DE3032069A1 - Lackartige haftvermittler fuer waessrige polyacrylamid-gele auf glatten kunststoff-folien, verfahren zu ihrer herstellung und ihre verwendung fuer die elektrophorese - Google Patents

Description

• Lackartige Haftvermittler für wäßrige Polyacrylamid-Gele
• auf glatten Kunststoff-Folien, Verfahren zu ihrer Her-Stellung und ihre Verwendung für die Elektrophorese M Die Erfindung betrifft lackartige Haftvermittler für wäßrige Polyacrylamid-Gele auf glatten Kunststoff-Folien, insbesondere für die Elektrophorese von Proteinen, Verfahren zu ihrer Herstellung und ihre Verwendung.
• Die Elektrophorese von Gemischen in wäßriger Lösung befindlicher Makromoleküle, also deren Trennung auf Grund verschiedenen Beweglichkeitsverhaltens im elektrischen Gleichspannungsfeld, hat auf dem Gebiet der Biochemie und der medizinischen Diagnostik eine große Bedeutung erlangt.
• Unter den verschiedenen methodischen Verfahren dieses Trennverfahrens nimmt die Polyacrylamid-Gel-EleRtrophorese einen besonderen Rang ein. Ihr Kennzeichen ist, daß die wäßrige Lösung, in welcher die Makromolekdle der Trennung unterworfen werden, durch ein darin polymerisiertes Netzwerk aus quervernetztem Polyacrylamid zur physikalischen Konsistenz einer geleeartigen Masse verfestigt ist. Das bringt den Vorteil mit sich, daß die elektrophoretische Trennung nunmehr nicht mehr in engen Rohren oder Küvetten vor sich gehen muß, sondern in einer formstabilen Masse, z.B. in Glasröhren von 6 mm Durchmesser oder in einer 0>1 - 5 mm dicken Flachschicht, ohne da3 die Zerstörung der Trennwirkung durch Konvektion oder Strömung ährend des Trennvorganges oder nach dessen Beendigung befürchtet werden muß.
• Bei der sogenannten Flachbett-Elektrophorese polymerisiert man üblicherweise das Polyacrylamid-Gel auf Glasplatten, an welchen es recht befriedigend haften bleibt, wenn die Glasplatten sorgfältig gereinigt wurden. Dieses Haften ist von großer Bedeutung. Anschließend an die Elektrophorese müssen nämlich die Pröteine oder andere getrennte Makromoleküle durch Behandlung mit starken Säuren immobilisiert werden, um die erzielte Trennung dadurch zu perpetuieren. Dann wird die Säure wieder herausgewaschen und die Schicht durch Behandlung mit Farbreagenzien in Lösungsmitteln wie Alkohol, essigsäure etc.
• behandelt, so daß die aufgetrennten Substanzen als direkte Zonen sichtbar nachgewiesen werden können.
• Alle diese Behandlungen verträgt die auf den Glasplatten aufgebrachte Schicht in der Regel ohne sich abzulösen. Wenn man aber das Polyacrylamid-Gel zur Aufbewahrung trocknen will, schrumpft es sehr beträchtlich und löst sich auf jeden Fall vom Glas ab. Um diesem Ubelstand abzuhelfen, wird das Glas mit einem Silan-Derivat (z.B. Methacryloxypropyl Trimethox'rs il behandelt, welches also ungesättigte Restgruppen enthält. So'e Derivate reagieren einerseits mit den Siliciumatomen der Glasoberfläche unter Ausbildung fester kovalenter Verbindungen, andererseits auch mit dem Polyacrylamid-Monomer, so daß das Acrylamid nunmehr durch feste kovalente Bindung am Glas verankert ist (Radola, B.J. 1980 Electrophcresis 1, J93-56).
