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DE3248043A1 - Fluorogene phosphorsaeureester, verfahren zu deren herstellung sowie verfahren und mittel zum nachweis und zur fluorometrischen bestimmung von phosphaten - Google Patents

Fluorogene phosphorsaeureester, verfahren zu deren herstellung sowie verfahren und mittel zum nachweis und zur fluorometrischen bestimmung von phosphaten

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Publication number
DE3248043A1
DE3248043A1 DE19823248043 DE3248043A DE3248043A1 DE 3248043 A1 DE3248043 A1 DE 3248043A1 DE 19823248043 DE19823248043 DE 19823248043 DE 3248043 A DE3248043 A DE 3248043A DE 3248043 A1 DE3248043 A1 DE 3248043A1
Authority
DE
Germany
Prior art keywords
phenyl
optionally
substituted
phosphorus
alkoxycarbonyl
Prior art date
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Withdrawn
Application number
DE19823248043
Other languages
English (en)
Inventor
Horst Dipl.-Chem. Dr. 5203 Much Harnisch
Otto S. Dr. Graz Wolfbeis
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Bayer AG
Original Assignee
Bayer AG
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Bayer AG filed Critical Bayer AG
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Priority to US06/561,391 priority patent/US4659657A/en
Priority to GB08333740A priority patent/GB2133007B/en
Priority to JP58242358A priority patent/JPS59130284A/ja
Publication of DE3248043A1 publication Critical patent/DE3248043A1/de
Withdrawn legal-status Critical Current

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Description

  • Fluorogene Phosphorsäureester, Verfahren zu deren Her-
  • stellung sowie Verfahren und Mittel zum Nachweis und zur fluorometrischen Bestimmung von Phosphatasen Die Erfindung betrifft neue fluorogene Phosphorsäureester, die unter dem Einfluß von Phosphatasen ein stark fluoreszierendes farbiges Anion bilden und zu einer verbesserten Bestimmungsmethode für Phosphatasen verwendet werden können.
  • Fluorimetrische Verfahren zur Bestimmung von Phosphatase-Aktivitäten sind bereits seit längerem bekannt (Guilbault, Enzymatic Methods of Analysis, Pergamon Press 1970). Die Fluorimetrie ist so empfindlich, daß hiermit auch äußerst geringe Enzymkonzentrationen nachgewiesen und bestimmt werden können. Bekannte fluorimetrisch verwendete Phosphatase-Reagentien sind Phosphorsäureester des Umbelliferons (G.G.Guilbault et al., Anal. Letters 1 (1968) 333), des 4-Methylumbelliferons (H.N.Fernley, P.G.Walker, Biochem. J. 97 (1965) 95), des Flavonols (D.B.Land, E.Jakim, Anal. Biochem. 16 (1966) 481), des .t-Naphthols (D.W.Moss, Clin. chim.
  • Acta 5 (1960) 283), des B-Naphthols (L.J.Greenberg, Biochem Biophys. Res. Comm. 9 (1962) 430) und des 3-0-Methyl-fluoresceins (H.D. Hill et al., Anal. Biochem. 24 (1968) 9).
  • Diese bekannten Nachweisverfahren sind jedoch aus verschiedenen Gründen nicht voll befriedigend: Die Phosphorsäureester des genannten Standes der Technik werden nur im alkalischen pH-Bereich rasch genug gespalten, um in der klinischen Analytik verwendet werden zu können. Für die Diagnose, beispielsweise bei der Früherkennung von Prostata-Karzinomen, wäre es jedoch wichtig, auch saure Phosphatase-Aktivitäten zu bestimmen. Bei vielen der-bekannten fluorogenen Phosphorsäureester tritt darüber hinaus eine störende Überlappung der Fluoreszenz des Esters und des bei der Hydrolyse entstehenden Anions auf. Im übrigen verlangen die Reagentien des Standes der Technik zum Teil auch einen erheblichen apparativen Aufwand.
