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DE69815060T2 - Neue potentiell fluorogene Verbindungen - Google Patents

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DE69815060T2
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DE
Germany
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compound
formula
inositol
organic
medium
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DE69815060T
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Günter Schabert
Lawrence Restaino
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Original Assignee
Biosynth AG
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Description

  • Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf neue und potentiell fluorogene Verbindungen, die fluorogen – und deshalb fluoroskopisch nachweisbar – werden, wenn sie in Kontakt mit bestimmten Mikroorganismen oder von den Mikroorganismen erzeugten Substanzen, gekommen sind, sowie auf die Verwendung dieser Verbindungen zum Nachweis und centifizierung verschiedener Bakterien.
  • Konventionelle Testverfahren zur Identifizierung von Bakterien stützen sich auf traditionelle Reaktionen ab, wie spezielle Merkmale der Säureproduktion für besondere Kohlenwasserstoffe, Produktion von Esculinase, pH-Indikatoren und Erzeugung von Wasserstoffsulfid. Solche Verfahren sind arbeitsintensiv und deshalb kostspielig.
  • Es ist bekannt, dass das Enzym mit der Bezeichnung "phosphatidylinositol-spezifische Phospholipase C" d. h. l-phosphatidyl-D-myoinositol, auch bekannt als Ino- sitolphosphohydrolase, hier abgekürzt mit PI-PLC (Enzym. Klassifikation. EC 3.1.4.10) auf dem Überstand von Kulturen verschiedener Bakterien, einschliesslich Bacillus thu- rinsiensis ebenso wie einiger pathogener Bakterien, wie Listeria monocytogenes, Listeria. ivaovii, Bacillus cereus, Staphylococous aureus und Clostridium noryl (siehe S. G. Rhee et al., Science 244 (l989) 546 ff) gefunden werden kann.
  • Vor Kurzem haben Notermans et al. (Applied and Environmetal Microbiology 57 (1991), 2655) über ein Testverfahren berichtet, bei dem PI-PLC auf oben liegende Listeria cytogenes-Kolonien mit einem besonderen Substrat, L-α-phosphatidyl-inositol, analysiert und auf trübe Halos um die Kolonie geprüft worden ist, was ein Anzeichen für die Anwesenheit des Enzyms wäre. Dies ist ein diskontinuierliches Verfahren.
  • Ein bekannter kontinuierlicher Test für PT-PLC gründet auf der Verwendung von 2-Naphthyl-myoinositol-l-phosphat als Substrat für fluorometrische Messungen der PI-PLC-Aktivität (siehe M. S. Shashidhbar, J. J. Volwerk, J. F. W. Keana, O. H. Griffith; Anal. Biochem. 198 (1991), 10). Dieses Substrat hat jedoch zwei grosse Nachteile: während 2-Naphtnol seine maximale Fluoreszenzintensität bei pH 10.4 entfaltet, hat PI-PLC einen optimalen pH-Wert bei pH 7,4 und ist oberhalb von pH 9,0 nicht aktiv.
  • Dementsprechend ist es die primäre Aufgabe der Erfindung neue und potentiell fluorogene Verbindungen anzugeben, welche die bekannten Nachteile vermeiden.
  • Der Ausdruck "potentiell fluorogen", wie er hier in Zusammenhang mit den neuen, erfindungsgemässen Verbindungen verwendet wird, bezeichnet die Fähigkeit dieser
  • Verbindungen "fluorogen"- d. h. fluoroskopisch aktiv und mit fluoroskopischen Verfahren nachweisbar bei Wechselwirkung mit Pf-PLC zu werden.
  • Weitere Aufgaben der Erfindung umfassen verbesserte Mittel zum Nachweis und Identifizierung verschiedener pathologischer Bakterien, wie der genannten Listeria.
  • Obige und weitere Aufgaben und Vorteile werden, wie aus der Beschreibung ersichtlich, mit einer ersten Ausführungsform der Erfindung durch potentiell fluorgene Verbindungen der Formel (I) verwirklicht,
    Figure 00020001
    in denen R1, R2, R3, R4 und R5 unabhängig voneinander aus Wasserstoff- oder chromogenen Substituenten gewählt sind, während X aus Hydroxyl, OR6, wobei R6 ein C1-C4-Alkyl ist, und O-Me+ gewählt ist, wobei Me+ ein Kation einer organischen oder anorganischen Base ist.
  • Ohne eine theoretische Beschränkung zu beabsichtigen, wird vermutet, dass die Wirksamkeit der Verbindungen der Formel (I) als Substrate zum Nachweis von Pf-PLC auf der Tatsache beruht, dass die Spaltung einer erfindungsgemässen Verbindung durch bakterielles PT-PLC hauptsächlich in der Bildung von inositol-l,2-zyklischem Phosphat und 4-Methylumbelliferon, das fluorogen ist, besteht.
  • Gemäss einer zweiten Ausführungsform bietet die Erfindung ein Verfahren zum Nachweis mikrobieller Aktivität in einer Probe, z. B. in der Art einer Vorauswahl, durch Kombination der Probe, mit einer Verbindung der Formel (I) oder eines Salzes hievon und Untersuchung des resultierenden Gemischs mit fluoroskopischen Mitteln.
  • Gemäss einer dritten Ausführungsform bietet die Erfindung ein Verfahren zur Identifizierung eines bestimmten bakteriellen Mikroorganismus, der phosphatidylinositol-spezifische Phospholipase-C-Enzyme erzeugen kann, durch:
    • (A) Bereitstellen einer Testprobe, in welcher der bestimmte Mikroorganismus vermutet wird;
    • (B) Die Testprobe einer Voranreicherung unterziehen;
    • (C) Kombinieren mindestens eines Teils des bei Schritt (B) erhaltenen Produkts mit einer Verbindung der Formel (I), um eine Vorauswahl zu erhalten, die eine positive fluroskopische Reaktion zeigt, falls sich in der Probe der bestimmte Mikroorganismus befindet oder das von ihm erzeugte PI-PLC darin vorkommt;
    • (D) Wenn die Vorauswahl eine positive fluoroskopische Reaktion zeigt (Schritt B), wird mindestens ein Teil des Produkts des Schritts (B) in ein Medium übertragen, das geeignet ist fur die inkulturnahme des Mikroorganismus, wobei das medium mindestens eine Verbindung enthält, die einen Farbstoff erzeugen kann, wenn sie dem Mikroorganismus ausgesetzt wird.
    • (E) Kultivieren des Mediums mit dem übertragenen Teils des Produkts zur Ausbildung mindestens einer sich verfärbenden Kolonie, welche die Färbung aufweist; und
    • (F) Zurückbehalten mindestens eines Teils der verfärbten Kolonie zur abschliessenden Identifizierung.
  • Gemäss einer weiteren Ausführungsform umfasst die Erfindung ein Substrat zum Nachweis von PI-PLC als Anzeichen für bakterielle Aktivität, wobei das Substrat mindestens eine Verbindung der Formel (I) in geeignetem Medium, wie wässriges Agar-agar, enthält.
  • Gemäss einer vierten Aufgabe umfasst die Erfindung ein Vorpräparat zum Nachweis von PI-PLC als Anzeichen für bakterielle Aktivität, wobei das Vorpräparat mindestens eine Verbindung der Formel (I) enthält.
  • Gemäss einer weiteren Aufgabe umfasst die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung einer Verbindung der Formel (I) durch Konversion einer Verbindung der Formel (IIIA) in eine Verbindung der Formel (IIIb) gemäss der Reaktion,
    Figure 00030001
    in welcher "Ins" für Inositol und G für eine HO-schützende Gruppe auf jedem Hydroxyl ausser 1-Hydroxy steht, und worin X und R1-R5 die Bedeutung haben, wie für die obige Formel (I) angegeben ist; durch das Entfernen der HO-schützenden Gruppen und op tionale Bildung eines Salzes durch Reaktion mit einer organischen oder anorganischen Base, wenn X für ein Hydroxyl steht.
