DE3329659C2 - - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum chemischen Modifizieren eines nativen Proteins zu einem modifizierten enzymartigen Protein.

Proteine sind biologisch synthetisierte Makromoleküle, die verschiedene Funktionen in lebenden Systemen haben. Enzyme sind besondere biologisch aktive Proteine, die bestimmte Reaktionen katalysieren. Derzeitig findet die Enzymtechnologie in vielen Bereichen von Industrie und Forschung Anwendung, zum Beispiel medizinische Forschung, Nahrungsmittel-Behandlung und -Konservierung, Herstellung fermentierter Getränke, Herstellung von Arzneimitteln und Bestimmung der Konzentration verschiedener Metabolite und Nahrungsmittelbestandteile mittels enzymatischer Analysen.

Enzyme sind in ihrer biologischen Aktivität hochspezifisch und katalysieren im allgemeinen eine bestimmte Reaktion in einem sehr hohen Grade im Vergleich zu der entsprechenden, bei Raumtemperatur ohne biologische Katalyse ablaufenden Reaktion. Ein Enzym kann katalytische Aktivität mit Bezug auf eine Anzahl von Substraten, auf die es wirken kann, zeigen. Demgemäß kann ein gegebenes Enzym die Synthese oder den Abbau von mehr als einem Substrat katalysieren. Einige Proteine, die nicht als klassische Enzyme angesehen werden, wie Rinderserum- Albumin, zeigen sehr begrenzte katalytische Aktivität mit Bezug auf ein oder mehrere Substrate.

Viele Enzyme werden in der Natur in sehr kleinen Mengen gefunden. Ihre Isolierung, Reinigung und Verwendung ist daher im Hinblick auf die Kosten und die Zeit, die zu ihrer Isolierung in verwendbarer Form erforderlich ist, auf Arbeiten in kleinem Maßstab beschränkt.

Einige Enzyme kommen in der Natur in relativ großen Mengen vor und sind verhältnismäßig leicht zu isolieren, zu reinigen und zu verwenden. Sie können aber wegen ihres bestimmten katalytischen Verhaltens nur bestimmte ausgewählte Reaktionen katalysieren.

In letzter Zeit sind viele Versuche unternommen worden, Enzyme zu synthetisieren, welche gleiches enzymatisches Verhalten zeigen wie die natürlichen Enzyme, die entweder selten sind oder deren Isolierung teuer ist. Ferner hat man versucht, native Enzyme zu modifizieren derart, daß sich ihre Substratspezifität ändert, so daß sie eine Reaktion katalysieren können, die sie vorher nicht katalysieren konnten.

Eine bekannte Technik, um enzymatisches Verhalten zur Katalysierung einer bestimmten gewünschten Reaktion zu erhalten, ist die Synthese der sogenannten Enzym-Modell- Moleküle. Zum Beispiel können Verbindungen niedrigen Molekulargewichts kovalent an funktionelle Gruppen gebunden werden, welche die Aktivität des Aktivitätszentrums eines Enzyms zeigen (siehe Breslow, R., Advances in Chemistry Series, R. F. Grould, Ed., American Chemical Society, Washington, D. C., 21-43 [1971], und Tang, C. C., Davalian, D., Haung, P., und Breslow, R., J. Amer. Chem. Soc., 100, 3918 [1978], und Breslow, R., Doherty, J., Guillot, G., und Lipsey, C., J. Amer. Chem. Soc., 100, 3227 [1978]).

Bei einer anderen Methode wird eine Matrix aus einem synthetischen Polymeren verwendet, welches entlang seiner Hauptkette modifiziert ist, um die funktionellen Gruppen, welche die Funktion des Aktivitätszentrums eines gegebenen Enzyms aufweisen, bereitzustellen (siehe z. B. Wulff, G., und Schulza, I., Israel, J. Chem., 17, 291 [1978], und Suh, J., und Klotz, I. M., Bioorganic Chemistry, 6, 165 [1977]).

Durch Anhängen eines chemischen Teils an ein natives Enzym in der Nähe seines Aktivitätszentrums hat man versucht zu verursachen, daß solch ein Enzym mit einer anderen katalytischen Aktivität reagiert. Ein Beispiel dafür ist die Umwandlung von Papain, einem proteolytischen Enzym, in ein Enzym vom Typ der Oxidase durch die kovalente Bindung eines Flavins nahe dem Aktivitätszentrum des nativen Papainenzyms. (Levine, H. L., und Kaiser, E. T., J. Amer. Chem. Soc., 100, 7670 [1978], Kaiser, E. T., et al., Adv. in Chemistry Series, No. 191, Biomimethic Chemistry, Seite 35, 1980; und Otsuki, T.; Nakagawa, Y., und Kaiser, E. T., J.C.S. Chem. Comm., 11, 457 [1978]. Andere Beispiele für eine derartige enzymatische Modifikation sind dem folgenden Artikel zu entnehmen: Wilson, M. E., und Whitesides, G. M., J. Amer. Chem. Soc., 100, 306 [1978].)

Die Substratspezifität läßt sich auch durch Ruhigstellung eines nativen Enzyms in einer Gelmatrix ändern. So ist z. B. das Enzym Trypsin in Polyacrylamid-Gel ruhiggestellt worden. Das Polyacrylamid-Gel gestattet Aminosäureestern durch die Gel-Matrix hindurchzudiffundieren, um mit dem Enzym zu reagieren, gestattet aber größeren Proteinen das Hindurchdiffundieren nicht. So wird die Substratspezifität durch Eliminieren des Zutritts eines der Substratmoleküle zu dem Enzym geändert (siehe Kirk-Othmer, Encyclopedia of Chemical Technology, 3 Ed., 9, 148 [1980], Wiley and Son, Inc.).

Es ist auch bekannt, daß eine native Lysin-Monooxigenase derart umgesetzt werden kann, daß die Sulfhydrylgruppen an dem Enzym blockiert sind. Dann zeigt das Enzym Lysin- Monooxigenase eine neue katalytische Aktivität gegenüber Aminosäuren und katalysiert oxidativ Desaminierung anstatt, wie das natürliche Enzym, oxigenativ Decarboxilierung. Die Autoren können jedoch nicht über das modifizierte Verhalten berichten (siehe Yamauchi, T., Yamamoto, S., und Hayaishi, D., in The Journal of Biological Chemistry, 248, 10, 3750-3752 [1973]). Auch durch Umsetzen eines nativen Enzyms, z. B. Trypsin, mit seinem natürlichen Inhibitor und anschließender Vernetzung kann Substratspezifität des Enzyms verändert werden (siehe Beaven, G. H., und Gratzer, W. B., in Int, J. Peptide Res., 5, 215-18 [1973]).

Außerdem sind synthetische Proteine durch Verankern eines Aminosäurerestes an einem festen Träger und anschließendes Zufügen eines Aminosäurerestes nach dem anderen hergestellt worden.

Ferner sind halbsynthetische Proteine synthetisiert worden, indem ein natives Protein einer begrenzten Hydrolyse ausgesetzt wurde, um Proteinbruchstücke zu erzeugen, denen dann ein oder mehrere Aminosäurereste angefügt oder von ihnen entfernt wurden, wodurch modifizierte Bruchstücke gebildet wurden. Diese wurden zu einem halbsynthetischen Protein mit einer geänderten Aminosäurezusammensetzung wieder zusammengefügt ("Semisynthetic Proteins" von R. E. Offord, John Wiley and Sons Ltd., 1980).

Obwohl diese Techniken für viele Anwendungszwecke geeignet sind, sind sie kostspielig. Nach den bekannten Methoden wird ein Enzym einfach einem Satz von Bedingungen unterworfen und dann versucht, sein Verhalten aufzuklären.

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein einfaches, einwandfrei arbeitendes, wirtschaftliches und systematisches Verfahren zum chemischen Modifizieren eines billigen und in großem Umfang zur Verfügung stehenden nativen Proteins zu einem modifizierten enzymartigen Protein anzugeben. Dieses Protein soll eine katalytische enzymatische Aktivität mit Bezug auf eine gewünschte chemische Reaktion zeigen, die bisher durch das native Enzym, das diese Reaktion katalysiert, keine geeignete Reaktion war; die neue Reaktion soll systematisch vorherbestimmt werden können.

Die Aufgabe wird durch das Verfahren des Anspruches 1 und das modifizierte enzymartige Protein des Anspruches 9 gelöst; bevorzugte Ausführungsformen des Verfahrens sind in den Unteransprüchen 2 bis 8 angegebenen.

Das Wort "Enzym" wird hier für ein Protein, das eine bekannte katalytische Aktivität gegenüber speziellen Substraten hat, gebraucht, das Wort "Protein", wie allgemein üblich, für ein Polypeptid, das aus Aminosäuren unter Bildung eines biologischen Moleküles aufgebaut ist.

Bei dem Verfahren nach der Erfindung wird ein natives Protein in ein modifiziertes enzymartiges Protein, das eine oder mehrere Eigenschaften eines ausgewählten Modellenzyms nachahmt, übergeführt. Es wird entweder ein nichtenzymatisches natives Protein in ein modifiziertes enzymartiges Protein oder ein enzymatisches natives Protein in ein neues enzymatisch aktives modifiziertes Protein umgewandelt. Alternativ kann eine schwache enzymatische Aktivität, die das native Protein besitzt, durch das erfindungsgemäße Verfahren zu einer wirtschaftlich nutzbaren Höhe verstärkt werden.

Es wird also ein natives Protein zu einem davon verschiedenen Protein maßgeschneidert, welches die enzymatischen Aktivitäten des Enzyms, das nachgebildet worden ist, zeigt. Die Möglichkeit, ein natives Protein zu einem Protein mit vorbestimmter katalytischer Aktivität chemisch zu modifizieren, bringt in weiten Bereichen von Chemie und Technik große Vorteile. Wenn man z. B. ein Enzym verwenden will, das nur in kleinen Mengen zur Verfügung steht, sehr teuer ist oder sehr schwer zu reinigen ist, kann man es nach dem erfindungsgemäßen Verfahren herstellen.

Erfindungsgemäß werden ein Enzym, das nachgebildet werden soll, und ein Inhibitor für dieses Enzym ausgewählt. "Inhibitor" bedeutet hierin ein Molekül mit ausreichender struktureller Ähnlichkeit mit dem natürlichen Substrat des Modellenzyms, um als Schablone zur Bewahrung einer inhibitorartigen Stelle am modifizierten enzymartigen Protein zu dienen. Der Inhibitor wird an einem festen Träger immobilisiert. Die Vorteile, die durch das Arbeiten mit einem derart immobilisierten Inhibitor erzielt werden, sind am Schluß der Beschreibung angegeben.

Es wird ein natives Protein, das in ein modifiziertes enzymartiges Protein umgewandelt werden soll, ausgewählt, gereinigt, partiell denaturiert und dann mit dem immobilisierten Inhibitor ausreichend lange und bei ausreichender Temperatur in Kontakt gebracht, um die vorliegende Menge des partiell denaturierten Proteins an den immobilisierten Inhibitor zu binden. Dann wird überschüssiges, nicht gebundenes partiell denaturiertes natives Protein von dem den Inhibitor enthaltenden Träger durch Waschen entfernt.

Das an den immobilisierten Inhibitor gebunden gebliebene partiell denaturierte native Protein wird vernetzt und danach wird überschüssiges Vernetzungsmaterial durch Waschen entfernt. Das inhibitorgebundene vernetzte Protein wird selektiv von immobilisierten Inhibitor weggewaschen, um ein modifiziertes enzymartiges Protein zu erhalten, das die katalytischen Aktivitäten des Modellenzyms, dessen Inhibitor in dem Verfahren verwendet wurde, zeigt.

