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DE3404441C2 - - Google Patents

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DE3404441C2
DE3404441C2 DE3404441A DE3404441A DE3404441C2 DE 3404441 C2 DE3404441 C2 DE 3404441C2 DE 3404441 A DE3404441 A DE 3404441A DE 3404441 A DE3404441 A DE 3404441A DE 3404441 C2 DE3404441 C2 DE 3404441C2
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DE
Germany
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candida
containers
microorganism
tests
determination
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DE3404441A
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Rodolfo Prato Florenz/Firenze It Berretti
Paolo Monteriggioni Siena It Tarli
Brunilde San Gimignano Siena It Berti
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Sclavo SpA
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Sclavo SpA
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    • C12M41/00—Means for regulation, monitoring, measurement or control, e.g. flow regulation
    • C12M41/30—Means for regulation, monitoring, measurement or control, e.g. flow regulation of concentration
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
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Description

Die vorliegende Erfindung betrifft eine Vorrichtung zur Be­ stimmung von Mikroorganismen auf der Grundlage biochemischer Tests.
Aus der US-PS 40 30 980 ist eine Vorrichtung zur Bestimmung oder Identifizierung von Mikroorganismen auf der Grundlage biochemi­ scher Tests bekannt, die aus mehreren Elementen, nämlich einer Platte mit den in Abständen angeordneten Vertiefungen einer Deckplatte zum Abdecken der Vertiefungen und Öffnungen, um die Vertiefungen mit der Luftatmosphäre zu verbinden und so das Wachstum der einzelnen Kulturen zu ermöglichen, besteht. Bei dieser Art von Vorrichtung ist es jedoch notwendig, die Ergeb­ nisse mit Hilfe einer extra Tabelle auszuwerten. Es ist not­ wendig, alle Ergebnisse zu sammeln und sie im Vergleich zu Tabellen und Lehrbüchern auszuwerten. Dies bedeutet, daß die einzelnen, mit den zu identifizierenden Mikroorganismen erhaltenen Ergebnisse mit denjenigen bekannter Spezies verglichen werden müssen. Dies ist ein langwieriges und zeitraubendes Verfahren; weiterhin müssen die erhaltenen Ergebnisse auf Listen übertragen werden, was die Gefahr von Übertragungsfehlern mit sich bringt. Aufgabe der Erfindung ist es daher, eine Vorrichtung zu schaffen, die eine schnelle und sichere Auswertung der Testergebnisse er­ möglicht.
Die erfindungsgemäße Vorrichtung zur Bestimmung bzw. Identifizierung von Mikroorganismen auf der Grundlage von biochemischen Tests, bestehend aus einer Reihe von Behältern, von denen jeder ein Reagenz zur Bestimmung solcher Mikroorganismen enthält und auf einem einzigen tragenden Element angebracht ist, ist dadurch gekenn­ zeichnet, daß auf dem tragenden Element eine Reihe von Markie­ rungen (17-23) angebracht ist, wobei die Behälter (4-12), in denen die zur Bestimmung eines spezifischen Mikroorganismus vorgeschriebenen biochemischen Tests durchgeführt werden, durch gleiche Markierungen verbunden sind.
Die Markierungen haben unterschiedliche Länge, Farbe und/oder Aussehen bzw. graphische Form und können auch teilweise durch Symbole und/oder Ziffern ersetzt werden.
Die Vorrichtung ist vorzugsweise kreisförmig angeordnet und die Behälter bestehen vorzugsweise aus Reagenzgläsern bzw. sind in der Form von Reagenzgläsern. Um den Gebrauch der Vorrichtung zweckmäßig zu gestalten, kann der Name des zu bestimmenden Mikro­ organismus längs der Bestimmungsmarkierung geschrieben werden.
