DE3501865C2

DE3501865C2 -

Info

Publication number: DE3501865C2
Application number: DE19853501865
Authority: DE
Inventors: Christian 5110 Alsdorf De Matschke
Original assignee: B Braun Melsungen AG
Current assignee: B Braun Melsungen AG
Priority date: 1985-01-22
Filing date: 1985-01-22
Publication date: 1989-05-11
Also published as: DE3501865A1

Description

Die Erfindung betrifft das im Anspruch 1 angegebene Verfahren zur Elektrofusion von Zellen. Anspruch 2 betrifft die Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens nach An spruch 1. Die Ansprüche 3 bis 5 betreffen Ausgestaltungen dieser Vorrichtung.The invention relates to the method for electrofusion specified in claim 1 of cells. Claim 2 relates to the device for Execution of the procedure according to An saying 1. The claims 3 to 5 relate Refinements of this device.

Bisher wird bei der Elektrofusion von Zellen so ver fahren, daß die Zellsuspension auf einer Oberfläche eines Zellträgers aufgebracht wird, die mit mindestens zwei Elektroden versehen ist (U. Zimmermann and J. Vienken, J. Membran Biol. 67, 165 (1982) und U. Zimmermann, Biochimica et Biophysica Acta, 694, 227- 277 (1982)). Die Zellsuspension verteilt sich dabei so auf der Oberfläche des Zellträgers, daß sie mit den beiden Elektroden in Kontakt kommt. Das Fusionsvolumen entspricht dabei einem von den beiden Elektroden und der Zellträgerplatte gebildeten Kanal, der von den elektrischen Feldern durchsetzt wird. Nach Anlegen ei nes elektrischen Wechselfeldes werden beispielsweise zu fusionierende Zellen zunächst durch Dielektrophorese aneinandergereiht und im Anschluß daran wird ein die Fusion der Zellen herbeiführender elektrischer Feldim puls appliziert.So far, electrofusion of cells has been used in this way drive that cell suspension on a surface a cell carrier is applied with at least two electrodes (U. Zimmermann and J. Vienken, J. Membrane Biol. 67, 165 (1982) and U. Zimmermann, Biochimica et Biophysica Acta, 694, 227- 277 (1982)). The cell suspension is distributed so on the surface of the cell support that they with the comes into contact with both electrodes. The fusion volume corresponds to one of the two electrodes and the channel formed by the cell support plate electrical fields. After creating an egg Nes alternating electrical field, for example fusing cells first by dielectrophoresis strung together and then a Fusion of cells producing electrical field pulse applied.

Es ist auch bekannt (DE 33 17 415 A1), anstelle des Zellträgers mit Elektroden eine Kammer zu verwenden, bei der das Fusionsvolumen durch einen Innenkörper und einen diesen mit gleichbleibendem Ab stand umschließenden Außenkörper begrenzt ist, wobei dieses Fusionsvolumen durch die zwischen dem Innen- und dem Außenkörper spiralförmig angeordneten Elektro den die Form einer mehrgängigen, den Innenkörper um gebenden Schraube besitzt.It is also known (DE 33 17 415 A1), a chamber instead of the cell carrier with electrodes to be used in which the fusion volume by a Inner body and one with the same ab stood enclosing outer body is limited, being this fusion volume through the between the interior and the outer body spirally arranged electro the shape of a multi-course, the inner body around owning screw.

Unmittelbar nach einer derartige Fusion sind die neu entstandenen Zellen sehr labil, da durch den Feldimpuls erzeugte Löcher der Zellmembran erst im Laufe der Zeit ausheilen und die fusionierte Zelle noch eine langge streckte, einer Aneinanderreihung der Zellen vor der Fusion ähnelnde Form besitzt, die sich erst nach einiger Zeit abrundet und eine energetisch günstigere und mecha nisch stabilere runde Form einnimmt.Immediately after such a merger, they are new resulting cells very unstable because of the field pulse created holes in the cell membrane only over time heal and the fused cell a long time stretched, a series of cells in front of the Fusion resembles a shape that only becomes apparent after a few Rounds off time and an energetically cheaper and mecha nically more stable round shape.

Trotz dieser Labilität der Zellen ist es notwendig, daß die Zellsuspension nach der Fusion möglichst schnell aus dem Fusionsvolumen entfernt wird. Dies hat zum ei nen den Grund, daß das Fusionsvolumen für die Fusion weiterer Zellen verwendet werden soll, und zum anderen ist dies darin begründet, daß die fusionierten Zellen möglichst schnell in ein Nachbehandlungsmedium überführt werden sollten, da ein zur Herstellung verwendetes und auch für die Durchführung der Fusion erforderliches spezielles Fusionsmedium die neu fusionierten Zellen im Laufe der Zeit schädigt und folglich deren Über lebensrate beträchtlich reduziert.Despite this cell lability, it is necessary that the cell suspension as soon as possible after the fusion is removed from the fusion volume. This has the egg nen the reason that the fusion volume for the fusion other cells to be used, and the other this is because the fused cells transferred to a post-treatment medium as quickly as possible should be used as a and also necessary for the implementation of the merger special fusion medium the newly fused cells damaged over time and consequently their excess life rate considerably reduced.

Bisher werden die fusionierten und zum Teil noch leicht an den Elektroden haftenden Zellen dadurch aus dem Fu sionsvolumen in das Sammelvolumen überführt, daß man diese aus dem Fusionsvolumen absaugt - beispielsweise mit einer Mikropipette - oder daß man das Fusionsvolumen ausspült, wobei als Spülmedium beispielsweise das Nach behandlungsmedium verwendet wird. Sowohl beim Ausspülen des Fusionsvolumens wie auch beim Absaugen entstehen jedoch Turbulenzen in der Suspension, die auf die Zellen wirkende Scherkräfte hervorrufen. Da die Zellmembran, wie bereits erläutert, noch nicht abgerundet und somit auch mechanisch noch sehr labil ist, haben diese Scherkräfte zur Folge, daß ein Teil der fusionierten Zellen beim Ausspülen oder Absaugen aus dem Fusions volumen zerstört wird.So far, the merged and partly still light cells adhering to the electrodes from the foot tion volume transferred to the collection volume that one sucks it out of the fusion volume - for example with a micropipette - or that you have the fusion volume rinsed out, the after as the rinsing medium, for example treatment medium is used. Both when rinsing of the fusion volume as well as during suction however, turbulence in the suspension that hits the cells cause acting shear forces. Because the cell membrane, as already explained, not yet rounded off and therefore is also mechanically very unstable, they have Shear forces caused some of the merged Cells when rinsing or aspirating from the fusion volume is destroyed.

Es ist ebenfalls bekannt (DE 33 17 415 A1 und R. Schnettler, U. Zimmermann und C. C. Emeis, FEMS Microbiology Letters 24 (1984), 81-85), die fusio nierten Zellen von dem Fusionsvolumen, in welchem sie in Fusionslösung suspendiert sind, in ein anderes mit Nach behandlungslösung gefülltes Volumen durch die Einwir kung von Zentrifugalkräften zu überführen. Dabei werden jedoch weder die Fusions- noch die Nachbehandlungslösung durch die Einwirkung der Zentrifugalkräfte bewegt, son dern diese beiden Lösungen bleiben als übereinanderge schichtete Lösungen stehen und nur die fusionierten Zellen werden, wie auch bei allen bisher bekannten Zen trifugierverfahren üblich, mittels der Zentrifugalkräfte durch die Fusionslösung hindurch und von dieser in die Nachbehandlungslösung überführt.It is also known (DE 33 17 415 A1 and R. Schnettler, U. Zimmermann and C. C. Emeis, FEMS Microbiology Letters 24 (1984), 81-85), the fusio cells from the fusion volume in which they are in Fusion solution are suspended in another with after treatment solution filled volume by the ent transfer of centrifugal forces. In doing so however, neither the fusion nor the post-treatment solution moved by the action of centrifugal forces, son but these two solutions remain one on top of the other layered solutions are available and only the merged Cells become, as with all previously known Zen centrifugal process by means of centrifugal forces through the fusion solution and from this into the Post-treatment solution transferred.

Auch bei diesem Verfahren wirken auf die fusionierten Zel len Scherkräfte, die dadurch entstehen, daß diese Zellen durch eine stehende Flüssigkeit mit einer bestimmten Zähigkeit hindurchbewegt werden müssen, so daß außen an der Zellmembran, vor allem bei noch nicht abgerundeten Zellen, große Scherkräfte angreifen.This process also affects the merged cells len shear forces that result from the fact that these cells through a standing liquid with a certain Toughness must be moved through so that outside on the cell membrane, especially in those that are not yet rounded Attack cells, high shear forces.

