DE3586511T2 - Diagnostisches reagenz zur bestimmung von harnstickstoff. - Google Patents
Diagnostisches reagenz zur bestimmung von harnstickstoff.Info
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Description
- Die vorliegende Erfindung betrifft allgemein die Methodologie der Harnstoffbestimmung und insbesondere ein kolorimetrisches Reagenz zur Bestimmung des Stickstoffs im Harnstoff sowie seinen Einsatz.
- Zur Bestimmung des Stickstoffs im Harnstoff sind bisher im wesentlichen drei Gruppen von Methoden in Gebrauch. Sie können eingeteilt werden in vermischte Methoden, Methoden, die auf der Umsetzung mit Diacetylmonoxim oder ähnlichen Verbindungen beruhen, sowie Methoden unter Verwendung von Urease. Die Methoden unter Verwendung von Diacetylmonoxim und Urease sind die gebräuchlichsten geworden.
- Im Jahre 1939 fand Fearon (Biochem. J. 33 : 902-907 (1930), daß die Umsetzung von Diacetylmonoxim (DAM) mit nachfolgender Oxidation Färbungen mit Verbindungen der Formel R&sub1;-NH-CO-NHR&sub2; erzeugte, wenn R&sub1; entweder Wasserstoff oder einen einzelnen aliphatischen Rest bedeutet. R&sub2; ist kein Acylrest und gewöhnlich Wasserstoff. Färbungen wurden mit Harnstoff, Kreatinin, Methylharnstoff (und Harnstoffderivaten), Allantoin und Proteinen erzeugt. Viele substituierte Harnstoffe ergaben eine rote Färbung, jedoch erzeugte lediglich Harnstoff eine gelbe Färbung. (Koritz et al, J. Bio. Chem. 209 : 145-150 (1954)).
- Im Jahre 1942 wandte Ormbsy (J. Biol. Chem. 146 : 595- 604 (1942)) die Diacetylmonoxim-Umsetzung (DAM) in stark saurem Medium auf die Bestimmung von Harnstoff an. Die resultierende Färbung wurde durch Oxidation mit Kaliumpersulfat verstärkt. Es wurden auch andere Oxidationsmittel verwendet und auch in der Literatur beschrieben.
- Natelson, Scott und Beffa (Am. J. Clin. Pathol. 21 : 275-281 (1951)) umgingen die Notwendigkeit der Verwendung von Oxidationsmitteln durch die Verwendung von freiem Diacetyl anstatt des Derivats.
- Im Jahre 1963 zeigten Coulombe und Favreau (Clin. Chem. 9 : 102-108 (1963)) den Effekt von Thiosemicarbazid auf die direkte Umsetzung zwischen Diacetylmonoxim und Harnstoff. Diese Verbindung verstärkte die Färbung weiter und inhibierte die Lichtempfindlichkeit. Anschließend wurde das Semicarbazid-Reagenz zum Bestandteil eines automatisierten Verfahrens gemacht, das von Pellerin (Clin. Chem. 10:374 : 375 (1964)) beschrieben wurde.
- Im Jahre 1965 legten Marsh, Fingerhut und Miller (Clin. Chem. 11 : 624-627 (1965)) sowohl ein automatisiertes als auch ein im Handbetrieb arbeitendes Diacetylmonoxim-Verfahren zur unmittelbaren Bestimmung von Harnstoff vor. Beide Methoden erwiesen sich zufolge des kombinierten Einsatzes von Thiosemicarbazid und von Eisen(III)-Ionen als hochempfindlich.
- Trotz der obigen Vorteile wurden derartige Harnstoffbestimmungen jedoch aufgrund der Instabilität von Arbeitslösungen beeinträchtigt, die zu einer eingeschränkten Gebrauchsdauer und zu möglicherweise irrtümlichen Ergebnissen führten.
- Wir haben nun ein diagnostisches Reagenz für diese kolorimetrische Bestimmung entwickelt, das eine gute Gebrauchsdauer aufweist und zu einer erhöhten Empfindlichkeit und Linearität führt, wenn es bei Stickstoffbestimmungen in Harnstoff verwendet wird, wobei es schnelle und genaue Ergebnisse liefert.