Unter "Immobilisierter Inhibitor" ist ein Inhibitor zu verstehen, der fest an einen festen, vorzugsweise wasserunlöslichen Träger gebunden ist, so daß der Inhibitor weitgehendst durch alle Verfahrensstufen wasserunlöslich bleibt.

Bei einer bevorzugten Ausführungsform wird der Inhibitor kovalent an einen wasserunlöslichen organischen oder anorganischen Träger gebunden. Wasserunlösliche organische Träger, die bevorzugt verwendet werden, sind: perlenförmiges hochmolekulares Polysaccharid, das mit Epichlorhydrin vernetzt worden ist (im Handel unter der Bezeichung Sepadex erhältlich); ein auf Agarose basierendes lineares vernetztes Polysaccharid mit alternierenden Resten von D-Galactose und 3,6-Anhydro-L-galactose (im Handel unter der Bezeichnung Sepharose erhältlich); ein dreidimensionales Polyacrylamidgitter mit einem die Zwischenräume füllenden Agarosegel (im Handel unter der Bezeichnung Ultrogel erhältlich).

Viele wasserunlösliche immobilisierte Inhibitoren stehen aus im Handel erhältlichen Quellen zur Verfügung, worin sie auf vorgenannten Trägern immobilsiert worden sind.

Bevorzugt verwendete anorganische wasserlösliche Träger schließen feuerfeste keramische Oxide ein, z. B. poröse feinzerteilte keramische Oxide, die durch Kompaktieren und Sintern von pulverförmigen keramischen Oxiden, wie Aluminiumoxid-, Zirkonoxid-, Magnesiumoxid-, Siliciumoxid- und Thoriumoxid-Pulver erhalten werden. Die Herstellung und Verwendung solcher keramischer Oxid-Träger ist in der US-PS 40 01 085 offenbart.

Es ist auch möglich, den Inhibitor an einen wasserlöslichen Träger, wie einem Protein, z. B. Serumalbumin, zu bilden. In einem solchen Fall ist der Inhibitor an dem Protein immobilisiert, bleibt aber in wasserlöslicher Form.

"Partielle Denaturierung" bedeutet eine Änderung in der Konformation eines Proteins, um die Gestalt oder die Konformation des Proteins zu stören, ohne eine irreversible starke Denaturierung des Proteins zu bewirken. "Konformation" ist allgemein definiert als Kombination von Sekundär- und Tertiär-Struktur eines Proteins. Die partielle Denaturierung von Proteinen ist bekannt und beschrieben in: "Biochemistry" von A. L. Lehningen, Worth Publishers, Inc., N.Y., 1970, S. 58; den Aufsätzen von P. L. Privalov, "Stability of Proteins" in Advances in Protein Chemistry, Vol. 33, S. 167-192; C. Sanford, "Protein Denaturation, PART C" in Advances in Protein Chemistry, Vol. 24, S. 2-97; F. R. N. Gurd, et al. "Motions in Proteins": in Advances in Protein Chemistry, Vol. 33, S. 74-166; O. Jardetzky in BBA, Vol. 621, S. 227-232; R. Huber in TIBS, Dec. 1979, S. 271, und D. S. Markovich, et al. in Molekulyarnaya Biologiya, Vol. 8, No. 6, S. 857-863.

Der Ausdruck "Denaturierungsmittel" bezieht sich sowohl auf Verfahrensbedingungen als auch auf Reagenzien, die eine partielle Denaturierung eines Proteins bewirken. Zur partiellen Denaturierung kann das Protein mit einer wäßrigen Lösung bei erhöhten Temperaturen, z. B. von 25 bis 60°C, durchtränkt werden. Bei den meisten Proteinen tritt eine Störung der Proteinstruktur ein, so daß eine partielle Denaturierung resultiert. Die partielle Denaturierung kann wie bekannt auch durch Tränken des Proteins mit einer wäßrigen Lösung, die ein anorganisches Salz, eine anorganische oder organische Säure oder ein mit Wasser mischbares organisches Lösungsmittel enthält, bewirkt werden.

Geeignete anorganische Salze sind z. B.: NaF, (NH₄)₂SO₄, (CH₃)₄NCl, (CH₃)₄NBr, KCH₃COO, NH₄Cl, RbCl, KCl, NaCl, CsCl, LiCl, KBr, NaBr, KNO₃, MgCl₂, NaNO₃, CaCl₂, KSCN, NaSCN, BaCl₂, NaJ und LiJ.

Geeignete anorganische Säuren schließen ein: Salzsäure, Salpetersäure, Schwefelsäure, Phosphorsäure u. ä. Protonen abgebende starke anorganische Säuren.

Geeignete organische Säuren sind z. B. Essigsäure, Ameisensäure, Propionsäure und Zitronensäure.

Geeignete mit Wasser mischbare Lösungsmittel, von denen angenommen wird, daß sie hydrophobe Gruppen am Protein solubilisieren und dadurch die Struktur destabilisieren, schließen ein: tert.-Butanol, Acetonitril, Dioxan, Aceton, Methanol, Ethanol und Dimethylsulfoxid.

In Fällen, in denen das zu modifizierende native Protein viele Disulfidbrücken enthält, wie z. B. Rinderserumalbumin oder Urease, kann die partielle Denaturierung durch Aufbrechen der Disulfidbrücken im Protein bewirkt werden, indem das Protein Mercaptoethanol oder anderen Sulfhydryl-Reduktionsreagenzien, die die Disulfid-Bindungen spalten, ausgesetzt wird.

Die Bedeutung des Wortes "Inhibitor" ist weiter vorn schon angegeben. Es kann irgendeiner der bekannten klassischen Inhibitoren für ein gegebenes Modellenzym verwendet werden (siehe "Enzyme Inhibitors", Proceedings of a Meeting held in Basel, Sitzerland, on 20 and 21 March 1980, edited by Urs Brodbeck, Verlag Chemie, Weinheim, "Inhibitor Index", p. 275 to 278; und "Handbook of Enzym Inhibitors", M. K. Jain, John Wiley + Sons, New York 1982, Inhibitor Index 1-380).

In vielen Fällen kann das natürliche Substrat des Modellenzyms als Inhibitor oder Schablone für das modifizierte Protein dienen. Ein Beispiel für die strukturelle Ähnlichkeit eines Enzym-Inhibitors und des natürlichen Substrats eines Enzyms ist der Fall von Glucose-Oxidase. Glucose ist das natürliche Substrat der Glucose-Oxidase, während D-Glucal der Inhibitor für Glucose-Oxidase ist. Glucose und D-Glucal sind strukturell sehr ähnlich.

"Vernetzen" bedeutet hierin die Bildung kovalenter Bindungen zwischen reaktiven Stellen an einem Protein. In dem Verfahren werden multifunktionelle Reagenzien wie Glutaraldehyd als Vernetzungsmittel verwendet. Weitere Beispiele sind: 2-Amino-4,6-dichlor-s-triazin; Diazoniumsalze; N- Hydroxi-succinamid; p-Benzoylazid und Reagenzien, wie in den nachstehenden Veröffentlichungen offenbart: Wold, F., Methods Enzymol, 11; Hirs, C. H. W., editor, Academic Press, 1967, 617; Fasold, H., et al., Augen. Chem. Int. Ed. Engl., 10, 795, 197, und Keyes, M. H., Kirk-Othmer: Encyclopedia of Chemical Technology, 9, 3d ed., 1980, J. Wiley and Sons, Inc., 148-172.

Beispiele für Enzyme, die nach dem Verfahren der Erfindung aus einem nativen Protein nachgebildet werden können, sind: hydrolytische Enzyme, Redox-Enzyme und Transferase-Enzyme.

Zu den hydrolytischen Enzymen gehören z. B. proteolytische Enzyme, die Proteine hydrolysieren, z. B. Papain, Ficin, Pepsin, Trypsin, Chymotrypsin, Bromelin, Keratinase; Carbohydrasen, welche Kohlenhydrate hydrolysieren, z. B. Cellulase, Amylase, Maltase, Pectinase, Chitanase; Esterasen, die Ester hydrolysieren, z. B. Lipase, Cholinesterase, Lecithinase, alkalische und saure Phosphatasen; Nucleasen, die Nucleinsäuren hydrolysieren, z. B. Ribonuclease, Desoxiribonuclease; und Amidasen, die Amine hydrolysieren, z. B. Arginase, Asparaginase, Glutaminase, Histidase und Urease. Redox-Enzyme, die die Oxidations- oder Reduktions-Reaktionen katalysieren, sind z. B. Glucose- Oxidase, Xanthin-Oxidase, Catalase, Peroxidase, Lipoxidase und Cytochrom-Reductase. Transferase-Enzyme übertragen Gruppen von einem Moleküle auf ein anderes. Beispiele hierfür sind Glutaminsäure-Brenztraubensäure-Transaminase, Glutaminsäure-Oxalessigsäure-Transaminase, Transmethylase, Phospho-Brenztraubensäure-Transphosphorylase.

Bei einer bevorzugten Ausführungsform wird zur praktischen Durchführung des Verfahrens eine Säule verwendet, um die genaue Kontrolle der Durchflußgeschwindigkeiten nutzen zu können. Der an dem Träger immobilisierte Inhibitor wird feucht in die Säule gefüllt, so daß die folgenden chemischen Reagenzien mit dem Träger und dem an ihn gebundenen Inhibitor durch einfaches Pumpen verschiedener wäßriger Lösungen durch die Säule in kontrollierter Flußrate in Kontakt kommen können. Lösliche immobilisierte Inhibitoren können in einer Durchflußsäule eingeschlossen werden, wenn Ultrafiltrations-Membrane an beiden Enden der Säule vorgesehen werden, um die lösliche Inhibitor- Träger-Einheit an Ort und Stelle zu halten. Das native Protein wird durch die Membrane und in Kontakt mit den durch die Membranen eingeschlossenen immobilisierten löslichen Inhibitor gepumpt.

Wenn das native Protein partiell denaturiert ist, wird eine Lösung davon langsam durch die Säule fließen gelassen, gewöhnlich mit einer Geschwindigkeit von 1 ml/min, wenn die Konzentration des nativen Proteins etwa 1 Gew.-% beträgt und die Säule etwa 7,5 cm lang ist und einen inneren Durchmesser von etwa 1,5 cm hat. Ein Aliquot von etwa 2 ml der etwa 1gew.-%igen Lösung wird typischerweise auf die Säule injiziert. Wenn das partiell denaturierte native Protein durch die Säule des immobilisierten Inhibitors fließt, wird, so wird angenommen, das Protein an den Inhibitor gebunden, und einem Teil des Proteins wird es ermöglicht, sich nach der Gestalt des Inhibitors zu formen. So wirkt der Inhibitor als eine Schablone für die Formung einer neuen geometrischen Gestalt des partiell denaturierten Proteins, die vorher nicht vorhanden war. Es wird angenommen, daß die vorteilhaften Ergebnisse der Erfindung erhalten werden, weil die partielle Denaturierung des nativen Proteins in einer Lockerung der Proteinstruktur resultiert. Die aufgelockerte Proteinstruktur ermöglicht es dem Inhibitor, sich an das Protein zu binden und eine Molekularstruktur an dem partiell denaturierten nativen Protein festzulegen, die der Inhibitorgestalt komplementär ist.