Daher ist es hierbei ebenfalls nicht möglich, die Zellen unmittelbar nach der Fusion in die Nachbehandlungslösung ohne Schädigung zu überführen, sondern es muß, wie bei Schnettler et. al. ausführlich beschrieben, so lange abge wartet werden, bis die Membranen der fusionierten Zellen sich abgerundet und somit ihre mechanisch stabile Form er reicht haben.Therefore, it is also not possible to use the cells immediately after the fusion in the aftertreatment solution without convicting damage, but it must, as with Schnettler et. al. described in detail, so long abge be waited for the membranes of the fused cells rounded off and thus their mechanically stable shape have enough.

Der Erfindung liegt nun die Aufgabe zugrunde, ein Verfah ren der gattungsgemäßen Art zu entwickeln, bei welchem die fusionierten Zellen schonend aus dem Fusionsvolumen entfernt werden können.The invention is based on the object, a method to develop ren of the generic type, in which the fused cells gently from the fusion volume can be removed.

Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß mit den Merkmalen des kennzeichnenden Teils des Patentanspruchs 1 gelöst.This object is achieved with the features of the characterizing part of the Claim 1 solved.

Der Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens besteht darin, daß durch die ausschließliche Einwirkung von Zentrifugalkräften die Suspension und mit dieser auch die darin enthaltenen fusionierten Zellen, ohne daß durch äußere Einwirkungen in der Suspension Turbulenzen und somit auf die Zellen wirkende Scherkräfte auftreten, aus dem Fusionsvolumen entfernt werden können. Dieses Ver fahren ist deshalb so schonend, da durch das Zentrifugieren in sämtlichen Volumenelementen der Zellsuspension und in erster Näherung auch in den Volumenelementen der fusionier ten Zellen denselben Betrag und dieselbe Richtung aufwei sende Kräfte auftreten, die die Zellsuspension mitsamt den darin enthaltenen fusionierten Zellen als Ganzes aus dem Fusionsvolumen hinausbewegen. Dabei kann durch Wahl der Winkelgeschwindigkeit der Betrag der Zentrifugal kräfte und somit auch eine Fließgeschwindigkeit der Suspension aus dem Fusionsvolumen heraus in einem sehr großen Bereich kontinuierlich variiert werden.The advantage of the method according to the invention is in that by the exclusive action of Centrifugal forces the suspension and with it the fused cells contained therein without due to external influences in the suspension turbulence and thus there are shear forces acting on the cells, can be removed from the fusion volume. This ver Driving is so gentle because of the centrifugation in all volume elements of the cell suspension and in first approximation also in the volume elements of the fusionier cells have the same amount and direction Sending forces occur that the cell suspension together with the contained fused cells as a whole move out of the fusion volume. You can do this by choice the angular velocity the amount of centrifugal forces and thus also a flow velocity of the Suspension out of the fusion volume in a very large area can be varied continuously.

Schließlich ist ein wesentlicher Vorteil des erfindungs gemäßen Verfahrens darin zu sehen, daß das Sammelvolumen gemeinsam mit dem Fusionsvolumen mitrotiert, so daß beim Übergang der Suspension von dem Fusionsvolumen in das Sammelvolumen außer den Zentrifugalkräften keine Kräfte auf die Suspension wirken, wie dies z. B. der Fall wäre, wenn das Sammelvolumen gegenüber dem Fusions volumen mit unterschiedlicher Winkelgeschwindigkeit rotieren oder gar stillstehen würde.Finally, a major advantage of the invention according to the procedure to see that the collection volume rotates together with the fusion volume, so that at the transition of the suspension from the fusion volume in the collection volume apart from the centrifugal forces none Forces act on the suspension, as z. B. the The case would be if the collection volume compared to the merger volume with different angular velocity would rotate or even stand still.

Das erfindungsgemäße Ver fahren kann zur Massenproduktion von fusionierten Zellen eingesetzt werden, wenn es quasikontinuierlich aus geführt wird, wobei ein Zuführen der Zellsuspension in das Fusionsvolumen, ein Fusionieren der Zellen und das Überführen der Zellsuspension von dem Fusionsvolumen in das Sammelvolumen jeweils aufeinanderfolgende und sich in dieser Reihenfolge ständig wiederholende Vor gänge sind.The Ver can drive to mass production of fused cells if used quasi-continuously is performed, with a supply of the cell suspension in the fusion volume, a fusion of the cells and that Transfer the cell suspension from the fusion volume consecutive and repetitive in this order gears are.

Bei dieser Verfahrensführung sammelt sich eine immer größere Menge von fusionierten Zellen in dem Sammelvolumen an, so daß das quasikontinuierliche Verfahren nach einigen Durchläufen unterbrochen werden müßte, um die fusionierten Zellen aus dem Sammelvo lumen zu entnehmen. Daher ist es zweckmäßig, wenn sich an das Überführen der Zellen in das Sammelvolumen noch ein Entfernen der Zellsuspension aus dem Sammelvolumen anschließt, so daß die einzelnen Vorgänge bei dem quasi kontinuierlichen Verfahren in beliebiger Zahl und be liebig lange wiederholt werden können und außerdem das Sammelvolumen nur so groß sein muß, daß es die bei einem Durchlauf des quasikontinuierlichen Verfahrens in dieses übergeführte Zellsuspension aufnehmen kann, die dann in einem letzten Schritt des quasikontinuier lichen Verfahrens aus dem Sammelvolumen entfernt wird.This procedure collects an ever increasing amount of fused cells in the collection volume, so that the quasi-continuous Process will be interrupted after a few runs would have to remove the fused cells from the collection remove lumen. Therefore, it is useful if transferring the cells into the collection volume removing the cell suspension from the collection volume connects, so that the individual processes in the quasi continuous process in any number and be can be repeated as long as you like and also that Collection volume must only be so large that it is at one pass of the quasi-continuous process can take up this transferred cell suspension, then in a final step of the quasi-continuous process is removed from the collection volume.

Bei der Erläuterung der bisherigen Führung des erfin dungsgemäßen Verfahrens wurde nicht darauf eingegangen, wie bei Zellen unterschiedlichen Zelltyps zu verfahren ist. Beispielsweise kann bei der Fusion zweier unter schiedlicher Zelltypen jeder Zelltyp in einer getrennten Zellsuspension in das Fusionsvolumen eingebracht werden. Weit zweckmäßiger ist es jedoch, wenn bei der Fusion unterschiedlicher Zelltypen diese vor dem Zuführen in das Fusionsvolumen in der Suspension miteinander ver mischt werden.When explaining the previous leadership of the inventor process according to the invention was not discussed how to proceed with cells of different cell types is. For example, when merging two under different cell types each cell type in a separate Cell suspension are introduced into the fusion volume. However, it is far more convenient if the merger different cell types before feeding them in ver the volume of fusion in the suspension to be mixed.

Sämtliche Ausführungsbeispiele des erfindungsgemäßen Verfahrens sind nicht auf eine bestimmte Durchführung der Elektrofusion beschränkt, sondern diese kann auf jede bisher bekannte Art und Weise erfolgen. Eine Zu sammenstellung der bisher bekannten Verfahren bei der Elektrofusion findet sich in der Veröffentlichung von U. Zimmermann, Biochimica et Biophysica Acta, 694, Seite 227 bis 277 (1982). So kann beispielsweise dem Applizieren des eigentlichen Fusionsimpulses die Bildung von Perlenketten der zu fusionierenden Zellen mit tels Dielektrophorese vorausgehen, es kann aber auch nur mit einer hohen Zelldichte in der Suspension gear beitet werden, so daß sich ein Aneinanderreihen der Zellen erübrigt und die Zellen nach ihrem Durchlöchern statistisch mit einer anderen Zelle in der Umgebung fusionieren, wobei selbstverständlich die Ausbeute an fusionierten Zellen gegenüber einem Fusionsverfahren mit vorhergehender Dielektrophorese weitaus geringer ist. All embodiments of the invention Procedures are not based on any particular implementation the electrofusion is limited, but this can be limited to any previously known way. A too compilation of the previously known methods in the Electrofusion can be found in the publication of U. Zimmermann, Biochimica et Biophysica Acta, 694, Pages 227 to 277 (1982). For example, the Apply the actual fusion pulse to the formation of pearl necklaces of the cells to be fused preceded by dielectrophoresis, but it can also only with a high cell density in the suspension gear be processed, so that a stringing of the Cells are unnecessary and the cells after their perforation statistically with another cell in the area merge, the yield of course fused cells versus a fusion process with previous dielectrophoresis much less is.

Die Vorrichtung zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens zeichnet sich durch die Merkmale des Patent anspruchs 2 aus.The device for performing the invention The process is characterized by the features of the patent demanding 2 out.