  • In US 3 772 340 werden Bis-cumarinylphosphate beschrieben, die zur fluorimetrischen Bestimmung von Phosphodiesterasen dienen sollen, wie sie in bakterienhaltigem Urin auftreten. Ein Nachteil dieser Verbindungen ist ihre Schwerlöslichkeit in Wasser, was ihre praktische Anwendbarkeit begrenzt.
  • Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, Reagentien für den fluorimetrischen Nachweis von Phosphatasen zur Verfügung zu stellen, welche von den oben erwähnten Nachteilen des Standes der Technik frei sind. Diese Aufgabe wird mittels der erfindungsgemäßen Phosphorsäureester gelöst.
  • Gegenstand der Erfindung sind neue Phosphorsäureester der Formel worin M für Wasserstoff, ein Alkali- oder Ammoniumion, das durch 1 - 4, gegebenenfalls eine Hydroxygruppe enthaltende C1-C2-Alkylreste substituiert sein kann, X für -0- oder -NQ-, Q für Wasserstoff, gegebenenfalls durch 1 - 2 OH-Gruppen substituiertes C1-C4-Alkyl oder für C1-C4-Alkoxycarbonyl, R für Wasserstoff, Chlor, Brom, Cyano oder Carbamoyl, A für Cyano, C1-C4-Alkoxycarbonyl, gegebenenfalls durch 1 - 2 C1-C4-Alkylreste substituiertes Carbamoyl oder Sulfamoyl, C1-C4-Alkylsulfonyl, Benzyl- sulfonyl, Phenylsulfonyl, p-Tolylsulfonyl, p-Chlorphenylsulfonyl, Sulfo, Nitro, Phenyl, p-Tolyl, Sulfophenyl oder für einen gegebenenfalls durch 1 - 2 C1 -C4-Alkyl, 1 - 2 Chlor, C1-C4-Alkoxy, Carboxyl, C1 -C4-Alkoxycarbonyl, Cyano, Trifluormethyl, C1-C4-Alkylsulfonyl, Cyclohexyl, Phenyl oder Sulfo substituierten Benzoxazol-2-yl-, Benzthiazol-2-yl-, Thiazol-2-yl-, Benzimidazol-2-yl-, Chinazol-4-on-2-yl-, 5-Phenyl-1,3,4-thiadiazol-2-yl-, 5-Phenyl-1,3,4-oxadiazol-2-yl-, 2- oder 4-Pyridyl-Rest und R1 für Wasserstoff oder eine Sulfonsäuregruppe stehen.
  • Bevorzugt sind jene Verbindungen der allgemeinen Formel (I), in welcher A für einen gegebenenfalls durch 1 - 2 C1-C4-Alkyl, 1 - 2 Chlor, C1-C4-Alkoxy, C1-C4 -Alkylsulfonyl, Carboxyl, C1-C4-Alkoxycarbonyl, Cyclohexyl, Phenyl oder Sulfo substituierten Benzoxazol-2-yl-, Benzthiazol-2-yl-, Thiazol-5-yl-, Benzimidazol-2-yl-, Chinazol-4-on-2-yl-, 5-Phenyl-1,3,4-thiadiazol-2-yl- oder 4-Pyridyl-Rest steht.
  • Besonders bevorzugt sind diejenigen Verbindungen der Formel (I), worin A für einen gegebenenfalls durch Methyl, Ethyl, Chlor, Methoxy, Ethoxy oder Sulfo substituierten Benzthiazol-2-yl- oder Benzoxazol-2-yl-Rest und R für CN stehen.
  • Die erfindungsgemäßen Phosphorsäureester der Formel (I) können hergestellt werden, indem man Hydroxy-Verbindungen der Formel worin X, A, R und R1 die obengenannte Bedeutung besitzen, zunächst mit einem Halogenid des 5-wertigen Phosphors (vorzugsweise in Gegenwart eines anorganischen oder organischen Säurefängers) umsetzt und die erhaltene Dihalogenphosphonyloxy-Verbindung anschließend hydrolysiert.