Nach dem Inkontaktbringen oder Binden des partiell denaturierten nativen Proteins an dem immobilisierten Inhibitor unter Schaffung einer neuen Struktur an der Oberfläche des Proteins, die der Gestalt des Inhibitors komplementär ist, muß das partielle denaturierte native Protein stabilisiert werden, um die neue aktive Stelle zu bewahren. Die neue Gestalt des Proteins wird durch Vernetzen stabilisiert.

Vorzugsweise wird das Vernetzungsmittel durch die mit dem an den Inhibitor gebundenen Protein gefüllte Säule unter Anwendung der Kreislaufführung hindurchgeschickt. Gewöhnlich wird eine niedertourige Pumpe kleinen Volumens mit einem Vorratsbehälter, aus dem die Vernetzungsmittellösung abgezogen wird, verbunden. Die Lösung wird durch die Säulen-Behälter-Schleife etwa 1½ Stunden gepumpt. Typischerweise werden der umlaufenden Lösung etwa 20 ml 8 Gew.-% Glutaraldehyd zugegeben, wenn die Säule gefüllt ist und eine Länge von etwa 8 cm und einen Durchmesser von etwa 2 cm hat.

Nachdem die Vernetzungsmittellösung die gewünschte Zeit durch die Säule umgewälzt worden ist, wird die Säule mit einem Eluant beschickt, welches das neugebildete stabilisierte enzymartig modifizierte Protein von dem festen Träger desorbiert. Für diesen Zweck hat sich eine saure Glycinlösung als geeignet erwiesen.

Der Säulenausfluß wird spektrophotometrisch im Ultraviolett- Bereich überwacht, um die Elution des modifizierten Proteins zu erfühlen. Die Menge gesammelten modifizierten Proteins wird durch Spektralanalyse bestimmt, um die Ausbeute festzustellen. Die enzymatische Aktivität des neu erzeugten modifizierten enzymartigen Proteins wird nach irgendeiner gebräuchlichen enzymkinetischen Methode bestimmt.

Bei einer alternativen Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens kann das native Protein mit dem immobilisierten Inhibitor vor der partiellen Denaturierung vermischt werden. Danach wird das Denaturierungsmittel der Mischung von nativem Protein und Inhibitor zugegeben. Bei dieser Ausführungsform steht der Inhibitor unmittelbar nach der partiellen Denaturierung des nativen Proteins zur Verfügung. Dann wird das partiell denaturierte, an den Inhibitor gebundene Protein vernetzt.

Dadurch, daß ein immobilisierter Inhibitor verwendet werden kann, kann man jetzt kleinste Mengen Inhibitor verwenden, die weitgehend in den Umlauf rückführbar sind, wenn der Inhibitor nicht verworfen wird, um das modifizierte enzymartige Protein zu reinigen. Ziemlich billige Eluate werden zum Herauswaschen des Endprodukts aus dem immobilisierten Inhibitor verwendet, wodurch teurer Inhibitor erhalten bleibt.

Wenn immobilisierter Inhibitor in einem Durchflußsystem verwendet wird, ist es auch leicht festzustellen, wann das partiell denaturierte native Protein an den Inhibitor gebunden ist.

Wenn das besondere native Protein nicht an den Inhibitor gebunden ist, fließt das native Protein durch die Säule und kann leicht am Säulenauslaß nachgewiesen werden. Wenn der Inhibitor in einer wäßrigen Lösung solubilisiert worden wäre, müßte ein ganzer Arbeitsvorgang durchgeführt werden, um festzustellen, wann das partiell denaturierte Protein tatsächlich an den Inhibitor gebunden worden ist. Dies würde zu Verlust an Reagenzien und gereinigtem nativen Protein-Ausgangsmaterial führen.

Durch Immobilisieren des Inhibitors ist es außerdem möglich, eine kontrollierte Menge Inhibitor auf dem wasserunlöslichen Träger einzuführen. Durch Wahl der Beschickungsfraktion, z. B. einer leichten Inhibitorbeschickung auf dem Träger, kann das Ausmaß der Oligomeren-Bildung in dem fertig modifizierten Proteinprodukt kontrolliert werden. Wenn der Träger spärlich mit immobilisiertem Inhibitor beschichtet ist, wird die Wahrscheinlichkeit der Bildung von Dimeren, Trimeren oder Oligomeren infolge intermolekularer Vernetzung nebeneinander angeordneter nativer Proteinmoleküle herabgesetzt. Im allgemeinen ist die Bildung von Oligomeren nicht erwünscht, da derartige Proteinaggregate häufig geringe Wasserlöslichkeit zeigen und nicht leicht zu reinigen und zu handhaben sind.

Außerdem ist es bei Verwendung des immobilisierten Inhibitors in einem Durchflußsystem nicht notwendig, umständliche Abgrenzungstechniken anzuwenden, um das Vernetzungsmittel von dem nativen Protein-Ausgangsmaterial und das fertig modifizierte Protein vom Inhibitor abzutrennen. Die Leichtigkeit der Materialhandhabung setzt die Zeit zur Durchführung des ganzen Verfahrens herab. Dies ist im Hinblick auf die Tatsache, daß viele Proteine und Enzyme, die als natives Ausgangsmaterial ausgewählt werden könnten, temperatur- und sauerstoffempfindlich sind, vorteilhaft. Wenn übliche Trenntechniken zur Trennung verschiedener Materialien voneinander angewendet werden müßten, würde dies das Verfahren in die Länge ziehen und wegen oxidativer und thermischer Zersetzung die Ausbeuten herabsetzen. Arbeiten bei niedrigen Temperaturen und inerter Atmosphäre wäre erforderlich, um die Ausbeuten zu sichern.

Nachstehend wird die Erfindung noch an Beispielen erläutert.

Beispiel 1 Teil A Herstellung der den immobilisierten Modell- Enzym-Inhibitor enthaltenden Säule

Es wurde eine Chromatographiersäule aus Glas einer Länge von 7,5 cm und eines inneren Durchmessers von 1,5 cm verwendet. Ein immobilisierter Inhibitor, L-Tryptophan-Agarosegel (No. T-0137, Partie 80F-9610), wurde bis zum Gebrauch in 0,5 m NaCl- Lösung bei etwa 0°C aufbewahrt.

Um die Säule zur Aufnahme des nativen Proteins vorzubereiten, wurde sie etwa 3,8 cm hoch mit immobilisiertem Inhibitor gefüllt. Nachdem die Säule gefüllt war, wurde zur Entfernung möglicher Verunreinigungen wie folgt gereinigt: Es wurde ein 200 ml Aliquot destillierten Wassers durch die Säule mit einer Geschwindigkeit von 1 ml/min gespült. Danach wurden 500 ml 0,1 m Carbonatpuffer, der 0,5 m NaCl enthielt, bei pH 10 mit einer Geschwindigkeit von 1 ml/min und dann mit 500 ml eines 0,1 m Natriumacetat-Puffers, der 0,5 m NaCl enthielt, bei pH 4,0 mit einer Geschwindigkeit von 1 ml/min durchgespült. Am Schluß wurde die Säule mit 500 ml einer 2,0molaren Harnstofflösung durchgespült.

Teil B Partielle Denaturierung des Proteins und Bindung an den Inhibitor

Eine frische 1%ige Rinderserumalbuminlösung (BSA) wurde durch Lösen von 0,2 g von weitgehend fettfreiem Rinderserumalbumin (No. A 7511, Partie 90F-9315) in 20 ml destilliertem Wasser hergestellt. Die Absorbance des frischen BSA wurde nach D. M. Kirschenbaum, Int. J. Peptide Res. 5, 1973, S. 49-62, bestimmt. Die Absorbance wurde bei 280 nm gemessen; sie war 6,43. Unter Benutzung des Absorbance-Koeffizienten 6,62 für eine 1%ige Lösung ergibt sich eine Konzentration der Lösung von etwa 9,7 mg/ml.

Die Säule von Teil A wurde mit einem fließenden Strom von 0,01 m Acetatpuffer von pH 4,4 einer Flußgeschwindigkeit von 1 ml/min gefüllt, welcher als Denaturierungsmittellösung wirkte. 2 ml einer 1%igen BSA-Lösung wurden auf dem Kopf der Säule injiziert. Dadurch wurde das BSA auf einen niedrigeren pH-Wert gebracht, und unter solch niedrigem pH-Wert tritt partielle Denaturierung ein.

Das Eluant der Säule wurde bei 254 nm überwacht. Als der Anteil des BSA, der nicht an den immobilisierten Inhibitor gebunden worden ist, aus der Säule austrat, wurde er gesammelt und durch Absorbance bei 280 nm bestimmt. Er enthielt etwa 16 mg. Dementsprechend sind etwa 3,4 mg BSA bei einmaligem Aussetzen der Säule an den Inhibitor gebunden worden.

Teil C Vernetzen

Der Auslaß aus der Säule des Teils B wurde mit einer Umlaufpumpe verbunden. Der Auslaß der Pumpe wurde mit dem Kopf der Säule verbunden, so daß eine geschlossene Umwälz-Flußschleife gebildet wurde. Dann wurden 20 ml einer 8%igen Glutaraldehydlösung (Cat. No. 216, Partie 4-1462) zu 25 ml Acetatpuffer vom pH 4,4 gegeben. Die Glutaraldehydlösung wurde auf die Säule injiziert und etwa 90 Minuten umgewälzt.

Teil D Sammeln des modifizierten Proteins

Das Umwälzystem des Teils C wurde unterbrochen und 0,02 m Glycin-HCl-Puffer vom pH 3,0 durch die Säule, die jetzt das inhibitor-gebundene stabilisierte modifizierte enzymartige Protein enthielt, mit einer Geschwindigkeit von 1 ml/min gepumpt. Hierdurch wird das durch Vernetzen stabilisierte partiell denaturierte Protein von dem am Träger gebundenen Inhibitor weggespült. Nach etwa 15 Minuten begann das Protein aus der Säule zu eluieren. Etwa 24 ml Eluat wurden gesammelt, bevor das modifizierte Proein aufhörte, aus der Säule zu eluieren. Der pH-Wert des gesammelten modifizierten Proteins wurde durch Zugabe von 1 ml 0,1 m Tris-Puffer, pH 7,5 zu 9 ml Eluant von 3 auf etwa 6,9 gebracht. Es wurden insgesamt etwa 0,3 mg modifiziertes Protein gesammelt.

Teil E Ergebnisse

Die Aktivität mit Bezug auf Substrat für Esteraseenzym wurde von einer Probe des modifizierten esteraseartigen Proteins, hergestellt nach dem Verfahren der Erfindung, aufgezeichnet.

Ein Teil der Eluatlösung des modifizierten Proteins wurde auf Esteraseenzym-Aktivität durch Hochdruck- Flüssigchromatographie (HPLC) wie folgt analysiert:

Die Untersuchungsprobe wurde wie folgt hergestellt:

16 ml 0,1 m Tris-Puffer, pH 7,7, und 2 ml 0,1 m N- alpha-Benzoyl-L-arginin-ethylester (BAEE)-Substrat wurden mit 2 ml modifiziertem Protein vermischt.

Die Kontrollösung wurde durch Zugeben von 16 ml 0,1 m Tris-Puffer, pH 7,7, zu 2 ml 0,1 m BAEE und 2 ml 0,02 m Glycin-HCl hergestellt; letzteres ist das Säuleneluant, das mit Tris-Puffer pH 7,5 auf pH 6,9 eingestellt worden ist.