  • Verbindungen der Formeln (I) und (II) – hier auch "Substrate" genannt hinsichtlich der Wechselwirkung mit einem Enzym – können in Racemform erhalten und verwendet werden, wobei solche Mischungen aufgetrennt werden können, um die Enantiomere zu erhalten. Allerdings erhält man normalerweise von den Enantiomeren keine wesentlichen Vorteile.
  • Dementsprechend wird die Verwendung von racemischen Gemischen der Verbindungen der Formeln (I) und (II) eine bevorzugte Form der Erfindung sein.
  • Beispiele geeigneter und für die erfindungsgemässe Verwendung bevorzugter organischer und anorganischer Basen in ihren verschiedenen Ausführungsformen, einschliesslich der Formel (I), aber ohne darauf beschränkt zu sein, wenn X ein Hydroxid bzw. O-Me+ ist, sind Natriumhydroxid, Kaliumhydroxid, Lithiumhydroxid, Ammoniumhydroxid, Diäthylamin, Triäthylamin, Tetramethylammoniumhydroxid, Tetraäthylammoniumhydroxid, Cyclohexylamin, Pyridin, Piperidin, Pyrrolidin, Morpholin, N-Methyl-morpholin, N-Äthyl-morpholin und p-Toluidin.
  • Eine bevorzugte Gruppe von Verbindungen der Formel (I) sind jene, deren chromogene Substituenten C1-C4-Alkylgrtippen, d. h. Methyl, Äthyl, Propyl und Butyl, sowie deren isomere Formen, optional mit einem Sauerstoffatom in der Alkylkette; C1-C4-Alkoxy; Nitro, Karboxy, C1-C4-Karboxyalkyl und Cyano sind, wobei die eben erwähnten Alkylgruppen optional ein oder mehrere Halogenatome, vorzugsweise Fluor, Chlor oder Brom, als Substituenten enthalten können; die Trifluormethylgruppe ist ein besonderes Beispiel eines bevorzugten halo-substituierten Alkyls zur Verwendung als chromogener Substituent in Formel (I).
  • Eine sogar noch bevorzugtere Gruppe der Verbindungen der Formel (I) umfasst jene, bei denen R3 ein niederes Alkyl ist, optional mit einem oder mehreren Halogenatomen, X ein Hydroxyl ist, und R1, R2, R4 und R5 Wasserstoff sind, während R3 ein niederes Alkyl oder eine Alkoxy-Gruppe ist.
  • Eine bevorzugte, speziell neuartige Verbindung der Formel (I) ist 4-Methyl-umbelliferyl-myo-inositol-l-phosphat sowie die Salze davon mit organischen oder anorganischen Basen des oben hervorgehobenen Typs, sodass die Verbindung die folgende Formel hat:
    Figure 00050001
    Eine meistens verwendete Verbindung zur Verwendung als fluorogenes erfindungsgemässes Substrat ist das N-methyl-morpholmsalz. von 4-Methylumbelliferyl-myo-inositol-1-phosphat. Der Kürze wegen wird es im Folgenden als "MeU-phos-inositol" bezeichnet. Es ist eine farblose wasserlösliche Substanz mit dem UV-Maximum (im Tris/HCl-Puffer in einem pH-Bereich von 7 bis 9) bei 314 nm mit einem Absorptionskoeffizient von ≈10800 l·mol-1·cm-1.
  • Eine erfindungsgemässe potentiell fluorogene Verbindung der Formeln (I) bzw. (II) wird bei Kontakt mit Pf-PLC stark fluorophor, was einfach festgestellt werden kann, z. B. von Hand mit einem üblichen Fluorometer, z. B. zum Betrieb bei Wellenlängen im ultravioletten Bereich, wie bei 366 nm, der Tür praktische Zwecke günstig ist. Diese einfache Nachweismethode kann erfindungsgemäss entweder als Vorauswahl und/oder als ein erster Schritt zu einem verfeinerteren Identifikationstest verwendet werden. Bei der Vorauswahl kann ein Fehlen der Fluoreszenz als "negative" Reaktion angesehen werden in dein Sinne, dass kein weiteres Testen notwendig ist und nur eine "positive" Reaktion bei den Primärproben durch weiteres Testen verifiziert werdenmuss.
  • Insbesondere hat 4-Methylumbelliferon (das von der Spaltung der Verbindung der Formel (II) durch Pf-PLC herrührt) ein Absorptionsmaximum bei 360 nm bei pH-Werten über 8, wohingegen die entsprechenden Verbindungen der Formel (I) lediglich eine vernachlässigbare Absorption bei 360 nm zeigen.
  • Mit anderen Worten, 4-Methylumbelliferon (4-Methyl-7-hydroxy-kumarin) ist ein sehr gutes Fluorogen. Grundsätzlich ist die Intensität der Fluoreszenz von 4-Methylbelliferylsubstraten bei pH 7 und pH 10 dieselbe, derweil die Fluoreszenz des Spaltungsprodukts in diesem pH-Bereich steigt. Im Allgemeinen wird die enzymatisch gespaltene Substanz vorzugsweise fluorometrisch bei pH um 9,5 nachgewiesen.
  • Bei pH 9,5 zeigen typische Substrate mit 4-Methylumbelliferon als Fluorophor Fluoreszenzemission mit Maxima um 380 nm (Anregungsmaxima bei 325 nm), wäh rend 4-Methylbelliferon sein Fluoreszenzmaximum bei 448 nm hat (Anregungsmaximum 364 nm).
  • Um sich den erfindungsgemässen Nachweisverfahren zuzuwenden, der Ausdruck "Primärprobe" wird hier zur Bezeichnung jener Stoffe verwendet, welche direkt aus der Quelle erhalten werden können, die mutmasslich physiologischen oder anderen Ursprungs sein können, wie Blut, Exkremente, infizierte Nahrungsmittel, Wasserquel-len, Getränke oder ähnliche Stoffe, welche die fraglichen Bakterien beherbergen können. Insbesondere kann die Erfindung zum Nachweis und Isolierung von Listeria, Staphylococcus und Clostridium eingesetzt werden. Eine wichtige Anwendung der Erfindung ist der Nachweis von Humanpathogenen, wie Listeria monocytogenes.
  • Bei der Verwendung einer Verbindung der Formel (I) oder (II) in einer Vorauswahl oder einem Identifikationstest für bakterielle Aktivität, für welche die Anwesenheit von PT-PLC zeugt, kann es von Vorteil sein, ein vorangereichertes flüssiges Medium zu verwenden, in das die Primärprobe übertragen wird, um die bakterielle Aktivität noch vor der fluoroskopischen Analyse zu erhöhen. Für viele Anwendungen des erfindungsgemässen Verfahrens wird die Verwendung des vorangereicherten flüssigen Mediums bevorzugt, das zusätzlich selektiv für die genannten Bakterien sein kann. Der Ausdruck "vorangereichertes flüssiges Medium", das selektiv sein kann, aber es nicht sein muss, wird von den Fachleuten auf diesem Gebiet verstanden, die in der Lage sind, das bestgeeignete vorangereicherte flüssige Medium für die genannten Bakterien auszuwählen. Grundsätzlich kann die Hemmung des Wachstums anderer, das PI-PLC-Enzym produzierender, Bakterien durch die Verwendung verschiedener Kombinationen selektiver Verbindungen inklusive Antibiotika und anderer Hemmstoffe bewerkstelligt werden und das Medium kann für jegliche Krankheitserreger, die PI-PLC enthalten oder erzeugen, spezifisch gemacht werden. Weitere spezifische Beispiele werden unten gegeben.