  • Als Halogenide des 5-wertigen Phosphors kommen beispielsweise Phosphoroxidtrichlorid, Phosphoroxidtribromid oder Phosphorpentachlorid in Betracht, wobei das letztgenannte bevorzugt dann eingesetzt wird, wenn das Molekül eine Sulfogruppe enthält (vorübergehende Überführung in das entsprechende Sulfochlorid).
  • Als Säurefänger eignen sich anorganische und organische Basen, beispielsweise wasserfreies Kalium- oder Natriumcarbonat, Magnesiumoxid, Triethylamin, Kollidin, Picolingemische, Pyridin und Dimethylanilin.
  • Die Reaktion wird vorzugsweise in Gegenwart eines Lösungs- oder Verdünnungsmittels im Temperaturbereich von -5 bis 1000C, im Falle der Phosphoroxidtrihalogenide Vorzugsweise bei 0 - 300C, im Falle von PCl5 vorzugsweise bei 20 - 900C durchgeführt.
  • Als Lösungs- und Verdünnungsmittel eignen sich unter den Reaktionsbedingungen inerte organische Flüssigkeiten wie Toluol, Chlorbenzol, Dichlorbenzol, Dichlormethan, Chloroform, Tetrachlormethan, Dichlorethan, Dichlorpropan, Trichlorethylen, Acetonitril, Dioxan, Tetrahydrofuran oder eine der obengenannten organischen Basen wie Pyridin.
  • Um die Reaktion des 5-wertigen Phosphorhalogenids mit 2 Molekülen (II) zu vermeiden, sorgt man während der Reaktion zweckmäßig für einen Überschuß an Phosphorhalogenid dadurch, daß man (II) als letzte Komponente nach und nach zugibt, gegebenenfalls vorgelöst in einem der obengenannten Lösungsmittel.
  • Die Hydrolyse der intermediären Dichlorphosphonyloxy-Verbindungen zu (I) kann z.B. durch vorsichtiges Erwärmen mit Wasser auf etwa 50°C, schonender jedoch bei Temperaturen von 0 - 250C durch Neutralisation mit Alkalihydroxid- oder Alkalicarbonat-Lösung oder wäßrigem Ammoniak durchgeführt werden. Anschließend dampft man die erhaltenen Alkali- oder Ammoniumsalze im Vakuum zur Trockne ein oder gewinnt durch Ansäuern mit einer Mineralsäure wie Schwefelsäure die freie Säure (I mit M=H) durch Abfiltrieren.
  • Die vorstehend aufgeführte Methode zur O-Phosphorylierung von (II) stimmt im wesentlichen mit der in Houben-Weyl, Methoden der Organischen Chemie, Band XII/2 (1964) S.
  • 172 - 177 beschriebenen allgemeinen Methode zur Phosphorylierung von aromatischen Hydroxyverbindungen überein.
  • Die Ausgangsverbindungen der Formel (II) sind bekannt (US-PS 3 521 187 Verbindung 11; DE-OS 27 02 337; DE-OS 30 44 128, DE-OS 21 00 295 und DE-OS 3 229 301) oder nach den dort genannten Methoden herstellbar.
  • Die neuen Verbindungen der Formel (I) sind wasserlösliche, schwach blau (R=H, Cl, Br) oder grünlich (R=CN, CONH2) fluoreszierende und zumeist nur wenig farbige Substanzen, die im wäßrigen Medium von alkalischer oder saurer Phosphatase zum stark fluoreszierenden, tief gelb bis rot gefärbten mesomeren Anion der Formeln gespalten werden.
  • Die neuen Phosphatase-Reagentien der Formel (I) eignen sich daher zum direkten Phosphatase-Nachweis in biologischen Materialien. Besonders vorteilhaft können sie zur quantitativen fluorimetrischen Bestimmung der alkalischen oder sauren Phosphatasen in der klinischen Analytik verwendet werden.