Die HPLC-Säulenbedingungen für die Untersuchung waren folgende: Die Säule wurde mit CM-Glycophase-Träger (Product No. 23 512) gefüllt; das ist eine hydrophile, nichtionische Kohlenhydratschicht, die Carboxyl-Methyl-Seitenketten kovalent an Glas kontrollierten Porendurchmessers gebunden, enthält. Die Partikelgröße ist etwa 125 bis 177 µm und der Porendurchmesser etwa 200 Angstrom (A). Das Säuleneluant war 0,005 m Tris-Puffer, pH 8,1, der 0,05 m NaCl enthielt. Die Flußrate war 1,75 ml/min bei einer Säule von 27 cm× 0,3 cm. Es wurden 20 ml der Probe injiziert und die Peakhöhe für das Benzoyl-L-arginin bei 254 nm bestimmt, wurde aufgezeichnet. Danach wurde die Kontrolle injiziert. Nach Sammeln von mindestens 4 Wertpunkten sowohl für die Probe wie auch für die Kontrolle wurde die Aktivität aus dem Aufzeichnen der Konzentration von Benzoyl- L-arginin gegen die Zeit errechnet. Das Untersuchungsergebnis war folgendes:

Die Ergebnisse zeigen, daß das modifizierte esteraseartige Protein des Teils D Aktivität mit Bezug auf das Esterasesubstrat BAEE besitzt, wo im nativen BSA-Protein vorher keine Aktivität nachgewiesen worden war. Dies zeigt die Umwandlung einer Gattung nichtenzymatischen Proteins, eines Albumins, in eine andere Proteingattung, ein enzymatisch aktives esteraseartiges Protein.

Um zu veranschaulichen, daß natives BSA-Protein keine nachweisbare katalytische Aktivität mit Bezug auf BAEE- Substrat hat, wurde das Testverfahren des Beispiels 3 durchgeführt. Das Ergebnis ist, daß BSA keine nachweisbare katalytische Aktivität mit Bezug auf Esterasesubstrat BAEE hat.

Beispiel 2 Teil A Herstellung der den immobilisierten Modellenzym- Inhibitor enthaltenden Säule

Es wurde eine Chromatographiersäule wie in Beispiel 1 verwendet. Ein immobilisierter Inhibitor, L-Arginin- Agarosegel (No. A-1018, Partie 20F-9740) wurde bis zum Gebrauch in 2,0 m NaCl-Lösung bei etwa 0°C aufbewahrt.

Die Säule wurde, wie in Beispiel 1 beschrieben, zur Aufnahme des nativen Proteins vorbereitet.

Teil B Partielle Denaturierung des Proteins und Bindung an den Inhibitor

Eine frische 1%ige Rinderserumalbuminlösung (BSA) wurde durch Lösen von 0,1 g weitgehend von fettsäurefreiem Rinderserumalbumin (No. A-6003, Partie 110F-9305) in 10 ml destilliertem deionisierten Wasser hergestellt. Die Absorbance wurde bei 280 nm gemessen; sie war 6,83. Unter Benutzung des Absorbance-Koeffizienten von 6,62 für eine 1%ige Lösung, ergibt sich eine Konzentration der Lösung von etwa 10,3 mg/ml.

Vor Zuführung des BSA zur Säule wurden 0,2 ml 0,1 m 2-Mercatoethanol in destilliertem Wasser zu 10 ml der 1%igen BSA-Lösung gegeben. Man ließ die partielle Denaturierung etwa 1 Stunde bei Raumtemperatur vor sich gehen.

0,001 m Tris-Puffer, pH 7, wurden durch die Säule mit einer Geschwindigkeit von 1½ ml/min gepumpt. 3 ml der BSA-Lösung wurden auf die Säule mit einer Flußrate von 1½ ml pro min injiziert. Es wurden insgesamt etwa 30,9 mg BSA auf die Säule aufgebracht.

Teil C Vernetzen und Sammeln des modifizierten Proteins

Eine Vernetzungslösung wurde durch Lösen von etwa 0,1 g des Vernetzungsmittels Dimethyl-suberimidat- Dihydrochlorid in 25 ml 0,001 m Tris-Puffer, pH 7,0, hergestellt. Der Auslaß aus der Säule des Teils B wurde mit einer Umlaufpumpe verbunden. Der Auslaß der Pumpe wurde mit dem Kopf der Säule verbunden, so daß eine geschlossene Umwälz-Flußschleife gebildet wurde. Dann wurde das Vernetzungsmittel durch die Säule 3 Stunden bei einer Flußrate von 1 ml/min umgewälzt.

Es wurde gefunden, daß die umlaufende Vernetzungsmittellösung etwa 15 mg des modifizierten, ursprünglich an die Säule gebundenen Proteins enthielt, so daß 15 mg noch gebunden waren.

Das Umlaufsystem wurde unterbrochen und ein Eluant gegen 0,02 m Glycin-HCl-Puffer, pH 2,5, ausgetauscht, um das an die Säule gebundene restliche modifizierte Protein zu sammeln.

Nach Hindurchpumpen des 0,02 m Glycin-HCl-Puffers, pH 2,5, bei einer Flußrate von 1½ ml/min für etwa 15 Minuten begann das modifizierte Protein aus der Säule zu eluieren. Etwa 20 ml Eluant wurden gesammelt, bevor das modifizierte Protein aufhörte zu eluieren.

Die Absorbance bei 280 nm wurde wie in Teil B bestimmt, sie war 0,432. So sind etwa 13 mg modifiziertes Protein gesammelt worden.

Teil D Ergebnisse

Die Aktivität mit Bezug auf das Substrat für Esteraseenzym wurde von einer Probe des modifizierten esteraseartigen Proteins, hergestellt nach der Erfindung und gesammelt in Teil C, aufgezeichnet.

Ein Teil der Eluantlösung des modifizierten Proteins wurde auf Esteraseenzym-Aktivität durch HPLC analysiert.

Die HPLC-Säulenbedingungen für die Untersuchung waren die gleichen wie in Beispiel 1. Das Säuleneluant war 0,005 m Tris-Puffer, pH 8,0, und enthielt 0,01 m NaCl. Die Flußrate war 8,5 ml/min.

Die Untersuchungsprobe wurde wie folgt hergestellt: 14 ml 0,01 m Tris-Puffer, pH 7,7, und 2 ml 0,1 m N-alpha-Benzoyl-L-arginin-ethylester (BAEE)-Substrat wurden mit 4 ml des in Teil C gesammelten modifizierten Proteins gemischt. Die Kontrollösung wurde durch Zugeben von 14 ml 0,01 m Tris-Puffer, pH 7,7, zu 2 ml des BAEE (0,1 m) und 4 ml 0,02 m Glycin-HCl-Puffer, pH 2,5, hergestellt. Nach dem Mischen war das pH der Untersuchungsprobe und der Kontrollösung 7,5.

20 ml Probe wurden in die HPLC-Säule injiziert. Das Eluieren wurde, wie vorstehend beschrieben, vorgenommen, und die Peakhöhe für das Benzoyl-L-arginin, bei 254 nm nachgewiesen, wurde aufgezeichnet. Dann wurde die Kontrollösung injiziert und die Benzol-L-arginin-Peakhöhe aufgezeichnet. Nach Sammeln von mindestens 4 Wertpunkten sowohl für die Probe wie für die Kontrolle wurde die Aktivität aus dem Aufzeichnen der Konzentration von Benzoyl-L-arginin gegen die Zeit unter Anwendung der Linear-Regressionsanalyse errechnet.

Um die Anfangs-Aktivität zu bestimmen, wurde natives BSA (A-6003, Partie No. 110F-9305) auf potentielle enzymatische Aktivität gegenüber BAEE-Substrat untersucht. Dazu wurden 0,013 g BSA in 20 ml 0,02 m Glycin-HCl-Puffer, pH 2,5, gelöst. Die BSA-Lösung hatte eine Absorbance bei 280 nm von 0,453. Unter Benutzung des Absorbance-Koeffizienten von 6,62 für eine 1%ige Lösung wurde die Konzentration mit 0,68 mg/ml errechnet. Die native BSA-Untersuchungslösung wurde wie folgt hergestellt: 14 ml 0,01 m Tris-Puffer, pH 7,7, wurden mit 2 ml 0,1 m BAEE und 4 ml nativer BSA- Lösung vermischt. Die Kontrollösung wurde durch Mischen von 14 ml 0,01 m Tris-Puffer, pH 7,7, mit 2 ml 0,1 m BAEE und 4 ml 0,02 m Glycin-HCl-Puffer, pH 2,5, hergestellt. Nach dem Mischen war der pH-Wert der nativen BSA-Untersuchungslösung und der Kontrollösung 7,5. 20 ml der BSA-Untersuchungslösung wurden injiziert und die Peakhöhe des Benzoyl-L-arginins bei 254 nm nachgewiesen und aufgezeichnet. Danach wurde die Kontrollösung injiziert.

Nach dem Sammeln von mindestens 4 Wertpunkten sowohl für die BSA-Untersuchungslösung als auch für die Kontrollösung wurde die Aktivität aus der Aufzeichnung der Konzentration des Benzoyl-L-arginins gegen die Zeit unter Anwendung der Linear-Regressionsanalyse errechnet. Die Untersuchungsergebnisse zeigen, daß die Neigung (slope) der nativen BSA-Untersuchungslösung 2,48±0,11 ×10^-7 Mol/min und die Neigung der Kontrollösung 2,59±0,04×10^-7 Mol/min war, was zeigt, daß in der nativen BSA keine nachweisbare Esteraseaktivität gegenüber BAEE-Substrat vorhanden war.

Die aus den Untersuchungsergebnissen errechnete Aktivität des modifizierten esteraseartigen Proteins war:

Die Ergebnisse zeigen, daß das modifizierte esteraseartige Protein des Teils C Aktivität mit Bezug auf das Esterase-Substrat BAEE besitzt, während am nativen BSA-Protein vorher keine Aktivität nachgewiesen worden ist. Dies veranschaulicht die Umwandlung einer Gattung von nichtenzymatischem Protein, einem Albumin, in eine andere Proteingattung, ein enzymatisch aktives esteraseartiges Protein.

Beispiel 3 Teil A Herstellung der den immobilisierten Modellenzym- Inhibitor enthaltenden Säule

Sie erfolgte wie in Beispiel 1 beschrieben.

Teil B Partielle Denaturierung des Proteins und Bindung an den Inhibitor

Eine frische 1%ige Rinderserumalbuminlösung (BSA) wurde, wie in Beispiel 1 beschrieben, hergestellt. Die Absorbance war 6,22. Die Konzentration der BSA-Lösung wurde nach den Lehren von D. M. Kirschenbaum in Int. J. Peptide Res. 5, 1973, S. 49-62, bestimmt. Unter Benutzung des Absorbance- Koeffizienten von 6,62 für eine 1%ige Lösung, ergab sich, daß die Lösung eine Konzentration von etwa 9,4 mg/ml hatte.

Die Säule von Teil A wurde von einem fließenden Strom 0,01 m Acetatpuffer, pH 4,0, gefüllt; die Flußrate war 1 ml/min. Der Puffer wirkte als Denaturierungsmittellösung. 2 ml der 1%igen BSA-Lösung wurden am Kopf der Säule injiziert, so daß etwa 18,8 mg BSA der Säule zugeführt wurden. Durch das Injizieren wurde das BSA auf einen niedrigeren pH-Wert gebracht und unter solchem niedrigen pH-Wert beim Fließen über die Säule partiell denaturiert.

