DE3028919C2 - - Google Patents
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Description
Die vorliegende Erfindung betrifft Human-Fibroblasten-
Interferon und dieses enthaltende pharmazeutische Präparat sowie ein Verfahren zu
dessen Herstellung durch eine Kombination von Affinitäts-
Chromatographie und Hochdruck-Flüssigkeitschromatographie
(HPLC).
Das Human-Fibroblasten-Interferon der vorliegenden Erfindung ist insbesondere
frei von Natriumdodecylsulfat und gekennzeichnet durch
- (a) homogene Form;
- (b) eine spezifische Aktivität von etwa 4×10⁸ Einheiten/mg;
- (c) ein Molekulargewicht von etwa 20 500 gemäß Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese;
- (d) die folgende relative Aminosäurezusammensetzung (±15%) basierend auf 24stündiger Hydrolyse in 6,0N HCl, enthaltend 0,2% Thioglycolsäure (bezogen auf einen Wert für Leucin von 22,0):
- (e) die Aminosäure-Teilsequenz
H₂N-Met¹-Ser-Tyr-Asn-Leu⁵-Leu-Gly-Phe-Leu-Gln¹⁰-Arg-Ser- Ser-Asn-Phe¹⁵-Gln-. . .-Gln-Lys¹⁹-. . . und - (f) höchstens 3 Glucosaminreste, 0 Galaktosamin- und 0 Mannosaminreste pro Molekül.
Seit seiner Entdeckung durch Isaacs und Lindenmann
im Jahre 1957 hat das Interferon, sowohl aus Leukozyten
wie aus Fibroblasten, während zwei Jahrzehnten Versuchen
von Forschern in der ganzen Welt erfolgreich widerstanden,
es als homogenes Peptid in solchen Mengen zu isolieren,
die eine Charakterisierung und Bestimmung seiner spezifischen
biologischen und chemischen Eigenschaften erlauben.
Während verschiedene Autoren beanspruchen, Mäuse-
oder Human-Interferone bis zur Homogenität gereinigt zu
haben, werden von ihnen keine der klassischen Beweise für
die Homogenität von Proteinen geliefert oder Eigenschaften
der angeblich reinen Verbindungen beschrieben.
Die Anwendung von HPLC zur Reinigung von Proteinen ist
allgemein bekannt. In der Literatur sind insbesondere Säulentypen
für die Ionenaustausch- und Ausschluß-Chromatographie
zur Reinigung von Proteinen beschrieben (z. B. Regnier und
Noel, J. Chromatog. Sci. 14, 316 [1976], und Chang et al.,
Anal. Biochem. 48, 1839 [1976]). In der Umkehrphasen-
Chromatographie wurde z. B. Lichrosorb RP-18 (Säulen auf
der Basis von Octadecyl-modifiziertem SiO₂) erfolgreich
zur Reinigung von Peptiden, wie β-Endorphin, verwendet
[siehe z. B. Rubinstein et al., Proc. Natl. Acad. Sci.
USA, 74, 4969-72 (1977)].
Es ist ferner bekannt, daß man die Affinitäts-
Chromatographie zur Reinigung von Human-Fibroblasten-
Interferon heranziehen kann. So beschreiben Davey et al.,
J. Biol. Chem. 251, 7620 (1976), die Verwendung von
Concanavalin A-Sepharose 4B bei der Herstellung von gereinigtem
Human-Fibroblasten-Interferon. Jankowski et al.,
Biochemistry 15, 5182 (1976), verwenden Blau Dextran-
Sepharose zu dem gleichen Zweck. Schließlich gelingt gemäß
US-Patent 41 72 071 (de Maeyer et al.) die Reinigung
verschiedener roher Lösungen von Leukozyten- und Fibroblasten-Interferon
durch Affinitätschromatographie an
einer Blau Dextran-Sepharose-Säule, wobei Präparate mit
einer spezifischen Aktivität zwischen 1 und 5×10⁸ internationale
Interferon-Einheiten erreicht werden. Zusätzliche
Reinigungsschritte werden nicht offenbart, und die
erhaltenen Interferon-Präparate sollen noch einen hohen
Anteil an Produkten mit Interferon-ähnlicher Aktivität
enthalten und lediglich zu einem großen Teil von verunreinigenden
Proteinen befreit sein.