  • Gegenüber den Phosphatase-Reagentien des Standes der Technik weisen die neuen Phosphorsäureester der Formel (I) wesentliche Vorteile auf: 1. Keinerlei störende überlappung der fluorimetrisch zu verfolgenden, bei der enzymatischen Spaltung von (I) entstehenden, starken Fluoreszenz des Hydroxylats (IIIa - IIIb) mit der schwachen Fluoreszenz des eingesetzten Reagenz (I) (große Stoke'sche Verschiebung).
  • 2. Verwendung einfachster Filterfluorimeter möglich, da weder eine Anregung durch UV-Licht, bei der sich in der Regel die Untergrundfluoreszenz des biologischen Materials störend bemerkbar macht, noch die Anwendung aufwendiger Monochromatoren oder Interferenzfilter, wie sie beim Einsatz von 3-O,Methylfluorescein-phosphat gebraucht werden, erforderlich sind.
  • 3. Bildung des tief farbigen fluoreszierenden Hydroxylatanions (IIIa - IIIb) überraschenderweise bereits unter schwach sauren Bedingungen (z.B. bei pH 5.2). Hierdurch ist es erstmalig möglich, die Aktivität saurer Phosphatasen fluorimetrisch in kontinuierlicher Messung mit einer so hohen Nachweisempfindlichkeit zu verfolgen, wie sie bisher nur bei zeitaufwendigeren nichtkinetischen Verfahren bekannt ist.
  • Die erfindungsgemäßen Phosphorsäureester können zur Bestimmung der Phosphataseaktivität in den verschiedensten Körperflüssigkeiten (Serum; cerebrospinale Flüssigkeit; Urin) verwendet werden. Es ist jedoch auch möglich, die erfindungsgemäßen Reagentien analog zur Lehre der US-PS 3 772 340 zur Messung der Bakterienkonzentration in Flüssigkeiten (z.B. bakteriell infiziertem Urin) heranzuziehen. Zu diesem Zweck werden zunächst in an sich bekannter Weise (z.B. osmotischer Schock; Sphäroplastenbildung) die bakteriellen Enzyme, darunter auch Phosphatasen, freigesetzt. Aus der mittels der erfindungsgemäßen Verbindungen bestimmten Phosphataseaktivität lassen sich dann Rückschlüsse auf die Zahl der vorhandenen Bakterien ziehen.
  • Bei der Bestimmung der Phosphataseaktivität können die erfindungsgemäßen Verbindungen wegen ihrer guten Wasser löslichkeit in Form wäßriger Lösungen, gegebenenfalls auf den gewünschten pH-Wert gepuffert (z.B. ca. 4,5 -7 für saure Phosphatasen; ca. 7 - 10 für alkalische Phosphatasen), eingesetzt werden. Es ist jedoch auch möglich, die neuen Phosphorsäureester in an sich bekannter Weise auf Träger aufzubringen und die Nachweisreaktion in heterogener Phase ablaufen zu lassen.
  • Geeignete Trägermaterialien sind z.B. Filterpapier oder auf einem Kunststoff (z.B. Polystyrol) aufgebrachtes, mit einem organischen Bindemittel versehenes Siliziumdioxid. Es lassen sich auf diese Weise Teststreifen herstellen, die nach dem Aufbringen der zu untersuchenden Flüssigkeit zu fluoreszieren beginnen und deren Fluoreszenz mittels der in der klinischen Analytik üb- lichen Fluorimeter gemessen werden kann. Die quantitative Bestimmung der Phosphatase-Aktivität in einer unbekannten Probe ist möglich, wenn man den zeitlichen Verlauf der Fluoreszenz-Intensität in der wäßrigen Lösung bzw.
  • auf dem Teststreifen mit jenem von Standards mit bekanntem Phosphatasegehalt vergleicht.
  • Bei den im folgenden beschriebenen Versuchen wurden als Standards folgende Phosphatasepräparate der Firma Sigma Chemical Co. verwendet: a) alkalische Phosphatase (EC 3.1.3.1): Typ I-S (P7640) (aus Rinderhodenmucosa) b) saure Phosphatasen (EC 3.1.3.2): Typ III (P6760) Typ IV-S (P1146) Typ V (P1267) (aus Weizenkeimlingen, Kartoffeln, Milch und Rinderhoden).