Das Eluant der Säule wurde bei 280 nm überwacht. Als der Teil des BSA, der nicht an den immobilisierten Inhibitor gebunden war, aus der Säule eluierte, wurde er gesammelt und nach der vorstehenden Methode festgestellt, daß er etwa 17,25 mg enthielt. Dementsprechend waren etwa 1,6 mg des BSA an den Inhibitor, einmal der Säule ausgesetzt, gebunden.

Teil C Vernetzen und Sammeln des modifizierten Proteins

Eine Vernetzungslösung wurde durch Lösen von etwa 0,068 g Dimethyl-suberimidat-Dihydrochlorid als Vernetzungsmittel in 50 ml 0,01 m Acetatpuffer, pH 4,0, hergestellt. Der Auslaß der Säule des Teils B wurde mit einer Umwälzpumpe verbunden. Der Auslaß der Pumpe wurde mit dem Kopf der Säule verbunden, so daß eine geschlossene Umwälzflußschleife gebildet wurde. Danach wurde das Vernetzungsmittel durch die Säule 2 Stunden mit einer Flußrate von 1 ml/min durch die Säule umgewälzt.

Das Umwälzsystem wurde unterbrochen und ein Eluant von 0,02 m Glycin-HCl-Puffer bei pH 3 durch die Säule gepumpt, um irgendwelches modifiziertes Protein, das an die Säule gebunden war, zu sammeln.

Teil D Ergebnisse

Die Aktivität mit Bezug auf Substrat für Esteraseenzym wurde von einer Probe des modifizierten esteraseartigen Proteins, hergestellt nach der Erfindung, aufgezeichnet.

Ein Teil der Eluantlösung des modifizierten Proteins wurde auf Esteraseenzym-Aktivität durch HPLC wie folgt analysiert:

Die Untersuchungsprobe wurde wie folgt bereitet: 14 ml 0,01 m Tris-Puffer, pH 8,0, und 2 ml 0,1 m N-alpha-Benzoyl- L-arginin-ethylester (BAEE)-Substrat wurden mit 4 ml modifiziertem Protein gemischt.

Die Kontrollösung wurde durch Zugeben von 14 ml 0,01 m Tris-Puffer, pH 8,0, zu 2 ml 0,1 m BAEE und 4 ml 0,02 M Glycin-HCl, pH 3,0, hergestellt; dies war das Säuleneluant. Der pH-Wert der Untersuchungs- und der Kontrollösung war am Schluß 7,7.

Natives BSA (A-7511, Partie No. 90F-9315) wurde gegenüber BAEE-Esterase-Substrat untersucht, um die Aktivität zu Beginn zu bestimmen. 0,1 g BSA wurden in 10 ml destilliertem deionisierten Wasser gelöst. Die resultierende 1%ige Lösung wurde 2 Stunden in 0,02 m Glycin-HCl-Puffer, pH 3, dialysiert. Dann wurde 1 ml der dialysierten BSA-Lösung auf 1 : 50 mit 0,02 m Glycin-HCl-Puffer, pH 3, verdünnt, um eine Absorbance bei 280 nm von 0,119 zu geben. Die Proteinkonzentration wurde mit 0,18 mg/ml errechnet. Die native BSA-Untersuchungslösung enthielt: 14 ml 0,01 m Tris-Puffer, pH 7,7; 2 ml 0,1 m BAEE und 4 ml der nativen BSA-Lösung, miteinander vermischt. Die Kontrollösung wurde durch Mischen von 14 ml 0,01 m Tris-Puffer, pH 7,7, mit 2 ml BAEE (0,1 m) und 4 ml 0,02 m Glycin-HCl-Puffer, pH 3, hergestellt.

Nach dem Mischen war der pH-Wert der nativen BSA-Lösung und der Kontrollösung 7,7. 20 ml der nativen BSA-Lösung wurde injiziert und die Peakthöhe für das Benzoyl-L-arginin bei 254 nm nachgewiesen und aufgezeichnet. Danach wurde die Kontrollösung injiziert.

Nach dem Sammeln von mindestens 5 Wertpunkten sowohl für die Untersuchungsprobelösung wie für die Kontrolle, wurde die Aktivität aus dem Aufzeichnen der Konzentration von Benzoyl-L-arginin gegen die Zeit unter Anwendung der Linear-Regressionsanalyse errechnet. Die Untersuchungsergebnisse zeigen, daß die Neigung des nativen BSA 4,39±0,22×10^-7 Mol/min und die Neigung der Kontrolle 4,69±0,17×10^-7 Mol/min ist. Dies zeigt, daß keine native Esteraseaktivität gegenüber BAEE-Substrat vorhanden war.

Die HPLC-Säulenbedingungen für die Untersuchung waren die gleichen wie in Beispiel 1.

Das Säuleneluant war 0,005 m Tris-Puffer, pH 8,0, der 0,05 m NaCl enthielt. Die Flußrate war 4,0 ml/min bei einer Säule von 27 cm×0,3 cm. Es wurden 20 ml der Probe injiziert und die Peakthöhe für das Benzoyl-L-arginin bei 254 nm bestimmt und aufgezeichnet. Danach wurde die Kontrollösung injiziert. Nach Sammeln von mindestens 4 Wertpunkten, sowohl für die Probe wie für die Kontrolle, wurde die Aktivität aus dem Aufzeichnen der Konzentration von Benzoyl-L-arginin gegen die Zeit errechnet. Das Untersuchungsergebnis war folgendes:

Die Ergebnisse zeigen, daß das modifizierte Protein des Teils D Aktivität mit Bezug auf das Esterasesubstrat BAEE besitzt, wo im nativen BSA-Protein vorher keine Aktivität nachgewiesen worden war. Dies zeigt die Umwandlung einer Gattung nichtenzymatischen Proteins, eines Albumins, in eine andere Proteingattung, ein enzymatisch aktives esteraseartiges Protein.

Beispiel 4 Teil A Herstellung der den immobilisierten Modellenzym- Inhibitor enthaltenden Säule

Sie erfolgte wie in Beispiel 1 beschrieben.

Teil B Partielle Denaturierung des Proteins und Bindung an den Inhibitor

5 ml Glucoamylase (Glucoamylase No. A-3514, Partie 28C-0442), System-Name Alpha-1, 4-Glucan-Glucohydrolose, wurde gegen 0,001 m Tris-Puffer, pH 7, über Nacht dialysiert. 100 mg Glucoamylase wurden in etwa 10 ml einer 3,2 m Ammoniumsulfat- Lösung, pH 6, suspendiert. Das Glucoamylase-Enzym wurde dialysiert unter Verwendung eines Dialysierrohres eines nativen Molekulargewichts-Ausschlußbereichs von 12 000- 14 000 Dalton.

Die Absorbance der Glucoamylase-Lösung bei 280 nm wurde mit 9,44 bestimmt. Die Konzentration des nativen Glucoamylaseenzyms wurde nach D. M. Kirschenbaum, Analytical Biochemistry 82, S. 83-100, 1977, bestimmt. Unter Benutzung des Absorbance-Koeffizienten von 13,6 war die Konzentration der Lösung etwa 6,9 mg Enzym pro ml Lösung.

Die Säule von Teil A wurde mit einem fließenden Strom von 0,01 m Acetatpuffer, pH 4,0, einer Flußgeschwindigkeit von 1 ml/min gefüllt, wobei der Puffer als Denaturierungsmittellösung wirkte. 2 ml der dialiysierten nativen Glucoseamylaseenzym-Lösung (13,9 mg) wurden auf den Kopf der Säule injiziert. Durch das Injizieren wurde das native Enzym auf einen niedrigen pH-Wert gebracht und unter solch niedrigem pH-Wert beim Fließen über die Säule partiell denaturiert.

Das Eluant der Säule wurde bei 280 nm überwacht. Als der Anteil des Enzyms, der nicht an den immobilisierten Inhibitor gebunden war, aus der Säule eluierte, wurde er gesammelt und nach der weiter oben beschriebenen Methode festgestellt, daß er tatsächlich kein partiell denaturiertes Enzym enthielt. Dementsprechend wurden bei einem einmaligen Durchgang durch die Säule etwa 13,9 mg des Enzyms an den Inhibitor gebunden.

Teil C Vernetzen und Sammeln des modifizierten Proteins

Es wurde eine Vernetzungslösung hergestellt durch Lösen von etwa 0,034 g Dimethyl-Suberimidat-Dihydrochlorid in 25 ml 0,01 m Acetatpuffer bei pH 4,0. Der Ausgang der Säule des Teils B wurde an eine Umlaufpumpe angeschlossen. Der Ausgang der Pumpe wurde mit dem Kopf der Säule verbunden, so daß eine geschlossene Umwälzflußschleife gebildet wurde. Dann ließ man das Vernetzungsmittel 3 Stunden bei einer Flußrate von 1 ml/min umlaufen.

Danach wurde das Umwälzsystem unterbrochen und 0,01 m Acetatpuffer, pH 4,0, als Eluant durch die Säule gepumpt, um eine stabile Aufzeichner-Grundlinie herzustellen.

Der 0,01 m Acetatpuffer ermöglicht eine stabile Grundlinie festzulegen, um die Elution des modifizierten Proteins zu überwachen. Nachdem eine stabile Grundlinie festgelegt war, wurde das modifizierte Protein mit 0,02 m Glycin-HCl-Puffer, pH 3, eluiert und die ganze proteinhaltige Fraktion gesammelt.

Teil D Ergebnisse

Die Aktivität einer Probe des modifizierten esteraseartigen Proteins, hergestellt nach der Erfindung, wurde aufgezeichnet.

Ein Teil der Eluantlösungen des modifizierten Proteins wurde auf Esteraseaktivität mittels HPLC analysiert und festgestellt, daß Esteraseaktivität vorhanden war. Um zu beweisen, daß native Glucoamylase keine Esteraseaktivität zeigt, wurde folgendes Verfahren durchgeführt.

Native Glucoamylase wurde gegenüber L-Tryptophan-Methylester (TME) untersucht und zeigte keine natürliche Esteraseaktivität gegenüber TME.

Die native Glucoamlyseenzym-Probeuntersuchung wurde durch Zugabe von 14 ml 0,005 m Tris-Puffer, pH 9,1, und 4 ml dialysierter nativer Glucoamylase zu 2 ml 0,1 m TME durchgeführt. Die native Glucoamylase wurde gegen 1000 ml 0,02 m Glycin-HCl-Puffer, pH 3, etwa 1 Stunde dialysiert, wonach das Dialysat durch eine frische 1000-ml-Probe des Puffers ersetzt wurde. Die Glucoamylase wurde dann mit 0,02 m Glycin-HCl, pH 3, auf 1 : 70 verdünnt, um sich der Konzentration des rückgewonnenen modifizierten Enzyms zu nähern. Die Kontrollösung dieser Untersuchung wurde hergestellt durch Zugabe von 14 ml 0,005 m Tris-Puffer, pH 9,1, 4 ml 0,02 m Glycin-HCl- Puffer, pH 3,0, und 2 ml 0,1 m TME. Die Probe zeigte keine native Esteraseaktivität gegenüber TME-Substrat. Der End-pH-Wert der Kontrollösung und der Untersuchungsprobelösung war 6,7.

Um die Höhe der Esteraseaktivität des nach dem erfindungsgemäßen Verfahren modifizierten Proteins zu zeigen, wurde folgendes Verfahren angewandt.