• Was die Glasplatten betrifft, so ist also das rroblem der Haftung von Gelschichten befriedigend gelöst. Glasplatten selbst sind aber in der Elektrophorese als Unterlage für das Gel wenig befriedigend wegen ihrer Starrheit, Zerbrechlichkeit und der Schwierigkeit, sie zu Dokumentationszwecken aufzubewahren. Sehr viel besser würden sich zu diesem Zweck durch sichtige Kunststoff-Folien eignen. Als solche kommen wegen einer Reihe mit der experlmentellen Technik zusammenhängender kriterien heute ausschließlich Pcyesterfolien in Betracht, also Folien aus einem Kateria', welches aus aliphatischen Diolen und Dicarbonsäuren durch Polymerisation aufgebaut ist.
• Auch bei Kunststoff-Folien als Unterlage ist das gute Haften der Schicht des Elektrophorese-Gels Voraussetzung.
• Alle Passagen durch Lösungsmittel und das anschließende Eintrocknen muß die Schicht überstehen ohne sich abzulösen. Bis Jetzt wurde nur ein Verfahren bekannt, diese Haftfähigkeit herbeizuführen, nämlich eine Anlehnung an 1 e oben für Glasplatten beschriebene Methode. Dazu muß allerdings erst die Polyesterfolie durch Behandeln mit Natronlauge oberflächlich angeäzt werden, d.h. es müssen aus dem 1 olymer enthaltenen Diol Hydrxylgruppen freigelegt werden. t¼n kann dann mit Hi'-fe von C=C-Doppelverbindungen enthaltenden Silanverbindungen in der Tat ein einigermaßen befriedigendes Haften von Polyacrylamid-Gel erzielen (B.j. Radola, ibid.).
• Ein derartiges Verfahren ist für Labormäßige Praparierunt einiger Folienstücke akzeptabel, eignet sich aber wenig für die Herstellung größerer Mengen im kontinuierlichen Verfahren, und zwar hauptsächlich aus folgenden Gründen: a) Die Einwirkungsdauer der hochkonzentrierten Natronlauge @uß mindestens 15 Minuten betragen. Für diesen Zeitraum müssen also die Fnlien in der gefährlichen und schwierig zu handhabenden Flüssigkeit bleiben.
• b) Anschließend muß die Lauge sorgfältig abgewaschen und die Folie rückstandsfrei getrocknet werden.
• c) Die anschließende Behandlung mit der Silanlösung muß sich ebenfalls auf längere Zeit erstrecken, zudem ist das ungesättigte Silan auch wieder eine die Atemwege sehr stark irritierende Substanz, die sorgfältig abgesaugt und weggetrocknet werden muß.
• d) Die Haftfähigkeit von Polyacrylamid-Gel an einer derartig behandelten Folie ist immer noch als höchstens einigermaßen befriedigend zu bezeichnen, denn besonders beim Trocknen der Gel-Schicht springt diese doch teilweise von der Folie ab, was die Dokumentation fertiger Elektrophoresen schwierig oder fast unmöglich macht.
• Eine verbesserte Haftfähigkeit von Schichten aus Polyacrylamid-Gel auf Trägerfolien aus Polyester sollte dadurch erreicht werden können, daß man eine mit dem Acrylamid reagierende Verbindungskomponente als lackartigen Haftvermittler auf die Folie aufträgt. An einen solchen haftvermittelnden Lack wären folgende Anforderungen zu stellen: a) Festes Haften an der Trägerfolie.
• b) Unlöslichkeit in Wasser.
• c) Unlöslichkeit in den Reagenzien, mit welchen die Schicht aus Polyacrylamid-Gel üblicherweise behandelt wird, also Methanol, Essigsäure, 15%ige Trichloressigsäure und Mischungen daraus.
• d) Es muß sich ein gleichmäßiger und vollkommen transparenter Überzug auf die Folie aufbringen lassen, der vermöge der zahlreichen vorhandenen ungesättigten Reste kräftig mit monomeren Acrylamid reagiert.
