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DE3147726A1 - Antibiotische komplexe, verfahren zu ihrer herstellung und pharmazeutische mittel, die diese verbindungen enthalten - Google Patents

Antibiotische komplexe, verfahren zu ihrer herstellung und pharmazeutische mittel, die diese verbindungen enthalten

Info

Publication number
DE3147726A1
DE3147726A1 DE19813147726 DE3147726A DE3147726A1 DE 3147726 A1 DE3147726 A1 DE 3147726A1 DE 19813147726 DE19813147726 DE 19813147726 DE 3147726 A DE3147726 A DE 3147726A DE 3147726 A1 DE3147726 A1 DE 3147726A1
Authority
DE
Germany
Prior art keywords
complex
methanol
group
cbs
ethanol
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
DE19813147726
Other languages
English (en)
Inventor
Henning Otto Bojsen 2840 Holte Lorck
Poul Rodbroe 3600 Frederikssund Rasmussen
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Leo Pharma AS
Original Assignee
Leo Pharmaceutical Products Ltd AS
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Leo Pharmaceutical Products Ltd AS filed Critical Leo Pharmaceutical Products Ltd AS
Publication of DE3147726A1 publication Critical patent/DE3147726A1/de
Withdrawn legal-status Critical Current

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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P1/00—Preparation of compounds or compositions, not provided for in groups C12P3/00 - C12P39/00, by using microorganisms or enzymes
    • C12P1/02—Preparation of compounds or compositions, not provided for in groups C12P3/00 - C12P39/00, by using microorganisms or enzymes by using fungi
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/14—Fungi; Culture media therefor
    • C12N1/145—Fungal isolates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23K—FODDER
    • A23K20/00—Accessory food factors for animal feeding-stuffs
    • A23K20/10—Organic substances
    • A23K20/195—Antibiotics
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/645—Fungi ; Processes using fungi

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  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines Containing Plant Substances (AREA)

Description

PROF. DR. DR. J. REITSTÖTTER DR. WERNER KINZEBACH
DR. ING. WOLFRAM BUNTE (,β8β-ιβ7β)
REITSTÖTTEH. KINZEBACH ft PARTNER POSTFACH 7ΘΟ. D-BOOO MÜNCHEN 43
PATENTANWÄLTE ZUGELASSENEVERTRETER BEIM EUROPÄISCHEN PATENTAMT EUROPEAN PATENT ATTORNEYS
VNR 104 523
TELEFON: (OBB) 2 71 IB 83 TELEX: ΟΕΖ102ΟΘ ISAR D BAUERSTRASSE 22. D-BOOO MÜNCHEN AO
BETREFF: RE
2. Dezember 1981
UNSERE AKTE:
OURREF: M/2 2 261
LEO PHARMACEUTICAL PRODUCTS LTD. A/S (L0VENS KEMISKE FABRIK PRODUKTIONSAKTIESELSKAB) Industriparken 55
-DK-2750 Ballerup
Antibiotische Komplexe, Verfahren zu ihrer Herstellung und pharmazeutische Mittel, die diese Verbindungen
enthalten
POSTANSCHRIFT; D-BCXXJ MÜNCHEN 43. POSTFACH 78Ο
Μ/22 261 ~8~
Die Erfindung betrifft antibiotisch wirkende Verbindungen und insbesondere einen antibiotisch wirkenden Komplex, der eine Gruppe nahe verwandter Verbindungen umfaßt. Dieser Komplex wird in der vorliegenden Anmeldung als Komplex PR-1350 oder einfach PR-1350 bezeichnet.
' Dieser Komplex weist interessante Eigenschaften auf "bezüglich seiner Verwendung in der Human- und Tiermedizin und als Futtermittelzusatz.
Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Herstellung von PR-1350, pharmazeutische Mittel, die PR-1350 enthalten, Verfahren zur Herstellung solcher Mittel und die Verwendung von PR-1350 zur Behandlung von Menschen und Tieren. Die Erfindung betrifft auch Stämme die PR-1350 produzieren und deren Mutanten.
Der antibiotisch wirkende Komplex PR-1350 wird von einem Pilz produziert, der im Zusammenhang mit der Gewinnung von Antibiotika produzierenden Pilzen in den Laboratorien der Anmelderin von einer infizierten Agar-Platte isoliert wurde. Der Organismus wurde taxonomisch vom Centraal-
3^ bureau voor Schimmelcultures, Baarn, Niederlande, als neuer Stamm von Oidiodendron truncatum Barron klassifiziert und dort unter der Bezeichnung Oidiodendron truncatum Barron, HL-972, ZP-88 unter der Nummer
CBS 475.78 hinterlegt.
35
3U7726
Μ/22.261 -9-
Oidiodendron gehört zur Gruppe der Fungi imperfecti. Nach N. F. Buchwald in Fungi Imperfecti und unter Verwendung der Klassifizierungsmethode von Saccardo gehört die Gattung Oidiodendron zu der Familie der Dematiaceae und zu der Ordnung Hyphomycetales.
Oidiodendron truncatum Barron HL-972, ZP-88 züchtet man in wäßrigem Nährmedium unter submersen aeroben Bedingungen, bis man einen bestimmten Grad an antibiotischer Aktivität erhält. Zur Herstellung von kleinen Mengen des Pilzes kann man auch Oberflächenkulturen und Schüttelkolben verwenden. D'er Stamm wird in einem Nährmedium gezüchtet, das als"Kohlenstoffquelle beispielsweise ein assimilierbares Kohlenhydrat, und als Stickstoffquelle,'beispielsweise eine assimilierbare Stickstoffverbindung oder ein proteinhaltiges Material enthält. Bevorzugte Kohlenstoff lieferende Verbindungen sind Glucose, Saccharose, Glycerin, Malzextrakt, Dextrin, und dergleichen. Bevorzugte Stickstoff liefernde Substanzen sind Maisquellwasser, Hefe, autolysierte Bierhefe, Sojabohnenmehl, Baumwollsamenmehl, Fischmehl, Maismehl, Milch-Feststoff, pankreatisch angedautes Casein, Brennereischlempe, tierische Peptonliquors, Fleisch- und Knochenmasse, und dergleichen. Vorteilhafterweise werden Kombinationen dieser kohlenstoff- und stickstoff-liefernden Substanzen verwendet. Es können auch rein "synthetische" Mediaverwendet werden, sie haben jedoch häufig niedrige Ausbeuten zur Folge. Es ist nicht notwendig, Spurenmetalle, beispielsweise Zink, Magnesium, Mangan, Kobalt, Eisen und dergleichen, dem Fermentationsmedium zuzugeben, da vor der Sterilisierung des Fermentationsmediums Leitungswasser und nicht-gereinigte Ingredienzen als Bestandteile des Mediums verwendet werden.
M/22 261 10
Die Herstellung des erfindungsgemäßen Komplexes kann bei jeder Temperatur durchgeführt werden, die dem zufriedenstellenden Wachstum der Mikroorganismen förderlich ist, beispielsweise bei Temperaturen zwischen ungefähr 12 und 35 C, insbesondere zwischen ungefähr • 14 und 30 C und vorzugsweise zwischen ungefähr 16 und 24 0C. Den pH des Mediums hält man ebenfalls bei Werten, die dem Wachstum der Mikroorganismen': förderlich sind, beispielsweise bei Werten zwischen 4,0 und 8,0, vorzugsweise zwischen "5,0 und 7,0. In Abhängigkeit vom Nährmedium und den Fermentationsbedingungen'erfolgt die optimale Herstellung des Komplexes normalerweise in ungefähr 2 bis 10 Tagen.