  • EC ist die Bezeichnung für den international gültigen Enzymkatalog.
  • Beispiel 1 800 ml trockenes Pyridin werden unter Kühlung und Rühren bei 0 - 50C tropfenweise mit 39 g (23 ml; 0,25 Mol) Phosphoroxidtrichlorid und anschließend bei der gleichen Temperatur innerhalb von ca. 30 Minuten portionsweise mit 80 g (0,25 Mol) 3-Benzthiazolyl-4-cyano-7-hydroxy-cumarin versetzt und 3 h bei 0 - 50C verrührt. Man trägt auf 2 1 Eiswasser aus, tropft unter Rühren 66 g (45 ml; 0,75 Mol) 45 gew.-%ige Natronlauge hinzu, wobei sich ein pH-Wert von ca. 7 einstellt, läßt die Mischung 10 h rühren, dampft sie mit Hilfe eines Rotationsverdampfers bei 400C im Vakuum zur Trockene ein und trocknet den Rückstand weiter bei 400C im Vakuum bis zu Gewichtskonstanz. Der Rückstand (185 gy besteht aus 44 g Kochsalz und 141 g (96 % der Theorie) der Verbindung der Formel Zur Reinigung wird der Rückstand aus Ethanol-Wasser (4:1) umkristallisiert. Man erhält orangefarbene Kristalle vom Schmelzpunkt 3250C (Zers.).
  • Die Verbindung ist löslich, z.B. in Wasser, Methanol, Dimethylformamid, Dimethylsulfoxid und Ethylenglykolmonomethylether.
  • Zur fluorimetrischen Verfolgung der enzymatischen Hydro lyse wählt man Anregungslicht mit einem Maximum bei 510 nm und mißt die Fluoreszenz bei 595 nm. Bei dieser Wellenlänge wird ausschließlich die Fluoreszenz des enzymatisch gespaltenen Substrats erfaßt.
  • In analoger Weise werden unter Verwendung der entsprechenden Ausgangsverbindungen die folgenden Phosphorsäureester der allgemeinen Formel hergestellt:
    Beispiel M R A X Schmelzpunkt
    (Zersetzung)
    °C
    2 Na H # O 301°
    3 K CN # O 309°
    4 Na H # O 302°
    5 Na CN # O 310°
    6 NH4 H # O 318°
    7 K CN # O 304°
    8 Na CN # O 308°
    Beispiel M R A X Schmelzpunkt
    (Zersetzung)
    °C
    9 Li H # O 300°
    10 Na CN # O 330°
    11 K CN # O 317°
    12 Na CN # O 315°
    13 NH4 H # N-C4H9-n 300°
    14 K H # N-CH3 313°
    15 Na H # N-COOC2H5 322°
    Beispiel M R A X Schmelzpunkt
    (Zersetzung)
    °C
    16 H2N(C2H4OH)2 CN # O 262°
    17 HN(C2H5)3 H # O 278°
    18 Na CN # O 307°
    19 K CN # O 316°
    20 Na CN CN O 327°
    21 K CN COOCH3 O 304°
    22 Na CN SO2CH3 O 312°
    23 Na CN SO2-C6H5 O 326°
    24 K CN # O 305°
    Beispiel 25 160 ml trockenes Pyridin werden unter Kühlung und Rühren bei 0 - 10°C innerhalb von 30 Minuten mit 11,5 g Phosphorpentachlorid (55 mMol) und anschließend mit 22,6 g (50 mMol) 3- (5-Methyl-7-sulfo-benzoxazol-2-yl) -7-hydroxycumarin-pyridiniumsalz versetzt und 1 h auf 800C erwärmt, wobei vorübergehend eine klare Lösung entsteht. Man trägt auf 400 ml Eiswasser aus, tropft unter Rühren 30 g (20 ml; 335 mMol) 45 gew.-%ige Natronlauge hinzu, wobei sich ein pH-Wert von ca. 7 einstellt, und läßt die Mischung 10 h rühren. Man dampft das Filtrat mit Hilfe eines Rotationsverdampfers zur Trockene ein und trocknet weiter bei 500C im Vakuum bis zur Gewichtskonstanz. Der Rückstand enthält außer 16 g Kochsalz und ca. 1 g Na2HPO4 25 g (95 % der Theorie) der Verbindung der Formel Zur Verfolgung der enzymatischen Hydrolyse durch Phosphatasen regt man im Fluorimeter bei ca. 450 nm an und mißt die Emission bei ca. 495 nm. Hierbei wird praktisch nur die Fluoreszenz des enzymatisch gespaltenen Substrates erfaßt.