Die Vorteile dieser Vorrichtung entsprechen denen des bereits eingangs beschriebenen Verfahrens.The advantages of this device correspond to those of already described method.

Selbstverständlich ist die erfindungsgemäße Vorrichtung nicht darauf beschränkt, daß nur ein Element und eine diesem zugeordnete Kammer in dem Gehäuse vorgesehen sind. In dem Gehäuse können auch mehrere Elemente vor gesehen sein und/oder jedem der Elemente kann jeweils eine Kammer zur Aufnahme der fusionierten Zellen des jeweiligen Elements zugeordnet werden.Of course, the device according to the invention not limited to just one element and one this associated chamber provided in the housing are. There can also be several elements in the housing can be seen and / or each of the elements a chamber for receiving the fused cells of the assigned to each element.

Bezüglich einer Ausbildung der Kammer wurden bislang noch keine Angaben gemacht, so daß beliebige Formen denkbar sind. Besonders bevorzugt wird jedoch ein Ausführungsbeispiel der Kammer mit den Merkmalen des Anspruchs 3. With regard to training the chamber have so far No details yet, so that any shape are conceivable. However, a is particularly preferred Embodiment of the chamber with the features of Claim 3.

Im einfachsten Fall ist der Volumenbereich bezüglich des Elements in Richtung der Schwerkraft tie fergelegt, so daß die Suspension nach dem Zentrifugieren nicht zu dem Element zurückfließen kann.In the simplest case, the volume range regarding the element in the direction of gravity tie put so that the suspension after centrifugation cannot flow back to the element.

Das Element zur Aufnahme der Zellsuspension kann unter schiedlich ausgebildet sein. Es ist ausschließlich er forderlich, daß dieses ein Entweichen der Suspension in Richtung der Zentrifugalkraft ermöglicht. Beispiels weise kann das Element als Rinne, Kanal, Trog oder auch als allseitig geschlossene Behältnis mit einer Öffnung ausgebildet sein, aus welchem die Suspension durch Wirkung der Zentrifugalkraft in die sich in ra dialer Richtung anschließende Kammer entweichen kann.The element for taking up the cell suspension can be found under be trained differently. It is only he required that this be an escape of the suspension in the direction of the centrifugal force. Example the element can be used as a channel, channel, trough or also as a container closed on all sides with a Be formed opening from which the suspension by the action of the centrifugal force in the ra dialer direction can escape chamber.

Besonders vorteilhaft ist es, wenn das Element als Zellträgerplatte ausgebildet ist, die auf einer Ober fläche mit mindestens zwei Elektroden versehen ist. Der Vorteil einer derartigen Zellträgerplatte besteht darin, daß einerseits die Suspension auf diese sehr einfach aufzubringen ist und andererseits die Suspension durch Einwirkung der Zentrifugalkräfte sehr leicht über die Oberfläche dieser Zellträgerplatte in Richtung der Kammer abfließen kann.It is particularly advantageous if the element is designed as a cell support plate, which on an upper surface is provided with at least two electrodes. The advantage of such a cell carrier plate is in that on the one hand the suspension on this very is easy to apply and on the other hand the suspension by the action of centrifugal forces very easily the surface of this cell support plate in the direction of Chamber can drain.

Einander zugewandte Seiten der Elektroden, die mit der Zellträgerplatte zusammen das Fusionsvolumen eingrenzen, können in beliebigen Richtungen auf der Zellträgerplatte verlaufen. Zum Beispiel kann das Fusionsvolumen ein Kanal sein, der zick-zack- oder mäanderförmig über die Zellträgerplatte verläuft. Ein besonders schonendes Entfer nen der fusionierten Zellen aus dem Fusionsvolumen ist je doch dann möglich, wenn einander zugewandte Seiten der Elek troden auf der Zellträgerplatte, zumindest zu einem wesent lichen Teil ihres Verlaufs, sich ungefähr in radialer Rich tung zu der Drehachse des Gehäuses erstrecken, so daß zwi schen diesen in radialer Richtung verlaufende Kanäle gebil det werden, längs denen die Zellsuspension mitsamt den fusionierten Zellen durch die Zentrifugalkräfte von dem Fusionsvolumen in die Kammer überführt werden kann, ohne daß in der Zellsuspension Turbulenzen und somit Scherkräfte auftreten.Mutually facing sides of the electrodes, which are connected to the Together, limit the cell carrier plate to the fusion volume, can be in any direction on the cell support plate run. For example, the fusion volume can be one Channel that zigzag or meandering over the Cell support plate runs. A particularly gentle removal NEN of the fused cells from the fusion volume is ever but possible if the sides of the elec tread on the cell support plate, at least to an essential part of their course, roughly in the radial direction tion to the axis of rotation of the housing, so that zwi channels formed in the radial direction along which the cell suspension together with the fused cells by the centrifugal forces from the Fusion volume can be transferred to the chamber without that turbulence and thus shear forces in the cell suspension occur.

Die Elektroden können in unterschiedlichster Weise auf die Zellträgerplatte aufgebracht sein. Die einfachste Möglichkeit sind auf der Zellträgerplatte gehaltene Drähte, die jede beliebige Form besitzen können.The electrodes can be applied in different ways the cell support plate must be applied. The easiest Possibility are wires held on the cell support plate, that can have any shape.

Wenn die Elektroden auf die Zellträgerplatte aufgebrachte dünne Schichten sind, können die aufgrund der Zentrifugal kräfte über die Oberfläche der Elektroden hinwegbewegten fusionierten Zellen durch die Oberflächenrauhigkeit dieser Elekroden nicht beschädigt werden. When the electrodes are applied to the cell support plate are thin layers, which can be due to centrifugal forces moved across the surface of the electrodes fused cells due to the surface roughness of these Electrodes are not damaged.

Weitere Merkmale und Vorteile ergeben sich aus der folgenden Beschreibung sowie der zeichne rischen Darstellung einiger Ausführungsformen der Er findung. In der Zeichnung zeigtFurther features and advantages result from the following description as well as the drawing representation of some embodiments of the Er finding. In the drawing shows

Fig. 1 einen Schnitt (längs Linie 1-1 in Fig. 2) durch ein erstes Ausführungsbeispiel der Vorrichtung; Fig. 1 is a section (along line 1-1 in Fig. 2) by a first embodiment of the device;

Fig. 2 einen Schnitt längs Linie 2-2 in Fig. 1; Fig. 2 is a section along line 2-2 in Fig. 1;

Fig. 3 einen Schnitt ähnlich Fig. 1 durch das erste Ausführungsbeispiel sowie durch eine Kontaktiervorrichtung; Fig. 3 is a section similar to Figure 1 by the first embodiment and by a contactor.

Fig. 4 eine teilweise aufgebrochene Ansicht einer Zentrifuge für das erste Ausführungsbei spiel; Fig. 4 is a partially broken view of a centrifuge for the first game Ausführungsbei;

Fig. 5 einen Ausschnitt aus einem ersten Aus führungsbeispiel einer Zellträgerplatte mit aufgedampften Elektroden; Fig. 5 is a detail of a first exemplary implementation of a cell from carrier plate with deposited electrodes;

Fig. 6 einen vergrößerten Ausschnitt der Zell trägerplatte in Fig. 5; Fig. 6 shows an enlarged section of the cell carrier plate in Fig. 5;

Fig. 7 ein zweites Ausführungsbeispiel einer Zellträgerplatte; Fig. 7 shows a second embodiment of a cell carrier plate;

Fig. 8 ein drittes Ausführungsbeispiel einer Zellträgerplatte; Fig. 8 shows a third embodiment of a cell carrier plate;

Fig. 9 ein Aufbringen von Zellsuspension auf die Zellträgerplatte eines ersten Aus führungsbeispiels der Vorrichtung; Fig. 9 is an application of cell suspension to the cell supporting plate from a first guide of the apparatus;

Fig. 10 ein Entnehmen der Suspension aus fusio nierten Zellen aus dem ersten Ausführungs beispiel der Vorrich tung; FIG. 10 is a removal of the suspension of cells fusio ned from the first execution of the example Vorrich tung;

Fig. 11 ein zweites Ausführungsbeispiel der Vorrichtung und Fig. 11 shows a second embodiment of the device and

Fig. 12 ein drittes Ausführungsbeispiel der Vorrichtung. Fig. 12 shows a third embodiment of the device.

