor identifizierten cDNA für SSX1 bis SSX5 bestätigt. Es wurde Taq-Polymerase bei 60ºC für SSC1 und 4, und 65ºC für SSX2, 3 und 5 eingesetzt. Jeder Satz von Primerpaaren erwies sich als spezifisch, mit der Ausnahme, dass festgestellt wurde, dass die SSX2-Primer winzige (weniger als 1/20 SSX2) Mengen an SSX3-Plasmid-DNA amplifizieren.
Sobald die Spezifität bestätigt wurde, wurden die Primer verwendet, um Hoden-mRNA zu analysieren, wobei die oben angeführten RT-PCR-Protokolle eingesetzt wurden.
In allen 5 Fällen wurden die erwarteten PCR-Produkte gefunden, und Amplifizierung mit dem SSX4-Paar ergab zwei Amplifizierungsprodukte, was mit alternativen Spleißvarianten in Einklang steht.
Dann wurde die Expression von SSX-Genen in kultivierten Melanozyten untersucht. RT- PCR wurde unter Einsatz der oben dargelegten Protokolle durchgeführt. Es wurde kein PCR-Produkt festgestellt. Reamplifizierung ergab eine kleine Menge an SSX4-Produkt, einschließlich beider alternativen Formen, was darauf hindeutet, dass die SSX4-Expression in kultivierten Melanozyten unbeständig ist und in sehr geringen Mengen auftritt, wenn sie stattfindet.
Diese Analyse wurde dann auf ein Panel von 12 Melanom-Zelllinien ausgedehnt. Diese Ergebnisse sind in der nachstehenden Tabelle angeführt. Tabelle 3 - DURCH RT-PCR ERMITTELTE SSX-EXPRESSION IN MELANOM-ZELLLINIEN¹
¹ Das Ausmaß an Expression wurde durch die Intensität von Ethidiumbromid-gefärbten RT-PCR-Produkten beurteilt: +++: starke Amplifizierung; +/-: schwache Amplifizierung; -: keine Amplfiizierung.
Die obigen Beispiele beschreiben die Isolierung und Klonierung von Nucleinsäuremolekülen für das SSX4 und die Spleißvariante von SSX4-Gen. Wie oben angeführt wird dieses Gen in Tumorzellen exprimiert, wodurch es Fachleuten auf dem Gebiet der Erfindung möglich ist, dies beispielsweise zum Testen auf Krebs wie Melanom einzusetzen. Da das Gen ein Protein exprimiert, das wiederum die Erzeugung von Antikörpern in vivo hervorrufen würde, ist dieses Protein ebenfalls ein Teil der Erfindung, ebenso wie die dafür spezifischen Antikörper.
Die isolierten Nucleinsäuremoleküle gemäß vorliegender Erfindung umfassen jene degenerierten Sequenzen, die, obwohl sie nicht identisch mit Seq.-ID Nr. 1 oder seiner Spleißvariante sind, für die gleichen Proteine wie diese Sequenzen kodieren. Ebenfalls Teil der Erfindung sind Expressionsvektoren, die diese Moleküle operabel an einen Promotor gebunden umfassen, und die Zelllinien oder Zellstämme, die mit diesen Vektoren transformiert oder transfiziert sind, oder die Nucleinsäuremoleküle selbst. Diese sind alle beispielsweise bei der Herstellung des Proteins sowie bei der Erzeugung amplifizierter Kopien der relevanten Sequenzen nützlich.
Ebenfalls Teil der Erfindung sind die hierin durch Seq.-ID-Nr. 11 und 12 definierten Nucleinsäuremoleküle, Zusammensetzungen, in denen sie enthalten sind, sowie ihre Verwendung beim Testen bezüglich der Expression eines oder mehrerer SSX-Gene. Es kann jede beliebige Nucleinsäurehybridisierungsmethodik eingesetzt werden, einschließlich PCR-Methodiken. Die Antikörper der Erfindung können ebenfalls bei Tests eingesetzt werden, aber in diesem Fall ist das Target das Expressionsprodukt der SSX-Gene.
Andere Merkmale der Erfindung werden Fachleuten auf dem Gebiet der Erfindung klar sein und müssen hier nicht wiederholt werden.
Die bisher verwendeten Begriffe und Ausdrücke dienen der Beschreibung und nicht als Einschränkung, es ist nicht beabsichtigt, durch die Verwendung dieser Begriffe und Ausdrücke irgendwelche Äquivalente für die gezeigten und beschriebenen Merkmale oder Teile davon auszuschließen, wobei festzustellen ist, dass innerhalb des Schutzumfangs der Erfindung verschiedene Modifikationen möglich sind.