  • In ihren beiden Ausführungsformen, nämlich als Vorauswahl bzw. Identifikationstest, sieht die Erfindung Mittel zum Nachweis bakterieller Aktivität von Mikroorganismen mit PI-PLC-Aktivität vor, inklusive des nicht-pathogenen Bacillus thuringiensis sowie der pathogenen Bazillus cereus, Listeria monocytogenes, Listeria ivanovii, Staphylococcus aureus, Clostridium novyi, Trypanosoma brunei.
  • Wie oben ausgeführt, umfasst ein kompletter Identifikationsschritt die Verwendung einer Verbindung der Formel (I) als potentiell fluorogenes Agens als auch die Wechselwirkung mit einem potentiell chromogenen Agens. Eine Farbe wird gebildet in Gegenwart eines solchen chromogenen Agens, wenn bakterielles PJ PLC von den genannten Bakterien im Kulturmedium produziert wird, und wird die Kolonie lokalisieren.
  • Eine Gruppe von bevorzugten chromogenen Agenzien zur Farberzeugung bei Aussetzung mit PT-PLC wurde in unserer ebenfalls hängigen Patentanmeldung WO 9 38 332 beschrieben. Im Allgemeinen haben solche Agenzien die Formel
    Figure 00070001
    wobei R11 Wasserstoff oder ein C1-C4,-Alkyl ist und R7, R8, R9 und R10 Wasserstoff oder ein chromogener Substituent ist derweil R11 Wasserstoffoder C1-C4-Alkyl ist; erneut, wie im Fall der Formel (IV) können Verbindungen mit einer organischen oder anorganischen Base vom oben erwähnten Typ erfindungsgemäss verwendet werden.
  • In einer Gruppe von bevorzugten Verbindungen der Formel (IV) sind R7 und R8 Halogenatome, vorzugsweise Chlor und Brom, während R9 , R10 und R11 Wasserstoff sind; wiederum können die Salze der Verbindungen der Formel (IV) mit organischen oder anorganischen Basen des oben ausgerührten Typs als potentielle Chromophore verwendet werden, d. h. sie führen zu starken, ausgeprägten Indigo-Farbstoffen bei Spaltung mit PI-PLC, Dimerisation und nachfolgender Oxidation, insbesondere wenn R11 Wasserstoffoder Methyl(alkohol) ist und die anderen Substituenten Wasserstoff, Fluor, Chlor, Brom, Jod, Cyano, Nitro, Carboxy, substituiertes oder unsubstituiertes Amin, substituiertes oder unsubstituiertes Aminomethyl oder Sulfonyl sind.
  • Häufig bevorzugte Verbindungen der Formel (IV) für die Verwendung als erfindungsgemässe chromogene Substrate sind die Salze von 5-Brom-4-chlor-3-indoxyl-myo-inositol-1-phosphat. Das Ammoniumsalz dieser Verbindung wird der Kürze halber im Folgenden als "X-phos-inosilol" bezeichnet.
  • Ein bevorzugtes Testverfahren zur Identifizierung von Listeria monocytogenes soll nun ausführlicher erklärt werden. Es umfasst die Verwendung eines vorangereicherten flüssigen Mediums, das beschädigte Zellen von Listeria monocytogenes wiederherstellen oder wiederbeleben kann. Nachdem die Zellen wiederhergestellt worden sind, kann das flüssige Medium ein schnelleres Wachstum von Listeria monocytogenes-Zellen unterstützen. Das Medium enthält Hemmstoff(e), welche die Wiederherstellung beschädigter Zellen von Listeria monocytogenes nicht behindern werden, jedoch das Wachstum einiger Gram negativer Bakterien verhindern können, die den Listeria monocytogenes-Zellen die Nährstoffe aus dem flüssigen Medium entziehen könnten.
  • Ferner ist ein selektives angereichertes flüssiges Medium, das fluorogene Substrate vorzugsweise 4-Methylumbelliferyl-myo-inositol-phosphat der Formel (II), wie oben angegeben, enthält, mit mindestens einem Teil des vorangereicherten flüssigen Mediums angeimpft. Dieses selektive angereicherte flüssige Medium enthält Hemmstoffe, die das Wachstum anderer, das PI-PLC-Enzym enthaltender Bakterien (andere als Listeria ivanovii) und Gram positiver Bakterien, die eng verwandt mit Listeria monocytogenes sind, verhindern.
  • Nach der Inkubation wird das selektive angereicherte flüssige Medium einem UV-Fluorometer ausgesetzt (lange Wellenlänge bei 366 nm) und auf Fluoreszenz untersucht. Bei einer positiven pathogenen Reaktion ist ein mutmasslich positiver Test angezeigt, der weiteres Testen erfordert, während keine Fluoreszenz bedeutet, dass keine Listeria monocytogenes in der getesteten Probe anwesend sind (und kein weiteres Testen erforderlich ist).
  • Nach der Inkubation des selektiven angereicherten flüssigen Mediums und dem Auftreten von Fluoreszenz wird ein kleiner Teil davon, z. B. einer von einer Drahtschlinge aufgenommenen kleinen Flüssigkeitsmenge, auf ein selektives Plattenmedium gestrichen, das eine potentiell chromogene Verbindung der Formel (IV) enthält. Bei Anwesenheit von Listeria monocytogenes werden die Zellen auf dem Plattenmedium wachsen und eine Kolonie hervorbringen, welche die durch den Kontakt mit PI-PLC erzeugte Färbung der chromogenen Verbindung aufweisen wird. Vorzugsweise wird das Plattenmedium selektiv gemacht, ebenfalls um das Wachstum der anderen Bakterien, ausser Listeria ivanovii, die das PT-PLC-Enzym enthalten und Listeria, die mit Gram positiven Bakterien verwandt sind, zu hemmen, damit Listeria monocytogenes eine optimale Umgebung zur Hervorbringung einer isolierten Kolonie erhalten.
  • Bei der Verifikation der chromogenen Kolonie (z. B. für ein Substrat mit 5-Brom-4-chlor-3-indoxyl-myo-inositol-l-phosphat der Formel (IV) Listeria monocytogenes ist die Farbe der Kolonie türkis bis blau. Die Kolonie kann somit wenn erforderlich für weiteres Testen isoliert werden.
  • Das chromogene Substrat wirkt am besten auf einer festen Oberfläche da die Farbe des Chromogens im Innern der Zelle zurückbehalten wird, weswegen die Färbe des Chromogens zur Farbe der Kolonie wird. Das Chromogen ist wasser-unlöslich, was der Farbe erlaubt, in der Kolonie zu bleiben. Deshalb würde das chromogene Substrat in einem flüssigen Medium nicht wirksam, da die Farbe des Chromogens keine Farbänderung des flüssigen Mediums verursachen wird.
  • Plattenmedia mit X-phos-inositol als chromogenes Substrat weisen sehr gute Haltbarkeit auf. Nach 12 Wochen Lagerung bei 4°C ist die Farbe und Selektivität des Plattenmediums gleich wie jenes des frisch präparierten Mediums.
  • Die Listeria monocytogenes Kolonien erscheinen türkis bis blau und nach aussen gewölbt, 1,0-2,5 mm im Durchmesser ohne oder mit einem türkis bis blauen Halo.
  • Verbindungen der Formel (I) oder deren Salze können gemäss dem obigen Reaktionsschema in einem ersten Prozessschritt durch Behandlung von 4-Methylumbelliferyl-dichlorophosphat (IIIA) mit einer reaktiven Inositol-Verbindung, z. B. OH-geschiitztes Tnosito! mit einer freien Hydroxyl-Gruppe in l-Position (unten mit "G-Ins-OH" bezeichnet) gewonnen werden, um ein Zwischenprodukt zu erhalten, z. B. durch Verrühren der Reagenzien in einer organischen Base, wie Pyridin, N-methylmorpholin oder Triäthylamin, als Reaktionsmedium bei Zimmertemperatur währendmehrerer Stunden (z. B. 1-10 Std.).