Die Reagenzien für die biochemischen Tests bzw. Analysen in den Behältern können getrocknet, gefriergetrocknet, fest, gepreßt oder in Form einer Lösung vorliegen. Die Behälter können ein we­ sentlicher Bestandteil der Vorrichtung selbst sein, oder sie können auf der Oberseite der Vorrichtung durch Adhäsion oder Einsetzen befestigt werden. Die Vorrichtung kann auch mit einer zentralen Vertiefung versehen sein, die vorzugsweise kreisför­ mig ist.
Im vorliegenden Fall wird beispielhaft und ohne Beschränkung die Anwendung einer solchen Vorrichtung zur Bestimmung bzw. Identifizierung der pathogenen Arten der Gattung Candida be­ schrieben.
Viele Candida-Arten und unter ihnen alle pathogenen Arten sind häufig vorkommende Kommensalen in den menschlichen Körperhöhlen. Solche Arten können bei vorliegender Empfänglichkeit des Systems durch einen endogenen Vorgang eine Anzahl krankhafter Ereignisse bewirken.
Zusätzlich zu der am häufigsten isolierten Art, Candida albicans, besitzen mindestens sechs verschiedene Arten gewisse pathogene Eigenschaften, viz.: Candida stellatoidea, Candida krusei, Candida tropicalis, Candida pseudotropicalis, Candida guiller­ mondii, Candida parapsilosis.
Daher ist es für die Diagnostik notwendig, nach der Isolierung des Candida-Stammes zu bestimmen, ob eine humanpathogene Art vorliegt.
Die Bestimmung bzw. Identifizierung der Arten, zu denen der be­ treffende Mikroorganismus gehört, wird durch die Anwendung bio­ chemischer Analysen erreicht, z. B.:
  • a) Assimilation einiger Zucker in einem Kulturmedium, das keine andere Kohlenstoffquelle besitzt (C-auxanogram);
  • b) Fermentationstest einiger Zucker, und
  • c) Wachstum in Gegenwart bestimmter Substanzen.
Diese Tests wurden bisher in folgender Weise durchgeführt:
Die Assimilationstests werden durchgeführt, indem mit der Auf­ schwemmung des zu bestimmenden Stammes und einem besonderen C-auxanogramen Medium ein Bakterienagar hergestellt wird. Auf den letzteren werden entweder (Filter-)Papierscheiben gelegt, die unmittelbar vor Gebrauch mit den verschiedenen Zuckerlösungen getränkt wurden, oder es werden (Filter-)Papierscheiben mit den Zuckern in getrockneter Form aufgelegt, oder auch Porzellanbe­ hälter oder Porzellaneinsätze mit den Zuckerlösungen.
Es ist möglich, Platten für besonderen Gebrauch mit zonaler Un­ terteilung am Boden zu verwenden. Wird eine besondere Platte mit bereits vorhandener Unterteilung in Sektoren benutzt, muß der Benutzer sie nicht mehr unterteilen und es ist nur noch er­ forderlich, die Symbole der zu testenden Zucker einzutragen.
Die Ergebnisse der Assimilationstests werden nach 24 bis 48 Std. Bebrütung bei 25°C bis 37°C ermittelt. Werden Wachstumshöfe um die Assimilationszucker beobachtet, werden diese Höfe als posi­ tive Reaktion bzw. Testergebnisse betrachtet und mit dem Symbol (+) versehen, im Gegensatz dazu wird das Fehlen der Höfe mit (-) bezeichnet.
Fermentationstests werden normalerweise nach den auxanogram Tests durchgeführt, da sie die letzteren vervollständigen: tat­ sächlich kann ein Zucker, der nicht assimiliert wurde, nicht fermentiert werden. Somit werden nur die assimilierten Zucker getestet.
Die Tests bzw. Analysen können in Hefe-Wasser oder in Lösungen durchgeführt werden, die Vitaminfaktoren in einer bestimmten vorgewählten Konzentration enthalten und mit einer geeigneten Menge des zu testenden Zuckers. Um Gasbildung festzustellen, können Durham-Kapseln verwendet werden, oder eine Mischung aus Paraffinwachs und Petroleumgel.