Eine Untersuchungsprobe wurde wie folgt hergestellt: 14 ml 0,005 m Tris-Puffer, pH 9,1, und 2 ml 0,1 m TME- Substrat wurden mit 4 ml des modifizierten Proteins vermischt.

Die Kontrollösung wurde durch Zufügen von 14 ml 0,005 m Tris-Puffer, pH 9,1, zu 2 ml 0,1 m TME und 4 ml 0,02 m Glycin-HCl, pH 3,0, hergestellt, was der Säuleneluant ist. Der End-pH-Wert der Kontrollösung und der Untersuchungslösung war 6,7.

Die HPLC-Säulenbedingungen für die Untersuchung waren die folgenden: Die Säule wurde mit Baker Bonded Phase Carboxyl-Träger gefüllt; dieser Träger ist ein Carboxyl-Silan, gebunden an Silicagel. Die Partikelgröße ist etwa 40 µm. Der Säuleneluant war 0,03 m Acetatpuffer, pH 6. Die Flußrate war 4 ml/min bei einer Säule von einer Größe von 27 cm×0,3 cm. 20 ml Probe wurden injiziert und die Peakthöhe für Trytophan bei 254 nm nachgewiesen und aufgeschrieben. Danach wurde die Kontrolle injiziert. Nach Sammeln von mindestens 4 Wertpunkten sowohl von der Probe als auch von der Kontrolle, wurde die Aktivität aus der Aufzeichnung der Konzentration des Tryptophans gegen die Zeit berechnet. Die Untersuchungsergebnisse waren die folgenden:

Die Ergebnisse zeigen, daß das modifizierte enzymartige Protein des Teils D Aktivität mit Bezug auf Esterasesubstrat TME besitzt, wo vorher im nativen Enzym keine Aktivität nachgewiesen wurde. Dies zeigt die Umwandlung einer Gattung von enzymatischem Protein, einer Glucoamylase, in eine andere Gattung von Enzym, einem enzymatisch aktiven esteraseartigen Protein.

Beispiel 5 Teil A Herstellung der den immobilisierten Modellenzym- Inhibitor enthaltenden Säule

Sie erfolgte wie in Beispiel 1 beschrieben.

Teil B Partielle Denaturierung des Proteins und Bindung an den Inhibitor

Eine frische 1%ige Rinderserumalbuminlösung (BSA) wurde wie in Beispiel 1 hergestellt. Die Absorbance wurde bei 280 nm gemessen und war 7,69. Unter Verwendung des Absorbance- Koeffizienten von 6,62 für eine 1%ige Lösung ergab sich, daß die Konzentration der Lösung etwa 11,6 mg/ml war.

Vor der Zugabe des BSA zu der Säule wurden 100 ml 0,01 m 2-Mercaptoethanol in deionisiertem Wasser zu 10 ml frisch hergestellter 1%iger BSA-Lösung gegeben. Die resultierende Lösung von BSA und 2-Mercaptoethanol- Denaturierungsmittel wurde etwa 1 Stunde bei Raumtemperatur schwach gerührt, um das native Protein partiell zu denaturieren.

Die Säule von Teil A wurde mit einem fließenden Strom von 0,01 m Acetat-Puffer, pH 4,4, Flußrate 1 ml/min, gefüllt; der Puffer wirkte auch als Denaturierungsmittellösung. 2 ml der 1%igen BSA und 2-Mercaptoethanol enthaltenden Lösung wurden am Kopf der Säule injiziert. So injiziert wurde BSA auf einen niedrigeren pH-Wert gebracht und unter solch niedrigem pH-Wert und dem 2-Mercaptoethanol ausgesetzt, partiell denaturiert.

Das Eluant der Säule wurde bei 280 nm überwacht. Als der Teil des BSA, der nicht an den immobilisierten Inhibitor gebunden war, aus der Säule eluierte, wurde er gesammelt und nach der vorstehend beschriebenen Methode festgestellt, daß er etwa 18,9 mg enthielt. Dementsprechend waren etwa 4,3 mg des BSA an den Inhibitor bei einem Durchgang durch die Säule gebunden.

Teil C Vernetzen

Der Auslaß der Säule des Teils B wurde dicht verschlossen. Die Säule wurde 17 Stunden bei einem pH von 4,4 stehengelassen, damit sich die Disulfidbrücken zur Vernetzung wieder bilden können.

Teil D Sammeln des modifizierten Proteins

Nach etwa 17 Stunden wurde das Eluant auf 0,02 m Glycin- HCl-Puffer, pH 3,0, umgestellt und das eluierende modifizierte Protein gesammelt.

Teil E Ergebnisse

Die Aktivität mit Bezug auf Substrat für Esteraseenzym wurde von einer Probe des modifizierten esteraseartigen Proteins, hergestellt nach der Erfindung, aufgezeichnet.

Ein Teil der Eluantlösung des modifizierten Proteins wurde auf enzymatische Esteraseaktivität mittels HPLC analysiert wie folgt: Die Untersuchungsprobe wurde wie folgt hergestellt: 14 ml 0,01 m Tris-Puffer, pH 7,8, und 2 ml 0,1 m N-alpha-Benzoyl-L-arginin-ethylester (BAEE)-Substrat wurden mit 4 ml des modifizierten Proteins vermischt.

Die Kontrollösung wurde durch Zufügen von 14 ml des 0,01 m Tris-Puffers, pH 7,8, zu 2 ml des 0,1 m BAEE und 4 ml 0,02 m Glycin-HCl, pH 3,0, hergestellt; letzteres war der Säuleneluant. Der pH-Wert der Kontrollösung und der Untersuchungslösung war am Schluß 7,7.

Die HPLC-Säulenbedingungen waren die gleichen wie in Beispiel 1. 20 ml der Proben wurden injiziert und die Peakhöhe für das Benzoyl-L-arginin bei 254 nm nachgewiesen und aufgezeichnet. Danach wurde die Kontrolle injiziert. Nach Sammeln von mindestens 5 Wertpunkten sowohl für die Probe als auch für die Kontrolle wurde die Aktivität aus dem Aufzeichnen der Konzentration von Benzoyl-L-arginin gegen die Zeit errechnet. Die Untersuchungsergebnisse waren wie folgt:

Die Ergebnisse zeigen, daß das modifizierte esteraseartige Protein des Teils D Aktivität mit Bezug auf Esterasesubstrat BAEE besitzt, wo im nativen BSA-Protein vorher keine Aktivität nachgewiesen worden war. Dies zeigt die Umwandlung einer Gattung von nichtenzymatischem Protein, einem Albumin, in eine andere Gattung von Protein, einem enzymatisch aktiven esteraseartigen Protein.

Beispiel 6 Teil A Herstellung der den immobilisierten Modellenzym- Inhibitor enthaltenden Säule

Bei diesem Beispiel wurde eine Chromatographiersäule aus Glas einer Länge von etwa 3,8 cm und eines Durchmessers von etwa 1,5 cm verwendet. Der Inhibitor, Cellobiose, wurde an einem festen organischen wasserunlöslichen Träger, nämlich einem auf Agarose basierenden linearen vernetzten Polysaccharid mit alternierenden Resten von D-Galactose und 3,6-Anhydro-L-galactose, immobilisiert. Der Immobilisierungsträger ist im Handel erhältlich (Sepharose 4B Gel).

Das Säulenmaterial wurde nach dem Verfahren von Sunberg und Porath, veröffentlicht in J. of Chromatography, hergestellt, und zwar wie folgt:

25 g Sepharose 4B Gel wurden auf einem Glas-Filtertrichter mit 2 l destilliertem deionisierten Wasser gewaschen und 5 Minuten unter Vakuum sauggetrocknet. Dem sauggetrockneten Gel wurden 25 ml 1,4-Butandiol-diglycidylether und 25 ml 0,6 m NaOH, die 2 mg Natriumborhydrid pro ml Lösung enthielt, gegeben. Die resultierende Lösung wurde 5 Stunden in einem Eberbach-Schüttler bei langsamer Schüttelgeschwindigkeit geschüttelt.

Nach 5 Stunden wurde die Suspension auf einem Glasfiltertrichter gewaschen mit 750 ml destilliertem deionisierten Wasser, dann mit 750 ml 0,02 m Natriumphosphat-Puffer, pH 7,5; 750 ml 0,001 m Tris-HCl-Puffer, pH 7,0; 750 ml 0,02 m Glycin-HCl-Puffer, pH 3,0, und abschließend mit 750 ml 0,05 m Natriumcarbonatpuffer, pH 10,0, und dann 5 Minuten sauggetrocknet.

Dem sauggetrockneten Gel wurden 25 ml einer 2%igen D(+)-Cellobioselösung zugegeben. Die Cellobioselösung wurde aus 500 mg Cellobiose in 25 ml 0,05 m Natriumcarbonat- Puffer, pH 10, hergestellt (die Cellobiose war No. C-7252, Partie No. 110F-0656). Die Cellobiose-Gellösung wurde 16 Stunden langsam geschüttelt.

Nach 16 Stunden wurde die Suspension auf einem Glasfiltertrichter gewaschen mit 750 ml 0,05 m Natriumcarbonat- Puffer, pH 10,0; 750 ml destilliertem deionisierten Wasser; 750 ml 0,001 m Tris-HCl-Puffer, pH 7,0; 750 ml 0,02 m Glycin-HCl, pH 3,0, und abschließend mit 750 ml 0,05 m Natriumcarbonat-Puffer, pH 9,5. Das Gel wurde unter Vakuum 5 Minuten sauggetrocknet.

12½ g des sauggetrockneten Materials wurden zu 20 ml 2,0 m Ethanolaminlösung gegeben. Die Ethanolaminlösung wurde durch Zugeben von 2,54 ml 95%igem Ethanolamin zu so viel 0,05 m Natriumcarbonat-Puffer, pH 9,5, hergestellt, daß ein Volumen von 20 ml resultierte. Die Gel- Ethanolaminlösung wurde 5 Stunden geschüttelt und dann auf einem Glasfiltertrichter wie folgt gewaschen: Mit 500 ml 0,05 m Natriumcarbonat-Puffer, pH 9,5; 500 ml 0,02 m Natriumphosphat-Puffer, pH 7,5; 500 ml 0,001 m Tris-HCl-Puffer, pH 7,0, und 500 ml destilliertem deionisierten Wasser. Das Gel wurde dann unter Vakuum sauggetrocknet, wieder in destilliertem deionisierten Wasser suspendiert und unter Gefrieren aufbewahrt, bis die Säule beschickt wurde.

Die 3,8×1,5,cm-Säule wurde ganz feucht mit dem Inhibitorgel gefüllt und die gefüllte Säule in nachstehend aufgeführter Reihenfolge gewaschen: mit 200 ml 0,02 m Natriumcarbonat-Puffer, pH 10,0; 200 ml destilliertem deionisierten Wasser; 200 ml 0,02 m Glycin-HCl-Puffer, pH 3,0 und 200 ml 0,02 m Natriumphosphonat-Puffer, pH 8,0.