  • G ist die schützende Gruppe an jedem Hydroxyl oder Inositol ausser 1-Hydroxyl; typische Beispiele für G umfassen optional substituiertes Benzyl, optional substituiertes C3-6, Alkalidin (z. B. Isopropylen, Cyclopentylidin oder Cyclohexylidin); sowie optional substituiertes Tetrahydropyranyl.
  • Im nachfolgenden Reaktionsschritt werden alle schützenden Gruppen G auf dem Zwischenprodukt entfernt, z. B. durch Hydrogenolysis oder Säurespaltung, je nach der Art der OH-schützenden Gruppen. Schliesslich kann das bevorzugte Salz durch Ion-Austausch gewonnen werden.
  • Es dürfte einleuchten, dass mit einem solchen Syntheseverfahren die neuen Verbindungen der Formel (I) in effizienter Weise und in hinreichen grossen Quantitäten hergestellt werden können, so wie es die Anwendung in Standard-Vorauswahlen erfordert.
  • Aufgrund von Tests, die mit der Lagerung von Lithiumsalz und N-methyl-morpholinsalz von 4-Methylumbelliferyl-myo-inositol-l-phosphat gemacht wurden, ist zu erwarten, dass die neuen erfindungsgemässen Verbindungen (I) über längere Zeiträume stabil sind, wenn sie in festem Zustand bei Temperaturen unterhalb von 15°C und lichtgeschützt gelagert werden.
  • Fluorogene Substrate der Formel (I) weisen eine gute Haltbarkeit in einem selektiven angereicherten flüssigen Medium auf. Gelagert in einem typischen selektiven angereicherten flüssigen Medium bei 4°C im Dunkeln betrug die Haltbarkeit des fluorogegen Substrats rund 4 Wochen.
  • Andererseits erwiesen sich die Verbindungen der Formel (I) bei Zimmertemperatur in konventionellen Pufferlösungen (Natriumzitrat, Tris/HCl) Tür einige Stunden bei pH-Werten von 5 bis 7 als nur massig stabil und bei alkalischen pH-Werten als unstabil. Die Zersetzungsgeschwindigkeit wächst mit dem pH-Wert. Bei einem pH-Wert von 8,5 ist die Spaltungsgeschwindigkeit durch PI-PLC vergleichbar mit der Zersetzungsgeschwindigkeit (Geschwindigkeiten 0,35 uMol·l-1·min-1 in l m M Lösungen). Bei pH 9 schreitet die Zersetzung schneller fort und bei pH-Werten oberhalb von 10 ist die Zersetzung extrem schnell.
  • Deshalb ist die stetige spektrophotometrische-Überwachung der Spaltung der Verbindungen der Formel (I) durch PI-PLC nicht bevorzugt.
  • Andererseits kann ein kolorimetrischer Test auf PT-PLC unter Benützung der neuen Substrate der Formel (I) bei pH-Werten im Bereich von 6 bis 7, wo Zersetzung in Pufferlösungen sehr langsam vor sich geht, effektiver durchgeführt werden. Ferner wirkt dass Enzym am besten bei pH-Werten um 7 und die Aktivität variiert nicht sehr stark zwischen pH 5 und 8,5.
  • Da die Extinktion von 4-Methylumbelliferon bei 360 nm vernachlässigbar ist bei pH 6, lässt sich das enzymatisch freigesetzte 4-Methylumbelliferon am besten in einer diskontinuierlichen Weise nachweisen.
  • Dementsprechend wird die enzymatische Spaltung der neuen Substrate der Formel (I) vorzugsweise bei pH um 6 oder 7 durchgeführt und die Menge des freigesetzten 4-Methylumbelliferons wird nach definierten Zeitabschnitten durch Erhöhung des pH-Werts einer Probe bis ungefähr 9,5 bestimmt, beispielsweise durch Zugabe einer ausreichenden Menge von 1-N-Natriumhydroxidlösung und unmittelbarer Messung der Extinktion des Anions von 4-Methylumbelliferon mit einem Spektrophotometer.
  • Gemäss dieser Ausführungsform der Erfindung werden die neuen Substrate der Formel (I), vorzugsweise das N-Methyl-morpholinsalz, für den sensitiven kolorimetri sehen Test auf PI-PLC von Bacillus cereus verwendet; schliesslich wird das Substrat in Anwesenheit von Serum Albumin verwendet, z. B. Bovine Serum Albumin (BSA).
  • Verglichen mit dem herkömmlichen, oben erwähnten Substrat 2-NIP, zeigt MeU-phos-inositol in Gegenwart von BSA bei der Spaltung mit PI-PLC eine hohe Umsatzgeschwindigkeit
  • Es ist zu erwarten, dass die neuen Substrate der Formel (I) für einen kontinuierlichen fluorometrischen Test auf PI-PLC verwendet werden können: Oblgleich die Intensität der Fluoreszenz von 4-Methyhimbelliferon ihr Maximum bei pH-Werten über 10 hat, ist die Fluoreszenz-Intensität bei pH 6 oder 7 für die Verwendung für einen sensitiven Test auf PI-PLC ausreichend.
  • Als eine Folge davon neigt das fluorogene Substrat (I) zu einer erhöhten Wirksamkeit in einem flüssigen Medium als auf einem festen Medium, wie Agar-agar, wo die Fluoreszenz aus der Kolonie ins Agar-agar-Medium durchsickern kann, was dazu fuhren kann, dass benachbarte Kolonien falsch gedeutet werden.
  • Folglich wird eine positive Reaktion (Absonderung des PI-PLC-Enzyms durch bakterielle Spezies in einem flüssigen Medium) in Gegenwart eines fluorogenen Substrats bewirken, dass das flüssige Medium Fluoreszenz als Anzeichen einer PI-PLC absondernden bakteriellen Spezies im flüssigen Medium bei einer signifikanten Zelldichte zeigt.
  • Dies ist eine mutmasslich positive Reaktion für die genannten bakteriellen Spezies (wie Listeria monocytogenes), die ferner die Isolation der bakteriellen Spezies in Form einer Kolonie auf einer festen Agar-Oberfläche bei Verwendung des chromogenen Substrats (FV) vom PI-PLC-Enzym, wie oben erläutert, garantieren.
  • Die Verwendung sowohl eines chromogenen Substrats der Formel (I) als auch eines chromogenen Substrats der Formel (IV) in einem allumfassenden Isolationsverfahren erlaubt eine mutmasslich positive Reaktion im flüssigen Medium (die Verwendung des fluorogenen Substrats) gefolgt von der Isolierung der Kolonie auf einem festen Medium unter Verwendung des chromogenen Substrats als gewissennassen einebestätigende Reaktion.
  • Die Erfindung wird nun anhand von Beispielen mit Bezügen zu den beigeschossenen Zeichnungen ausführlicher erklärt, in welchen:
    l ein Diagramm ist, das die Abhängigkeit der Extinktion (auf der Ordinate) von der Zeit (auf der Abszisse) bei verschiedenen Enzym-Konzentrationen in einer Pufferlösung bei pH 6,0 zeigt, die durch eine diskontinuierliche Messung bei einer Substrat-Konzentration von l mM erhalten wurde; und
  • 2 ein Diagramm ist, das die Geschwindigkeit der Spaltung des Substrats (Ordinate, in nMol·l-1·min-1) als Funktion der Enzymmenge zeigt (Abszisse, inNanogramm).
  • Es ist in jedem Fall zu beachten, dass die speziellen Beispiele in keiner Weise Einschränkungen der Erfindung sein sollen.
  • Beispiele
  • Bereitung neuer Substrate
  • Beispiel l: Bereitung des Lithium- und N-Methyl-morpholinsalzes von 4-Methylum-belliferyl-myo-inositol-l-phosphat
  • 2,3 : 5,6-Di-isopropyiidin-4-(4-methoxy-tetrahydropyran-4-yl-)-myo-inositol (siehe M. S. Shashidar et al., Chem. Phys. Lipids 60 (1991), 101) wurde präpariert wie in dieser Referenz angegeben.