Die Durchführung dieser Tests bzw. Analysen erfordert die An­ impfung des zu testenden Stammes, seine Inkubation bei 25°C bis 37°C und tägliche Probeentnahmen bzw. Ablesungen bis zu 10 Tagen Inkubation.
Danach ist es möglich, die Arten mit Hilfe der Tabellen, die in vielen Lehrbüchern widergegeben sind, wie z. B. J. Lodder, 1970 Edn., The Yeast, North Holland Publishing Co., Amsterdam, zu bestimmen.
Kohlehydratassimilations- und Fermentationsanalysen können mit käuflichen gebrauchsfertigen Kits durchgeführt werden. Z. B. können "API 20 C Yeast System" (Analytab Products, Inc., New York) und "Uni-Yeast Tek System" (Flow Diagnostic) genannt werden.
API 20 C besteht aus 20 Zellkammern, in denen sich die dehydra­ tisierten Kohlehydrate für die Assimilations- und Fermentations­ analysen befinden.
Die Zellkammern werden mit einer Aufschwemmung des zu testenden Pilzes gefüllt, wie hergestellt in einem Agar, der gelöst und auf 50°C abgekühlt wird, der mit der Ausrüstung mitgeliefert wird. Nach Inkubation für 48 bis 72 Std. bei 30°C kann die Zucker­ fermentation am Farbumschlag eines Indikators und die Gas­ bildung an der Blasenbildung abgelesen werden.
Die Assimilation der Kohlehydrate wird durch das Wachstum der Stämme in den Zellen (Kammern) verdeutlicht.
Das Uni-Yeast Tek System besteht dagegen aus zwei Reagenzglä­ sern und einer vielfach unterteilten Petrischale. Die Reagenz­ gläser enthalten Nährmedien zum Auffinden der entwicklungsfähigen Pseudotubuli bzw. zur Assimilation von Saccharose und erlauben die Bestimmung von Candida stellatoidea. Die Petrischale ent­ hält 11 periphere Unterteilungen, die festes Nährmedium für die Kohlehydratfermentation, den Ureasennachweis und für die Kohle­ hydrat- und Nitratassimilation enthalten. In der Mitte befindet sich ein kleiner Behälter mit Maismehl-Agar zum Nachweis des Mycels und der Chlamydosporen.
Die Petrischale wird mit einem Tropfen der Aufschwemmung des zu testenden Pilzes in destilliertem Wasser beimpft und 2 bis 7 Tage lang bei 25°C bebrütet.
Im Gegensatz zu diesen langwierigen Untersuchungen wird es durch die erfindungsgemäße Vorrichtung ermöglicht, auf einfache und wirksame Art einen Mikroorganismus einer bestimm­ ten Art zu identifizieren, im vorliegenden Fall einen Mikroor­ ganismus der Gattung Candida, die auf den Assimilations- und Fermentationstest einiger Zucker hinsichtlich der Möglichkeit des Wachstums in Gegenwart von KNO₃ und Cycloheximid und der Fähigkeit zur Ureasebildung basiert.
Die erfindungsgemäße Vorrichtung, vorzugsweise von kreisförmigem Um­ riß, hat an ihrer Oberseite bzw. Oberfläche eine Anzahl Behälter, die vorzugsweise die Form von Reagenzgläsern haben, oder eine Anzahl lee­ rer Zwischenräume, deren Zahl im vorliegenden Fall bei der Gat­ tung Candida wenigstens 16 sein sollte.
Die Behälter enthalten Reagenzien für die biochemischen Analy­ sen in irgendeiner der oben erwähnten Formen. Auf der Oberseite befinden sich Markierungen unterschiedlicher Länge, Farbe und/oder Aussehen oder graphischer Form (auch teilweise ersetzt durch Symbole und/oder Ziffern), die alle Behälter verbinden, in denen die biochemischen Tests stattfinden, die zur Bestimmung eines speziellen Mikroor­ ganismus ausreichen. Entlang der Markierung kann der Name der zu bestimmenden Candida-Art eingetragen werden.