Zur Züchtung der Pilze in großen Fermentern verwendet man zum Animpfen statt der Sporenform vorzugsweise die vegetative Form der Mikroorganismen, um die Produktion nicht zu verzögern und die Apparatur voll auszulasten. Demnach ist es wünschenswert, ein vegetatives Inoculum in einer Nährkultur durch Animpfen dieser Nährkultur mit einem aliquoten Teil einer Schrägkultür herzustellen.
Hat man auf diese Weise junges, aktives, vegetatives Impfmaterial erhalten, überführt man es aseptisch in große Fermenter. Das Medium, in dem das vegetative Impfmaterial hergestellt wird, kann gleich oder verschieden von dem Medium sein, das zur Produktion der erfindungsgemäßen Verbindungen benützt wird, solange die Mikroorganismen darin zufriedenstellend wachsen.
Obwohl das erfindungsgemäße mikrobiologische Verfahren unter Verwendung des Stammes Oidiodendron truncatum Barron HL-972 ZP-88, CBS-475.78 im einzelnen beschrieben ist, ist es nicht auf die Verwendung dieses Mikroorganismus begrenzt.
3U7726
M/22 261 11~
Erfindungsgemäß können auch andere Stämme oder Mutanten obigen die nach bekannten Verfahren hergestellt werden können, beispielsweise indem man die neuartigen Microorganismen der Einwirkung von Röntgen- oder UV-Strahlen, Stickstofflost, Phagen und dergleichen aussetzt.
Weitere Oidiodendron truncatum Barron-Stämme sind bekannt und stehen zur Verfügung, ihre Fähigkeit Antibiotika zu bilden war bislang jedoch unbekannt. Es konnte nun gezeigt werden, daß diese Stämme bei Anwendung der richtigen Fermentierungsbedingungen den erfindungsgemäßen Komplex PR-1350 produzieren.
15
Diese Stämme sind beim Centraalbureau voor Schimmelcultures, Baarn, Niederlande unter den Nummern CBS 629.70, CBS 222.65, CBS 115.65 und CBS 114.65 erhältlich.
im Anschluß an die Herstellung des Komplexes PR-1350 kann eine große Zahl an Verfahren, beispielsweise Lösungsmittelextraktion, Verteilungschromatographie, Chromatographie an Kieselgel, flüssig-flüssig Verteilung in einer Craig Apparatur, Absorption an Harzen, Kristallisation aus Lösungsmitteln und andere, bei Fermentierungen häufig verwendete Verfahren, zur Isolierung und Reinigung der erfindungsgemäßen Verbindungen verwendet werden. Da die Hauptmenge der antibiotischen Aktivität in der Nährbrühe vorhanden ist, besteht ein bevorzugtes Verfahren zur Gewinnung der erfindungsgemäßen Verbindungen darin, daß man das Fermentationsmedium filtriert und den Wirkstoff an einem macroreticularen Harz, wie Amberlite^ XAD-2 oder Diaion^ HP-20, bei einem pH-Wert zwischen 2 und 10 absorbiert, den Wirkstoff anschließend mit einem organischen Lösungsmittel eluiertund das Lösungsmittel im Vakuum verdampft. Für dieses Verfahren ist Methanol ein besonders bevor-
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M/22 261 -12-
/.ugtes Eluierüngsmittel. Alternativ kann der Komplex PR-1350 aus der Nährbrühe mit einem geeigneten organischen Lösungsmittel bei einem pH-Wert zwischen 2 und 10 extrahiert werden. Den Extrakt behandelt man dann mit einem Trocknungsmittel und engt ihn ein, wobei man das Rohprodukt erhält. Lösungsmittel mittlerer Polarität, wie Äthyläther, Äthylacetat, Benzol oder Chloroform, sind für die Extraktion bevorzugt.
PR-1350 Der erfindungsgemäße Komplex .kann weiter durch Chromatographie, beispielsweise an Diaioir=^ HP-20 unter Verwendung von beispielsweise Methanol-Wasser-Mischungen als Eluierüngsmittel, oder an Sephadex ^ LH-20 unter Verwendung von beispielsweise Methanol oder Chloroform-Methanol-Hexan-Mischungen als Eluierüngsmittel, gereinigt werden.
antibiotische
Der/Komplex PR-1350 ist ein farbloser, amorpher Feststoff, dessen Elementaranalyse das Fehlen von Stickstoff, Phosphor, Schwefel, Chlor und Brom im Molekül ergibt.
Der stärkste Peak im Feld-Ionisations-Massenspektrum liegt bei m/e 3 66. Die hoch auflösende Stoßionisationsmassenspektrometrie ergibt für diesen Peak die Formel C0^H0nO,. Weitere starke Peaks des Massenspektrums sind
ZU J U D
in der nachfolgenden Tabelle A aufgezählt. 30
M/22 261 -13-
Tabelle A
Charakteristische Peaks des Stoßionisations-Massen-Spektrums des Komplexes PR-1350
m/e Formel
366 C20H30°6
205 15
161 159, 149 147
145 135 133 131 121 119 109 107 105 95 93 91 81
204 C14H20°
189 C14H21 und
187 175
3U7726
M/22 261 14~
m/e
79 77 69 67 55 44 41
PR-1350
Der erfindungsgemäße Komplex/ist in üblichen organischen Lösungsmitteln, wie Äthylacetat, Äthyläther, Benzol, Äthanol, Methanol, Chloroform und dergleichen löslich, er ist relativ unlöslich in Wasser und unlöslich in gesättigten Kohlenwasserstoffen.
Eine Lösung des Komplexes PR-1350 in Äthanol weist ein UV- Maximum, λ. max, bei 230 nm (E1 = 304)auf.
ι cm
Figur 1 zeigt das IR-Spektrum des erfindungsgemäßen Komplexes (KBR-Preßling), in Tabelle B und C sind
1 die charakteristischen Signale des H und C-NMR-Spektrums zusammengestellt. Die NMR-Spektren wurden an einem JEOL FX 100 Spektrometer bei 99,6 MHz aufgenommen, die erfindungsgemäßen Verbindungen wurden in einer 10 %-igen Lösung in Deuterochloroform oder Deuteroaceton vermessen. Die chemische Verschiebung ist in ppm (δ-Skala) unter Verwendung von Tetramethylsilan als Standard angegeben.
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Tabelle B
Charakteristische Signale des H-NMR-Spektrums des Komplexes PR-1350 (in Deuteroaceton) 10
Chemische Multiplizität relative
Verschiebung Intensität
9.28 S 1
6.63+) breit, t 1
2.41 m 2
1.77 m
1.21 S
0.96 S
+ ) Dieses Signal erscheint bei 6.54,-wenn das Spektrum
von einer Lösung des Komplexes in Deuterochloroform 25 aufgenommen wird.
M/22 261 ~16
Tabelle C
1 Charakteristische Signale des - C-NMR-Spektrums des
Komplexes PR-1350 (in Deuterochloroform)
Chemische Verschiebung Multiplizität
193.8 d
151.9 s
151.5 d
44.1 37.6 36.3 29.3 28.6 25;9 21.6 17.8 15.8
Die optische Drehung des erfindungsgemäßen KomplexesPR-1350 "25 kann sich nach Herstellung der Lösung noch einige Stunden ändern, wobei der Anfangswert von der Isolierungsmethode des Komplexes abhängt. Der Endwert wird von solchen Faktoren nicht beeinflußt. Charakteristische Werte für zwei verschiedene Chargen des erfindungsgemäßen Komplexes sind in Tabelle D zusammengestellt.