  • Rohes 4-Methylumbelliferyl-dichlorphosphat (das annähernd ein Äquivalent Pyridin-Hydrochlorid enthält) wurde nach dem beschriebenem Verfahren für 1-Acetyl-5-brom-4-chlor-indoxyl-3-dichlorphosphat von J. P. Honvitz et. al. In J. Med. Chem. 13 (1970), 1024 bereitet.
  • Schritt 1: Bereitung von Pyridinsalz aus 4-Methylumbelliferyl [2,3:5,6-di-isopropylidin-4-(4-methoxv-tetrahvdropyran-4-vl-)-mvo-inositol]-l-phosphat
  • Rohes 4-Methylumbelliferyl-clichlorphosphat (1,80 g, was 1,28 g, 4,37 mMol der puren Substanz entspricht) wurde unter Stickstoff in trockenem Pyridin (13 ml) suspendiert und 2,3 : 5,6-Di-isopropylidin-4-(4-methoxy-tetrahydropyran-4-yl-)-myo-inositol (0,93 g, 2,48 mMol) wurde nach 20 Minuten zugefügt. Die Mischung wurde gut über Nacht gerührt.
  • Die grau-braune Lösung , die einige feste Teile enthielt, wurde in einem Eisbad gekühlt: dann wurde Wasser (4 ml) zugefügt, wobei die Temperatur auf 16°C anstieg und die festen Teile sich rasch auflösten. Nach Entfernung des Eisbades wurde Chloroform (25 ml) zugefügt. Die Lösung wurde dann weitere zehn Minuten gerührt. Die or ganische Phase wurde separiert und die wässrige Phase mit Chloroform (10 ml) extrahiert und dann ausgeschieden.
  • Die kombinierten organischen Phasen wurden zweimal mit Wasser extrahiert und die kombinierten wässrigen Extrakte dreimal mit Chloroform (10 ml) gestrippt. Die kombinierten organischen Phasen und Extrakte wurden über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und in Vakuum abgedampft. Die erhaltene gelbliche Trockenmasse wurde in Chloroform (10 ml) aufgelöst und in Vakuum rückverdampft unter Zurucklassung eines beigen kristallinen Festkörpers, der weiter in Vakuum getrocknet wurde (l,45 g, ergibt 84%). C33H42NO13P (MW = 691,67).
    400 MHz 1H-NMR (D2O) : δ 1.14 (s, 3H), 1.34 (s, 3H), 1.36 (s, 3H), 1.47 (s, 3H), 1.70-1.95 (m, 4H), 2.39 (d, 3H), 3.28 (s, 3H), 3.63 (m, 2H),3.74 (m, 2H), 3.97-4.08 (m, 4H), 4.68 (t, 1H), 4.83 (m, 1H), 6.16 (d,lH), 7.32 (dd, 1H), 7.41 (d, lH), 7.48 (d, 1H), 7.75 (t, 2H), 8.24 (t, 1H), 8.83 (d, 2H).
  • Schritt 2: Bereitung von rohem Pyridinsalz aus 4-Methylumbelliferyl-myo-inositol-1-phosphat
  • 4-Methylumbelliferyl[2,3 : 5,6-di-isopropylidin-4-(4-methoxy-tetrahydrtopyran-4-yl)-myo-inositol]-phosphat in der Form von Pyridinsalz (1,04 g, l ,5 mMol) wurde in Essigsäure/Wasser l : 1 (10 ml) suspendiert und drei Stunden bei 50°C gerührt. Die fast klare Lösung wurde in Vakuum abgedampft; das erhaltene blass gelbe Öl wurde in Wasser gelöst (8 ml) und viermal mit Äthylacetat (10 ml) extrahiert; die blass gelbe wässrige Lösung wurde gefiltert und zusammen mit Äthanol (10 ml) abgedampft. Äthanol wurde zum gelben, klaren Öl (10 ml) beigefügt; die resultierende Lösung wurde wiederum abgedampft, um das rohe Pyridinsalz als ein gelbliches Harz zu erhalten 0,68 g, ergibt 91%). C21H24NO11P (MW = 497,39)
  • Schritt 3a: Bereitung von Lihiumsalz aus 4-Methylumbelliferyl-myo-inositol-l-phosphat
  • Dowex® 50x8 Kationenaustauschharz (2,2 g) wurde in Wasser (1,6 ml) suspendiert und eine Lösung des oben erwähnten rohen Pyridinsalzes aus 4-Melhylumbelliferyl-myo-inositol-l -phosphat (0,75 g) in Wasser (4,5 ml) wurde zugefügt. Die Suspension wurde 5 Minuten gerührt und das März durch Filtration entfernt.
  • Das erhaltene blass gelbe Filtrat, eine Lösung von Lilhiumhydroxid-monohydrat (0,05 g in l ml Wasser), wurde tropfenweise beigefügt bis ein pH-Wert von 6 (ungefähr 0,72 ml wurden benötigt) erreicht war.
  • Die Lösung wurde dreimal mit Äthylacetat (6 ml) extrahiert und die wässrige Phase im Vakuum abgedampft. Das erhaltene gelbe Öl wurde in Methanol (3 ml) auf genommen und tropfenweise zu gut verrührtem Aceton (60 ml) beigefügt. Der feine Niederschlag wurde eine weitere Stunde gerührt, anschliessend über Nacht im Kühlschrank belassen. Der weissc Feststoff wurde durch Filtration eingesammelt, mit Aceton gewaschen und im Vakuum getrocknet (0,58 g, ergibt 91%).
  • Anal. Kalk. für C16H18O11Pli (MW = 424,22): C 45,30, H 4,28, P 7,30, Li 1,64; Erhalten (auf trockener Materie): C 44,51, H 4,39, P 7,13, Li 1,66, (Wassergehalt 7,7%).
    400 MHz 1H-NMR (D2O) δ 2.30 (d, 3H), 3.17 (t, lH), 3.39 (dd, lH), 3.49 (t, lH), 3.63 (t, lH), 3.95 (m, 1H) , 4.11 (t, lH), 6.13 (d, lH), 7.10 (m, 2H), 7,60 (d, 1H). UV (4 mg in 100 ml buffer Tris-HCl, pH 7): λ_max = 314 nm; ε = 10100 l mol-1 cm-1.
  • Schritt 3b: Bereitung von N-Methyl-moropholinsalz aus 4-Methylumbelliferyl-myo-inositol-1-phosphat (MeU-phos-inositol)
  • Dowex 50Wx8 Kationenaustauschharz (2,2 g) wurde in Wasser (1,6 ml) suspendiert und eine Lösung des oben erwähnten rohen Pyridinsalzes aus 4-Methylumbelliferyl-myo-inositol-1-phosphat (0,75 g) in Wasser (4,5 ml) zugefügt. Die Suspension wurde 5 Minuten gerührt und das Harz anschliessend durch Filtration entfernt.
  • Zum blass gelben Filtrat wurde tropfenweise N-methyl-morpholin (ungefähr 0,18 ml) zugefügt, bis ein pH-Wert von 6 erreicht war. Die Lösung wurde dreimal mit Äthylacetat (6 ml) extrahiert und die wässrige Phase im Vakuum verdampft. Das erhaltene gelbe Öl wurde aufgenommen in Methanol (3 ml) und tropfenweise gut gerührtes Aceton (60 ml) zugefügt. Der Niederschlag wurde eine weitere Stunde gerührt, dann über Nacht im Kühlschrank gelassen. Der weisse Feststoff wurde durch Filtration eingesammelt, mit Aceton gewaschen und in Vakuum getrocknet (0,74 g, ergibt 95%).