Eine solche Vorrichtung ermöglicht es, gleichzeitig die Assimi­ lation und Fermentation der Zucker, das Wachstum in Gegenwart von KNO₃ und Cycloheximid und die Ureaseproduktion zu testen.
Es ist somit möglich, die zu identifizierenden Arten schnell und wirksam zu bestimmen.
Fig. 1 zeigt eine mögliche Ausführungsart der erfindungsgemäßen Vorrichtung zur Bestimmung der pathogenen Candida-Arten.
Auf der Vorrichtung befinden sich 7 Kreisbogenmarkierungen 17 bis 23 von unterschiedlicher Länge und Farbe: die Farbgebung ist rein zufällig und in der nachstehenden Liste sind die Farben angegeben, die den zu bestimmenden Arten zugeordnet sind:
GelbCandida guillermondii (17) RotCandida albicans (20) GrünCandida parapsilosis (21) WeißCandida pseudotropicalis (19) HimmelblauCandida tropicalis (18) ViolettCandida krusei (23) OrangeCandida stellatoidea (22)
Zusätzlich gilt: ist die Markierung durchgehend (-), ist das Testergebnis positiv, ist sie unterbrochen (- - - -), vari­ iert das Ergbnis und fehlt sie, ist das Ergebnis negativ.
Die Vorrichtung enthält auch Symbole der folgenden Bedeutungen:
fFermentation aSäurebildung f/aFermentation oder Säurebildung -/anegativ oder Säurebildung f/-Fermentation oder negativ vvariabel
Ein Zucker wird fermentiert, wenn Säure und Kohlendioxid gebil­ det wird.
Ein Zucker wird angesäuert, wenn nur Säure gebildet wird.
In der Mitte der Vorrichtung befindet sich eine Vertiefung (24), die bei Verwendung einer Petrischale eine bestimmte Menge Was­ ser zur Anfeuchtung der Umgebung aufnimmt. Die Reagenzien für die biochemischen Tests werden in die 16 Behälter von 1 bis 16 einschließlich gefüllt in irgendeiner der schon beschriebenen Form und können anhand der Symbole der Reagenzien bestimmt wer­ den.
Die 16 Behälter enthalten folgende Substanzen bzw. Reagenzien:
Fermentationstests:Glukose (GLU) (13)
Maltose (MAL) (14)
Saccharose (SAC) (15)
Lactose (LAT) (16) Wachstumstests:KNO₃ (1)
Cycloheximid+Glukose (C. EX.) (12) Ureasebildung:Harnstoff (URE) (3) Assimilationstests:Inosit (4)
Maltose (5)
Trehalose (TRE) (6)
Glukose (GLU) (7)
Saccharose (SAC) (8)
Cellobiose (CEL) (9)
Raffinose (RAF) (10)
Lactose (LAT) (11) Kontrolle:kein Reagenz (2) (für den Stickstoffassimilationstest)
pH-Indikatoren können den Substanzen beigefügt werden, um die Reaktionen deutlicher zu machen.
Zur Bestimmung der pathogenen Candida-Arten wird folgendermaßen vorgegangen:
Die Vorrichtung gemäß Fig. 1 wird in eine Petrischale gestellt und die 8 Behälter, die die Zucker für die Assimilationstests wie oben erwähnt enthalten, und der Behälter mit dem Cycloheximid werden mit einem aushärtbaren bzw. verfestigenden Nährmedium ohne weitere Kohlen­ stoffquelle mit oder ohne ph-Indikator gefüllt. Der Behälter für den Nitrogenassimilationstest und der Kontrollbehälter (Vergleich) werden mit einem anderen aushärtbaren bzw. verfestigenden Nährmedium mit oder ohne einen pH-Indikator und ohne andere Stickstoffquelle gefüllt.