In Proc. Natl. Acad. Sci. USA 73,
520-523 (1976) wird von Knight die Reinigung
von Human-Fibroblasten-Interferon durch Fraktionierung
an Carboxymethyl-Sephadex und präparative Polyacrylamid-
Gelelekrophorese in Gegenwart von Natriumdodecylsulfat
(SDS-PAGE) beschrieben, wobei ein Produkt resultierte mit
einer auf mindestens 2×10⁸ Einheiten/mg veranschlagten
spezifischen Aktivität und einem gelelektrophoretisch ermittelten
Molekulargewicht von 20 000. Es wird festgestellt,
daß es sich hinsichtlich der Molekulargröße um eine homogene
Substanz handelt. Die Frage, ob es sich bei diesem
Produkt aber bereits um eine reine Verbindung handelt, d. h.
einerseits um Fibroblasten-Interferon frei von Verunreinigungen
durch andere Glykoproteine gleichen Molekulargewichts
(S. 522, rechte Kolonne) oder andererseits um chemisch einheitliches
Material (S. 523, linke Kolonne), wurde ausdrücklich
offengelassen. Während die vorliegende Erfindung
ausdrücklich auf ein chemisch einheitliches Material abstellt
(siehe Angabe der Aminosäurenzusammensetzung und Angabe
einer Partialsequenz) ist von einem solchen in der Knight-
Publikation ausdrücklich nicht die Rede. Ein
wesentlicher Unterschied beider
Produkte liegt darin, daß Knight Komplexe des Fibroblasten-
Interferons mit Natrium-dodecylsulfat (SDS) erhielt, weil
er als letzte Stufe der Reinigung eine präparative SDS-PAGE
verwendete. Das erfindungsgemäße Reinigungsverfahren vermeidet
eine solche Stufe und liefert von SDS völlig freies Fibroblasten-Interferon. Die im Zusammenhang mit der
vorliegenden Erfindung angewandte SDS-PAGE diente lediglich
analytischen Zwecken bzw. Zwecken der Molekulargewichtsbestimmung.
Beim SDS handelt es sich um eine hämolytisch wirkende
und stark toxische Verbindung und der Gehalt eines
Interferons an 0,05-1,0% SDS ist für dessen pharmazeutische
Anwendung prohibitiv (vgl. z. B. US-PS 44 62 940).
Das erfindungsgemäße Verfahren zur Herstellung
von Human-Fibroblasten-Interferon als homogenes
Protein betrifft eine Kombination von Affinitäts-Chromatographie
und HPLC und ist dadurch gekennzeichnet, daß
eine wäßrige Lösung von Human-Fibroblasten-Interferon in
unreinem Zustand zunächst der Affinitäts-Chromatographie an
Concanavalin A-Sepharose oder Blau Dextran Sepharose und
die erhaltenen Interferon-Fraktionen dann der ein- oder mehrmaligen
HPLC an Säulen auf der Basis einer durch Cyclohexyl-
oder Octylgruppen modifizierten SiO₂-Matrix unterworfen werden,
wobei im Fall von vorhergehender Concanavalin A-Sepharose-Chromatographie
die Ausgangszusammensetzung des bei der
HPLC verwendeten Elutionsmittelgemischs Pyridin/Ameisensäure/
Isopropanol/n-Butanol-/Wasser 8 : 8 : 20 : 0 : 64 (Vol.-%) ist und mit
einem Isopropanol/n-Butanol-Gradienten gearbeitet wird, so
daß die Endzusammensetzung des Elutionsmittelgemischs
8 : 8 : 25 : 20 : 39 (Vol.-%) ist, während im Fall von vorhergehender
Blau Dextran Sepharose-Chromatographie die Ausgangszusammensetzung
des bei der HPLC verwendeten Elutionsmittelgemischs
Pyridin/Ameisensäure/Isopropanol/n-Butanol/
Wasser 8 : 8 : 20 : 3,3 : 60,7 (Vol.-%) ist und mit einem Isopropanol/
n-Butanol-Gradienten gearbeitet wird, so daß die Endzusammensetzung
des Elutionsmittelgemischs ebenfalls 8 : 8 : 25 : 20 : 39
(Vol.-%) ist.
Für die Affinitäts-Chromatographie-Stufe des vorliegenden
Verfahrens kann Concanavalin A-Sepharose 4B oder
Blau Dextran-Sepharose verwendet werden, wobei letztere
bevorzugt ist, im Hinblick auf wesentlich höhere Ausbeuten
und ein stabileres Endprodukt.