- Gemäß der Erfindung wird eine diagnostische Reagenzlösung geschaffen, die sich zur kolorimetrischen Bestimmung von Stickstoff in Harnstoff eignet und beim Aufbewahren stabil bleibt, wobei die Lösung enthält:
- (a) 0,02 bis 5,0% (Gewicht/Volumen) von Diacetylmonoxim oder einem Derivat davon,
- (b) 0,001 bis 0,2% (Gewicht/Volumen) eines Farbverstärkers und
- (c) bis 0,5% (Gewicht/Volumen) einer Verbindung der Formel:
- worin R eine Alkyl- oder Amino- oder eine Mono- oder Dialkylaminogruppe ist, wobei die Alkylgruppe(n) 1 bis 4 Kohlenstoffatome aufweist bzw. aufweisen, X eine Iminogruppe bedeutet und n 0,1 oder 2 ist,
- oder eines Thiosalzes davon.
- Ein bevorzugter Farbverstärker ist Thiosemicarbazid. Bevorzugte Verbindungen für die Komponente (c) sind diejenigen der Formeln
- und
- Die Reagenzien gemäß der Erfindung (insbesondere die bevorzugten Reagenzien) können für kolorimetrische Bestimmungen von Harnstoff-Stickstoff in einer Harnstoff enthaltenden Probe verwendet werden, wobei die Harnstoffkonzentration der Probe in linearer Beziehung zu einem gefärbten Umsetzungsprodukt steht, das sich bei 520 nm kolorimetrisch bestimmen läßt.
- Wie schon zuvor beschrieben haben Coulombe und Favreau den Effekt von Thiosemicarbazid auf die direkte Umsetzung zwischen Diacetylmonoxim und Harnstoff gezeigt, nämlich die verstärkte Farbe. Jedoch sind Farbreagenzien für die Harnstoff-Stickstoff-Bestimmung, die Diacetylmonoxim und Thiosemicarbazid enthalten, instabil. Es besteht die Notwendigkeit, ein Reagenz zu schaffen, das haltbar ist, d. h. mindestens sechs Monate bei Raumtemperatur stabil ist und das dennoch seine volle Empfindlichkeit und Linearität behält, was das Ziel der vorliegenden Erfindung ist. Im vorliegenden Fall werden "Empfindlichkeit" als etwa 0,0022 Absorptionseinheiten je mg Harnstoff-Stickstoff/dl und "Linearität" als lineare Reaktion auf Testproben im Bereich von 0 bis 150 mg Harnstoff-Stickstoff/dl definiert.
- Die Reagenzien gemäß der Erfindung können zum kolorimetrischen Bestimmen des Harnstoffgehaltes von Fluiden, wie beispielsweise Blutserum, Plasma, Urin und Spinalflüssigkeit, verwendet werden.
- Das farberzeugende Agens ist vorzugsweise Diacetyl, obwohl jedes Derivat davon, wie beispielsweise Diacetylmonoxim, verwendet werden kann, solange die erforderliche Ureid-Gruppenreaktion stattfindet, um eine meßbare gelbe Färbung zu erzeugen. Es ist bevorzugt, 0,02 bis 5,0% (Gewicht/Volumen) des farberzeugenden Agens im Reagenz zu haben, wobei 0,1 bis 0,3% (Gewicht/Volumen) am meisten bevorzugt sind.
- Während, wie oben erwähnt, der Farbverstärker vorzugsweise Thiosemicarbazid ist, kann auch jedes andere Material verwendet werden, das die oben beschriebene Färbung sowie den Wechsel des Farbtons von Gelb zu Rot verstärkt. Es ist bevorzugt, 0,001 bis 0,2% (Gewicht/Volumen) des Farbverstärkers zu verwenden, und am meisten bevorzugt ist ein Bereich von 0,002 bis 0,5% (Gewicht/Volumen).
- Es ist bevorzugt, bis zu 0,5% (Gewicht/Volumen) der Verbindung der Komponente (c) in der Reagenzzusammensetzung zu verwenden, wobei die am meisten bevorzugte Menge im Bereich von 0,02 bis 0,1% (Gewicht/Volumen) liegt.
- Die Erfindung umfaßt auch eine kolorimetrische Bestimmung des Harnstoffgehalts von Fluiden, bei der ein diagnostisches Reagenz gemäß der Erfindung verwendet wird. Harnstoff ist das Hauptendprodukt des Proteinstoffwechsels im Blut, und seine Konzentration im Blut ergibt einen Indikator für die Nierenfunktion. Die quantitative Ermittlung von Harnstoff ist daher ein unschätzbares Werkzeug für die Analyse von Nierenfunktionsstörungen.