Dann wird die Aufschwemmung des zu testenden Mikroorganismus vorbereitet: die Kolonien werden von einer Isolationsplatte (z. B. Sabouraud) entnommen und damit werden alle Behälter für die Fermentationstests wie oben aufgezählt und auch der Harn­ stoff enthaltende Behälter beimpft. Zusätzlich wird ein Tropfen der Aufschwemmung in die Behälter mit dem bereits verfestigten Nährmedium gegeben.
Anschließend werden die Behälter für die Fermentationstests mit zuvor verflüssigtem Petroleumgel versiegelt. Der gesamte Ein­ satz wird dann bei 25°C bis 30°C bebrütet. Nach Abschluß der Bebrütung werden die Zuckerassimilationstests ausgewertet: ent­ hält die Testanordnung den erwarteten Mikroorganismus, findet man Wachstum oder Farbwechsel bei den pH-Indikatoren vor, an­ dernfalls kann keine Änderung beobachtet werden.
Die Farbe der Markierung wird beobachtet, die den Assimilations­ test mit dem Cycloheximid-Wachstumstest, die positive Ergeb­ nisse ergaben, (Wachstum oder Farbwechsel des pH-Indikators) verbindet und die Art der Gattung Candida ist bestimmt.
Zum Beispiel: sind die Assimilationstests für Maltose (MAL), Trehalose (TRE), Glukose (GLU) und das Wachstum in Cycloheximid positiv, bedeutet es, daß der Stamm Candida stellatoidea (durch­ gehende orangene Linie) vorliegt.
Folgt man der farbigen Markierung entlang ihres Umfangs, so kann man die Ergebnisse der biochemischen Tests, welche die Identifizierung bestätigen, ablesen. Im Falle von Candida stellatoidea sind die Fermentationstests für Glukose (GLU) und Maltose (MAL) positiv (f), während derjenige von Saccharose (SAC) negativ (-/a) ist.
Der Kontrolltest dient als Hinweis für den Stickstoffassimilations­ test (KNO₃).
Die erfindungsgemäße Vorrichtung wie z. B. die in Fig. 1 dargestellte, kann auch zur Bestimmung bzw. Identifizierung anderer pathogener Hefen herangezogen werden. Ihre Bestimmung basiert auf ähnlichen Tests mit der gleichen Verfahrensweise und wird mittels einer Tabelle durchgeführt, worin die Ergebnisse solcher Tests eingetragen wurden. Solche Tabellen sind in vielen Nachschlagewerken, wie z. B. J. Lodder, 1970 Edn., The Yeast, North Holland Publishing Co., Amsterdam, angegeben.
Beispiel
In der Vorrichtung gemäß Fig. 1 bestehen die Reagenzien für die Zuckerassimilationstests aus Lösungen der verschiedenen Zucker (20% bis 40%) in destilliertem Wasser mit Polyvinyl­ alkohol (1% bis 0,5%). Das Reagenz für den Kaliumnitrat­ assimilationstest ist eine Lösung von KNO₃ der Konzentration 10% in 1% bis 0,5% Polyvinylalkohol.
In der Kontrollösung für die Stickstoffassimilation liegen keine Reagenzien vor.
Das Reagenz für den Cycloheximidsensitivitätstest ist eine Glu­ koselösung von 20% Konzentration in destilliertem Wasser und Poly­ vinylalkohol (1% bis 0,5%) und Cycloheximid (0,5%).
Für den Ureaseproduktionstest ist das Reagenz eine besondere Christensentyp-Nährlösung mit ph-Indikator.