  • Anal. Kalk. für C21H30NO12P (MW = 519,44): C 48,56, H 5,82, N 2,70, P 5,96; Erhalten (trocken: C 48,25, H 5,93, N 2,66, P 5,90, (Wassergehalt 4,1%).
    400 MHz 1H-NMR (D2O) 8 2.32 (d, 3H), 2.75 (s, 3H), 3.03 (m, 2H), 3.17 (t, lH), 3.30 (m, 2H), 3.39 (dd, lH), 3.49 (t, lH), 3.62 (m, 2H), 3.63 (t, 1H), 3.93 (m, 2H), 3.95 (m, 1H), 4.11 (t, lH), 6.15 (d, lH), 7.11 (m, 2H), 7.62 (d, 1H). UV (4 mg in 100 ml Puffer Tris-HCl of pH 7) : λ_max = 314 nm; ε = 10900 l mol-1 cm-1.
  • Beispiel 2: Stabilität des fluorogenen Substrats in Pufferlösungen bei verschiedenen pH-Werten
  • In diesem Beispiel wurde ein Perkin-Elmer Lambda 15 Spektrophotometer für die Experimente verwendet, welche bei Zimmertemperatur (um 25°C) durchgeführt wurden.
  • Die Stabilität des neuen fluorogenen Substrats MeU-phos-inositol wurde in 3 ml Küvetten in Pufferlösungen, die 0,1% Bovine serum Albumin (BSA) unter verschiedenen pH-Bedingungen (0,1 M Natriumzitrat-Puffer von pH 5 und 6; 0,1 M Tris/HCl-Puffer von pH 7, 8 und 8,5) enthielten, untersucht, gefolgt von spektrophotometrischem Nachweis von 4-Methyl-umbelliferon hei 360 nm entweder durch kontinuierliche Messung oder (für pH-Werte < 8) durch diskontinuierliche Messung (Anhebung des pH-Werts bis 9,5), wie unten in Beispiel 3 beschrieben.
  • Die Resultate (siehe Tabelle 1) zeigen, dass das Fluorogen unter Bedingungen des Enzymtests freigesetzt wurde, wenn der pH-Wert alkalisch war. Diese nicht-enzymatische Hydrolyse erwies sich als linear, wenn sie in Abhängigkeit von Zeit und Sub trat-Konzentration aufgetragen wurde, und stieg mit steigenden pH-Werten markant an.
  • Tabelle 1: Hydrolysegeschwindigkeiten von MeU-phos-inositol
    Figure 00150001
  • Diese Ergebnisse bestätigen, dass die Geschwindigkeiten bei Zusatz von Enzymlösung (2 μl, vgl. Beispiel 3) zunimmt, was eine enzymatische Spaltung des Substrats durch Pl-PLC bei pH 8,5 anzeigt.
  • Da die Hydrolyse-Geschwindigkeiten vergleichbar oder sogar höher sind als die Geschwindigkeiten der enzymatischen Spaltung, erbringt ein Test auf PI-PLC keine nennenswerten Ergebnisse, wenn er bei alkalischen pH-Werten durchgeführt worden ist.
  • Beispiel 3: Kolorimetrisch er Test auf PI-PLC unter Verwendung von MeU-phos-inositol
  • In diesem Beispiel wurde ein Perkin-Elmer Lambda 15 Spektrophototneter für die Experimente verwendet, welche bei Zimmertemperatur (um 25°C) durchgeführt wurden.
  • Die Verfahren zum Nachweis von PI-PLC ging folgendermassen vor sich: MeU-phos-inositol wurde in 25 ml vom 0,1 M Natriumzitrat-Puffer bei pH 6,0, der 0,1% von Bovine Serum Albumin (BSA) enthielt, aufgelöst.
  • Eine Aliquote einer Stammlösung von PI-PLC (Boehringer Mannheim # 1143 069; spezifische Aktivität 600 U/mg, 5U/100 μl Lösung, entsp. 8,33 μg/100 (μl) wurde zugefügt.
  • Nach wohldefinierten Zeitabschnitten wurden 3 ml der Lösung in eine Küvetteübertragen.
  • Das enzymatisch freigesetzte 4-Methylumbelliferon wurde in die anionische Form durch Zugabe von 0,05 ml von 1-N-Natriumhydroxidlösung (pH-Wert stieg ungefähr auf 9,5) konvertiert. Die Photometer-Ablesungen bei 360 um wurden für verschiedene Enzym-Konzentrationen sofort notiert.
  • In 1 ist die Extinktion als Funktion der Zeit für verschiedene Enzym-Konzentrationen bei einer Substrat-Konzentration von l mM dargestellt. Die Spaltgeschwindigkeiten [nMol·l-1·min-1] und die spezifischen Enzym-Aktivitäten sind in Tabelle 2 dargestellt.
  • Tabelle 2: Abhängigkeit der Geschwindigkeit der Spaltung und der spezifischen Aktivität von der Enzym-Konzentration bei pH 6.0
    Figure 00160001
    Die spezifische Aktivität des neuen Substrats (bei pH 6) ist mindestens 30mal höher als im Fall des oben erwähnten herkömmlichen Substrats 2-NIP. Da die Umsatzgeschwindigkeit von PI-PLC ihr Maximum um pH 7 hat, wird sich die spezifische Aktivität bei Durchführung des Tests bei pH 7 weiter erhöhen.
  • Bei pH 6 liegt die Grenze der Nachweisbarkeit oder die Sensitivität bei einer Substrat Konzentration von l mM unter 100 ng des Enzyms.
  • Die Grenze der Nachweisbarkeit wird sogar noch tiefer sein, wenn der Test bei pH 7 durchgeführt wird. Zusätzlich kann die Substrat-Konzentration erhöht werden.
  • Eine Darstellung der Geschwindigkeiten in Abhängigkeit von der Menge des zugefügten Enzyms (vgl. 2) wies befriedigende Linearität auf.
  • Beispiel 4: Vorangereichertes flüssiges Medium zur Isolation von Listcria monocytogenes
  • Dieses Beispiel umfasst Impfung, Präparation und Wirksamkeit des vorangereicherten nüssigen Mediums. Das vorangereicherte flüssige Medium umfasst die folgenden Bestandteile:
    Proteose Pepton(von Difco) 5,0 Gramm/Liter
    Glukose 3,0 Gramm/Liter
    Trypton (von Difco) 5,0 Gramm/Liter
    Hefeextrakt (von Difco) 6,0 Gramm/Liter
    Rindfleischextrakt getrocknet(von Difco) 5,0 Gramm/Liter
    Natriumphosphat (dibasisch) 9,6 Gramm/Liter
    Kaliumphosphat (monobasisch) 1,35 Gramm/Liter
    Natriumpyruvat 10,0 Gramm/Liter
    Nalidixische Säure (von. Sigma) 0,03 Gramm/Liter
  • Alle Komponenten wurden gelöst in l Liter Wasser (deionisiert oder destilliert). Ein Hütchen wurde oben auf dem Behälter platziert und die Inhalte des Formkastens wurden 15 Minuten bei 121°C autoklaviert.
  • Das flüssige Medium wurde auf Raumtemperatur gekühlt. Die Haltbarkeit des flüssigen Mediums wurde 12 Wochen lang bei Zimmertemperatur entweder im Hellen oder Dunkeln aufrecht gehalten. Zum Nachweis von Listeria monocytogenes wurden die Proben mit dem vorangereicherlen flüssigen Medium im Verhältnis 1 : 10 re-hydriert und ausgiebig vermischt. Das angeimpfie vorangereicherte flüssige Medium wurde während 22-24 Stunden bei 30°C inkubiert.