(1) ALLGEMEINE INFORMATIONEN:

(i) ANMELDER: Gure, Ali O.; Tureci, Ozlem, Sahin, Ugur; Tsang, Solam; Scanlan, Matthew J.; Knuth Alexander; Pfreundschuh, Michael; Old, Llyod J.; Chen, Yao-Tseng
(ii) TITEL DER ERFINDUNG: Isolierte Nucleinsäuremoleküle, die für Mitglieder der SSX-Familie kodieren, und deren Verwendung
(iii) ANZAHL DER SEQUENZEN: 1
(iv) KORRESPONDENZADRESSE:
(A) ADRESSAT: Felt & Lynch
(B) STRASSE: 805 Third Avenue
(C) STADT: New York City
(E) BUNDESSTAAT: New York
(F) PLZ: 10022
(v) COMPUTERLESBARE FORM:
(A) ART DES MEDIUMS: 3,5-Zoll Diskette, 144 kb Speicher
(B) COMPUTER: IBM
(C) BETRIEBSSYSTEM: PC-DOS
(D) SOFTWARE: Wordperfect
(vi) AKTUELLE ANMELDUNGSDATEN:
(A) ANMELDENUMMER:
(B) EINREICHDATUM:
(vii) PRIORITÄTSANMELDUNGSDATEN:
(A) ANMELDENUMMER: 08/851,138
(B) ANMELDEDATUM: 5. Mai 1997
(C) KLASSIFIZIERUNG: 435
(viii) INFORMATIONEN ÜBER ANWALT/VERTRETER:
(A) NAME: Hanson, Norman D.
(B) REGISTRIERUNGSNUMMER: 30,946
(C) KENNZEICHEN/AKTENZAHL: LUD 5480 = PCT
(ix) TELEKOMMUNIKATIONSINFORMATIONEN:
(A) TELEFON: (212) 688-9200
(B) TELEFAX: (212) 838-3884
(2) INFORMATIONEN FÜR SEQ.-ID Nr. 1
(i) SEQUENZMERKMALE:
(A) LÄNGE: 576 Nucleotide
(B) TYP: Nukleinsäure
(C) ANZAHL DER STRÄNGE: einzeln
(D) TOPOLOGIE: linear (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: Seq.-ID Nr. 1:

Claims

1. Isoliertes Nucleinsäuremolekül, das für ein Protein kodiert, dessen Aminosäuresequenz aus der Aminosäuresequenz besteht, für die Seq.-ID Nr. 1 kodiert oder die Nucleotide 1-330, verkettet mit den Nucleotiden 467-576 von Seq.-ID Nr. 1 kodieren.

2. Isoliertes Nucleinsäuremolekül nach Anspruch 1, worin das isolierte Nucleinsäuremolekül für das Protein kodiert, für das Seq.-ID Nr. 1 kodiert.

3. Isoliertes Nucleinsäuremolekül nach Anspruch 1, worin das isolierte Nucleinsäuremolekül für das Protein kodiert, für das die Nucleotide 1-330, verkettet mit den Nucleotiden 467-576 von Seq.-ID Nr. 1 kodieren.

4. Isoliertes Nucleinsäuremolekül nach Anspruch 1, das aus der Nucleotidsequenz von Seq.-ID Nr. 1 besteht.

5. Isoliertes Nucleinsäuremolekül nach Anspruch 1, das aus der Nucleotidsequenz besteht, die durch die Nucleotide 1-330, verkettet mit den Nucleotiden 467-576, wie in Seq.-ID Nr. 1 angegeben, definiert wird.

6. Expressionsvektor, der ein isoliertes Nucleinsäuremolekül nach einem der Ansprüche 1 bis 5 mit einem Promotor operabel verbunden umfasst.

7. Zelllinie oder Zellstamm, die bzw. der mit einem isolierten Nucleinsäuremolekül nach einem der Ansprüche 1 bis 5 transformiert oder transfiziert ist.

8. Zelllinie oder Zellstamm, die bzw. der mit einem Expressionsvektor nach Anspruch 6 transformiert oder transfiziert ist.

9. Isoliertes Protein, für das ein isoliertes Nucleinsäuremolekül nach einem der Ansprüche 1 bis 5 kodiert.

10. Isoliertes Nucleinsäuremolekül, das zum Bestimmen der Expression eines SSX4- Gens in einer Probe nützlich ist, wobei das isolierte Nucleinsäuremolekül aus der in Seq.-ID Nr. 11 oder Seq.-ID Nr. 12 angegebenen Nucleotidsequenz besteht, wie in Tabelle 2 gezeigt.

11. Zum Bestimmen der Expression eines SSX-Gens in einer Probe nützliche Zusammensetzung, umfassend (a) Seq.-ID Nr. 3 und Seq.-ID Nr. 4, wie in Beispiel 2 gezeigt, (b) Seq.-ID Nr. 5 und Seq.-ID Nr. 6, (c) Seq.-ID Nr. 7 und Seq.-ID Nr. 8, (d) Seq.-ID Nr. 9 und Seq.-ID Nr. 10, (4) Seq.-ID Nr. 11 und Seq.-ID Nr. 12, und (f) Seq.-ID Nr. 13 und Seq.-ID Nr. 14, wie in Tabelle 2 gezeigt.

12. Verfahren zum Bestimmen der Expression eines SSX4-Gens in einer Probe, umfassend das Kontaktieren der Probe mit zumindest einem isolierten Nucleinsäuremolekül nach Anspruch 10 und das Bestimmen der Hybridisierung des isolierten Nucleinsäuremoleküls an ein Target als Bestimmung der Expression eines SSX4-Gens in der Probe.

13. Isolierter Antikörper, der sich spezifisch an ein isoliertes Protein nach Anspruch 9 bindet.

14. Verfahren zum Nachweis der Gegenwart eines Expressionsprodukts eines SSX4- Gens in einer Probe, umfassend das Kontaktieren der Probe mit einem isolierten Antikörper nach Anspruch 13 und das Bestimmen der Bindung des Antikörpers an ein Target als Nachweis der Gegenwart des Expressionsprodukts eines SSX4-Gens in der Probe.