Teil B Partielle Denaturierung des Proteins und Bindung an den Inhibitor

Eine frische 0,4%ige Rindercatalase-Lösung, System-Name Wasserstoffperoxid-Oxidoreduktase, wurde durch Lösen von 0,04 g kristalliner Rindercatalase (No. C-40, Partie No. 100F-7275) in 10 ml destilliertem Wasser hergestellt. Die Lösung wurde 15 Minuten bei Raumtemperatur zur Lösung der Catalase gerührt. Die Absorbance bei 280 nm war 5,71. Die tatsächliche Menge in Milligramm Catalase wurde nach Int. J. Peptide Protein, Res., 5, 1973, S. 53, von D. M. Kirschenbaum berechnet, und zwar unter Verwendung des Absorbance- Koeffizienten 12,9 bei 280 nm für eine 1%ige Lösung. Die berechnete Protein-Konzentration war 4,43 mg/ml. Dann wurde der pH-Wert der Lösung durch Filtrieren mit 0,1 n HCl auf 3 gesenkt und 1 Stunde auf diesem Wert gehalten. Dann wurden 20 ml 0,1 m β-Mercaptoethanol innerhalb von 2 Stunden unter Rühren langsam zugefügt.

2 ml der Catalaselösung wurden auf die Säule injiziert und damit 8,86 mg Protein der Inhibitorsäule zugefügt.

Als das Protein zu eluieren begann, was unvollständige Bindung anzeigte, wurde das Eluat gesammelt. 30 ml des Materials wurde mit einer Absorbance von 0,078 gesammelt, was 1,83 mg gesammelter Catalase ergab. So sind etwa 7 mg Catalase am Inhibitor in der Säule gebunden worden.

Teil C Vernetzung

Eine Vernetzungsmittellösung wurde durch Lösen von 0,035 g Dimethyl-Suberimidat-Dihydrochlorid (No. D-763, Partie No. 110F-0322) in 25 ml 0,02 m Natriumphosphat-Puffer, pH 8, hergestellt. Der Auslaß der Säule des Teils B wurde mit einer Umlaufpumpe verbunden. Der Auslaß der Pumpe wurde mit dem Kopf der Säule verbunden, so daß eine geschlossene Umwählflußschleife gebildet wurde. Dann wurden die 25 ml Vernetzungsmittellösung etwa 1 Stunde bei einer Flußrate von 1 ml/min in Umlauf geführt.

Teil D Sammeln des modifizierten Proteins

Das Umwälzsystem des Teils C wurde unterbrochen und 0,02 m Glycin-HCl-Puffer, pH 3,0, durch die Säule, die jetzt das inhibitor-gebundene stabilisierte modifizierte Protein enthielt, mit einer Geschwindigkeit von 1 ml/min gepumpt. Nach etwa 5 Minuten begann das modifizierte Protein aus der Säule zu eluieren. Etwa 15 ml des Eluants wurden gesammelt, bevor das modifizierte Protein aufhörte zu eluieren.

Die Absorbance bei 280 nm wurde wie in Teil B bestimmt; sie war 0,249, d. h. etwa 2,9 mg modifiziertes Protein sind gesammelt worden.

Dann wurde das Eluant gegen 0,02 m Natriumcarbonat- Puffer, pH 10,0, ausgetauscht und 5 ml zusätzliches Eluant gesammelt, welches 0,27 mg weiteres modifiziertes Protein enthielt.

Teil E Ergebnisse

Die Aktivität mit Bezug auf Substrat für beta-Glucosidase- Enzym von einer Probe eines modifizierten beta- glucosidase-artigen Proteins, erfindungsgemäß hergestellt in den Teilen A-D, wurde aufgezeichnet.

Ein Anteil des in Teil D gesammelten Eluants wurde auf Beta-Glucosidaseenzym-Aktivität wie folgt analysiert. Die Aktivität wurde spektrophotometrisch unter Verwendung eines CARY-14-RI-Spektrophotometers bestimmt; es wurde die Änderung in der Absorbance als Funktion der Zeit auf einer Skala von 0 bis 0,1 Absorbance-Einheiten gemessen.

Das Reaktionsgemisch wurde wie folgt hergestellt: 2,4 ml 0,02 m Natriumphosphat-Puffer, pH 7,0, und 0,5 ml 0,014 m p-Nitrophenyl-beta-D-glucosid-Substrat (NPG) wurden mit 0,1 ml des in Teil D bei pH 3,0 gesammelten modifizierten Proteins gemischt. Die Substratlösung wurde durch Lösen von 0,042 g Substrat in 10 ml destilliertem deionisierten Wasser hergestellt.

Die Kontrollmischung wurde durch Vermischen von 2,4 ml 0,02 m Natriumphosphat-Puffer, pH 7,2, und 0,5 ml destilliertem deionisierten Wasser mit 0,1 ml des modifizierten Proteins des Teils D hergestellt.

Eine zweite Kontrollösung wurde durch Mischen von 2,4 ml 0,02 m Natriumphosphat-Puffer, pH 7,1, und 0,5 ml 0,014 m NPG mit 0,1 ml destilliertem deionisierten Wasser hergestellt. Die Absorbance-Änderung bei 405 nm wurde 5 Minuten lang für die Kontrollösungen und das Reaktionsgemisch aufgezeichnet. Der pH-Wert aller 3 Lösungen war am Schluß 7,1.

Die Absorbance-Änderung der ersten Kontrollösung war 0,001 in 4,5 Minuten. Die zweite Kontrollösung zeigte keine Absorbance-Änderung, was keine Rate, herrührend von der Substrathydrolyse, anzeigt.

Es ist gefunden worden, daß die beobachtete Aktivität zweiphasig ist. Die Rate der ersten Minuten ist deutlich größer als die aufrechterhaltende Rate. Die anfängliche Absorbance-Änderung des Reaktionsgemisches ist 0,0025 in der ersten Minute oder der ersten Phase der Aktivitätsmessung und 0,0017 in 4,5 Minuten der aufrechterhaltenden Rate oder der zweiten Phase der Aktivitätsmessung.

Zur Berechnung der enzymatischen Aktivität des modifizierten glucosidase-artigen Proteins, hergestellt wie in Teil A-D beschrieben, wurde unter Anwendung folgender Gleichung errechnet:

Darin beteutet: 13×10³ l/Mol der Extinktionskoeffizient für p-Nitrophenol, bestimmt für den gegebenen pH-Wert und das gegebene Puffersystem.

Die Untersuchungsergebnisse waren wie folgt:

Da Catalase schnell ausfällt, wurde eine zweite Untersuchungsmethode unter Verwendung eines CARY 14-RI- Spektrophotometers durchgeführt. Der Isobestic-point- Test für p-Nitrophenyl-B-D-glucosid wurde benutzt, um festzustellen, wann das modifizierte glucosidase-artige Protein bei pH 7,1, dem Untersuchungs-pH-Wert, ausfällt. Der Isobestic-Punkt von p-Nitrophenyl-B-D-glucosid und p-Nitrophenol bei pH 7,1 in 0,02 m Natriumphosphat- Puffer ist 331,8 nm.

Es wurden zwei Tandem-Spektrophotometer-Küvetten verwendet. Die Weglänge jeder Zelle war 0,5 cm. Die Bezugstandemküvette wurde mit destilliertem deionisierten Wasser auf einer Seite gefüllt. Die zweite Seite wurde mit 1,2 ml 0,02 m Natriumphosphat-Puffer, pH 7,2; 0,2 ml 0,014 m p-Nitrophenyl-B-D-glucosid und 50 ml destilliertem deionisierten Wasser gefüllt.

Die Probe-Tandemküvette wurde auf einer Seite mit destilliertem deionisierten Wasser und auf der anderen Seite mit 1,2 ml 0,02 m Natriumphosphat-Puffer, pH 7,2, 0,2 ml 0,014 m p-Natrophenyl-B-D-glucosid und 50 ml modifizierter Proteinlösung gefüllt.

Während des Versuchs wurde keine Änderung in der Absorbance bei 331,8 nm festgestellt. Da kein Anstieg in der Absorbance beobachtet wurde, wird infolge des Ausfallens des modifizierten Proteins nicht zur gemessenen Reaktionsrate beigetragen.

Um zu zeigen, daß native Rindercatalase keine meßbare katalytische Aktivität gegenüber Glucosidasesubstrat zeigt, wurde wie folgt vorgegangen. Eine Lösung der nativen Rindercatalase (No. C-40, Partie No. 100F-7275) wurde gegenüber p-Nitrophenyl-beta-D- glucosid (NPG)-Substrat untersucht, um zu bestimmen, ob es gegenüber NPG enzymatisch aktiv ist. Die native Rindercatalase- Lösung wurde durch Lösen von 0,1 g der Catalase in 10 ml destilliertem deionisierten Wasser hergestellt. Die resultierende 1%ige Lösung wurde 15 Minuten bei Raumtemperatur gerührt, um die Catalase zu lösen. Dann wurde das pH der Lösung durch Titrieren mit 0,1 n HCl auf 3 gesenkt. Diese Lösung wurde in 0,02 m Glycin-HCl-Puffer, pH 3,0, etwa eine Stunde dialysiert. Nach 1 Stunde wurde das Dialysat durch frischen 1000-ml-Aliquot des Puffers ersetzt. Ein Spectra/Por-Dialysierrohr wurde verwendet, das einen Molekulargewichtsausschlußbereich von 12-14 000 Daltons hat. Die dialysierte Catalase wurde dann mit 0,02 m Glycin-HCl-Puffer, pH 3, auf 1 : 50 verdünnt, um sich der Konzentration des wie weiter oben beschrieben zurückgewonnenen und getesteten modifizierten glucosidase-artigen Proteins zu nähern. Die bei 280 nm gemessene Absorbance war 0,251. Unter Verwendung des Absorbance-Koeffizientwerts von 12,9 (wie in dem schon zitierten Artikel von Kirschenbaum offenbart) ergab sich eine Konzentration von etwa 0,2 mg modifiziertem Protein pro ml Lösung.

Die Untersuchung wurde spektrophotometrisch unter Verwendung eines CARY-14-RI-Spektrophotometers durch Messung der Änderung in der Absorbance als Funktion der Zeit vorgenommen. Das CARY-14-Gerät hat einen festgelegten Basislinien-Drift von weniger als 0,001 Absorbance-Einheiten pro Stunde.

Es wurde eine native Catalase-Enzym-Untersuchungsmischung wie folgt hergestellt: 2,4 ml 0,02 m Natriumphosphat- Puffer, pH 7,1, und 0,5 ml 0,014 m NPG-Substrat wurden mit 0,1 ml der dialysierten nativen Catalase, pH 3,0, vermischt. Die NPG-Substratlösung wurde durch Lösen von 0,042 g NPG-Substrat in 10 ml destilliertem deionisierten Wasser hergestellt.

Eine Kontrollösung wurde durch Mischen von 2,4 ml 0,02 m Natriumphosphat-Puffer, pH 7,1, und 0,5 ml NPG- Substrat mit 0,1 ml 0,02 m Glycin-HCl-Puffer, pH 3, hergestellt.

Der pH-Wert beider Lösungen am Schluß war 7,1. Die Änderung der Absorbance bei 405 nm wurde von beiden Lösungen 5 Minuten lang aufgezeichnet. Die Absorbance der nativen Catalaseenzymmischung und der Kontrollmischung war die gleiche, nämlich 0,001 Absorbance-Einheiten in 5 Minuten. Folglich hat die native Rindercatalase keine nachweisbare Beta-Glucosidaseaktivität gegenüber NPG-Substrat.

Dies zeigt, daß native Rindercatalase keine meßbare katalytische Aktivität mit Bezug auf Glucosidase-Substrat NPG hat.