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-17-
Tabelle D
Spezifische Drehung des Komplexes PR-1350 (c. 1, Äthanol)
Zeit nach Herstellung der Lösung (Stunden)
[α]
Charge A
0 1 2 3
+ 82.1 ■1-85.6 + 86.5 + 86.6 + 86.6
Charge B
0 1 2 3 4
+ 72.0 +80.0 +85.0 +85.5 + 85.6
PR-13'50 Die Komponenten des erfindungsgemäßen Komplexes /Können durch Chromatographie an Cephadex LH-20 unter Verwendung von Chloroform-Methanol-Hexan (65:10:25) als Eluierungsmittel getrennt werden. Durch wiederholte Chromatographie ( Einzelheiten sind in Beispiel 9 beschrieben) kann gezeigt werden, daß die getrennten Komponenten beim Stehen in Lösung sich rasch wieder in den Komplex umwandeln.
LQst man den erfindungsgemäßen Komplex in Methanol und stellt die Lösung wenige Tage in den Kühlschrank, fällt ein kristallines Hemiacetal aus. Diese Verbindung ist ebenfalls Gegenstand der vorliegenden Erfindung und wird als Komplex PR-1381 bezeichnet. Er weist einen
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Schmelzpunkt von 139 bis 141 G und ein UV-Maximum bei
230 nm (e!% =310; Äthanol) auf. 1 cm
Figur 2 zeigt das IR-Spektrum (KBr-Pressling) dieses Komplexes.
Feldionisations- und Elektronenstoß-Massenspektren des Komplexes PR-1381 sind identisch mit denen des Komplexes PR-1350.
ι Die charakteristischen Signale des H-NMR-Spektrums, das unmittelbar nach Auflösen von PR-1381 in Deuterochloroform aufgenommen wurde, sind in Tabelle E zusammengestellt. . -
Läßt man die Deuterochloroformlösung bei Raumtemperatur stehen, verschwinden die ursprünglich erhaltenen Signale allmählich. Gleichzeitig wird Methanol aus dem Molekül freigesetzt. Nach 10 Stunden schließlich beobachtet man ein NMR-Spektrum, das bis auf ein zusätzliches Signal bei 5 = 3.48, das wahrscheinlich auf das während der Umwandlung von PR-1381 in PR-1350 freigesetzte Methanol zurückzuführen ist, identisch mit dem NMR-Spektrum des Komplexes PR-1350 ist.
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Tabelle E
Charakteristische Signale des H-NMR-Spektrums von PR-1381, unmittelbar nach Herstellung einer Lösung in Deuterochloroform aufgenommen
Chemische Ver Multiplizität relative In
schiebung tensität
9, 28 S 1
6,54 t 1
5,31 breit, s .1
4,58 t 1
. 3,40 S 3
3,25 d (J=4.5) 1
2,82 d (J=4.5) 1
2,35 m 2
1,77 m
1,21 S 3
1,00 d (J=6) 3
0,90 S 3
Der Komplex PR-1381 scheint sich somit in Lösung unter Freisetzung von Methanol in den Komplex PR-1350 umzuwandeln. Dieser Befund wird zudem durch die Tatsache, daß die antimikrobielle Wirkung von PR-1381 qualitativ und quantitativ mit der des Komplexes PR-1350 identisch ist, und durch die" in Tabelle F angegebene spezifische Drehung von PR-1381 in Abhängigkeit von der Zeit, bekräftigt.
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Tabelle F Spezifische Drehung von PR-1381 (c 0.2fÄthanol)
Zeit nach Herstellung [α],
1D der Lösung (Stunden)
0 +102.8 1/2 +97.2
1 +94.0
2 +91.6 10 +89.6
Aus dieser Tabelle wird offenbar, daß der Anfangswert verschieden ist von dem in Tabelle D angegebenen Anfangswert des Komplexes PR-1350, wohingegen die Endwerte der beiden Komplexe recht gut übereinstimmen.
Die dem Komplex PR-13.81 entsprechenden Hemiacetale kann man durch Umsetzung des Komplexes PR-1350 mit einem anderen Alkohol als Methanol, mit oder ohne Lösungsmittel, erhalten. Solche Alkohole entsprechen der allgemeinen Formel ROH, worin:
R für eine geradkettige oder verzweigte Alkylgruppe ^O mit 1 bis 8 Kohlenstoffatomen, wie eine Methyl-, Äthyl-, Propyl-, Isopropyl-, Butyl-, Isobutyl-, oder tert.-Buty!gruppe, oder ein bekanntes Isomereseiner Pentyl-, Hexyl-, Heptyl- oder Octyl-Gruppe,steht, wobei die Alkylgruppen gegebenenfalls durch Halogenatome oder Hydroxy-, Alkyloxy-, Aralkyloxy-, Aryloxy-, Alkanoyloxy-, Aralkanoyloxy-, Aroylbxy-, Sulfhydrylalkylthio-, Aralkylthio-, Arylthio-, Alkanoylthio-, Aroylthio-, Azido-, Nitro-,■ Cyano-, Thiocyano-,
ϊ1 47726
Μ/22 261 -21-
Hydroxycarbonyl-, Alkyloxycarbonyl-, Aryloxycarbonyl-, Amino-, Alkylamino-, Dialkylamino-, Arylamine»-, Alkanoylamino- und Aroylamino-Gruppen substituiert sein können, oder
worin
R eine Alkenyl- oder Alkinyl-Gruppe mit 2 bis 6 Kohlenstoffatomen, wie eine Allyl-, Crotyl-, oder Propargyl-Gruppe,
eine Cycloalkylgruppe mit 3 bis 7 Kohlenstoffatomen im alicyclischen Ring, wie eine Cyclopropyl-, Cyclobutyl-, Cyclopentyl-, Cyclohexyl- oder Cycloheptyl-Gruppe oder deren Mono- oder Dihalogen-, Niedrigalkyl-, Niedrigalkoxy- oder Hydroxy-substituierten Analoge,
oder .
eine Aralkyl-, Heterocyclylalkyl- oder Aryl-Gruppe, wie eine Benzyl-, Phenyläthyl-, Phenyl-oder Furfurylgruppe, bedeutet,
wobei diese Gruppen gegebenenfalls durch Halogenatome, oder Nitro-, Niedrigalkyl-, Hydroxy- oder Alkoxygruppen substituiert sein können.
25
Wie der Komplex PR-1381 sind die nach diesem Verfahren erhaltenen Verbindungen antibiotisch aktiv.
Die in vitro antimikrobielle Aktivität des PR-1350 Komplexes gegen eine Reihe von Testorganismen wurde mit Hilfe der Standard-Reihenverdünnungs- und -Agarverdünnungsmethode bestimmt. Die minimalen Hemmkonzentrationen (MIC) sind in Tabelle G zusammengestellt.
35
M/22 261
6 . a .
-22-
Tabelle G
In Vitro Antibakterielle Aktivität des Komplexes PR-1350
Stapliylococcus aureus Stapliylococcus aureus Stapliylococcus aureus (Pen.Strep.-resist. ) Staphylococcus aureus (Pen.Strep.Tetrac.Eryt, Methic.-Resist.)