Für die Durchführung der Affinitäts-Chromatographie
unter Verwendung von Concanavalin A-Sepharose 4B kann die
folgende allgemeine Arbeitsvorschrift angegeben werden:
- (a) 20-30 Säulenvolumina rohen Human-Fibroblasten-Interferons (spezifische Aktivität etwa 10⁴ Einheiten/mg) in Eagle's Minimalmedium, enthaltend 5% fötales Kälberserum, werden auf eine Concanavalin A-Sepharose 4B-Säule bei einer Durchflußrate von 30-60 cm/Stunde gepumpt;
- (b) es wird mit Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (PPK) vom pH 7,2 gewaschen;
- (c) es wird mit PPK-0,1M α-Methylmannosid (α-MM) gewaschen und
- (d) es wird mit PPK-0,1M α-MM, enthaltend 50% Ethylenglykol (V/V), eluiert.
Das nach Schritt (d) erhaltene gereinigte Interferon
weist eine spezifische Aktivität von etwa 10⁷ Einheiten/mg
auf bei einer Ausbeute von etwa 10-30%.
Für die Durchführung der Affinitäts-Chromatographie
unter Verwendung von Blau Dextran-Sepharose kann die
folgende allgemeine Arbeitsvorschrift angegeben werden:
- (a) 10-40 Säulenvolumina eines Kultur-Überstandes (1-3×10⁴ Einheiten/ml, 0,2-1 mg Protein/ml) werden durch Zusatz von gesättigter NaCl-Lösung auf einen Gehalt von 1,25M NaCl eingestellt und auf die Säule gepumpt bei einer linearen Durchflußrate von 20-40 cm/Stunde;
- (b) die Säule wird mit 5-15 Säulenvolumina von 1M NaCl/ 0,02-0,05M Phosphat und dann mit 5-15 Säulenvolumina von 1M NaCl/0,02-0,05M Phosphat, enthaltend 15% (V/V) Ethylenglykol (pH 7,2) gewaschen und
- (c) Interferon wird mit 1M NaCl/0,02-0,05M Phosphat, enthaltend 50% (V/V) Ethylenglykol (pH 7,2) eluiert.
Das erhaltene Interferon hat eine spezifische Aktivität
von etwa 3×10⁶ Einheiten/mg und kann in diesem Schritt
in einer Ausbeute von etwa 80% erhalten werden.
Die in der Affinitäts-Chromatographie verwendete Blau
Dextran-Sepharose kann durch Kupplung von Blau Dextran
(an Dextran gekoppeltes Cibacron Blau F3GA) an CNBr-aktivierte
Sepharose 4B bei pH 9,5 erhalten werden.
Dieses Kupplungsverfahren ist, genauso wie das
Waschen und Altern des Harzes und die Beladung und Elution
der Säule, von entscheidender Bedeutung, um maximale Ausbeuten
und ein hochreines Human-Fibroblasten-Interferon
zu erhalten.
Stammt das Interferon aus einem Serum-freien Medium,
so wird seine Reinigung durch ein- oder zweimalige Passage
durch eine Blau Sepharose-4B-Säule und Elution mit einer
gepufferten wäßrigen Lösung von Ethylenglykol (30-50%,
V/V, pH 7,2) erreicht.
Zur weiteren Reinigung des Interferons wird es nach
der Affinitäts-Chromatographie ein- bzw. mehrmaliger präparativer
HPLC mit hoher Auflösung und hoher Ausbeute unterworfen.
Für die HPLC werden Säulen auf der Basis einer
porösen SiO₂-Matrix, an die Cyclohexyl- oder Octylgruppen
gebunden sind,
verwendet. Mittels dieser Säulen, die nacheinander und
unter verschiedenen pH-Bedingungen sowie mit unterschiedlichen
Gradienten des organischen Elutionsmittels verwendet
werden können, kann das Human-Fibroblasten-Interferon bis
zur Homogenität gereinigt werden. Homogenität des Interferons
ist dann gegeben, wenn bei der Natriumdodecylsulfat
(NaDodSO₄)-Polyacrylamid-Gelelektrophorese ein einziges
Band erhalten wird, eine konstante spezifische Aktivität
erreicht ist und bei der HPLC ein einzelner Peak erhalten
wird, mit übereinstimmenden Aktivitäts- und Protein-Banden.
Die Chromatographie-Säulen auf der Basis einer unregelmäßig
geformten, völlig porösen SiO₂-Matrix (Partikelgröße
etwa 10 µ, Porengröße etwa 10-5 mm), die Cyclohexyl- oder
Octylgruppen enthält,
sind im Handel erhältlich. Ein geeignetes HPLC-System ist
im US-Patent Nr. 41 16 046 (Stanley Stein) beschrieben.
Gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren wird die durch
die Affinitäts-Chromatographie gereinigte Lösung des Human-
Fibroblasten-Interferons in einem wäßrigen Puffer vom
pH 4-8 über die SiO₂-Säule geschickt. Ein für diesen Zweck
bevorzugter Puffer ist ein Gemisch aus Pyridin/Ameisensäure/Wasser
(8 : 8 : 84, V/V). Gewöhnlich wird unter Druck
vorzugsweise im Bereich von 3,4 bis etwa 340 atm. gearbeitet.
Das an die Säule gebundene Interferon wird anschließend
in selektiver Weise eluiert unter Verwendung eines
wäßrigen Puffergemisches mit einem Gradienten eines mit
Wasser mischbaren organischen Lösungsmittels. Als geeignete,
mit Wasser mischbare organische Lösungsmittel kommen vor
allem Alkanole wie n-Propanol, Isopropanol, n-Butanol,
tert.-Butanol, Ethanol und Methanol in Frage. Besonders
geeignet für die Elution von Human-Fibroblasten-Interferon
ist ein Gemisch aus Propanol und Butanol.
Das Eluat wird in üblicher Weise fraktioniert und der
Proteingehalt der einzelnen Fraktionen wird ständig durch
hochempfindliche Monitore registriert. Ein für diesen
Zweck geeignetes System haben Bohlen et al., Anal. Biochem.
67, 438 (1975), bechrieben (vgl. auch US-Patent
Nr. 38 76 881).
Die Wahl des für die HPLC geeignetsten Harzes hängt
von der Herkunft und Reinheit des Human-Fibroblasten-
Interferons ab. Material, das von einer Concanavalin A-
Sepharose-Säule stammt, wird zweckmäßigerweise duch HPLC
an einer Cyclohexyl-modifizierten SiO₂-Säule und anchließend
an einer Occtyl-modifizierten SiO₂-Säule bis zur Homogenität
gereinigt. Andererseits wird Material, das von
einer Blau Dextran-Säule stammt, mittels ein- oder mehrmaliger
Passagen durch eine Octyl-modifizierte SiO₂-Säule
oder mittels Passage durch eine Octyl-modifizierte sowie
eine Cyanopropyl-modifizierte SiO₂-Säule und schließlich,
sofern notwendig, eine Diphenyl-modifizierte SiO₂-Säule
bis zur Homogenität gereinigt. Stammt das Material aus
einem Serum-freien Präparat und wird die Affinitäts-
Chromatographie an einer Blau Sepharose-4B-Säule durchgeführt,
so genügt eine einmalige Passage durch eine Octyl-
modifizierte SiO₂-Säule, um Homogenität zu erreichen.
Im Hinblick auf die Empfindlichkeit von Human-Fibroblasten-Interferon
gegenüber organischen Lösungsmitteln,
wie Propanolen, Butanol oder 2-Methoxyethanol, bei neutralem
pH, wurde die Chromatographie bei sauren pH-Werten
durchgeführt. Da Human-Fibroblasten-Interferon hydrophober
ist als Leukozyten-Interferon und da ferner andere, mehr
hydrophobe Proteine in den teilweise gereinigten Fibroblasten-Interferon-Präparaten
vorliegen, bewährte sich ein
Gemisch aus Propanol und Butanol als Elutionsmittel in
der HPLC an den verwendeten Umkehrphasen am besten. Die
Verwendung dieses Gemisches erlaubte es, den Gehalt an
organischem Lösungsmittel zu begrenzen und dadurch weniger
Artefakte im Eluat zu erhalten.
Das gemäß vorliegender Erfindung erhaltene homogene
Human-Fibroblasten-Interferon wurde nach der jeweils
letzten HPLC-Säule in Form eines einzelnen Peaks isoliert
und lieferte ein einzelnes enges Band bei der NaDodSO₄-
Polyacrylamid-Gelelektrophorese in Gegenwart von 2-Mercaptoethanol.
Die Extraktion des Gels lieferte einen einzigen
Peak antiviraler Aktivität, der mit der Proteinbande übereinstimmte.
Jeder übliche Assay zur Bestimmung von Human-
Fibroblasten-Interferon-Aktivität kann zu diesem Zweck
verwendet werden.
Das Molekulargewicht des homogenen Human-Fibroblasten-
Interferons, bestimmt durch Polyacrylamid-Gelelektrophorese,
betrug etwa 20 500. Die spezifische Aktivität des gereinigten
Materials war etwa 4×10⁸ Einheiten/mg.
Die folgende N-terminale Partialsequenz konnte an
einer Probe von homogenem Human-Fibroblasten-Interferon
festgestellt werden:
Met¹-Ser-Tyr-Asn-Leu⁵-Leu-Gly-Phe- Leu-Gln¹⁰-Arg-Ser-Ser-Asn-Phe¹⁵-Gln-. . .-Gln-Lys¹⁹-. . .