• Es wurde nun gefunden, daß diese Anforderungen von Umsetzungsprodukten-erfüllt werden, die entstehen, wenn man polymere cyclische Säureanhydride in Reaktion bringt mit ungesättigten Alkoholen, mit ungesättigten primären oder sekunaären aliphatischen Aminen oder schließlich mit C=C-Doppelbindungen enthaltenden Epoxiden. Die so erhaltenen Produkte sind also hochpolymere Substanzen, welche eine Vielzahl von ungesättigten Resten enthalten wie im nachfolgenden Formelschema I, II und III gezeigt.
• Die als Ausgangsmaterial benützten polymeren cyclischen Säureanhydride sind in verschiedenen Handelsformen verfügbar, vor allem als Kopolymere von Maleinsäureanhydrid mit ungesättigten aliphatischen Verbindungen vom Typ CH2 = CH - R, wobei bei den drei in dieser Patentanmeldung genannten Handelsprodukten der Rest R gemäß Formel I bis-III gestaltet ist.
• I R = OCOCH: - "Coplex" (Wacker Chemie, Burghausen) II R = C16H1:' "PA-18" (Gulf Oil Chemical Corp., Shawnee Emission, KS USA) III R = OCH3: - "Gantrez AN" (GAF ( Deutschland ) GmbH, Hamburg) Die erhaltenen Umsetzungsprodukte dieser Kopolymeren von Maleinsäurenanhydrid mit ungesättigten Alkoholen, Aminen oder Epoxiden sind nur in Flüssigkeiten wie Dimethylformamid oder Dimethylsulfoxid löslich. Zur Herstellung von Lack-Konzentraten werden die Reaktionspartner daher als Lösungen in Dimethylformamid zusammengebracht, in welchem sie bei Zimmertemperatur schon in kurzer Zeit reagieren, was am Anstieg der Viskosität und am Verschwinden der freien OH- oder NH-Gruppen zu verfolgen ist. Die Lösung des so gebildeten Lackes wird anschließend m.-it Aceton soweit verdünnt, daß der Dimethylformamid-Gehalt noch ausreicht, ihn in Lösung zu halten, daß andererseits aber die Lösung aufgrund ihres Acetongehaltes günstigere Eigenschaften aufweist, nämlich niedrige Viskosität und leichte Verdunstbarkeit.
• Die Beschichtung der Polyesterfolien erfolgt durch einfaches Durchziehen in Tauchbädern und anschließendes Festbrennen bei 1100C.
• Beispiele 1) Umsetzung des Kopolymers von Maleinsäureanhydrid und Hexadecen-l mit Allylalkohol.
• 350 g (1/n mol, n = Zahl der Monomeren im Kopolymer) Maleinsäureanhydrid-Hexadecen-1-Kopolymer (PA-18) wurden unter fortgesetztem Rühren in 7 1 Dimethylformamid gelöst. Dann wurden 120 g (2 mol) Allylalkohol zugesetzt und das Gemisch über Nacht stehen gelassen.
• 2) Umsetzen des Kopolymers von Maleinsäureanhydrid und Vinylmethylether mit Diallylamin.
• 150 g (i/n mol) Kopolymer von Maleinsäureanhydrid und VinylmethJrlether (Gantrez - AN) wurden in 3 1 Dimethylformamid unter Rühren aufgelöst. Sodann wurden IOC g (g. mol) T)iallylamin zugegeben. Die Reaktionsmischung färbte sich vorüter gehend tiefrot. Nach 24 Stunden haben die Komponenten ausreagiert, die Reaktionsmischung ist nunmehr gelblich oder hellrötlich.
• 3) Umsetzen des Copolymers von Maleinsäureanhydrid und Vinylacetat mit Allylglycidether.
• 195 g (l/n mol) wurden in 5 1 Dimethylformamid gelöst und so langsam mit 330 g (3 mol) Allylglycidether versetzt, da2 die Temperatur nicht über 350C stieg. Die Reaktionsmischung wurde alsdann 24 Stunden stehen gelassen.
• tÇ Beschichten von Polyesterfolien mit erfindungsgemäß hergestellten Haftvermittler-Lackschichten.