Diplococcus pneumonia CJ
CJ85
CJ9
GJIlO
EA
0.1 0.1
0.1
0.1 0.3
M/22 261
-23-
Organismus Stamm MIC
με/mi
Streptococcus pyogenes NCTC8198 EC 0.1
Streptococcus faecalis ATCC8O43 EI3 0.3
Corynebacterxum xerosis NCTC9755 FF 0.03
Listeria monocytogenes NCTC7973 FT 0.1
Erysipelothrxx insidiosa NCTC8163 FU 0.1
Bacillus subtilis KA2 0.1
Pseudomonas aeruginosa BA2 10
Pseudomonas aeruginosa (Psl8s) BAl4 30
Pseudomonas aeruginosa (mcPhillip) BAl 5 10
Pseudomonas stutzeri BC 3
Vibrio comma NCTC8367 BQ 0.03
Alcaligenes faecalis GA 1
Escherichia coli HA 3
Escherichia coli HA2 10
Escherichia coli HAIl 10
Escherichia coli B AS19 H A4 7 0.3
Escherichia coli V 3HO R~ HA58 3
Klebsiella pneumoniae HE 3
Klebsiella pneumoniae ATCCIOO31 HE4 0.3
Klebsiella pneumoniae ATCC10273 HE7 10
3U-7726
M/22 261
-24-
Organismus Stamm *' MIC
K'lebsd ella aerogenes 1082E KC 7 10
Enterobacter cloacae P99 HC8 10
Serratia marcescens ATCC14756" HG4 10
Proteus vulgaris ATCCI3315 ' HJ 3
Proteus mirabilis HJ3 10
Salmonella paratyphi A NCTC8002 HK 30
Salmonella schotrnuelleri NCTC57O4 HL 30
Salmonella typhimurium NCTC571O HL2 10
Salmonella abortus-equi NCTC5727 HL3 3
Salmonella hirschfeldii NCTC5733 HM 1
Salmonella cholerae-suis NCTC5735 HM2 10
Salmonella typhosa NCTC5760 HN 3
Salmonella enteritidis NCTC3O45 HN2 10
Shigella dysenteriae NCTC8217I HR 10
Shigella flexneri NCTC 8192 HT 3
Yersenia enterocolitica HY 3
Bacteroides fragilis JA2 1
Chromobacterium violaceum NCTC9371 LQ 0.3
Neisseria gonorrhoeae
(SuIfathiaz.Resi st.)		 DA2 1
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-25-
Organismus *)
Stamm		 MIC
μεΑηΐ
Neisseria gonorrhoeae DA 3 0.3
Neisseria gonorrhoeae
(Pen.resist.)		 DA9 0.3
Neisseria gonorrhoeae
(Pen.resist.)		 da4o 0.3
Neisseria meningitidis NCTC8365 . DB 0.1
Haemophilus influenzae NCTC 6489 1X3 3
Haemophilus influenzae 1X5 0.1
Haemophilus influenzae ATCC9OO7 1X12 3
Haemophilus influenzae
(Ampicillin Resist.)		 1X23 1
Haemophilus influenzae
(Ampicillin Resist.)		 1X29 3
Haemophilus ρarahaemoIyticus 1X7 1
Bordetella pertussis IY3 3
Propionibacterium acnes NCTC737 FN 3
Mycobacterium paratuberculosis
NCTC 6926		 MD 3-2
Mycobacterium phlei MO 1.0
Candida albicans ATCCIO231 ZA >100
M/22 261
-26-
Organismus Stamm ' MIC
Hfr/ml
5
Caxidida albicans		 ZA2 >100
Candida parakrusei ZA3 >100
Candida guilliermondii CBS566 ZA6 >100
10 Candida pseudotropicalis CBS607 ZAIl >100
Candida tropicalis CBS 9h- ZAl 3 >100
Saccharomyces ellipsoideus ZZ >100
Aspergillus fumigatizs CBS ZM >100 .
15
Trichophyton raentagrophytes CBS		 ZO >ioo
Trichophyton mentagrophytes var.
interdigitale CBS		 Z02 >100
Trichophyton rubrura ATCC1O272 ■ ZO7 >100
20 Γχ-ichophyton schönleini ZOlO >100
Tetraliymena pyriformis CU-l63O/l-¥ 10
*) Die Angaben beziehen sich auf die Leo-Pharmaceutical Products Culture Collection.
Der Komplex PR-1350 weist keine Kreuzresisteni: gegenüber irgendwelchen in der Medizin verwendeten Antibiotika, wie Pencilline, Cephalosporine, Aminoglycoside, Tetracycline, Fusidinsäure, Chloramphenicol, Erythromycin, Novobiocin oder Lincomycine, auf.
PR-1350 besitzt starke bakterizide Wirkung gegen alle in Tabelle G erwähnten Bakterien.
3H7726
M/22 261 -27-
Darüber hinaus besitzt PR-1350 auch Antitumorwirkung. Wenn man Mäusen, die am Tage Null intraperitoneal mit 10 P-388 Leukämie-Zellen infiziert wurden, den Komplex PR-1350 intraperitoneal an 9 aufeinanderfolgenden Tagen (1 bis 9) in vier verschiedenen Dosierungen verabreicht, beobachtet man bei allen Gaben eine deutliche Hemmung des Tumors. Die Ergebnisse sind in Tabelle H zusammengestellt.
Tabelle H
Aktivität des Komplexes PR-1350 gegen P-388 lymphozytische Leukämia bei Mäusen
Dosis (mg/kg) T/C x)
250 200
125 164
62.5 160
31.25 163
x)
T/C ist das Verhältnis der durchschnittlichen Überlebenszeit der behandelten Mäuse (6 Mäuse pro Dosierung) zu der der unbehandelten Kontrolltiere
ist
in %. Aktivität/definiert als Wert für T/C ^ 125.
Die erfindungsgemäßen Verbindungen weisen bei Mäusen und Ratten nur geringe Toxizität auf.
— 9R —
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Es ist bekannt, daß ein Produkt, das aus einer Kultur des Stammes Oidiodendron truncatum Barron isoliert wurde, antibakterielle und fungizide Wirkung besitzt. (Marchisio, Abstracts of Mycology, [Vol. 12(5)] 4, 50697, aus Allionia 21,67,1976). In dieser Veröffent-lichung ist beschrieben, daß die Wirkung dieses Produkts gegen Staphylococcus aureus und gegen Escherichia coli gleich groß ist und daß die Wirkung gegen den Hefepilz Candida albicans besonders groß ist. Der Autor zieht daraus die Schlußfolgerung, daß der Wirkstoff dem Antibiotikum Fuscin entspricht, das, wie von S.E. Michael (Biochem. J. 43,528,1948) beschrieben, von Oidiodendron fuscum Robak produziert wird.
Aus den mit dem Komplex PR-1350 durchgeführten anLibiotisehen Untersuchungen geht jedoch hervor, daß dieser Komplex eine hohe Wirkung, gegen Staphylococcus aureus, eine 10 bis 100 mal geringere Wirkung gegen Escherichia coli und keine Wirkung gegen Candida albicans aufweist. Es ist somit offenbar, daß sich der Komplex PR-1350 von dem von Marchisio beschriebenen antibiotischen Wirkstoff unterscheidet.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist auch die Schaffung von pharmazeutischen Mitteln zur Behandlung von Infektionskrankheiten. Diese Mittel können auch als Antitumormittel in der Human— und Tiermedizin verwendet werden.
Die erfindungsgemäßen Mittel enthalten als Wirkstoff den Komplex PR-1350 oder ein Hemiacetal davon, z.B. PR-1381, in Kombination mit festen oder flüssigen \ pharmazeutischen Trägern und/oder Verdünnungsmitteln.