  • In analoger Weise werden unter Verwendung der entsprechenden Ausgangsverbindungen die folgenden sulfogrup- haltigen Phosphorsäureester der allgemeinen Formel hergestellt:
    Beispiel M R A
    26 Na CN ßX
    27 K H wüs
    OCH3
    28 Na CN ß>
    29 Na H t t Cl
    N Cl
    30 Na CN
    Beispiel 31 In einem Fluorimeter füllt man bei 230C die Küvette mit 3 ml einer 0,1 mmolaren wäßrigen citratgepufferten (0,05 Mol Citrat/Liter) Lösung der Verbindung des Beispiels (1) vom pH 5.2, stellt die Anregungswellenlänge auf 510 nm und die Emissionswellenlänge auf 595 nm ein, fügt 0,1 ml der auf saure Phosphatase-Aktivität zu bestimmtenden Körperflüssigkeit (Serum, cerebrospinale Flüssigkeit), deren Gehalt in der Größenordnug von 0,1 mg Phosphatase pro ml liegen soll, hinzu und verfolgt die zeitliche Änderung der Fluoreszenzintensität über einen Zeitraum von etwa 1 - 3 Minuten im Vergleich zu vorher angefertigten Eichkurven. Der anfangs lineare Anstieg der Fluoreszenzintensität ist ein direktes Maß für die Enzymaktivität. Die Nachweisgrenze für saure Phosphatasen liegt bei der vorstehend beschriebenen Anordnung bei ca. 1x10 -5 Enzymeinheiten pro ml. Mit bekannten Phosphatase-Reagentien ist eine kinetische Messung der sauren Phosphatase-Aktivität mit einer derartigen Empfindlichkeit bisher nicht möglich gewesen. Nichtkinetische Verfahren sind zwar ähnlich empfindlich, aber langwieriger und aufwendiger.
  • Als Eichsubstanz kann saure Phosphatase aus Kartoffeln (Enzym-Katalog-Nr. 3.1.3.2, Typ IV-S), käuflich erhältlich bei Sigma Chemical Co. unter der Nr. P-1146, mit einer Aktivität von 1.9 Enzymeinheiten/mg verwendet werden (definiert ist die Enzymeinheit als diejenige Menge des Enzyms, die 1 ;iMol p-Nitrophenylphosphat pro Minute bei pH 4,8 und 370C hydrolysiert).