Ein erstes Ausführungsbeispiel einer erfindungsgemäßen Vorrichtung, dargestellt in den Fig. 1 und 2, zeigt im einzelnen ein zu einer Drehachse 20 rotationssymme trisches, hohlzylindrisch ausgebildetes Gehäuse 22 mit einem Mantel 24, einem bezüglich der Drehachse 20 ra dial nach innen gezogenem Bodenteil 26, das eine Boh rung 28 aufweist, und einem ebenfalls radial nach innen gezogenen Oberteil 30 mit einer Öffnung 32. Somit ist durch das radial nach innen gezogene Oberteil 30 und das Bodenteil 26 sowie den Mantel 24 im Inneren des Gehäuses 22 ein Ringkanal 34 gebildet, welcher von einem Inneren des Gehäuses in radialer Richtung zu gänglich ist. A first embodiment of a device according to the invention, shown in FIGS. 1 and 2, shows in detail a to a rotational axis 20 rotationally symmetrical, hollow cylindrical housing 22 with a jacket 24 , a with respect to the rotational axis 20 ra dial inwardly drawn bottom part 26 , the a drilling tion 28 , and also a radially inwardly drawn upper part 30 with an opening 32nd Thus, an annular channel 34 is formed by the radially inwardly drawn upper part 30 and the bottom part 26 and the casing 24 in the interior of the housing 22 , which is accessible in the radial direction from an interior of the housing.

Das Bodenteil 26 trägt auf einer dem Ringkanal 34 zuge wandten Innenseite 36 einen sich in Richtung des Ober teils 30 erhebenden ringförmigen Wulst 38, der sich in radialer Richtung im Anschluß an die Bohrung 28 nach außen erstreckt, so daß auf der Innenseite 36 zwischen dem Wulst 38 und dem Mantel 24 eine zu dem Ringkanal 34 gehörende kreisringförmige Vertiefung 40 gebildet wird.The base part 26 bears on a the annular channel 34 facing the inner side 36 of a rising in the direction of the top part 30 annular bead 38, which extends in a radial direction subsequent to the bore 28 to the outside, so that on the inner surface 36 between the bead 38 and the jacket 24 an annular recess 40 belonging to the annular channel 34 is formed.

Der vom Oberteil 30 den geringsten Abstand aufweisende Teil des Wulstes 38 trägt eine zur Drehachse 20 kon zentrische Ringnut 42 zur Aufnahme einer kreisscheiben förmigen Zellträgerplatte 44, die sich senkrecht zur Dreh achse 20 erstreckt. Diese ist in der Ringnut 42 so ge halten, daß eine dem Oberteil 30 zugewandte Oberfläche 46 der Zellträgerplatte 44 einen geringeren Abstand von dem Oberteil 30 aufweist als der sich in radialer Richtung außen an die Zellträgerplatte 44 anschließende Teil des Wulstes 38. Damit ist sichergestellt, daß bei zur Richtung der Schwerkraft parallel stehender Dreh achse 20 eine die Zellträgerplatte 44 in radialer Rich tung verlassende Zellsuspension ein Gefälle vorfindet, durch welches sie über den Wulst 38 in Richtung der Vertiefung 40 geleitet wird.The upper part 30 having the shortest distance from the portion of the bead 38 carries a con centric to the rotation axis 20 annular groove 42 for receiving a circular disk-shaped cell carrier plate 44, which is perpendicular to the rotational axis of which extends 20th This is in the annular groove 42 so ge keep that the upper part 30 facing surface 46 of the cell carrier plate 44 has a smaller distance from the upper part 30 than the radially outward adjoining the cell carrier plate 44 part of the bead 38th This ensures that when the rotation axis 20 is parallel to the direction of gravity, a cell suspension plate leaving the cell carrier plate 44 in the radial direction finds a gradient through which it is passed over the bead 38 in the direction of the depression 40 .

Bevorzugterweise ist die Zellträgerplatte 44 in der Ringnut 42 auswechselbar gehalten, wobei es im allge meinen ausreichend ist, wenn die Ringnut 42 so ausge bildet ist, daß sie einen Paßsitz für die Zellträger platte 44 darstellt, die bei diesem Ausführungsbeispiel von oben, d. h. von seiten des Oberteils 30, in die Ring nut 42 einsetzbar ist.Preferably, the cell carrier plate 44 is held interchangeably in the annular groove 42 , although it is generally sufficient if the annular groove 42 is formed so that it fits a plate 44 for the cell carrier, which in this embodiment is from above, ie from the side of the upper part 30 , in the ring groove 42 can be used.

Zum Verschließen der Öffnung 32 in dem Oberteil 30 ist ein Deckel 48 vorgesehen, welcher in die Öffnung 32 einsetzbar ist und in radialer Richtung das Oberteil 30 auf einer Außenseite 50 übergreifende Randbereiche 52 besitzt, die verhindern, daß der Deckel 48 auf der Oberfläche 46 der Zellträgerplatte 44 aufsteht.To close the opening 32 in the upper part 30 , a cover 48 is provided, which can be inserted into the opening 32 and has in the radial direction the upper part 30 on an outer side 50 overlapping edge areas 52 , which prevent the cover 48 on the surface 46 of the Cell support plate 44 stands up.

Die Zellträgerplatte 44 ist auf ihrer Oberfläche 46 mit zwei Elektroden 54 und 56 versehen, welche eine beliebige Form besitzen können, jedoch in ihren einan der zugewandten Bereichen so aneinander anzupassen sind, daß zwischen diesen Elektroden 54, 56 ein Spalt 58 entsteht, der stets ungefähr dieselbe Breite aufweist. Die einzelnen Formen der Elektroden 54 und 56 werden später im einzelnen beschrieben.The cell support plate 44 is provided on its surface 46 with two electrodes 54 and 56 , which can have any shape, but are to be adapted to one another in their facing areas so that a gap 58 is formed between these electrodes 54, 56 , which is always approximately has the same width. The individual shapes of the electrodes 54 and 56 will be described later in detail.

Die Kontaktierung der Elektroden 54 und 56 erfolgt durch in dem Deckel 48 vorgesehene und bevorzugterweise parallel zur Drehachse 20 stehende Kontaktstifte 60 und 62. Diese sind in jeweils ihrem Durchmesser angepaß ten Bohrungen 64 und 66 verschieblich gelagert, so daß sie beim Aufsetzen des Deckels 48 auf die den Kontaktstif ten 60 und 62 zugeordneten Elektroden 54 bzw. 56 drücken und mit diesen einen elektrischen Kontakt herstellen können. Um die Kontaktstifte 60 und 62 bei Abnahme des Deckels 48 gegen ein Durchrutschen durch die Bohrungen 64 und 66 zu sichern, sind diese an einem der Zellträgerplatte 44 abgewandten Ende mit einem Kopf 68 bzw. 70 versehen, der teilweise in dem Deckel 48 versenkt ist.The electrodes 54 and 56 are contacted by contact pins 60 and 62 provided in the cover 48 and preferably parallel to the axis of rotation 20 . These are each in their diameter adapted th bores 64 and 66 slidably mounted so that they press on the cover 48 th on the contact pins 60 and 62 associated electrodes 54 and 56 and can make an electrical contact with them. In order to prevent the contact pins 60 and 62 from slipping through the bores 64 and 66 when the cover 48 is removed, they are provided at one end facing away from the cell carrier plate 44 with a head 68 and 70 , which is partially countersunk in the cover 48 .

Zur Versorgung der Elektroden 54 und 56 mit für eine Fusion der Zellen notwendigen Spannungen ist eine in Fig. 3 dargestellte Halterung 72 vorgesehen, in welche das Gehäuse 22 mit bereits geschlossenem Deckel 48 ein setzbar ist. Die Halterung 72 umfaßt eine Grundplatte 74, auf welcher das Gehäuse 22 mit seinem Bodenteil 26 steht. Gleichzeitig sind an der Halterung 72 bügel ähnliche Federkontakte 76 und 78 gehalten, welche den Deckel 48 des Gehäuses 22 übergreifen und eine elektri sche Verbindung mit dem Kopf 68 bzw. dem Kopf 70 der Kontaktstifte 60 bzw. 62 herstellen. Diese Federkontakte 76 und 78 stehen ihrerseits wieder mit einem Spannungs generator 80 in Verbindung, der die zu einer Elektro fusion erforderlichen Spannungen und Spannungsimpulse liefert.For supply to the electrodes 54 and 56 required for a fusion of cell voltages of a holder 72 shown in Fig. 3 is provided, into which the housing 22 having been closed lid 48 is a settable. The holder 72 comprises a base plate 74 on which the housing 22 stands with its bottom part 26 . At the same time bracket-like spring contacts 76 and 78 are held on the bracket 72 , which overlap the cover 48 of the housing 22 and produce an electrical connection with the head 68 and the head 70 of the contact pins 60 and 62, respectively. These spring contacts 76 and 78 are in turn connected to a voltage generator 80 which supplies the voltages and voltage pulses required for an electrical fusion.