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In den erfindungsgemäßen Mitteln kann das Verhältnis von Wirkstoff zu Trägersubstanz zwischen 1 und 95 Gew.-% variieren. Die erfindungsgemäßen Mittel können in Form verschiedener, pharmazeutischer Darreichungsformen vorliegen, wie Granulaten, Tabletten, Pillen, Dragees, Suppositorien, Kapseln, Tabletten mit verzögerter Wirkstoffabgabe, Suspensionen oder Injektionspräparaten. Die erfindungsgemäßen Mittel können auch in Flaschen, Röhrchen oder ähnliche Behälter abgefüllt werden, wenn Mischungen verarbeitet werden sollen. Zur Herstellung der erfindungsgemäßen Mittel können orgaorganische oder anorganische, feste oder flüssige und/oder für topisehe Zwecke geeignete Träger verwendet werden. Als Träger können Wasser, Gelatine, Lactose, Stärke, Magnesiumstearat, Talkum, pflarrzXiehe und tierische öle und Fette, Benzylalkohol, Gummistoffe, Polyalkylenglycol, Vaseline, Kakaobutter, Lanolin oder andere zur Herstellung von Arzneimitteln bekannte Träger verwendet werden. Als Hilfsstoffe können Stabilisierungsmittel, Netz- und Emulgiermittel, Salze zur Beeinflussung des osmotischen Druckes oder Puffer zur Aufrechterhaltung eines geeigneten pH-Werts zum Einsatz kommen. Die erfindungsgemäßen Mittel können darüber hinaus auch andere pharmazeutische Wirkstoffe enthalten, die in geeigneter Weise zusammen mit dem Komplex PR-1350 oder einem Hemiacetal davon zur Behandlung von Infektionskrankheiten oder als Antitumormittel verabreicht werden können. Solche Wirkstoffe können andere geeignete Antibiotika oder Antitumormittel sein, insbesondere solche Mittel, die die Wirkung steigern und /oder die Ausbildung von Resistenz verhindern. Andere Verbindungen, die vorteilhafterweise, insbesondere bei topischen Präparaten, mit den erfindungsgemäßen
Verbindungen kombiniert werden können, sind z.B.
Corticosteroide, wie Hydrocortison, Triamcinolon oder Fluocinolon.
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In Form von Granulaten, Tabletten, Kapseln oder Dragees
creeioneterweise enthalten die erfindungsgemäßen Mittel/25 bis 95 % der erfindungsgemäßen Verbindungen, wohingegen oral zu verabreichende Suspensionen geeigneterweise 2 bis 25 % der erfindungsgemäßen Verbindungen enthalten.
Zur parenteralen Anwendung werden die erfindungsgemäßen Verbindungen bevorzugt in Form von Injektionspräparaten verabreicht, die 1 bis 20 % Wirkstoff enthalten.
Wie bereits angedeutet, können die erfindungsgemäßen Verbindungen zu pharmazeutischen Darreichungsformen verarbeitet werden, die Suspensionen, Pulver, Salben und Cremes umfassen. Ein pharmazeutisches Präparat zur oralen Applikation kann auch in Form einer Suspension, die die erfindungsgemäßen Verbindungen in einer Menge von 20 bis 100 mg pro ml Trägerflüssigkeit enthält, vorliegen. Zur topischen Applikation können die erfindungsgemäßen Verbindungen als Pulver, Salben, Cremes oder Lotionen formuliert werden, wobei die erfindungsgemäßen Verbindungen in Mengen von 0,5 bis 10g pro 100 g des Präparates enthalten sind.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist darin zu sehen, die Dosierung der erfindungsgemäßen Verbindungen so auszuwählen, daß man die gewünschte Wirkung ohne gleichzeitige Nebenwirkungen erhält. In der Human therapie werden die erfindungsgemäßen Verbindungen bequemerweise in Dosiseinheiten verabreicht, die (bei Erwachsenen) nicht weniger als 50 mg und bis zu 1000 mg, vorzugsweise 250 bis 750 mg, enthalten.
Der Ausdruck "Dosiseinheit" bezieht sich auf eine einheitliche, d.h. einzelne Dosis, die entweder die erfindungsgemäßen Verbindungen als solche oder in Mischung mit festen oder flüssigen pharmazeutischen
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Verdünnungsmitteln oder Trägern enthält, und die einem Patienten verabreicht werden kann, sich leicht handhaben und verpacken läßt und dabei als Dosiseinheit unversehrt bleibt.
Die erfindungsgemäßen Verbindungen können in Form einer Dosiseinheit einmal oder mehrere Male pro Tag in geeigneten Zeitabständen verabreicht werden. Die Verabreichung soll jedoch immer in Abhängigkeit vom Zustand des Patienten und in Übereinstimmung mit der Verordnung des Arztes erfolgen.
Die tägliche Dosis zur systemischen Behandlung liegt bei einer Menge von 0,25 bis 4g, vorzugsweise 0,5 bis 3 g der erfindungsgemäßen Verbindungen pro Tag.
Der Ausdruck "Dosiseinheit" in Verbindung mit topischer Applikation bedeutet eine einheitliche, d.h. einzelne Dosis, die einem Patienten topisch verabreicht werden
kann, wobei pro cm infizierter Fläche 0,1 bis 10 mg, vorzugsweise 0,2 bis 1 mg>der erfindungsgemäßen Verbindungen appliziert werden.
Zur Injektion können Ampullen, Vials, oder ähnliche Behälter bereitgestellt werden, die als Dosiseinheit eine parenteral verträgliche, wäßrige oder ölige injizierbare Lösung oder Dispersion des Wirkstoffes enthalten.
Parenterale Formulierungen sind besonders nützlich bei der Behandlung von Zuständen, die eine rasche Reaktion auf die Behandlung erfordern. Zur kontinuierlichen Therapie bei an Infektionskranheiten leidenden Patienten "° sind Tabletten oder Kapseln die geeignete Formulierung, da ein oral, insbesondere in Form von Tabletten mit verzögerter Wirkstoffabgabe, verabreichtes Arzneimittel eine lang anhaltende Wirkung entfaltet.
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5 Zur Behandlung von Infektionskrankheiten oder zur Tumorbehandlung können solche Tabletten, wie schon erwähnt, vorteilhafterweise weitere Wirkstoffe enthalten.
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Beispiel 1
5
Um vegetatives Wachstum zu erzielen, werden Sporen von Oidiodendron truncatuin Barron, Stamm HL-972 ZP-88 aus einem 10 Tage alten Schrägagar in einen 500 ml Erlenmeyerkolben überführt, der eine sterile Nährbrühe (100 ml) folgender Zusammensetzung enthält:
Maisquellwasser 20 g/Liter
KH3PO4-2H2O 10 g/Liter
MgSO4-7H2O 0,5 g/Liter
Saccharose 50 g/Liter
Leitungswasser (pH 6,7) ad 1 000 ml
Diese Kultur wird aerob 3 Tage bei 28 0C auf einer Schüttelvorrichtung bebrütet. Das so erhaltene Impfmaterial wird in 2-Liter-Schüttelkolben überführt, die 250 ml eines Nährmediums folgender Zusammensetzung;
Malzextrakt 20 g/Liter
Saccharose 20 g/Liter
Sojabohnenmehl 7,5 g/Liter
Fleisch- und Knochenmehl 7,5 g/Liter
K2HPO4 1 g/Liter
Leitungswasser (pH 6.2) ad 1 000 ml
enthielten, wobei die Konzentration an Impfmaterial 8 % betrug.
Die Fermentierung erfolgt auf einer Schüttelvorrichtung (112 Schwingungen/min) bei 281^C und bei einem pH des Nährmediums von ungefähr 6,0. Man bestimmt die antibiotische Aktivität während der Fermentierung nach einer Disk-Platten-Kulturen-Methode mit einer Reihe von Testorganismen. Die Ergebnisse sind in Tabelle I zusammen-
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-34-
gefaßt.
Tabelle I.
Test-Organismus mm Inhib:
2 Tage		 Lerungszone-
6 Tage
Streptococcus pyogenes 28 33
Staphylococcus aureus 32 36
Corynebacterium xerosis 33 37
Eschericliia coli •trace (16)
Klebsiella pneumoniae 17 20
Pseudomonas aeruginosa 17 1 20
Neisseria gonorrhoeae 35 39
Candida albicans 0 0
Tricophyton raentagrophytes o 0
Aspergillus clavatus 0 0
30 " Beispiel·-?