Met¹-Ser-Tyr-Asn-Leu⁵-Leu-Gly-Phe- Leu-Gln¹⁰-Arg-Ser-Ser-Asn-Phe¹⁵-Gln-. . .-Gln-Lys¹⁹-. . .
Interferone besitzen antivirale, Antitumor-, wachstumshemmende
und immunsupressive Aktivität. Diese Aktivitäten
konnten sogar in klinischem Maßstab festgestellt werden
bei Verabreichung von 1-10×10⁶ Einheiten/Tag mit relativ
unsauberen Präparaten, die weniger als 1% Human-Interferon
enthielten. Das gereinigte homogene Human-Fibroblasten-
Interferon der vorliegenden Erfindung kann in der gleichen
Weise, wie bereits von Interferon-Präparaten bekannt, verwendet
werden, unter Anpassung der Dosierung an den gesteigerten
Reinheitsgrad.
Die Verfahrens- und Produktaspekte der vorliegenden
Erfindung werden durch die folgenden Beispiele illustriert.
Alle in Einheiten/ml oder Einheiten/mg angegebenen Interferon-Titer
beziehen sich auf einen Standard für Human-
Leukozyten-Interferon (GO23-901-527) des US National
Institutes of Health.
50 ml Concanavalin A-Sepharose 4B (äquilibriert mit
PPK vom pH 7,2, enthaltend 0,1M α-MM) wurde in eine 50 ml
Polypropylen-Säule mit einer Polyethylenfritte gepackt.
Es wurde mit 1,25 l roher Interferon-Lösung (2×10⁷ Einheiten,
spezifische Aktivität 2×10⁴ Einheiten/mg) bei
einer Durchflußrate von 180 ml/Stunde (35,5 cm/Stunde)
beladen. Die Säule wurde dann mit 150 ml PPK und mit 600 ml
PPK, enthaltend 0,1M α-MM, gewaschen. Das Interferon wurde
schließlich mit dem obigen Puffer, enthaltend 50% (V/V)
Ethylenglykol, eluiert. Ausbeute 9% (1,8×10⁶ Einheiten,
spezifische Aktivität etwa 1×10⁷ Einheiten/mg). Bei
einer größeren Bandbreite des Peaks werden unter Einschluß
weiterer Fraktionen 15% Ausbeute erhalten (3×10⁵
Einheiten, spezifische Aktivität 2-4×10⁶ Einheiten/mg).
120 ml des Eluates der Concanavalin A-Sepharose 4B-
Säule (2,5×10⁶ Einheiten, etwa 2-4×10⁶ Einheiten/mg)
wurden bei einer Durchflußrate von 0,4-0,8 ml/Min. direkt
auf eine 4,6×300 mm-Säule auf der Basis einer Cyclohexylgruppen
enthaltenden SiO₂-Matrix (Chromegabond 10 µ),
die vorher mti einem Gemisch von Pyridin/Ameisensäure/Isopropanol/Wasser
(8 : 8 : 20 : 64; V/V; Puffer A) äquilibriert
wurde, gegeben, wobei der maximale Druck unter 306 atm.
gehalten wurde. Das für die HPLC verwendete System entsprach
im wesentlichen dem von Bohlen et al. (Anal. Biochem.
67, 438 [1975]) beschriebenen.
Bei einer Durchflußgeschwindigkeit von 0,4 ml/Min.
wurde der folgende Gradient, ausgehend vom Puffer A, für
Puffer B (Pyridin/Ameisensäure/Isopropanol/n-Butanol/
Wasser, 8 : 8 : 25 : 20 : 39, V/V) verwendet: 0-25% B, 32 Min.;
25-60% B, 225 Min.; 60-100% B, 63 Min. Es wurden Fraktionen
zu 2,0 ml gesammelt. Die vereinigten Fraktionen 26-29
(2×10⁶ Einheiten) wurden mit 4 ml Pyridin/Ameisensäure
verdünnt und direkt auf eine 4,6×300 mm-Säule auf der
Basis einer Octylgruppen enthaltenden SiO₂-Matrix
(Chromegabond 10 µ) gegeben. Es wurde unter den für die
Cyclohexylsäule angegebenen Bedingungen eluiert. Die spezifische
Aktivität im Zentrum des Aktivitäts-Peaks war etwa
4×10⁸ Einheiten/mg bei einer Gesamtausbeute an gereinigtem
Human-Fibroblasten-Interferon von 10⁶ Einheiten.