  • Das flüssige Medium ist selektiv, indem es das Wachstum verschiedener Gram negativer Bakterien (diese Bakterien könnten schneller wachsen als Listeria monocytogenes m flüssigem Medium) und einiger Gram positiver Bakterien (aufgeführt in Tabel le 3) nicht zulässt ohne dabei die Wiederherstellung beschädigter und nachfolgendes Wachstum von Listeria monocytogenes-Zellen zu verhindern (vgl. Tabelle 4).
  • Tabelle 3: Hemmung verschiedener bakterieller Stämme im vorangereicherten flüssigen Medium mit 30 mg/liter nalidixischer Säure
    Figure 00180001
    Tabelle 4: Wiederherstellung beschädigter Listeria monocytogenes Zellen im vorangereicherten flüssigen Medium
    Figure 00190001
  • Beispiel 5: Impfung, Präparation und Wirksamkeit des selektiven vorangesicherten flüssigen Mediums
  • In diesem Beispiel verhinderte das selektive angereicherte flüssige Medium das Wachstum besonderer Bakterien ausser für die Gattung Listeria und nahm ein fluorogenes PI-PLC-Substrat zur Erzielung einer mutmasslich positiven Reaktion der Listeria monocytogenes and Listeria ivanovii auf, was sich in einer Fluoreszenz (festgestellt von einem in der Hand gehaltenen UV Fluorometer – 366 nm) nach der Inkubation bei 35°C während 24 bis 48 Stunden äusserte.
  • Das Wachstum anderer, das PI-PLC-Enzym enthaltender, Bakterien wurde im selektiven angereicherten flüssigen Medium verhindert, wodurch eine exzellente Spezifizität für Listeria monocytogenes in einem Fluoreszenzrohr nach der Inkubation erzielt werden konnte.
  • Unter den Listeria-Arten können einzig die pathogenen Listeria monocytogenes und Listeria ivanovii Fluoreszenz im selektiven angereicherten flüssigen Medium nach der Inkubation entwickeln, wie in Tabelle 5 dargestellt.
  • Zusammensetzung des seleletiven angereicherten flüssigen Mediums:
    Proteosepepton (von Difco) 4.0 Gramm/Liter
    Hefeextrakt (von Difco) 7.0 Gramm/Liter
    Trypton (von Difco) 10.0 Gramm/Liter
    Casamino Säuren (von Difco) 6.2 Gramm/Liter
    Glukose 3.1 Gramm/Liter
    Kaliumphosphat (dibasisch) wasserfrei (von Sigma) 4.5 Gramm/Liter
    Lithiumchlorid (von Sigma) 7.5 Gramm/Liter
  • Alle Ingredienzen wurden in l Liter Wasser (destilliert oder deionisiert) aufgelöst, verteilt auf Mengen von 10 ml und 15 Minuten lang bei 121°C autoklaviert.
  • Zusatzstoffe:
    Bovine Albumin (Bayer 82-067) 4.0 Gramm/Liter
    Ceftazidimpentahydrat (ex Glaxo Wellcome) 0.035 Gramm/Liter
    4-Methylumbelliferyl-myo-inositol--1-phosphat, N-methylmorpholinsalz 0.4 Gramm/Liter
  • Die Zusatzstoffe wurden aseptisch in insgesamt 30 ml sterilem, destilliertem oder deionisiertem Wasser gelöst und aseptisch zum obigen Medium beigefügt (0,3 ml pro 10 ml basalen Mediums).
  • Die Haltbarkeit des selektiven angereicherten flüssigen Mediums bei 4°C im Dunkeln betrug 4 Wochen. Tabelle 5: Fluorogene Reaktion verschiedenener Listeria- Arten im selektiven angereicherten flüssigen Medium nach der Inkubation bei 35°C, 24 Stunden, lang
    Listeria Arten Fluorogene Reaktion
    Listeria monocytogenes 4 b helle Fluoreszenz, die sich im Reagenzglas teilweise nach oben erstreckte
    Listeria monocytogenes 1/2 b helle Fluoreszenz, die sich im Reagenzglas teilweise nach oben erstreckte
    Listeria monocytogenes ATCC 43249 helle Fluoreszenz, die sich im Reagenzglas teilweise nach oben erstreckte
    Listeria monocytogenes 3 a helle Fluoreszenz, die sich im Reagenzglas teilweise nach oben erstreckte
    Listeria innocua Keine Fluoreszenz; gleich wie beim ungeimpften Kontroll-Rea genzglas mit dem selektiven angereicherten flüss. Medium
  • Dieses Beispiel illustriert die Präparation, Impfung, Wirksamkeit, und Haltbarkeit eines erfindungsgemässen festen Plattenmediums. Zusammensetzung von Platten-Agar:
    Proteosepepton (von Difco) 3.0 Gramm/Liter
    Trypton (von Difco) 12.0 Gramm/Liter
    Casamino Säuren (von Difco) 6.0 Gramm/Liter
    Lab-Lemco-Pulver (von Oxoid) 5.0 Gramm/Liter
    Glukose 2.5 Gramm/Liter
    Hefeextrakt (von Difco) 8.0 Gramm/Liter
    Kaliumphosphat (dibasisch) 4.5 Gramm/Liter
    Lithiumchlorid (von Sigma) 4.5 Gramm/Liter
    Agar-Agar (von Difco) 15.0 Gramm/Liter
  • Sämtliche Zutaten wurden in 970 ml Wasser (destilliert oder deionisiert) gelöst und 15 Minuten bei 121°C autoklaviert.
  • Zusatzstoffe:
    Bovine Albumin (Bayer 82-067) 3.0 Gramm/Liter
    Ceftazidim pentahydrat (von Glaxo Wellcome) 0.035 0.035 Gramm/Liter
    5-Brom-4-chlor-3-indoxyl-myo-inositol-l-Phosphat, Ammoniumsalz 0.3 0.3 Gramm/Liter
  • Die Zusatzstoffe wurden aseptisch in insgesamt 30 ml sterilen destilliertem oder deionisiertem Wasser aufgelöst und dem obigen Medium nach Kühlung in einem Wasserbad auf 50-55°C aseptisch beigerügt.
  • Das komplette Medium wurde in Petri-Schalen gegossen und die Oberfläche trocknete bei zweitägiger Lagerung der Platten im Dunkeln bei Zimmertemperatur. Überzählige Platten können bei 4°C im Dunkeln bis zu 12 Wochen gelagert werden und immer noch wie frisch begossene Platten funktionieren.
  • Das Plattenmedium wurde angeimpft durch Verwendung einer Drahtschlinge voll Flüssigkeit aus einem fluoreszierenden selektiven angereicherten flüssigen Medium zum Bestreichen auf dem Agar, um die Isolierung von Listeria monocytogenes-Kolonien zu erleichtern.
  • Das Plattenmedium wurde 48 Stunden lang bei 35°C inkubiert. Die Kolonien, die nach der Inkubation die folgenden Merkmale aufwiesen, wurden mutmasslich für Listeria monocytogenes gehalten und weitere Tests mit Standardmethoden zum Nachweis von Listeria monocytogenes waren angesagt: türkis bis blaue Farbe, nach aussen gewölbt, 1,0-2,5 mm im Durchmesser ohne oder mit einem türkis bis blaue Halo um die Kolonie herum.
  • Tabelle 6 listet die koloniebezogenen Merkmale einer Vielzahl von Bakterien auf einem selektiven/differentiellen Plattenmedium nach der Inkubation auf.
  • Die türkis bis blaue Farbe der Listeria monocytogenes-Koloniec war ein Indiz für die Anwesenheil des PI-PLC-Enzyms unter Ausbildung des tief verfärbten, wasserunlöslichen 5,5-dibrom-4,4-dichor-indigo-Komplexes, der in der Kolonie zurückbehalten wurde und nicht ins Medium hinaus diffundierte. Dieser unlösliche Komplex lässt ein festes Medium geeigneter erscheinen als ein flüssiges Medium.