Um vegetatives Wachstum zu erzielen, überführt man Sporen von Oidiodendron tuncatum Barron, Stamm HL-972 ZP-88 von einem 10 Tage alten Schrägagar in 2-Liter-35 Schüttelkolben (1. Generation), die ein steriles Nährmedium (250 ml) folgender Zusammensetzung enthalten:
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Maisguellwasser 20 g/Liter
Saccharose 50 g/Liter
KH2PO4-2H2O 10 g/Liter
MgSO4-7H2O 0,5 g/Liter
Leitungswasser (pH 6,7) ad 1 000 ml
Diese Kultur wird aerob bei 20 0C 3 Tage auf einer Hin- u. Her-Schüttelvorrichtung bebrütet. Das auf diese Weise
erhaltene Impfmaterial wird in eine Reihe von Gefäßen (2. Generation) überführt, die die gleiche, für die Generation angegebene Nährbrühe enthält. Die Fermentierung dieser vegetativen Stufe erfolgt aerob unter 2-tägigem Rühren bei einer Temperatur von 20 C.
In einem 1,5 m Edelstahlkessel wird ein Kulturmedium (1,0 m ) folgender Zusammensetzung bereitet:
Malzextrakt 20 g/Liter
Saccharose 20 g/Liter
Sojabohnenmehl 7,5 g/Liter
Fleisch- und Knochenmehl 7,5 g/Liter
K2HPO4 1 g/Liter
Leitungswasser ad 1 000 ml
Der pH-Wert dieses Mediums w±rd~. vor der Sterilisierung auf 6,0 eingestellt. Die Sterilisierung erfolgt
45 Minuten bei einer Temperatur von 120 0C. Nach dem Abkühlen auf 20 0C wird mit der zweiten Generation in einer Konzentration von 3 % angeimpft. Während
der Fermentierung wurde unter Rühren (110 UpM)
sterile Luft in einer Menge von 0,8 m /Minute durch das Medium geleitet. Man fermentiert weitere 70 Stunden, wobei man zur Kontrolle der Schaumbildung Silikone
als Antischaummittel zugibt. Der pH-Wert wird während
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der Fermentation durch Zugabe von Phosphorsäure bei 6,0 gehalten. Die antibiotische Aktivität der Kulturenproben wird durch Messung der Hemmzone, die man mit Staphylococcus aureus als Testorganismus nach der Agar-Cup Methode erhält, bestimmt.
Beispiel 3 Isolierung des Komplexes PK-I350
Die nach Beispiel 2 hergestellte Fermentationsbrühe wird unter Verwendung von Kieselgur als Filterhilfsmittel filtriert. Das Filtrat (900 Liter) wird mit einer Geschwindigkeit von 2 Litern/Minute, über eine Säule von 4,4 Liter Diaion ^ HP-20 gegeben (Höhe 56 cm, Durchmesser 10 cm; das Harz wird vor der Verwendung mit Wasser, 2 N wäßrigem Natriumhydroxyd, Wasser, Methanol, 2 N wäßriger Salzsäure, Wasser, Methanol und Wasser behandelt). Die Säule wird mit Wasser (20 Liter), 25 %-igem wäßrigem Methanol (12 Liter), 50 %-igem wäßrigem Methanol (12 Liter) und 75 %-igem wäßrigem Methanol (12 Liter) gewaschen und anschließend mit Methanol eluiert. Es wurden Fraktionen von 2 Litern abgenommen. Die Fraktionen 2 bis 7, die die Hauptmenge an antibakterieller Aktivität enthalten, werden vereinigt und das Lösungsmittel im Vakuum abgezogen. Der Rückstand wird mit 400 ml Methanol extrahiert, das Methanol wird nach Filtration verdampft. Der Rückstand wird in 50 ml Methanol aufgenommen. Zu dieser Lösung gibt man unter Rühren Äther (800 ml). Der ausgefallene Niederschlag wird abfiltriert und das Filtrat im Vakuum eingeengt, wobei man ein öl erhält, das in Methanol (20 ml) gelöst und der Säulenchromatographie an 600 ml Diaion ® HP-20 unterworfen wird (Höhe 90 cm, Durchmesser
3U7726
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2,9 cm) . Die mit Methanol-Wasser (95:5) eluierten, aktiven Fraktionen wurden vereint und im Vakuum eingeengt, wobei man 10,1 g eines Öls erhielt. 5
Man löst 5,7 g dieses Rohprodukts in Methanol (10 ml), gibt diese Lösung auf eine Sephadex^-^LH-20-Säule (Höhe 9 0 cm, Durchmesser 29 cm) und eluiert die Säule mit Methanol. Die aktiven Fraktionen (150 ml) werden gesammelt und im Vakuum zur Trockene eingeengt. Man erhält 4,2 g eines Öls, das in einer Mischung von Äther (100 ml) und Cyclohexan (200 ml) gelöst wird. Diese Lösung wird mit 3 g Norit ^ behandelt, filtriert und im Vakuum auf ein Volumen von 50 ml eingeengt.
Unter Rühren gibt man 200 ml Cyclohexan zu und filtriert den ausgefallenen Niederschlag ab. Nach Waschen des Niederschlags mit Cyclohexan und Trocknen erhält man den antiobiotischen Komplex 1350 in Form eines farblosen, amorphen Pulvers.
Einengen der Mutterlauge auf 50 ml und Abfiltrieren des ausgeschiedenen Niederschlages ergibt eine weitere Fraktion des Komplexes.
Beispiel 4
Herstellung von Tabletten, die 250 mg des Komplexes
PR-I 350 enthalten
Inhaltsstoffe:
PR-1350 250 g
Lactose 165 g
Polyvinylpyrrolidon 7 g
Maisstärke 50 g
Talkum 25 g
Magnesiumstearat 3 g
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Der Komplex PR-1350 und Lactose werden durch ein Sieb von 850 μΐη (20 mesh) gegeben und 15 Minuten lang c vermischt. Diese Pulvermischung wird anschließend mit einer Lösung des Polyvinylpyrrolidons in Wasser befeuchtet. Die feuchte Masse gibt man durch ein 2,0 mm (10 mesh) Sieb und trocknet sie bei 3·3 0C. Nach dem Trocknen werden die Granalien durch ein
jQ 1,18 mm Sieb aufgebrochen und mit Maisstärke, Talkum und Magnesiumstearat gemischt. Das Granulat wird unter Verwendung von 1,27 cm (16/32") Formen und entsprechenden Stempeln zu Tabletten von 0,50 g geformt. Man erhält auf diese Weise 1000 Tabletten, von denen jede 250mg PR-1350 enthält.
Beispiel 5
Herstellung von Kapseln, die 250 mg des Komplexes PR-1381 enthalten
Inhaltsstoffe: .
PR-1381 250 g
Stärke 27 g
Magnesiumstearat 3 g
Die Inhaltsstoffe werden durch ein 250 μπι Sieb (60 mesh) gegeben und 15 Minuten lang vermischt. Diese Mischung wird unter Verwendung einer halbautomatischen Kapselfüllmaschine, die durch einen Vibrator angetrieben wird, in Gelatinekapseln abgefüllt* Jede Kapsel enthält 280 mg der Mischung, ansprechend 250 mg des Komplexes PR-1381.