Das an einer Concanavalan A-Säule gereinigte Interferon
wird bei der HPLC an einer Cyclohexylgruppen- bzw.
einer Octylgruppen-tragenden Säule sehr nahe beim Haupt-
Peak eluiert. Wird bei der HPLC zuerst an der Octyl-Säule
chromatographiert, so wird das Interferon direkt vor dem
Haupt-Peak eluiert, während es bei Verwendung einer Cyclohexyl-Säule
als erster Säule unmittelbar nach dem Haupt-
Peak eluiert wird.
Proben des HPLC-gereinigten Human-Fibroblasten-Interferons
wurden an 12,5 oder 15% NaDodSO₄-Polyacrylamid-Gel
in Tris/Glycinpuffer der Elektrophorese unterworfen (1 µg
Protein). Nach Anfärbung mit Coomassie Blau wurde ein
einziges Band erhalten. Durch Assay auf antivirale Aktivität
wurde festgestellt, daß das Maximum dieser Aktivität
im Zentrum der gefärbten Bande lag. Das Molekulargewicht
wurde mit etwa 20 500 bestimmt unter Verwendung von Rinderserumalbumin,
Chymotrypsin, Cytochrom C und Ribonuclease
als Vergleichssubstanzen. Die relative Beweglichkeit der
Human-Fibroblasten-Interferon-Bande war nicht von der
Anwesenheit von Mercaptoethanol in der Probe abhängig.
50 g bepackte Sepharose 4B wurde mit 1 l Wasser gewaschen
und nochmals in 50 ml destilliertem Wasser suspendiert.
Es wurden 15 g fein verteiltes CNBr unter leichtem
Rühren zugesetzt und der pH-Wert auf 11±0,2 durch
tropfenweise Zugabe von 10N NaOH eingestellt. Die Temperatur
wurde durch Zugabe von Eis auf 20±5°C gehalten. Nach
15-20 Minuten wurde mit einem Volumen-Eiswasser versetzt
und die Suspension auf einem Buchner-Trichter nochmals mit
5 Volumina 0,01N HCl gewaschen.
Das aktivierte Harz wurde sofort in 50 ml 0,4M Natriumcarbonatpufffer
(pH 9,5), enthaltend 1,00 g gelöstes Blau
Dextran, suspendiert und über Nacht bei 4°C in einer Rundbodenflasche
geschüttelt. Es wurde mit 10 Volumina 1M NaCl,
2 Volumina 50% (V/V) Ethylenglykol, enthaltend 1M NaCl
und 0,05M Natriumphosphat (pH 7,2), gewaschen, über Nacht
in 50% (V/V) Ethylenglykol stehengelassen, mit einem
Volumenteil 80%igem (V/V) Ethylenglykol und 5 Volumina
Gibco No. 11 Minimalmedium (MEM) gewaschen und in diesem
Medium über Nacht bei 50°C aufbewahrt. Nach nochmaligem
Waschen mit 3 Volumina 80%igem (V/V) wäßrigem Ethylenglykol,
enthaltend 1M NaCl, und anschließend mit 2 Volumina
MEM wurd das Harz in MEM aufgeschlämmt und in eine Säule
übergeführt.
Ein Gemisch aus 1,5 l rohem Human-Fibroblasten-Interferon
(2×10⁴ Einheiten/ml; 1 mg Protein/ml; spezifische
Aktivität 2×10⁴ Einheiten/mg Protein) und 0,27 Volumina
gesättigter NaCl-Lösung (etwa 6,3M) wurde auf eine 50-ml-
Polypropylen-Säule mit einer Polythylen-Fritte, enthaltend
35 ml Blau Dextran-Sepharose 4B, bei einer Durchflußrate
von 100 ml/Stunde (20 cm/Stunde) gegeben. Die Säule wurde
nacheinander mit 200 ml 1M NaCl, enthaltend 0,05M Natriumphosphatpuffer
(pH 7,2) und 500 ml 1M NaCl, enthaltend 0,05M
Natriumphosphat (pH 7,2) und 75 ml Ethylenglykol, gewaschen
und schließlich mit 500 ml 1M NaCl, enthaltend
0,05M Natriumphosphat (pH 7,2) und 250 ml Ethylenglykol
eluiert. Etwa 90% des Interferons wurde in einem einzigen
Peak zusammen mit dem Durchbruch des 50% Ethylenglykol enthaltenden
Lösungsmittels eluiert. Die spezifische Aktivität
im Peak-Maximum, mit dem mehr als 50% des gesamten Interferons
eluiert wurde, lag bei 1×10⁷ Einheiten/mg.