Die Reagenzien für die Fermentationstests sind übliche Spezial­ nährlösungen auf der Grundlage von Ochsenfleischextrakt, Na­ triumchlorid und destilliertem Wasser, die einzelnen Zucker liegen je in einer Konzentration von 2% vor und Bromthymolblau ist der pH-Indikator. Anteile von 100 Mikroliter jeder Lösung werden in die entsprechenden Behälter abgesetzt bzw. pipettiert. Jetzt wird die Vorrichtung in ein Gerät zum Trocknen der Re­ agenzien gestellt, z. B. unter ein Vakuum.
Anschließend kann die Vorrichtung (alleine oder in einer Petri­ schale) in eine Hülle aus entsprechendem Material, wie z. B. ein Plastikmaterial, gestellt werden, das dann versiegelt wird.
Die Sterilisation erfolgt entweder mit Äthylendioxid oder Gammastrahlen. Anschließend wird die Vorrichtung (alleine oder in einer Petrischale) in eine Hülle aus einem Material gegeben, das genügend Schutz gegen Feuchtigkeitseinwirkung bietet.
So vorbereitet kann die Vorrichtung eine lange Zeit bei +2°C bis +8°C aufbewahrt werden, bevor sie zur Bestimmung von Mikro­ organismen herangezogen wird.
Das Nährmedium für die Zuckerassimilationstests basiert auf einem Kulturmedium für Hefe, 2% Agar-Agar und Bromkresolviolett als pH- Indikator. Das Nährmedium für die Stickstoffassimilationstests beruht auf einer animilierbaren Kohlenstoffquelle, 2% Agar-Agar und Bromthymolblau als pH-Indikator.

Claims (9)

1. Vorrichtung zur Bestimmung bzw. Identifizierung von Mikroorganismen auf der Grundlage von biochemischen Tests, bestehend aus einer Reihe von Behältern, von denen jeder ein Reagenz zur Bestimmung solcher Mikroorganismen enthält und auf einem einzigen tragenden Element angebracht ist, dadurch gekenn­ zeichnet, daß auf dem tragenden Element eine Reihe von Markie­ rungen (17-23) angebracht ist, wobei die Behälter (4-12), in denen die zur Bestimmung eines spezifischen Mikroorganismus vorgeschriebenen biochemischen Tests durchgeführt werden, durch gleiche Markierung verbunden sind.
2. Vorrichtung gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Reagenzien zur Bestimmung bzw. Identifizierung der Mikro­ organismen in getrockneter, gefriergetrockneter oder fester Form, auch tablettenförmig vorliegen.
3. Vorrichtung gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Markierungen verschiedene Längen, Farben und/oder Aussehen haben und auch teilweise durch Symbole und/oder Ziffern ersetzt sein können.
4. Vorrichtung gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Behälter (4-12) ein integraler Bestandteil der Vor­ richtung sein können, oder daß sie auf der Oberseite durch Ad­ häsion befestigt oder eingefügt sein können.
5. Vorrichtung gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß sie eine zentrale Vertiefung (24) aufweisen kann.
6. Vorrichtung gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Anzahl der Behälter der Vor­ richtung 16 ist, wenn ein Mikroorganismus der Gattung Candida indentifiziert werden soll.
7. Vorrichtung gemäß den vorhergehenden Ansprüchen, dadurch gekennzeichnet, daß die Behälter KNO₃, Cycloheximid plus Glukose, Harnstoff, Glukose allein, Saccharose, Lactose, Maltose, Raffinose, Cellobiose, Inosit, Trehalose enthalten, wenn ein Mikroorganismus der Gattung Candida indentifiziert werden soll.
8. Verwendung der Vorrichtung gemäß den vorhergehenden Ansprüchen 1 bis 7 zur Identifizierung einer Hefe.
9. Verwendung nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß der Mikroorganismus die Arten Candida albincans, Candida stellatoidea, Candida krusei, Candia tropicalis, Candida guillermondii, Candida parapsilosis und Candida pseudotropicalis umfaßt.
DE3404441A 1983-02-08 1984-02-08 Vorrichtung zur bestimmung von mikroorganismen Granted DE3404441A1 (de)

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