'3H7726
M/22 261 -39-
Beispiel
Herstellung einer Salbe, die 1O mg des Komplexes P?J~J 350 pro g enthält
Inhaltsstoffe:
PR-1350 10 g
Cholesterin 30 g
Stearylalkohol 30 g
Butylhydroxyanisol 0,1 g
Weißwachs 80 g
White petrolatum 850 g
Stearylalkohol, Weißwachs und white petrolatum werden auf einem Dampfbad verschmolzen. Das Cholesterin und das Butylhydroxyanisol werden anschließend zugegeben und in der geschmolzenen Mischung gelöst, die anschließend kaltgerührt wird. Der Komplex PR-1350 wird durch ein 180 \im Sieb (80 mesh) gegeben, und allmählich mit der Salbenbase verrieben.
Beispiel
Isolierung des Komplexes PR-1350 30
Die Fermentationsbrühe, hergestellt wie in Beispiel 1 beschrieben, wird unter Verwendung von Kieselgur als Filterhilfsmittel filtriert. Das Filtrat (4 Liter) wird mit 2 Portionen Äthyläther (2x1 Liter) extrahiert. Die vereinigten organischen Phasen werden mit Wasser gewaschen und getrocknet. Das nach dem Abziehen des Lösungsmittels im Vakuum erhaltene Rohprodukt wird
—4 Ο —
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weiter gereinigt, indem man es wie in Beispiel 3 beschrieben, an Diaion ^ HP-20 unter Verwendung von Methanol-Wasser als Eluierungsmittel und anschließend an Sephadex ^ LH-20 unter Verwendung von Methanol als Eluierungsmittel chromatogräphäiert' und anschließend aus Äther-Cyclohexan fällt.
Beispiel 8
'torste11ung des Komplexes PR-I38T
Eine Lösung des Komplexes PR-1350 (100 mg), hergestellt wie in Beispiel 3 beschrieben, in Methanol (0,3 ml) läßt man bei 5 C stehen. Im Verlauf von 72 Stunden scheiden sich langsam Kristalle aus der Lösung ab. Man gibt Diisopropyläther (5 ml) zu und filtriert die Kristalle ab. Waschen mit Diisopropyläther und Trocknen der Kristalle ergibt den Komplex PR-1381 vom Schmelzpunkt 139-141 0C.
Beispiel 9 Auftrennung des Komplexes PR-1350 in die Komponenten
A. 300 mg des Komplexes PR-1350, hergestellt wie im Beispiel 3 beschrieben, werden an einer Sephadex ^ LH-20 Säule (Höhe 90 cm, Durchmesser 2,9 cm) unter Verwendung von Chloroform-Methanol-Hexan (65:10:25)als Eluierungsmittel chr>omatographiert. Die ersten 280 ml des Eluats werden auf einmal aufgefangen. Danach nimmt man Fraktionen von 15 ml ab. 10 μΐ jeder Fraktion werden mit 1 ml Methanol verdünnt und auf die Wirkung gegen Staphylococcus aureus nach der Agar-Cup Methode Untersucht. Die Resultate sind
M- -3U7728
Μ/22
-41-
in der nachfolgenden Tabelle zusammengestellt.
Fraktion Nr. Inhibierungszone
1 2k
2 23
3 29
35
5 - 33
6 33
7 28
8 32
9 . 31
10 30
11 32.5
12 32
13 32
Ik 31.5
15 31
16 26
17 21
18 0
19 0
M/22
-4 2-
B. Die Fraktionen 4 bis 6, erhalten wie in Teil A dieses Beispiels beschrieben, werden vereinigt und das Lösungsmittel im Vakuum abgezogen. Man erhält 100 mg eines öligen Rückstandes, der auf eine Säule analog der in Teil A verwendeten Sephadex ® LH-20 Säule aufgetragen wird . Die Säule wird mit Chloroform-Methanol-Hexan. (65:10:25) eluiert. Nach Abnahme der ersten 300 ml des Eluats auf einmal werden 12 ml Fraktionen gesammelt. Die Fraktionen werden auf antistaphylokokkische Wirkung nach der in Teil A dieses Beispiels beschriebenen Methode untersucht. Die Ergebnisse sind in der nachfolgenden Tabelle zusammengestellt:
Fraktion Nr. Inhibierungszone
1 22
2 • 28
3 31.5
h 30
5 29
6 27-5
7 21
8 2k
M/22
,.-3U7726
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Fraktion Kr. Inhibierungszone
9 26
10 22
11 21
12 21
13 19
14 18
15 20
i6 Zk
17 29
18 21
19 16
20 0
C. Fraktionen Nr. 11 bis 15, erhalten wie in Teil A dieses Beispiels beschrieben, werden vereinigt und das Lösungsmittel im Vakuum abgezogen. Man erhält 175 mg eines öligen Rückstandes, der auf die gleiche, in den Beispielen A und B dieses Beispiels verwendete Sephadex ® LH-20 Säule aufgetragen wird. Die Säule wird mit Chloroform-Methanol-Hexan (65:10:25) eluiert. Nach Abnahme der ersten 285 ml des Eluats auf einmal werden 13 ml Fraktionen gesammelt. Die Fraktionen werden auf antistaphylokokkische Wirkung, wie in Teil A dieses Beispiels beschrieben, untersucht. Die Ergebnisse sind in der nachfolgenden Tabelle zusammengestellt:
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M/22
-44-
Fraktion Nr. I Inhibierungszone
1 15
2 20
3 29
k 30
5 26
6 24
7 20
8 20
9 20
10 22
11 22.5
12 31.5"
13 29.5
Ik 30
15 30.5
> 16 30
17 25
18 18 '
19 17
20 0
ην m, *
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Die Ergebnisse dieses Beispiels zeigen, daß die Komponenten des Komplexes PR-1350 wenigstens teilweise getrennt werden können, die abgetrennten Komponenten sich jedoch rasch wieder in den ursprünglichen Komplex PR-1350 umwandeln.