• Eine Folie aus Ethylenglycol - Terephthalsäure-Kopolymeri.
• sat (MylarR) wurde mit einer Geschwindigkeit von 2 cm/sek.
• durch eine Haftvermittler-Lösung (gem. Beisp. 1 - 3) gezogen, welche aus dem Konzentrat durch Verdünnen mit Aceton auf eine Konzentration von 0,1 g/l Festsubstanz gebracht worden war. Die aus der Lösung kommende Folie wurde senkrecht nach oben geführt, so daß bei der langsamen Durchlurtgeschwindigkeit der größte Teil der Lösung Zeit hatte, als zusammenhängender Film von der Folie glatt abzulaufen.
• Etwa 40 cm über dem Flüssigkeitsspiegel begann ein 1 m langer Tunnel, durch welchen die Folie senkrecht nach oben stieg und welcher mittels dampfbeheizter Kupferschlangen auf 110 0C temperiert war. Das erhaltene Material wurde aufgewickelt und vor der Verwendung mindestens 24 Stunden aufbewahrt.
• Anwendungsbeispiele 1) Das Monomer wurde gemäß Beispiel 1 - 4 aufgebracht und die beschichtete Folie auf eine befeuchtete Glasplatte gleicher Größe mittels einer Gummiwalze aufgepreßt, so daß sie völlig glatt am Glase auflag. Bs wurde ein Dichtungsrahmen aus 0,5 - 2 mm dickem Silikongummi aufgelegt, darauf eine Glasplatte, welche zur Abweisung des gebildeten wäßrigen Polyacrylamid-Gels mit einem Silikonöl (Polymethylsiloxan) benetzt war. Das Ganze wurde mit Metallklammern zusammengehalten, so daß eine rechteckige Küvette entstand, in welche nunmehr durch eine Öffnung im Dichtungsrahmen die Lösung von monomeren Acrylamiden mittels Kanüle eingespitzt wurde und welche folgende Zusammensetzung hatte: 50 g/l Acrylamid 1,7 g/l Methylenbisacrylamid 0,8 g/l Ammoniumpersulfat 2,5 g/l Tetramethylethylendiamin Ammoniumpersulfat und Tetramethylethylendiamin sind Katalysatoren und wurden kurz vor dem Gießen des Acrylamides zugegeben. Nach 5 - 10 Minuten war die Lösung in der Küvette erstarrt. Die Gießvorrichtung konnte nun auseinandergenommen werden, der Polyacrylamid-Film ist auf der Mylar-Folie aufpolymerisiert. Es zeigte sich, daß solche Filme nicht vom Polyester abgelöst werden, wenn man sie jeweils 24 Stunden in Methanol-Essigsäure-Wasser-Mischung 40:10:50 schüttelt und auch wenn man sie anschließend eintrocknen läßt. Ein bequemer und schneller Test besteht darin, daß man auf die frisch gebildete Schicht aus Polyacrylamid-Gel ein Blatt Filterpapier auflegt, dieses andrückt und dann abzieht. Bei einem guten Haftvermittler muß die Schicht aus Polyacrylamid-Gel so fest sitzen, daß sie beim Abziehen des Papiers zerrissen wird, ein Teil also noch auf der Polyesterfolie verbleibt und dieser ein rauhes Aussehen gibt. Bei unbefriedigenden Haftvermittlern lassen sich die Schichten glatt von der Polyesterfolie abziehen und geben deren glänzende Oberfläche frei.
• 2) Eine mit Haftvermittler versehene Folie wird gemäß Anwendungsbeispiel 1 mit einer 0,5 mm dicken Schicht aus Polyacrylamid-Gel beschichtet, welche außerdem 2% (bezogen auf Festgehalt) einer Mischung aus amphoteren Verbindungen gemäß DE-PS 2 137 617 enthält. Sie wird auf die Abmessung 12 x 12 cm zugeschnitten und auf eine auf 5 - 10 0C gekühlte isolierte Unterlage gelegt. Die Unterlage befindet sich in einer elektrisch isolierten Kammer.