Claims (10)

  1. Patentansprüche Verbindungen der allgemeinen Formel worin M für Wasserstoff, ein Alkali- oder Ammoniumion, das durch 1 - 4, gegebenenfalls eine Hydroxygruppe enthaltende C1-C2-Alkylreste substituiert sein kann, X für -0- oder -NQ-, Q für Wasserstoff, gegebenenfalls durch 1 - 2 OH-Gruppen substituiertes C1-C4-Alkyl oder für C1-C4-Alkoxycarbonyl, R für Wasserstoff, Chlor, Brom, Cyano oder Carbamoyl, A für Cyano, C1-C4-Alkoxycarbonyl, gegebenenfalls durch 1 - 2 C1 -C4-Alkylreste substituiertes Carbamoyl oder Sulfamoyl, Cl-C4-Alkylsulfonyl, Benzylsulfonyl, Phenylsulfonyl, p-Tolylsulfonyl, p-Chlorphenylsulfonyl, Sulfo, Nitro, Phenyl, p-Tolyl, Sulfophenyl oder für einen gegebenenfalls durch 1 - 2 C1-C4-Alkyl, 1 - 2 Chlor, C1-C4-Alkoxy, Carboxyl, C1-C4 -Alkoxycarbonyl, Cyano, Trifluormethyl, C1 -C4-Alkylsulfonyl, Cyclohexyl, Phenyl oder Sulfo substituierten Benzoxazol-2-yl-, Benzthiazol-2-yl-, Thiazol-2-yl-, Benzimidazol-2-yl-, Chinazol-4-on-2-yl-, 5-Phenyl-1,3,4-thiadiazol-2-yl-, 5-Phenyl-1,3,4-oxadiazol-2-yl-, 2- oder 4-Pyridyl-Rest und R1 für Wasserstoff oder eine Sulfonsäuregruppe stehen.
  2. 2) Verbindung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß A für einen gegebenenfalls durch 1 - 2 C1-C4-Alkylgruppen, 1 - 2 Chlor, C1-C4-Alkoxy-, C1-C4-Alkylsulfonyl-, Carboxyl-, C1 -C4-Alkoxycarbonyl-, Cyclohexyl-, Phenyl- oder Sulfonsäurereste substituierten Benzoxazol-2-yl-, Benzthiazol-2-yl-, Thiazol-5-yl-, Benzimidazol-2-yl-, Chinazol-4-on-2-yl-, 5-Phenyl-1,3,4-thiadiazol-2-yl- oder 4-Pyridyl-Rest steht.
  3. 3) Verbindung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß R für CN und A für einen gegebenenfalls durch Methyl, Ethyl, Chlor, Methoxy, Ethoxy oder Sulfo substituierten Benzthiazol-2-yl- oder Benzoxazol-2-yl-Rest stehen.
  4. 4) Verfahren zur Herstellung von Verbindungen nach Ansprüchen 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß man Hydroxy-Verbindungen der Formel worin X, A, R und R1 die in Anspruch 1 bis 3 genannte Bedeutung besitzen, zunächst mit einem Halogenid des 5-wertigen Phosphors umsetzt und die erhaltene Dihalogenphosphonyloxy-Verbindung anschließend hydrolysiert.
  5. 5) Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß man die Umsetzung mit einem Halogenid des 5-wertigen Phosphors in Gegenwart eines anorganischen oder organischen Säurefängers durchführt.
  6. 6) Verfahren nach Anspruch 4 oder 5, dadurch gekennzeichnet, daß man als Halogenid des 5-wertigen Phosphors Phosphoroxidtrichlorid, Phosphoroxidtribromid oder Phosphorpentachlorid einsetzt.
  7. 7) Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß man als Säurefänger wasserfreies Kaliumcarbonat, Natriumcarbonat, Magnesiumoxid, Triethylamin, Kollidin, Picolingemische, Pyridin oder Dimethylanilin einsetzt.
  8. 8) Fluorogene Phosphorsäureester enthaltende Testmittel für den fluorimetrischen Nachweis von Phosphatasen, dadurch gekennzeichnet, daß sie als fluorogene Phosphorsäureester Verbindungen nach Anspruch 1 bis 3 enthalten.
  9. 9) Testmittel nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß die Phosphorsäureester in einem Trägermaterial enthalten sind.
  10. 10) Verfahren zur Bestimmung von Phosphatase-Aktivität in einer flüssigen Probe, dadurch gekennzeichnet, daß man die zu untersuchende Probe mit einer Verbindung nach Anspruch 1 bis 3 bzw. einem Testmittel nach Anspruch 8 oder 9 in Kontakt bringt und den zeitlichen Verlauf der Fluoreszenzaktivität in der Probe verfolgt.
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