(A) 125 ml von der Blau Dextran-Sepharose 4B-Säule eluierte
Interferon-Lösung (3×10⁷ Einheiten; 1×10⁷ Einheiten/mg)
wurden auf eine 4,6×300 mm Säule auf der Basis einer
Octylgruppen enthaltenden SiO₂-Matrix (Chromegabond 10 µ)
prä-äquilibriert mit 1M NaCl/50% (V/V) Ethylenglykol,
gepumpt. Bei einer Durchflußrate von 0,45 ml/Min. wurde,
ausgehend von Puffer A (Pyridin/Ameisensäure/Isopropanol/
n-Butanol/Wasser, 8 : 8 : 20 : 3,3 : 60,7, V/V), der folgende
Gradient beim Übergang zu Puffer B (Pyridin/Ameisensäure/
Isopropanol/n-Butanol/Wasser, 8 : 8 : 25 : 20 : 39, V/V) eingehalten:
0-25% B, 30 Min.; 25-55% B, 190 Min.; 55-100% B,
20 Min.; 100% B, 60 Min. Die Interferon-Aktivität stimmte
im wesentlichen überein mit einem einzigen Protein-Peak
in den Fraktionen 18-23 (jede Fraktion enthielt 1,5 ml
Elutionsflüssigkeit).
(B) Bei Applikation von etwa einem Viertel der in Stufe
(A) applizierten Menge an der gleichen Säule unter den für
die Cyclohexyl-Säule in Beispiel 1 beschriebenen Bedingungen,
stimmte die Interferon-Aktivität mit einem Protein-Peak
in den Fraktionen 24-26 überein.
(C) Unter den gleichen Bedingungen hinsichtlich Beladung,
Gradient und Durchflußmenge wie in (A) und den gleichen
Puffern A und B wie in (B) an einer Octylgruppen-enthaltenden
Säule (9,6×500 mm, Chromegabond), so daß ¹/₉ der
Beladung pro Kolonnenvolumen resultierte, wurde eine
bessere Trennqualität erreicht.
(D) Das Material, das die höchste spezifische Aktivität
(4×10⁸ Einheiten/mg) aus Verfahrensschritt (A) enthielt,
wurde rechromatographiert an einer Cyanopropylgruppen-enthaltenden
Säule unter Verwendung von Pyridin/Ameisensäure/
Wasser (8 : 8 : 84, V/V) und einem einstündigen Gradienten bezüglich
n-Propanol (0-40%, V/V), bei einer Durchflußrate
von 0,3 ml/Min. Es wurde ein symmetrischer Hauptpeak erhalten.
Elektrophorese wie in Beispiel 1 beschrieben von
Interferonproben, die in den Verfahrensschritten (A), (B)
und (C) erhalten wurden, lieferte eine Hauptbande vom
Molekulargewicht 20 500, die im Assay auf Interferon-Aktivität
mit der Mitte des Aktivitätspeaks übereinstimmte.
Eine zweite Bande, die ein Molekulargewicht von etwa 10 500
aufwies und 20-50% des gesamten Materials, bezogen auf die
Färbungsintensität, enthielt, variierte von Probe zu Probe
und besaß keine antivirale Aktivität. Wenn die Proben
nicht mit Mercaptoethanol behandelt wurden, wurde eine
Bande mit einem Molekulargewicht von 40 000 beobachtet,
die aber nur untergeordnete Aktivität aufwies. Die Aminosäureanalysen
der Banden mit den Molekulargewichten 20 000
und 40 000 unterschieden sich nicht, während die Analyse
derjenigen Bande, die ein Molekulargewicht von 10 000 aufwies,
sehr deutlich differierte.
Die Elektrophorese einer gemäß Verfahren (D) erhaltenen
Interferon-Probe lieferte ein Molekulargewicht
von etwa 20 500 und eine spezifische Aktivität von 4×10⁸
Einheiten/mg. Die Aminosäureanalyse dieses homogenen Peptids
lieferte nach 24stündiger Hydrolyse in 6N HCl die
folgenden, auf Leucin mit 25,0 bezogenen Werte:
(a) 5 l Kulturüberstand, enthaltend 19 400 Einheiten/ml
Fibroblasten-Interferon, wurden durch ein 0,3-µ-Filter
filtriert und dann auf eine Säule mit 275 ml Blau Dextran-
Sepharose gegeben. Der Überstand wurde vorher durch
Zugabe von 1350 ml einer gesättigten Lösung von NaCl
(6,3M) auf 1,25M NaCl eingestellt und auf die Säule bei
einer Durchflußrate von 360 ml/Stunde gepumpt. Etwa 4-6%
des Interferons passierten die Säule ohne adsorbiert zu
werden.