• Nunmehr werden auf den zwei gegenüberliegenden Seiten des quadratischen Zuschnittes zwei mit verdünnter Säure oder Lauge befeuchtete Streifen aus Filterkarton gelegt, darauf Platinelektroden gebracht und ein in Wasser gelöstes Proteingemisch auf die Schicht aufgetragen. Unter Einwirkung eines von den Platinelektroden ausgehenden elektrischen Gleichspannungsfeldes, wobei die Gleichspannung anfangs 240 V im Laufe von 1 - 2 Stunden bis auf 2000 V gesteigert wird, beobachtet man na&n einiger Zeit eine Auftrennung der: Proteine. Nach Beendigung der Trennung wird die Schicht folgenden Prozeduren unterworfen: 1) Einlegen in 12%ige Trichloressigsäure, mindestens 15 Mtruten lang.
• 2) Waschen mit Methanol-Essigsäure-Wasser-Mischung gemäß Anwendungsbeispiel 1 (2 x 30 Minuten).
• 3) Färben mit Eiweißfarbstoff (z.B. C,5 g/l color Index Acid Blue 83 im Lösungsmittel gemäß Anwendungsbeispiel 1. 30 Minuten.
• 4) Waschen mit zwei Passagen Methanol-Essigsäure-Wasser-Mischunggemäß Anwendungsbeispiel 1. 2 x 60 Minuten.
• 5) Trocknen an der Luft für eine Stunde.
• Als Endergebnis hat man ein Präparat, welches Muster der aufgetrennten Proteine in dunkelblauer Farbe zeigt. Die aufgetrocknete Schicht aus Polyacrylamid-Gel ist jetzt nur noch.
• ca. 5 µ dick.

Claims (7)

1. Patentansprüche 1) Lackartige Haftvermittler zur Haftverbesserung von wäßrigen Polyacrylamid-Gelen auf glatten Kunststoff-Folien, dadurch gekennzeichnet, daß sie aus polymeren Verbindungen mit ur.-gesättigten Molekülresten bestehen, die zur Addition von Acrylamid in Gegenwart von Katalysatoren befähigt sind.
2. 25 Haftvermittler nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet,da? sie aus Umsetzungsprodukten der Kopolymeren nach Maleinsäureanhydrid und ungesättigten aliphatischen Verbindungen vom Typ CH2=CH-R mit ungesättigten Alkoholen, z.B. Allylalkohoi, bestehen.
3. )) Haftvermittler nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, oaß aus Umsetzungsprodukten der Kopolymeren von Maleinsäurean:.ydrid und ungesättigten aliphatischen Verbindungen mit Allylglycidester bestehen.
4. 4) Haftvermittler nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß sie aus Umsetzungsprodukten der Kopolymeren von Maleins-^-ureanhydrid und ungesättigten aliphatischen Verbindungen mit ungesättigten aliphatischen Aminen, z.B. Allylamin oder I allylamin bestehen.
5. 5) Verwendung der Haftvermittler nach Anspruch 3 bis 4 zur ehandlung von Kunststoff-Folien, dadurch gekennzeichnet, aß man die gelösten Haftvermittler als gleichmäßigen Film von der Kunststoff-Folie abrinnen läßt.
6. 6) Verwendung der Haftvermittler nach Anspruch 3 bis 5 zur Herstellung von festhaftenden Schichten der wäßrigen Gele von kopolymerisiertem Acrylamid und Methylenbisacrylamid als Quervernetzer an einer nach Anspruch 1 bis 5 mit Haftvermittler belegten Folienoberfläche, dadurch gekennzeichnet, daß man die Acrylamid-Monomeren in Gegenwart von Katalysatoren in Kontakt mit der so behandelten Folie polymerisiert.
7. 7) Verwendung der nach Anspruch 1 bis 6 hergestellten Schichten aus wäßrigen Polyacrylamid-Gelen für die Elektrophorese von hochmolekularen Natur stoffen.