Claims (1)

3H7726 M/22 261 -Z- ϊ Patentansprüche
1. Komplex PR-1350 aus nahe verwandten Verbindungen, gekennzeichnet durch folgende physikalisch-chemische Daten:
a) IR-Spektrum: 3400 (br), 2900 (s), 2670 (w), 1770(w), 1670 (s), 1620 (m), 1440 (m), 1410 (m), 1380 (m),
1225 (m), 1180 (m), 1120 (m) 1030 (br), 690 (w) cm"1; gemäß Figur 1;
b) optische Drehung [a]^ = +85-90° (c=1, Äthanol), vier Stunden nach Herstellung der Lösung gemessen;
c) Stoßionisations-Massenspektrum (iti/e) : 366, 205, 204, 189, 187, 175, 161, 159, 149, 147, 145, 135, 133,
131, 121, 119, 109, 107, 105, 95, 93, 91, 81, 79, *
77, 69, 67, 55, 44, 41; |
d) H-NMR-Spektrum (10 %-ige Lösung in Deuteroaceton): 9,28 (s), 6,63 (bt), 2,41 (m), 1,77 (m), 1,21 (s), 0,96 (s);
1 3
e) C-NMR-Spektrum (10 %-ige Lösung in Deuterochloroform): 193.8 (d), 151.9 (s), 151.5 (d), 44.1, 37.6, 36.3, 29.3, 28.6, 25.9, 21.6, 17.8, 15.8;
f) UV-Maximum bei 230 nm (e]% = 304) in Äthanol;
1 cm
g) Löslichkeit: Löslich in üblichen organischen Lösungsmitteln, wie Äthylacetat, Äthyläther, Benzol, Äthanolf Methanol und Chloroform; relativ unlöslich in Wasser und unlöslich in gesättigten Kohlenwasserstoffen;
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\ 1 und seine Hemiacetale! mit Alkoholen der allgemeinen
Formel:
R-OH
worin:
R eine geradkettige oder verzweigte Alkylgruppe mit 1 bis 8 Kohlenstoffatomen, wie eine Methyl-,
Äthyl-, Propyl-, Isopropyl-, Butyl-, Isobutyl-,
ein oder tert.-Butylgruppe, oder/bekanntes Isomeres einer Pentyl-, Hexyl-, Heptyl oder Octylgruppe, bedeutet, wobei die Alkylgruppen gegebenenfalls durch Halogenatome oder Hydroxy-, Alkyloxy-, Aralkyloxy-, Aryloxy-, Alkanoyloxy-, Aralkanoyloxy-, Aroyloxy-, SuIfhydrylalkylthio-, Aralkylthio-, Arylthio-, Alkanoylthio-, Aroylthio-, Azido-, Nitro-, Cyano-, Thiocyano-, Hydroxycarbonyl-, Alkyloxycarbonyl-, Aryloxycarbonyl-, Amino-, Alkylamino-, Dialkylamino-, Arylamino-, Alkanoylamino- und Aroylamino-Gruppen substituiert sein können, oder worin
* 20 R eine Alkenyl- oder Alkinyl-Gruppe mit 2 bis 6 Kohlen-
stoffatomen, wie eine Allyl-, Crotyl- oder Propargyl-
~ gruppe,
eine Cycloalkylgruppe mit 3 bis 7 Kohlenstoffatomen im al!cyclischen Ring, wie eine Cyclopropyl-, Cyclobutyl-, Cyclopentyl-, Cyclohexyl- oder Cycloheptyl-Gruppe oder deren Mono- oder Dihälogen-, Niedrigalkyl-, Niedrigalkoxy- oder Hydroxy-substituierte:·. Analoge,
eine Aralkyl-, Heterocyclylalkyl- oder Aryl-Gruppe, wie eine Benzyl-, Phenyläthyl-, Phenyl- oder Furfurylgruppe bedeutet,
wobei diese Gruppen gegebenenfalls durch Halogenatome oder Nitro-, Niedrigalkyl-, Hydroxy- oder
Alkoxygruppen substituiert sein können. 35
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2. Hemi-acetal-Koinplex PR-1381 nach Anspruch 1 mit
Methanol, gekennzeichnet durch folgende physikalischen chemische Daten:
a) Elementar-Analyse: C 66,30; H 8,50;
b) Schmelzpunkt: 139 - 141 °C;
c) IR-Spektrum: 3520 (Sch), 337.5 (br), 2950 (s) ,
2930 (s), 2780 (s), 2700 (w), 1670 (s), 1620 (w),
1460 (w), 1410 (w), 1390 (w), 1350 (w), 1310 (w) ,
1170 (w), 1080 (S), 1040 (s), 1030 (s) , 1020 (s),
950 (w) , 940 (w) , 900 (w), 830 (w), 750 (w), 680 (w), 630 (w) cm ; gemäß Figur 2;
d) Spezifische Drehung (c=0,2; Äthanol) [a]^° =+102,8°, *
sofort nach Herstellung gemessen; /
e) Spezifische Drehung (c= 0,2; Äthanol) [α]β = +89,6°, 10 Stunden nach Herstellung gemessen;
f) Stoßionisations-Massenspektrum (m/e): identisch
mit dem Spektrum von PR-1350 nach Anspruch 1;
g) H-NMR-Spektrum, unmittelbar nach Herstellung einer 10 %-igen Lösung in Deuterochloroform aufgenommen:
9,28 (s), 6.54 (t>, 5.31 (bs), 4,58 (t), 3,40 (s), 3,25 (d, J=4,5), 2,82 (d, J=4,5), 2,35 (m), 1.77 (m), 1.21 (s), 1.00 (d, J=6), 0,90 (s);
1 %
h) UV-Maximum bei 230 nm (E1 = 310) in äthanolischer
Lösung.
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3. Komplex nach Anspruch 1 oder 2 in im wesentlichen reiner Form.
4. Verfahren zur Herstellung eines Komplexes nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, daß man einen Stamm vonuOidiodendron truncatum Barron in einem Nährmedium züchtet, wobei sich der Komplex in der Nährbrühe anreichert, und man den Komplex dann aus der Nährbrühe isoliert.
15
5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß man Oidiodendron truncatum Barron, HL-972, ZP-88 (CBS 475.78) verwendet.
20
6. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß
man einen weiteren Stamm von Oidiodendron truncatum Barron verwendet, ausgewählt unter Stämmen, die beim Centraalbureau voor Schimmelculttax.es, Baarn, Niederlande, unter den Nummern CBS 629.70, CBS 222.65, CBS 115.65 und CBS 114.65 hinterlegt sind.
7. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, 3^ daß man einen Mutanten der in Anspruch 5 und 6 angegebenen Stämme verwendet, wobei der Mutant in an sich bekannter Weise hergestellt wird.
8. Verfahren nach Anspruch 4 zur Reinigung der in der ° Nährbrühe angereicherten Substanz, dadurch gekennzeichnet, daß man den Komplex PR-1350 aus dem
M/22 261 ~ -V-1
Fermentationsmedium extrahiert, den Extrakt konzentriert und das Rohprodukt weiter reinigt.
9. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet,
daß man zur Gewinnung des Komplexes PR-I350 10
a) das Fermentationsmedium mit einem organischen Lösungsmittel extrahiert und den Extrakt einengt, oder
den im Fermentationsmedium vorhandenen Komplex PR-1350 an einem macroreticularen Harz, wie Amberlite®XAD-2 oder Diaion ® HP-20, bei einem pH-Wert zwischen 2 und 10 absorbiert, anschließend mit einem organischen Lösungsmittel, wie Methanol, eluiert und das Lösungsmittel im Vakuum verdampft,
und
b) das so erhaltene Rohprodukt durch Chromatographie
(R) an einem macroreticularen Harz, wie Diaion ^ HP-20 unter Verwendung von Methanol-Wasser-Mischungen als Eluierungsmittel, oder Sephadex-^ LH-20 unter Verwendung von Methanol oder Chloroform-Methanol-Hexan-Mischungen als
Eluierungsmittel, weiter reinigt. 30
10. Verfahren zur Herstellung eines Hemiacetalkomplexes nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man den Komplex PR-1350 mit einem Alkohol der Formel ROH, 3^ worin R die in Anspruch 1 angegebenen Bedeutungen besitzt, mischt.
M/22 261 ~*
1.1. Verfahren zur Herstellung des Hemiacetals PR-1381 nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man den Komplex PR-1350 in Methanol löst und das kristalline Produkt durch Filtration isoliert.
12. Verfahren zur Herstellung des Komplexes PR-1350 nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man ein Hemiacetal des Komplexes PR-1350 in einem organischen Lösungsmittel, das von den in Anspruch 1 angegebenen Alkoholen ROH verschieden ist, löst, die Lösung entsprechend lange stehen läßt und den auf diese Weise gebildeten Komplex PR-1350 ausfällt.
13. ^Pharmazeutisches Mittel zur Anwendung bei Menschen oder Tieren, gekennzeichnet durch einen Gehalt an
mindestens einer der Substanzen nach Anspruch 1 oder 2 als Wirkstoff, gegebenenfalls in Kombination mit pharmazeutisch verträglichen, nicht-toxischen Trägern und/oder Hilfsstoffen. 25
14. Komplex nach Anspruch 1 oder 2 zur Verwendung als antibiotisches oder Antitumor-Mittel.
15. Oidiodendron truncatum Barron HL^972, ZP-88 (CBS
475.78).
16. Mikroorganismen nach Anspruch 15 in oder auf einem sterilen Medium.
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