Fig. 4 zeigt eine Zentrifuge 82, die einen Motor 84 und einen durch diesen antreibbaren Rotor 86 besitzt, in welchen das Gehäuse 22 nach Durchführung der Elekrofusion ein setzbar und zum Entfernen fusionierter Zellen von der Oberfläche 46 der Zellträgerplatte 44 zentrifugierbar ist. FIG. 4 shows a centrifuge 82 which has a motor 84 and a rotor 86 which can be driven thereby, in which the housing 22 can be inserted after centrifugation and can be centrifuged to remove fused cells from the surface 46 of the cell carrier plate 44 .

Ein erstes Ausführungsbeispiel für die Ausbildung der Elektroden 54 und 56 auf der Oberfläche 46 der Zellträ gerplatte 44 zeigt Fig. 5. Die Elektrode 54 umfaßt da bei einen am äußeren Rand der Zellträgerplatte 44 ent langlaufenden Kreisring 90, von welchem aus strahlen förmig in radialer Richtung weitere Elekroden 92 nach innen verlaufen. Die Elektrode 56 weist eine konzentrisch auf der Zellträgerplatte 44 angeordnete Kreisfläche 94 auf, von welcher aus sich in radialer Richtung strahlen förmige Elektroden 96 erstrecken, die zwischen den je weiligen Elektroden 92 liegen. Die Form der Elektroden 92 und 96 ist dabei so gewählt, daß der Spalt 58 zwi schen einander zugewandten Elektroden ungefähr die selbe Breite besitzt, wie auch der vergrößerte Aus schnitt in Fig. 6 zeigt.A first exemplary embodiment for the formation of the electrodes 54 and 56 on the surface 46 of the cell carrier plate 44 is shown in FIG. 5. The electrode 54 comprises an annular ring 90 running along the outer edge of the cell carrier plate 44 , from which radially in the radial direction further electrodes 92 run inwards. The electrode 56 has a circular surface 94 arranged concentrically on the cell carrier plate 44 , from which radially shaped electrodes 96 extend in the radial direction and lie between the respective electrodes 92 . The shape of the electrodes 92 and 96 is chosen so that the gap 58 between electrodes facing each other has approximately the same width, as also shows the enlarged section in Fig. 6.

Selbstverständlich müssen die Kontaktstifte 60 und 62 in dem Deckel 48 so angeordnet sein, daß jeder der Kon taktstifte 60 und 62 nur auf einer der Elektroden 54 bzw. 56 aufsitzt. Wie Fig. 1 zeigt, ist beim ersten Ausführungsbeispiel bevorzugterweise der Kontaktstift 62 konzentrisch zur Drehachse 20 angeordnet, so daß er auf der Fläche 94 der Elektrode 56 aufsteht und der Kontaktstift 60 so angeordnet ist, daß er auf den kreis ringförmigen Teil 90 der Elektrode 54 aufsitzt.Of course, the contact pins 60 and 62 must be arranged in the cover 48 so that each of the con tact pins 60 and 62 is seated only on one of the electrodes 54 and 56, respectively. As shown in FIG. 1, in the first exemplary embodiment the contact pin 62 is preferably arranged concentrically to the axis of rotation 20 , so that it stands on the surface 94 of the electrode 56 and the contact pin 60 is arranged such that it contacts the circular part 90 of the electrode 54 sits on.

Prinzipiell können die Elektroden 54 und 56 beliebig gestaltet sein, denn es ist einzig und allein der Spalt 58 zwischen den Elektroden 54 und 56 maßgebend. In principle, the electrodes 54 and 56 can be of any design, because only the gap 58 between the electrodes 54 and 56 is decisive.

Fig. 7 zeigt beispielsweise einen mäanderförmigen Ver lauf des Spaltes 58 und Fig. 8 einen schneckenförmigen Verlauf dieses Spaltes 58. Fig. 7 shows, for example, a meandering course of the gap 58 and Fig. 8 shows a helical course of this gap 58th

Die Zellträgerplatte 44 besteht bevorzugterweise aus einer Glasplatte oder Quarzglasplatte, auf welche die Elektroden 54 und 56 durch Aufdampfen oder durch ein fototechnisches Verfahren aufgebracht werden können. Die Dicke derartiger aufgedampfter Schichten beträgt ungefähr 5 bis 40 µm. Vorteilhafterweise wird als Material für die Elektroden Chrom verwendet.The cell carrier plate 44 preferably consists of a glass plate or quartz glass plate, to which the electrodes 54 and 56 can be applied by vapor deposition or by a photo-technical method. The thickness of such vapor-deposited layers is approximately 5 to 40 μm. Chromium is advantageously used as the material for the electrodes.

Die Breite des Spalts 58 oder der Abstand der Elektroden muß nach der Größe der zu fusionierenden Zellen und nach den zur Verfügung stehenden Ausgangsspannungen des Spannungsgenerators 80 gewählt werden. Beispielsweise werden für Bakterien und Hefezellen Elektrodenabstände von 30 µm und für Pflanzenprotoplasten Elektrodenabstände bis zu 500 µm verwendet. Es sind jedoch auch Elektroden abstände im Bereich von 1 bis 5 mm denkbar, die den Vor teil haben, daß die entstehenden Felder wesentlich ho mogener sind als bei geringeren Abständen, jedoch muß dann mit hohen Suspensionsdichten gearbeitet werden.The width of the gap 58 or the distance between the electrodes must be chosen according to the size of the cells to be fused and according to the available output voltages of the voltage generator 80 . For example, electrode distances of 30 µm are used for bacteria and yeast cells and electrode distances of up to 500 µm for plant protoplasts. However, there are also electrode distances in the range from 1 to 5 mm conceivable, which have the part that the fields that arise are considerably more homogeneous than at shorter distances, but then high suspension densities must be used.

Damit ist zur Aufnahme der zu fusionierenden Zellen auf der Zellträgerplatte 44 ein System von kanalartigen Ver tiefungen vorgesehen, die seitlich durch Ränder der unge fähr 5-40 µm dicken Elektroden 54 und 56 begrenzt sind und eine Bodenfläche besitzen, die durch die Oberfläche 46 der Zellträgerplatte 44 gebildet ist, wobei deren Breite der obengenannten Breite des Spalts 58 entspricht. Thus, a system of channel-like depressions is provided for receiving the cells to be fused on the cell carrier plate 44 , which are laterally delimited by edges of the approximately 5-40 μm thick electrodes 54 and 56 and have a bottom surface through the surface 46 of the cell carrier plate 44 is formed, the width of which corresponds to the aforementioned width of the gap 58 .

Besonders vorteilhaft ist es, wenn die Elektroden 54 und 56 so gestaltet sind, daß die Vertiefungen im wesentlichen, wie in Fig. 5 dargestellt, in radialer Richtung verlaufen, so daß beim Zentrifugieren die Zellsuspension mitsamt den fusionierten Zellen in einer Längsrichtung der Vertiefungen strömen kann und nur am Rand der Zellträgerplatte 44 eine durch den Kreisring 90 der Elektrode 54 gebildete Barriere überwinden muß. Dies ist jedoch unproblematisch, da sich beim Zentrifugieren die Zellsuspension in diesem Bereich aufstaut und somit diese Barriere leicht überwindet, ohne daß in der Zellsuspension die fusionierten Zellen schädi gende Turbulenzen entstehen.It is particularly advantageous if the electrodes 54 and 56 are designed in such a way that the depressions run essentially in the radial direction, as shown in FIG. 5, so that during centrifugation the cell suspension together with the fused cells can flow in a longitudinal direction of the depressions and only has to overcome a barrier formed by the circular ring 90 of the electrode 54 at the edge of the cell carrier plate 44 . However, this is not a problem since the cell suspension builds up in this area during centrifugation and thus easily overcomes this barrier without the fused cells causing damaging turbulence in the cell suspension.

Bei einem ersten Ausführungsbeispiel des erfindungsgemä ßen Verfahrens unter Verwendung des vorstehend beschriebe nen ersten Ausführungsbeispiels wird folgendermaßen verfah ren:In a first embodiment of the invention process using the method described above The first exemplary embodiment is carried out as follows ren:

Zuerst wird, wie in Fig. 9 dargestellt, der Deckel 48 von dem Gehäuse 22 abgenommen, so daß die Oberfläche 46 der Zellträgerplatte 44 von oben zugänglich ist. Dies hat unter sterilen Bedingungen zu erfolgen, um zu ver hindern, daß die aufzutragende Zellsuspension infiziert wird, wobei selbstverständlich bereits vorher das Ge häuse 22 und der Deckel 48 sterilisiert wurden.First, as shown in FIG. 9, the cover 48 is removed from the housing 22 so that the surface 46 of the cell support plate 44 is accessible from above. This has to be done under sterile conditions in order to prevent the cell suspension to be applied from becoming infected, the housing 22 and the cover 48 having of course already been sterilized beforehand.