  • Tabelle 6: Koloniale Morphologien verschiedener Bakterien auf dem selektiven Plattenmedium, das das chromogene Substrat (X-phos-inositol) enthält und 48 Stunden lang bei 35°C inkubiert wurde
    Figure 00230001
  • Figure 00240001
  • Es ist zu bemerken, dass obwohl die oben gegebenen Beispiele MeU-phos-inositol und X-phos-inositol, die bevorzugten Substrate der Formeln (I) bzw. (IV), berücksichtigen, aus den allgemeinen Enthüllungen oben augenscheinlich ist, class sehr ähnliche Resultate mit anderen Substraten der Formeln (I) bzw. (IV) erhalten werden können. Deshalb dürften verschiedene Modifikationen der oben gegebenen Beispiele offensichtlich sein.
  • Grundsätzlich bietet die Erfindung eine sichere, sensitive und kommerziell lebensfähige Nachweismöglichkeit potentiell pathogener bakterieller Aktivität von Mikroben wie Staphylococcus aureus- und verschiedener Listeria monocytogenes- und Listeria ivanovii-Stämme in potentiell infizierten Materialien sowie physiologischen Proben oder Konsunigütern wie Esswaren und Getränken. Der Anwendungsbereich derErfindung ergibt sich aus den folgenden Ansprüchen.

Claims (17)

  1. Potentiell fluorogene Verbindung der Formel (I):
    Figure 00250001
    m der R1, R2, R3, R4 und R5 unabhängig voneinander gewählt sind aus Wasserstoff- und chromogenen Substituenten und X gewählt ist aus Hydroxy; OR6, wobei R6 ein C1-C4-Alkyl ist; und O-Me+ wobei Me+ ein Kation einer organischen oder anorganischen Base ist.
  2. Verbindung nach Anspruch 1, bei der die Base gewählt ist aus Natriumhydroxid, Kaliumhydroxid, Lithiumhydroxid. Ammoniumydroxid, Diethylamin, Triethylamin, Tertraethylammoniumhydroxid, Tetraethylammoniumhydroxid, Cyclohexylamin, Pyridin, Piperidin, Pyrrolidin, Morpholin, N-Methylmorpholin, N-Ethylmorpholin und p-Toluidin.
  3. Verbindung nach Anspruch 1, bei der die chromogenen Substituenten gewählt sind aus C1-C4-Alkyl, das in der Alkylkette ein Sauerstoffatomenthalten kann C1-C4-Alkoxy, Nitro, Carboxy, C1-C4-Carboxyalkyl und Cyano, wobei jede Alkylgruppe als Substituenten ein oder mehrere Halogenatome enthalten kann, z. B. wie in Trifluormethyl.
  4. Verbindung nach Anspruch l, bei der R3 ein Niederalkyl ist, das ein oder mehrere Halogenatome enthalten kann, X Hydroxyl ist, und R1, R2, R4 und R5 Wasserstoffatome sind, sowe die Salze dieser Verbindung mit einer organischen oder anorganischen Base.
  5. 4-Methylumbelliferyl-myoinosit-)-phosphat und die mit einer organischen oder anorganischen Base gebildeten Salze dieser Verbindung.
  6. Verfahren zum Nachweis mikrobieller Aktivität in einer Probe, das folgende Schritte umfasst: (i) Kombinieren der Probe mit einer Verbindung der Formel (I) nach einem der Ansprüche l-5, und (ii) fluoroskopische Untersuchung der mit der Verbindung der Formel (I) oder einem Salz hievon vereinigten Probe.
  7. Verfahren nach Anspruch 6, bei dem die Probe mit einem vorangereicherten flüssigen Medium behandelt wird, um die Aktivität vor Schritt (i) zu vergrössem.
  8. Verfahren nach Anspruch 7, bei dem das vorangereicherte flüssige Medium für Mikroben selektiv ist, welche diese Aktivität besitzen.
  9. Verfahren nach einem der Ansprüche 6-8 zur Verwendung als Screeningtest für den Nachweis von Bakterien, der Gruppe Listeria. Staphylococcus und Clostridium.
  10. Verfahren zum Identifizieren eines Mikroorganismus, der phosphatidyl-inositol-spezifisches Phospholipase-C-Enzym erzeugen kann, welches Verfahren folgende Schritte umfasst: (A) Bereitstellen einer Testprobe, in welcher der Mikroorganismus vermutetwird; (B) Voranreicherung der Testprobe; (C) Vereinigen mindestens eines Teils des in Schritt (B) erhaltenen Produkts mit einer Verbindung gemäss einem der Ansprüche l-5, um eine Screeningprobe zu erhalten, die bei Anwesenheit des genannten Mikroorganismus in der Testprobe ein positives fluoroskopisches Verhalten zeigt; (D) Übertragung mindestens eines Teils des in Schritt (B) erhaltenen Produkts - sofern die Screeningprobe ein positives fluroskopisches Verhalten zeigt - in ein Medium, das sich zum Kultivieren des Mikroorganismus eignet, wobei das Medium mindestens eine Verbindung enthält, die bei Anwesenheit des Mikroorganismus zur Erzeugung einer Farbe befähigt ist;. (E) Kultivieren des Mediums mit dem übertragenen Teil des Produkts zur Entwicklung mindestens einer Kolonie, welche die Farbe aufweist; und (F) Gewinnung mindestens eines Teils der gefärbten Kolonie für eine endgültige Identifizierung.
  11. Verfahren nach Anspruch 10, bei dem die mindestens eine Verbindung, die bei Gegenwart des Mikroorganismus eine Farbe erzeugt, eine Verbindung der Formel (IV)
    Figure 00270001
    ist, in der R10 gewählt ist aus Wasserstoff und C1-C4-Alkyl, wie Methyl, Ethyl, Propyl oder Butyl, und R6, R7, R8 und R9 gewählt sind aus Wasserstoff und chromogenen Substituenten, oder ein Salz der Verbindung der Formel (TV) mit einer organischen oder anorganischen Base und Sulphonyl.
  12. Verfahren nach Anspruch 11, bei dem R6 und R7 Chlor oder Brom sind, R8 und R9 Wasserstoff sind und R10 Wasserstoff ist und/oder worin die Verbindung der Formel (IV) als Salz mit einer organischen oder anorganischen Base vorliegt.
  13. Verfahren nach einem der Ansprüche 10-12, bei dem die Mikroorganismen Bakterien aus der Gruppe Listeria, Staphylococcus und Clostridiumsind.
  14. Substrat zur Bestimmung eines phosphatidyl-inositol-spezifischen Phospholipase-C-Enzyms als Nachweis bakterieller Aktivität, wobei das Substratmindestens eine Verbindung gemäss einem der Ansprüche l-5 enthält.
  15. Ausrüstung zur Bestimmung eines phosphatidyl-inositol-spezifischen Phospholipase-C-Enzyms als Anzeichen bakterieller Aktivität, wobei die Ausrüstung mindestens eine Verbindung der Formel (I) gemäss einem der Ansprüche l-5 enthält.
  16. Ausrüstung nach Anspruch 15, die außerdem mindestens eine Verbindung der Formel (IV) nach einem der Ansprüche 11 oder 12 enthält.
  17. Verfahren zur Herstellung einer Verbindung gemäss einem der Ansprüche l-4, gekennzeichnet durch Umwandlung einer Verbindung der Formel (IIb) gemäss der Reaktion
    Figure 00280001
    in der Ins Inositol und G eine HO-Schutzgruppe an jeder Hydroxylgruppe des Inosilols, mit Ausnahme der 1-Hydroxygruppe bedeutet, und wobei X und R1-R5 die in den Ansprüchen l- 4 angegebene Bedeutung haben, Entfemen der HO-Schutzgruppen und gegebenenfalls Bildung eines Salzes durch Umsetzung mit einer organischen oder anorganischen Base, wenn X Hydroxyl bedeutet.
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