- Wenngleich die am meisten bevorzugte Anwendung des Verfahrens gemäß der Erfindung sich auf Blutserum bezieht, ist das Verfahren selbstverständlich auch auf andere Körperflüssigkeiten anwendbar, wie beispielsweise auf Blutplasma, Urin, Spinalflüssigkeit oder jede beliebige Harnstoff enthaltende wäßrige Lösung.
- Die folgenden Beispiele dienen der Erläuterung der Erfindung.
- Dieses Beispiel beschreibt die Verwendung einer Zusammensetzung gemäß der Erfindung zur Bestimmung von Stickstoff im Blutharnstoff mit Hilfe des analytischen Systems SMAC (SMAC ist ein eingetragenes Warenzeichen). Das SMAC- System wurde bei diesem Beispiel gemäß den schriftlichen Herstellerinstruktionen von TECHNICON INSTRUMENTS CORPORATION, Tarrytown, New York 10591 verwendet.
- Entionisiertes Wasser 1,0 l
- Oberflächenaktives Mittel (ein geeignetes oberflächenaktives Mittel ist eine 30%ige wäßrige Lösung von Brij. -35, Warenzeichen von ICI Americas, Inc., Wilmington, Delaware) 0,001 l
- Entionisiertes Wasser 1,0 l
- Diacetylmonoxim 2,0 g
- Thiosemicarbazid 0,2 g
- Natriumsalz von 1-Cyano-3-methylisothioharnstoff 0,6 g
- Oberflächenaktives Mittel und andere nichtaktive Bestandteile
- Schwefelsäure, konzentriert 0,25 l
- Phosphorsäure, konzentriert 0,0012 l
- Eisen(III)-Chlorid, Hexahydrat 0,06 g
- Entionisiertes Wasser ad 1 l
- Eine Serumprobe wird in das System eingeführt und in einem mit Luft segmentiertem Strom des BUN-Probenverdünnungsmittels bis auf ein Verhältnis von 74 ul Probe/287 ul Verdünnungsmittel verdünnt. Nach dem Vermischen wird die verdünnte Probe einer Dialysemembran ausgesetzt. Der Harnstoff dialysiert durch die Membran in 385 ul eines ständigen Stroms aus BUN-Farbreagenz. Der die zu analysierende Probe enthaltende BUN-Farbreagenz-Strom wird dann mit 226 ul BUN-Säurereagenz angesäuert. Nach dem Ansäuern durch Zusatz des BUN- Säurereagenzes wird der Strom des Umsetzungsgemisches auf 90ºC erhitzt, wobei das Thiosemicarbazid die Farbe verstärkt. Die Absorption des Stroms des Umsetzungsgemisches wird in einer Durchflußzelle bei 520 nm gemessen. Die beobachtete Absorption ist proportional dem Harnstoff-Stickstoff in der Probe, und die Harnstoff-Stickstoff-Konzentration wird durch Vergleich mit einem geeigneten Standard errechnet.
Claims (5)
1. Haltbare diagnostische Reagenzlösung, verwendbar
für die kolorimetrische Bestimmung von Harnstoff-
Stickstoff in einer Harnstoff enthaltenden Probe,
wobei die Lösung enthält:
(a) 0,02 bis 5,0% (Gewicht/Volumen) von
Diacetylmonoxim oder einem Derivat davon,
(b) 0,001 bis 0,2% (Gewicht/Volumen) eines
Farbverstärkers und
(c) bis 0,5% Gewicht/Volumen) einer Verbindung der
Formel
worin R eine Alkyl-, Amino- oder Mono- oder
Dialkylaminogruppe bedeutet, wobei die Alkylgruppe(n) 1 bis 4
Kohlenstoffatome aufweist bzw. aufweisen, X eine Iminogruppe
bedeutet und n 0,1 oder 2 ist,
oder eines Thiosalzes davon.
2. Reagenz gemäß Anspruch 1, worin der Farbverstärker
Thiosemicarbazid ist.
3. Reagenz gemäß Anspruch 1 oder 2, worin die
Komponente (c) eine Verbindung der Formel
ist.
4. Reagenz gemäß Anspruch 1 oder 2, worin die
Komponente (c) eine Verbindung der Formel
ist.
5. Kolorimetrisches Verfahren zur Bestimmung von
Harnstoff-Stickstoff in einer Harnstoff enthaltenden
Probe, wobei das diagnostische Reagenz gemäß einem
der Ansprüche 1 bis 4 verwendet wird.
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