Mittels einer Pipette 100 wird eine so große Menge von Zellsuspension auf die Oberfläche 46 der Zellträgerplatte 44 aufgetragen, daß diese im wesentlichen vollständig mit Zellsuspension bedeckt ist. A pipette 100 is used to apply such a large amount of cell suspension to the surface 46 of the cell carrier plate 44 that it is essentially completely covered with cell suspension.

Anschließend wird der Deckel 48 aufgesetzt, der vorteil hafterweise das Gehäuse 22 steril abschließt.Then the cover 48 is placed, which advantageously closes the housing 22 sterile.

Zur Fusion wird das verschlossene Gehäuse 22 in die Halterung 72 (Fig. 3) eingesetzt. Dadurch sind die beiden Elektroden 54 und 56 über die Kontaktstifte 60 und 62 und die Federkontakte 76 und 78 mit dem Spannungsgenerator 80 verbunden, so daß die zur Elektrofusion erforderlichen Spannungsimpulse angelegt werden können, die zwischen den Elektroden 54 und 56 elektrische Felder erzeugen, durch welche die Fusion erfolgt. Bei einer vorteilhaften Gestal tung der Elektroden 54 und 56 gemäß den Fig. 5, 7 und 8 wird dabei eine für die Fusion ausreichende elektrische Feldstärke im wesentlichen nur zwischen den Rändern der Elektroden 54, 56, d. h. im Bereich des Spalts 58 erreicht, so daß nur die in diesem Bereich vorliegenden Zellen fu sioniert werden. Je nach dem verwendeten Elektrofusions verfahren wird entweder mit einer hohen Zelldichte gear beitet, bei welcher sich die Dielektrophorese erübrigt, so daß sofort die Fusionsimpulse angelegt werden können, die zu einem Durchlöchern der Membran der im elektri schen Feld zwischen den Elektroden 54 und 56 befindli chen Zellen führen, oder es werden vor der Fusion, vor allem bei geringen Zelldichten in der Zellsuspension, mittels Dielektrophorese die Zellen in sogenannten Perlen ketten aneinandergereiht, wie sie in Fig. 6 zu sehen sind. Die Dielektrophorese hat bei den als vorteilhaft beschrie benen Ausführungsformen gemäß den Fig. 5, 7 und 8 der Elek troden 54 und 56 zur Folge, daß die Zellen, aufgrund des Verlaufs der Inhomogenität des elektrischen Feldes, zwischen derartig gestalteten Elektroden auch aus einer über den Vertiefungen und den Elekroden 54 und 56 stehenden Schicht aus Zellsuspension in die Vertiefungen hineingezogen und an den Rändern der Elektroden 54 und 56 zu Perlenketten aneinandergereiht werden.For the fusion, the closed housing 22 is inserted into the holder 72 ( FIG. 3). As a result, the two electrodes 54 and 56 are connected to the voltage generator 80 via the contact pins 60 and 62 and the spring contacts 76 and 78 , so that the voltage pulses required for electrofusion can be applied, which generate electrical fields between the electrodes 54 and 56 , through which the merger takes place. In an advantageous design of the electrodes 54 and 56 according to FIGS. 5, 7 and 8, an electrical field strength sufficient for the fusion is essentially achieved only between the edges of the electrodes 54, 56 , ie in the region of the gap 58 , so that only the cells present in this area are fused. Depending on the electrofusion method used, either a high cell density is used, in which the dielectrophoresis is unnecessary, so that the fusion pulses can be applied immediately, which cause perforation of the membrane in the electrical field between electrodes 54 and 56 Cells lead, or before fusion, especially with low cell densities in the cell suspension, the cells are strung together in so-called pearl chains by means of dielectrophoresis, as can be seen in FIG. 6. In the enclosed advantageous beschrie embodiments in accordance with the dielectrophoresis has the Fig. 5 7 and 8 of the elec trodes 54 and 56 with the result that the cells due to the course of the inhomogeneity of the electric field between such shaped electrodes also consist of a via Wells and the electrodes 54 and 56 standing layer of cell suspension are drawn into the wells and strung together at the edges of the electrodes 54 and 56 to form pearl necklaces.

In beiden Fällen wird eine Membran der Zellen durchlöchert, so daß die benachbarten Zellen miteinander fusionieren, d. h. eine gemeinsame Zellmembran bilden. Die gemeinsame Zellmembran hat, wie bereits eingangs beschrieben, zu nächst noch eine langgestreckte, der Perlenkette ähnliche Form und ist aus diesem Grund noch sehr labil.In both cases, a membrane of the cells is perforated, so that the neighboring cells fuse together, d. H. form a common cell membrane. The common As already described at the beginning, the cell membrane has too next an elongated one, similar to the pearl necklace Form and is therefore still very unstable.

Zum Entfernen der Zellsuspension mit den fusionierten Zellen wird das Gehäuse 22 aus der Halterung 72 ent nommen und in den Rotor 86 der Zentrifuge 82 eingesetzt. Eine Drehzahl des Motors 84 der Zentrifuge 82 kann so gewählt werden, daß auf die auf die Oberfläche 46 der Zellträgerplatte 44 befindliche Zellsuspension und die darin enthaltenen fusionierten Zellen so große Zentri fugalkräfte wirken, daß diese in radialer Richtung der Zellträgerplatte 44 nach außen getrieben werden, sich auf der Innenseite 36 des Bodenteils 26 in den Ringkanal 34 bewegen und sich dort im Bereich des Man tels 24 und der Vertiefung 40 sammeln. Dabei wird so lange zentrifugiert, bis die ganze Zellsuspension von der Oberfläche 46 der Zellträgerplatte 44 entfernt wurde. Bevorzugte Werte für die Drehzahl der Zentrifuge 82 liegen im Bereich von 100-500 Umdrehungen pro Minute. To remove the cell suspension with the fused cells, the housing 22 is removed from the holder 72 and inserted into the rotor 86 of the centrifuge 82 . A speed of the motor 84 of the centrifuge 82 can be selected so that centrifugal forces act on the cell suspension located on the surface 46 of the cell carrier plate 44 and the fused cells contained therein so large that they are driven outward in the radial direction of the cell carrier plate 44 , move on the inside 36 of the bottom part 26 into the annular channel 34 and collect there in the area of the man 24 and the recess 40 . Centrifugation is continued until the entire cell suspension has been removed from the surface 46 of the cell carrier plate 44 . Preferred values for the speed of the centrifuge 82 are in the range of 100-500 revolutions per minute.

Wenn der Rotor 86 wieder zum Stillstand gekommen ist, sammelt sich die Zellsuspension mit den fusionierten Zellen in der durch den Wulst 38 und den Mantel 24 ge bildeten Vertiefung 40 des Ringkanals 34 an, wobei durch die Vertiefung 40 verhindert wird, daß die Zell suspension wieder auf die Oberfläche 46 der Zellträger platte 44 zurückfließt.When the rotor 86 has come to a standstill again, the cell suspension with the fused cells accumulates in the depression 40 of the annular channel 34 formed by the bead 38 and the jacket 24 , the depression 40 preventing the cell suspension from again on the surface 46 of the cell carrier plate 44 flows back.

Das Entnehmen der Zellsuspension aus dem Ringkanal 34 kann beispielsweise wie in Fig. 10 dargestellt erfolgen. Dazu wird das Gehäuse 22 um seine Drehachse 20 gekippt, so daß sich die Zellsuspension an einer tiefsten Stelle des Ringkanals 34 sammelt. Nach Abnehmen des Deckels 48 wird dann, ebenfalls unter sterilen Bedingungen, die Zellsuspension vorsichtig mittels einer Pipette 100 ab gesaugt.The cell suspension can be removed from the ring channel 34 , for example, as shown in FIG. 10. For this purpose, the housing 22 is tilted about its axis of rotation 20 , so that the cell suspension collects at a deepest point of the ring channel 34 . After removing the cover 48 , the cell suspension is then carefully sucked off using a pipette 100 , also under sterile conditions.