Beispiel 7 Teil A Herstellung der den immobilisierten Modellenzym- Inhibitor enthaltenden Säule

Es wurde eine Chromatographiersäule aus Glas einer Länge von etwa 3,8 cm und eines Durchmessers von etwa 1,5 cm verwendet. Der immobilisierte Inhibitor, Cellobiose-Gel, wurde wie in Beispiel 6 beschrieben hergestellt. Um die Säule zur Aufnahme des nativen Proteins vorzubereiten, wurde sie etwa 3,8 cm hoch mit dem immobilisierten Inhibitor gefüllt. Nachdem die Säule gefüllt war, wurde sie zur Entfernung möglicher Verunreinigungen wie folgt gereinigt: Mit 200 ml 0,02 m Natriumcarbonat-Puffer, pH 10,0, 200 ml destilliertem deionisierten Wasser, 200 ml 0,02 m Glycin-HCl-Puffer, pH 3,0, und abschließend mit 200 ml 0,001 m Tris-HCl-Puffer, pH 7,0.

Teil B Partielle Denaturierung des Proteins und Bindung an den Inhibitor

2,5 ml Glucoamylase, eine Alpha-Glucosidase mit dem Systemnamen alpha-1, 4-Glucan Glucohydrolase (Glucoamylase No. A-3514, Partie 28C-0442) wurde mit 7,5 ml destilliertem deionisierten Wasser verdünnt und gegen 0,001 m Tris-HCl-Puffer, pH 7,0, etwa 16 Stunden dialysiert. 100 mg dieses Handelsproduktes Glucoamylase wurden in etwa 10 ml 3,2 m Ammoniumsulphatlösung, pH 6, suspendiert. Das Glucoamylaseenzym wurde unter Verwendung eines Dialysierrohres eines Molekulargewichts-Ausschlußbereichs von 12 000-14 000 Daltons dialysiert.

Die Konzentration der nativen Glucoseamylase-Enzym- Lösung wurde nach D. M. Kirschenbaum (Analytical Biochemistry 82, S. 83-100, 1977) bestimmt. Die bei 280 nm gemessene Absorbance war 2,78. Unter Verwendung des Absorbance-Koeffizient-Wertes von 13,6 ergab sich, daß die Konzentration der Lösung etwa 2,1 mg natives Glucoseamylaseenzym/ ml Lösung war.

Bevor die dialysierte Glucoseamylase bei pH 7,0 auf die Inhibitorsäule gegeben wurde, wurden ihr 20 ml 0,1 m 2-Mercaptoethanol, in destilliertem deionisierten Wasser, pro 10 ml der dialysierten Glucoseamylase gegeben. Die resultierende Lösung von Glucoseamylase und dem Denaturierungsmittel 2-Mercaptoethanol wurde 60 Minuten bei Raumtemperatur langsam gerührt, um das native Enzym partiell zu denaturieren.

Die Säule von Teil A wurde mit einem fließenden Strom von 0,001 m Tris-HCl-Puffer, pH 7,0, mit einer Flußgeschwindigkeit von 0,5 ml/min gefüllt. 5 ml der Lösung von Glucoamylase und 2-Mercaptoethanol wurden am Kopf der Säule injiziert. Als das Protein zu eluieren begann, was unvollständige Bindung anzeigte, wurde das Eluant gesammelt. 15 ml Proteinmaterial mit einer Absorbance von 0,03 wurden gesammelt, was 0,33 mg gesammelter Glucoamylase ergab. Es wurden also etwa 10 mg Glucoamylase an dem Inhibitor an der Säule gebunden.

Teil C Vernetzen

Eine Vernetzungsmittellösung wurde hergestellt durch Lösen von 0,044 g Dimethyl-Suberimidat-Dihydrochlorid (No. D-7636, Partie 31F-0225) in 25 ml 0,005 m Tris-HCl-Puffer, pH 7,5. Der Auslaß der Säule des Teils B wurde mit einer Umlaufpumpe verbunden. Der Auslaß der Pumpe wurde mit dem Kopf der Säule verbunden, so daß eine geschlossene Umwälzflußschleife gebildet wurde. Die 25 ml Vernetzungsmittel wurden etwa 1 Stunde mit einer Flußrate von 0,5 ml/min durch die Säule in Umlauf geführt.

Teil D Sammeln des modifizierten Proteins

Das Umwälzsystem des Teils C wurde unterbrochen und 0,02 m Glycin-HCl-Puffer, pH 3,0, durch die Säule, die jetzt das inhibitor-gebundene stabilisierte modifizierte enzymartige Protein enthielt, mit 0,5 ml/min gepumpt. Nach etwa 5 Minuten begann das modifizierte Protein aus der Säule zu eluieren. Etwa 16 ml Eluant wurden gesammelt, bevor das modifizierte Protein aufhörte zu eluieren.

Die Absorbance bei 280 nm wurde wie in Teil B bestimmt, und zwar mit 0,764, was besagt, daß etwa 8,9 mg des modifizierten Proteins gesammelt worden sind.

Teil E Ergebnisse

Die Aktivität mit Bezug auf das Substrat für ein Beta- Glucosidaseenzym wurde von einer Probe des modifizierten beta-glucosidase-artigen Proteins, erfindungsgemäß in den Teilen A-D hergestellt, aufgezeichnet.

Ein Teil des in Teil D gesammelten Eluants wurde auf Beta-Glucosidaseenzym-Aktivität wie folgt analysiert. Die Aktivität wurde spektrophotometrisch unter Verwendung eines ACTA III-Spektrophotometers durch Messung der Änderung in der Absorbance als Funktion der Zeit bestimmt.

Die Reaktionslösung wurde wie folgt hergestellt: 0,7 ml 0,002 m Natriumacetat-Puffer, pH 5,0, und 0,2 ml 0,014 m p-Nitrophenyl-beta-D-glucosid-Substrat (NPG) wurden mit 0,1 ml des modifizierten Beta-Glucosidase-Proteins aus Teil D, gesammelt bei pH 3,0, vermischt. Die Substratlösung wurde durch Lösen von 0,042 g des Substrats in 10 ml destilliertem deionisierten Wasser hergestellt.

Die Kontrollösung wurde durch Mischen von 0,7 ml 0,002 m Natriumacetat-Puffer, pH 5,0, und 0,2 ml 0,014 m NPG- Substrat mit 0,1 ml 0,02 m Glycin-HCl-Puffer, pH 3,0, hergestellt. Der pH-Wert der Kontrollösung und der Untersuchungslösung war am Schluß 5,0.

Nach Bebrüten der Reaktions- und der Kontrollösung 15 Minuten lang bei 30°C in einem trockenen Heizblock wurde die Reaktion durch Zugabe von 1 ml 0,02 m Natriumcarbonat gestoppt.

Die Absorbance der Kontrollösung war 0,028, wenn bei 405 nm gemessen wurde, und die Absorbance der Reaktionslösung war 0,043. Die Absorbance-Änderung nach 15 Minuten war 0,015.

Die nachstehende Gleichung wurde zur Berechnung der enzymatischen Aktivität des modifizierten beta-glycosidase- artigen Proteins, das erfindungsgemäß hergestellt worden ist, benutzt.

worin 16,2×10³ Liter/Mol der Extinktionskoeffizient von p-Nitrophenol, bestimmt bei dem gegebenen pH-Wert und dem gegebenen Puffer-System, ist.

Die Versuchsergebnisse sind die folgenden:

Die Ergebnisse zeigen, daß das modifizierte beta-glucosidase- artige Protein des Teils D Aktivität mit Bezug auf Beta-Glucosidase-Substrat NPG besitzt, während in der nativen Glucoamylase keine Aktivität gegenüber NPG festgestellt worden war.

Um zu zeigen, daß native Glucoamylase keine natürliche Beta-Glucosidase-Aktivität zeigt, wurde wie folgt vorgegangen. Native Glucoamylase wurde gegen 0,001 m Tris-HCl-Puffer bei pH 7,0 über Nacht dialysiert. Die Glucoamylase wurde unter Verwendung eines Dialysierrohres eines Molekulargewicht-Ausschlußbereiches von 12 000- 14 000 Daltons dialysiert.

Das native Glucoamylase-Reaktionsgemisch wurde wie folgt hergestellt: 0,7 ml 0,002 m Natriumacetat-Puffer, pH 5,0, und 0,2 ml 0,014 m NPG wurden mit 0,1 ml der dialysierten nativen Glucoamylase vermischt.

Die Kontrollmischung für diese Untersuchung wurde durch Mischen von 0,7 ml 0,002 m Natriumacetat-Puffer, pH 5,0, und 0,2 ml 0,014 NPG-Substrat mit 0,1 ml 0,001 m Tris-HCl- Puffer, pH 7,0, hergestellt. Der pH-Wert der Kontrollmischung und der nativen Glucoamylase-Reaktionsmischung war am Schluß 5,0.

Nach Bebrüten beider Mischungen 15 Minuten bei 30°C in einem trockenen kontrollierten Heizblock wurde die Untersuchung durch Zugabe von 1 ml 0,02 m Natriumcarbonat gestoppt.

Die Absorbance der Kontrollmischung und der Reaktionsmischung war, gemessen bei 405 nm, 0,026. Es war also keine Änderung in der Absorbance eingetreten. Folglich ist an der nativen Glucoamylase keine Aktivität mit Bezug auf das Beta-Glucosidase-Substrat NPG festgestellt worden.

Claims (9)

1. Verfahren zum chemischen Modifizieren eines nativen Proteins zu einem modifizierten enzymartigen Protein, gekennzeichnet durch

• a) Auswählen eines enzymatisch aktiven Proteins, das nachgebildet werden soll, als Modellenzym;
• b) Auswählen eines Inhibitors für das Modellenzym in Form eines Moleküls mit ausreichender struktureller Ähnlichkeit mit dem natürlichen Substrat des Modellenzyms, um als Schablone zur Bewahrung einer inhibitorartigen Stelle am modifizierten enzymartigen Protein zu dienen;
• c) Immobilisieren des Inhibitors des Modellenzyms an einem festen Träger;
• d) partielles Denaturieren des nativen Proteins;
• e) In-Kontakt-Bringen des partiell denaturierten nativen Proteins mit dem immobilisierten Inhibitor;
• f) Vernetzen des an den immobilisierten Inhibitor gebundenen partiell denaturierten nativen Proteins;
• g) Entfernen überschüssigen Vernetzungsmittels durch Waschen und
• h) Gewinnen des modifizierten enzymartigen Proteins durch selektives Wegwaschen des inhibitorgebundenen vernetzten Proteins vom immobilisierten Inhibitor.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Inhibitor des Modellenzyms kovalent an dem festen Träger immobilisiert wird.

3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als fester Träger ein Agarosegel eingesetzt wird.

4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als fester Träger ein wasserunlöslicher Träger verwendet wird.

5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß das partiell denaturierte Protein mit dem immobilisierten Inhibitor des Modellenzyms durch Hindurchfließenlassen des Proteins durch eine diesen Inhibitor enthaltende Säule in Kontakt gebracht wird.

6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß das partiell denaturierte Protein mit dem immobilisierten Inhibitor des Modellenzyms durch Durchtränken des partiell denaturierten Proteins mit einem den Inhibitor enthaltenden wäßrigen Medium in Kontakt gebracht wird.

7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß eine wäßrige Lösung des Vernetzungsmittels durch eine Säule hindurchgeschickt wird, die das an den Inhibitor gebundene partiell denaturierte Protein enthält.

8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß das an den Inhibitor gebundene partiell denaturierte Protein mit einem wäßrigen Medium, welches das Vernetzungsmittel enthält, durchtränkt wird.

9. Modifiziertes enzymartiges Protein, erhalten nach dem Verfahren des Anspruches 1.