Ein zweites Ausführungsbeispiel der erfindungsgemäßen Vorrichtung ist in Fig. 11 dargestellt. Identische Teile sind dabei mit denselben Bezugszeichen wie beim ersten Ausführungsbeispiel bezeichnet und werden nicht mehr gesondert erläutert. Der einzige Unterschied zum ersten Ausführungsbeispiel ist darin zu sehen, daß das Innere des Gehäuses 22 durch drei in radialer Richtung von der Drehachse 20 zu dem Mantel 24 verlaufende Trennwände 102 in drei Volumenbereiche aufgeteilt ist. Die Zell trägerplatte 44 besitzt ebenfalls in jedem der Volumen bereiche zwei Elektroden 54 und 56, wobei entweder alle drei Sätze von Elektroden 54 und 56 parallel geschaltet oder durch eine entsprechende Anzahl von Kontaktstiften direkt kontaktiert und separat mit entsprechenden Span nungen versorgt werden können.A second exemplary embodiment of the device according to the invention is shown in FIG. 11. Identical parts are designated with the same reference numerals as in the first exemplary embodiment and are no longer explained separately. The only difference from the first exemplary embodiment is to be seen in the fact that the interior of the housing 22 is divided into three volume regions by three partition walls 102 running in the radial direction from the axis of rotation 20 to the casing 24 . The cell carrier plate 44 also has two electrodes 54 and 56 in each of the volume areas, either all three sets of electrodes 54 and 56 being connected in parallel or being contacted directly by a corresponding number of contact pins and being supplied separately with corresponding voltages.

Der Vorteil des zweiten Ausführungsbeispiels besteht darin, daß beispielsweise Suspensionen mit jeweils un terschiedlichen Zellen gleichzeitig zentrifugiert und eventuell auch fusioniert werden können.The advantage of the second embodiment is in that, for example, suspensions with un different cells are centrifuged and simultaneously possibly can also be merged.

Ein drittes Ausführungsbeispiel einer erfindungsgemäßen Vorrichtung zeigt Fig. 12. Auch dort sind mit dem ersten Ausführungsbeispiel identische Teile mit denselben Be zugszeichen versehen und werden nicht mehr beschrieben. FIG. 12 shows a third exemplary embodiment of a device according to the invention . Also there, parts identical to the first exemplary embodiment are provided with the same reference numerals and are no longer described.

Das Gehäuse 22 entspricht im wesentlichen dem des ersten Ausführungsbeispiels, mit dem Unterschied, daß dieses bei dem dritten Ausführungsbeispiel stationär auf dem Rotor 86 montiert ist. Außerdem ist das Bodenteil 26 mindestens an einer Stelle mit einem schräg von der Ver tiefung 40 nach außen verlaufenden Auslaßkanal 104 ver sehen, der in einem an einer Unterseite 106 des Boden teils 26 angeordneten Stutzen 108 endet. Eine in der Vertiefung 40 liegende Mündung 110 des Auslaßkanals 104 ist so geformt, daß sie eine Ventilkugel 112 aufnimmt, die die Mündung 110 flüssigkeitsdicht verschließen kann. Die Mündung 110 ist dabei so zu formen, daß sich beim Zentrifugieren die Ventilkugel 112 nicht von dieser entfernt, sondern verstärkt auf die Mündung 110 gedrückt wird und diese noch besser abdichtet. Vorzugsweise kann auch noch eine die Kugel 112 in Richtung der Mündung 110 beaufschlagende Feder 114 vorgesehen sein, welche sich mit ihrem anderen Ende an dem Oberteil 30 des Ge häuses 22 abstützt.The housing 22 corresponds essentially to that of the first embodiment, with the difference that it is mounted stationary on the rotor 86 in the third embodiment. In addition, the bottom part 26 is seen at least at one point with an obliquely extending from the United recess 40 to the outside outlet channel 104 ver, which ends in a bottom part 26 arranged on a bottom 106 of the bottom piece 108 . A mouth 110 of the outlet channel 104 lying in the depression 40 is shaped such that it receives a valve ball 112 which can close the mouth 110 in a liquid-tight manner. The mouth 110 is to be shaped in such a way that the valve ball 112 does not move away from it during centrifugation, but rather is pressed onto the mouth 110 and seals it even better. Preferably, a spring 114 acting on the ball 112 in the direction of the mouth 110 can also be provided, which with its other end is supported on the upper part 30 of the housing 22 .

Zum Entleeren der Vertiefung 40 ist ein auf den Stutzen 108 verschiebliches Rohr 116 vorgesehen, das einen in den Auslaßkanal 104 einführbaren Dorn 118 besitzt, welcher die Ventilkugel 112 aus ihrem die Mündung 110 abdichtenden Sitz herausdrückt, wenn das Rohr 116 über den Stutzen 108 geschoben ist. Damit ist der Auslaß kanal 104 freigegeben, so daß die sich in der Vertiefung 40 angesammelte Zellsuspension durch den Auslaßkanal 104 in das Rohr 116 ausströmen kann.For emptying the depression 40 , a pipe 116 is provided which is displaceable on the socket 108 and has a mandrel 118 which can be inserted into the outlet channel 104 and which pushes the valve ball 112 out of its seat which seals the mouth 110 when the pipe 116 is pushed over the socket 108 . So that the outlet channel 104 is released so that the cell suspension accumulated in the recess 40 can flow out through the outlet channel 104 into the tube 116 .

Des weiteren unterscheidet sich das dritte Ausführungs beispiel der Vorrichtung von dem ersten Ausführungsbei spiel dadurch, daß der konzentrisch zur Drehachse 20 sitzende Kontaktstift 62 in Richtung der Drehachse 20 nach oben durch ein Rohrstück 120 verlängert ist, des sen zur Drehachse 20 koaxiale Bohrung 122 sich auch in den Kontaktstift 62 hinein bis zur Oberfläche 46 der Zellträgerplatte 44 fortsetzt. Damit die Zellsuspension durch die Bohrung 122 auf die Oberfläche 46 der Zell trägerplatte 44 aufgebracht werden kann, ist das auf der Oberfläche 46 aufstehende Ende des Kontaktstifts 62 noch mit in radialer Richtung weisenden Ausnehmungen 124 versehen, welche ausgehend von der Bohrung 122 auf einer Außenseite des Kontaktstifts 62 münden. Furthermore, the third execution differs example of the apparatus of the first Ausführungsbei play characterized in that the concentric fitting to the rotational axis 20 of the contact pin is lengthened 62 in the direction of the axis of rotation 20 upwardly through a pipe section 120, of the sen coaxial to the rotational axis 20 of bore 122 also continues into the contact pin 62 up to the surface 46 of the cell carrier plate 44 . So that the cell suspension can be applied through the bore 122 to the surface 46 of the cell carrier plate 44 , the end of the contact pin 62 standing up on the surface 46 is also provided with recesses 124 pointing in the radial direction, which recesses proceed from the bore 122 on an outside of the Contact pin 62 open.

Die Zufuhr von Zellsuspension erfolgt vorzugsweise über ein Gefäß 126, welches ein Ansatzstutzen 128 mit ei nem Ventil 130 besitzt, der in das Rohrstück 120 mündet.Cell suspension is preferably supplied via a vessel 126 , which has a connecting piece 128 with a valve 130 , which opens into the pipe section 120 .

Eine Kontaktierung der Kontaktstifte 60 und 62 erfolgt ebenfalls über Federkontakte 132 bzw. 134, wobei der zum Kontaktstift 62 führende Federkontakt 134 auch an dessen Rohrstück 120 anliegen kann und nicht notwendiger weise auf dessen Kopf 70 aufliegen muß. Die Federkon takte 132, 134 sind an einer Halterung 136 befestigt, welche beweglich sein muß, damit die Kontakte beim Zen trifugieren, d. h. beim Drehen des Gehäuses 22 von den Kontaktstiften 60, 62 abgehoben werden können. Wie beim ersten Ausführungsbeispiel stehen die Federkontakte 132 und 134 mit einem Spannungsgenerator 80 in Verbindung.Contacting of the contact pins 60 and 62 also takes place via spring contacts 132 and 134 , the spring contact 134 leading to the contact pin 62 also being able to rest against the pipe section 120 thereof and not necessarily resting on its head 70 . The Federkon clocks 132, 134 are attached to a bracket 136 which must be movable so that the contacts trifuge when Zen, ie when the housing 22 is rotated from the contact pins 60, 62 can be lifted off. As in the first exemplary embodiment, the spring contacts 132 and 134 are connected to a voltage generator 80 .

Ein zweites Ausführungsbeispiel des erfindungsgemäßen Verfahrens wird unter Verwendung des dritten Ausführungs beispiels der Vorrichtung so geführt, daß die Zellsus pension zunächst in das Gefäß 126 gegeben wird. Dieses kann auch gleichzeitig als Mischkammer dienen, wenn beispielsweise vorgesehen sein soll, Zellen unterschied lichen Typus zu fusionieren. Dazu werden die Zellen von unterschiedlichem Typus mit der Zellsuspension, in der sie aufgenommen sind, in das Gefäß 126 gegeben und in dieser durch ein übliches Mischverfahren eine ein homo genes Gemisch der Zellen von unterschiedlichem Typus bildende Zellsuspension hergestellt. A second embodiment of the method according to the invention is performed using the third embodiment example of the device so that the Zellsus pension is first placed in the vessel 126 . This can also serve as a mixing chamber at the same time, for example, if it is intended to fuse cells of different types. For this purpose, the cells of different types with the cell suspension in which they are accommodated are placed in the vessel 126 and a cell suspension which forms a homogeneous mixture of the cells of different types is produced by a conventional mixing method.

Eine dosierte Menge von Zellsuspension wird durch ent sprechendes Öffnen des Ventils 130 über die Bohrung 122 und die Ausnehmungen 124 auf die Oberfläche 46 der Zellträgerplatte 44 aufgebracht. Die Zellsuspension ver teilt sich dabei wie beim ersten Ausführungsbeispiel gleichmäßig über die gesamte Oberfläche 46. Anschließend wird die Halterung 136 derart bewegt, daß die Federkon takte 132 und 134 mit den Kontaktstiften 60 bzw. 62 eine elektrische Verbindung herstellen und somit die Elek troden 54 und 56 der Zellträgerplatte 44 mit dem Span nungsgenerator 80 verbunden sind, der, wie beim ersten Ausführungsbeispiel, je nach Art des Verfahrens der Elektrofusion Spannungsimpulse erzeugt, so daß die Zel len in dem elektrischen Feld zwischen den Elektroden 54 und 56 miteinander fusionieren.A metered amount of cell suspension is applied by opening valve 130 accordingly via bore 122 and recesses 124 on surface 46 of cell carrier plate 44 . As in the first exemplary embodiment, the cell suspension distributes itself uniformly over the entire surface 46 . Subsequently, the holder 136 is moved such that the spring contacts 132 and 134 make an electrical connection with the contact pins 60 and 62, respectively, and thus the electrodes 54 and 56 of the cell carrier plate 44 are connected to the voltage generator 80 , which, as in the first Embodiment, depending on the type of electrofusion process, generates voltage pulses so that the cells in the electric field between the electrodes 54 and 56 fuse together.

Das Entfernen der fusionierten Zellen von der Oberfläche 46 der Zellträgerplatte 44 erfolgt durch Rotieren des bereits fest auf dem Rotor 86 sitzenden Gehäuses 22. Dazu muß jedoch zuerst die Halterung 136 soweit ver schoben werden, daß die Federkontakte 132 und 134 nicht mehr die Kontaktstifte 60 bzw. 62 berühren, und außerdem muß das Rohr 116 soweit zurückgezogen werden, daß es den an das Gehäuse 22 angeformten Stutzen 108 freigibt und der Dorn 118 ebenfalls aus dem Auslaßkanal 104 zu rückgezogen ist. Dies führt dazu, daß die Ventilkugel 112 auf der Mündung 110 aufsitzt und diese dichtend verschließt. The fused cells are removed from the surface 46 of the cell carrier plate 44 by rotating the housing 22 which is already firmly seated on the rotor 86 . To do this, however, the bracket 136 must first be pushed so far that the spring contacts 132 and 134 no longer touch the contact pins 60 and 62 , and also the tube 116 must be withdrawn to the extent that it releases the nozzle 108 formed on the housing 22 and the mandrel 118 is also withdrawn from the outlet channel 104 . This leads to the valve ball 112 being seated on the mouth 110 and sealingly closing it.

Durch Drehen des Gehäuses 22 mitsamt der Zellträger platte 44 werden die fusionierten Zellen unter Einfluß von Zentrifugalkräften in radialer Richtung wie beim ersten Ausführungsbeispiel des Verfahrens in den Ring kanal 34 überführt und sammeln sich dort nach Beendi gung des Zentrifugierens in der Vertiefung 40.By rotating the housing 22 together with the cell carrier plate 44 , the fused cells are transferred under the influence of centrifugal forces in the radial direction as in the first embodiment of the method in the ring channel 34 and collect there after completion of the centrifugation in the recess 40th

Zum Abführen der Zellsuspension aus der Vertiefung 40 muß sichergestellt sein, daß das Gehäuse 22 in einer definierten Stellung stehen bleibt, in welcher der Dorn 118 in den Auslaßkanal 104 und das Rohr 116 über den Stutzen 108 geschoben werden kann. Dadurch wird durch den Dorn 118 die Ventilkugel 112 von der Mündung 110 entfernt und gibt den Auslaßkanal 104 frei, durch wel chen die Zellsuspension mitsamt den fusionierten Zellen unter Wirkung der Schwerkraft in das Rohr 116 abfließen kann. Bevorzugterweise kann dabei die Vertiefung 40 so ausgebildet sein, daß ihre tiefste Stellung bezüglich der Richtung der Schwerkraft im Bereich der Mündung 110 liegt, so daß die Zellsuspension aus dem gesamten Ring kanal 34 in Richtung der Mündung 110 abfließt.To remove the cell suspension from the recess 40, it must be ensured that the housing 22 remains in a defined position in which the mandrel 118 can be pushed into the outlet channel 104 and the tube 116 over the nozzle 108 . Characterized the valve ball 112 is removed from the mouth 110 by the mandrel 118 and releases the outlet channel 104 through which the cell suspension together with the fused cells can flow into the tube 116 under the action of gravity. Preferably, the recess 40 can be designed so that its lowest position with respect to the direction of gravity is in the region of the mouth 110 , so that the cell suspension flows out of the entire ring channel 34 in the direction of the mouth 110 .

Dieses zweite Ausführungsbeispiel des erfindungsgemäßen Verfahrens ermöglicht vorteilhafterweise eine quasikon tinuierliche Verfahrensführung, d. h., daß die einzelnen Verfahrensschritte, wie das Aufbringen der Zellsuspension auf die Oberfläche 46 der Zellträgerplatte 44, das Fu sionieren der Zellen, das Überführen der fusionierten Zellen in die Vertiefung 40 und das Abführen der Zellen aus dieser Vertiefung 40 aufeinanderfolgend beliebig oft erfolgen können.This second exemplary embodiment of the method according to the invention advantageously enables a quasi-continuous procedure, that is to say that the individual method steps, such as applying the cell suspension to the surface 46 of the cell carrier plate 44 , fusing the cells, transferring the fused cells into the depression 40 and the like The cells can be removed from this depression 40 successively as often as desired.

Ein weiterer Vorteil dieses Verfahrens ist auch darin zu sehen, daß sterile Bedingungen beim Zuführen der Zellen in das Gehäuse 22 und beim Abführen ein facher eingehalten werden können als bei dem ersten Aus führungsbeispiel.Another advantage of this method is also to be seen in the fact that sterile conditions when feeding the cells into the housing 22 and when discharging can be more easily complied with than in the first exemplary embodiment.

Schließlich ist das zweite Ausführungsbeispiel des er findungsgemäßen Verfahrens besonders dazu geeignet, automatisiert zu werden, da die Steuerung sämtlicher Verfahrensschritte automatisch erfolgen kann und beispiels weise das Gehäuse 22 zum Fusionieren und zum Zentri fugieren nicht in separate Vorrichtungen eingesetzt werden muß.Finally, the second embodiment of the method according to the invention is particularly suitable for being automated, since the control of all process steps can take place automatically and, for example, the housing 22 for fusing and centrifuging does not have to be used in separate devices.

Claims

1. A method for the electrofusion of cells, in which a cell suspension is fed to a fusion volume and the cells contained in the cell suspension are fused in the fusion volume by means of electric fields and the cell suspension is subsequently transferred from the fusion volume into a collection volume, characterized in that to transfer the cell suspension from the fusion volume into the collection volume by the action of centrifugal forces, the fusion volume and the collection volume are set in a rotational movement about the same axis of rotation at the same angular velocity.

2. Device for performing the method according to claim 1, with an element for receiving a cell suspension and with at least two electrodes in contact with the cell suspension, between which a fusion of the cells leading to producing electric fields can be generated, characterized in that the device comprises a housing ( 22 ) which can be placed on a rotor ( 86 ) of a centrifuge ( 82 ) and which has an axis of rotation ( 20 ) which is coaxial with the rotor ( 86 ) and which serves to receive the element, and that the housing ( 22 ) has an axis of rotation ( 20 ) in the radial direction adjoining the element, which has the suspension with the fused cells collecting during centrifugation.

3. Device according to claim 2, characterized records that the chamber one the collected Do not flow the suspension back to the element volume range.

4. Apparatus according to claim 2 or 3, characterized in that the element is designed as a cell support plate ( 44 ) which is provided on an upper surface ( 46 ) with at least two electrodes ( 54, 56 ).

5. The device according to claim 4, characterized in that mutually facing sides of the electrodes ( 54, 56 ) on the cell support plate ( 44 ), at least to a substantial part of their course, approximately in the radial direction to the axis of rotation ( 20 ) Housing ( 22 ) are extending.