(b) Die Säule wurde dann bei einer Durchflußrate von
420 ml/Stunde mit 1300 ml einer wäßrigen Lösung, die
15% (V/V) Ethylenglykol, 1M NaCl und 0,02M Natriumphosphat
(pH 7,2) enthielt, gewaschen. Etwa 1% des adsorbierten
Interferons wurden von der Säule eluiert.
(c) Das Interferon wurde dann bei einer Durchflußrate von
420 ml/Stunde mit einer wäßrigen Lösung, die 50% (V/V)
Ethylenglykol, 1M NaCl und 0,02M Natriumphosphat (pH 7,2)
enthielt, eluiert. Mit den ersten 200 ml des Eluates wurde
wenig Interferon eluiert. Das meiste Interferon wurde mit
den nächsten 300 ml des Eluats eluiert, wie die folgende
Tabelle zeigt:
Es wurden insgesamt 114% der eingesetzten Interferon-
Aktivität wiedergefunden.
Die Fraktionen 2-6 der Blau Dextran-Sepharose-Kolonne
(250 ml; 13×10⁷ Einheiten; spezifische Aktivität 8,12×
10⁶ Einheiten/mg) wurden auf eine Säule (9,5×500 mm)
auf der Basis einer Octylgruppen-enthaltenden SiO₂-Matrix
bei einer Durchflußrate von 4 ml/Min. gepumpt. Während
12 Minuten wurde Puffer A (Pyridin/Ameisensäure/2-Propanol/
n-Butanol/Wasser, 8 : 8 : 20 : 2,5 : 61,5. V/V), bei einer Durchflußrate
von 2 ml/Min., durch die Säule gepumpt. Anschließend
wurde mit dem folgenden Gradienten bezüglich Puffer B
(Pyridin/Ameisensäure/1-Propanol/n-Butanol/Wasser,
8 : 8 : 25 : 25 : 34, V/V), bei einer Durchflußrate von
1,25 ml/Min., eluiert: 0-20% B, 18 Min.; 20-29% B, 57
Min.; 29% B isokratisch während 27 Min.; 29-30% B, 3 Min.;
30-100% B, 36 Min.; 100% B, 54 Min.
Die Interferon-Aktivität wurde im isokratischen Bereich
des Gradienten eluiert, und zwar gemeinsam mit einem
Peak der mit einem Fluorescamin-Monitor-System nachgewiesen
wurde. 45×10⁶ Einheiten Interferon (Ausbeute 35%)
mit einer spezifischen Aktivität von 2×10⁸ Einheiten/mg
wurden im Pool zusammengefaßt (50 ml)). Nach zweimonatiger
Aufbewahrung bei -20°C in verschlossenem Polypropylen-
Ampullen war die Aktivität auf 10% des Wertes nach HPLC
zurückgegangen. Proteinverlust trat nicht ein.
Dieser 50-ml-Peak (spezifische Aktivität etwa 0,2×
10⁸ Einheiten/mg) wurde mit 1 ml Thiodiglykol und 20 ml
n-Propanol versetzt. Mittels Assay wurden für dieses Gemisch
insgesamt 4,26×10⁶ Einheiten festgestellt. Dem
Gemisch wurden 100 ml 0,1% Triton X-100/0,3% Thiodiglykol
zugesetzt. Dieses Gemisch, das gemäß Assay insgesamt
5,1×10⁶ Einheiten enthielt, wurde innerhalb von 30
Minuten auf eine Säule auf der Basis einer CN-Gruppen-
enthaltenden SiO₂-Matrix (4,6×250 mm, 5 µ/8×10⁶ mm,
Spherisorb), äquilibriert mit einem Gemisch von Pyridin/
Ameisensäure/Wasser (8 : 8 : 84, V/V, Puffer A), bei einer
Durchflußrate von 1,5 ml/Stunde, gepumpt. Der folgende
Gradient bezüglich Puffer B (Pyridin/Ameisensäure/n-Propanol/Wasser,
8 : 8 : 50 : 34, V/V) bei einer Durchflußrate von
0,5 ml/Min. wurde eingestellt: 0-25% B, 30 Min.; 25-50% B,
210 Min. Die Interferon-Aktivität wurde mit dem einzigen
festgestellten Peak eluiert. Es wurden 4,2×10⁶ Einheiten
(82%) in drei 1-ml-Fraktionen wiedergefunden.
Dieser Pool, der 69% des gesamten, auf die erste CN-
Säule aufgegebenen Proteins darstellt, wurde mit 2 ml 0,1%
Triton X-100 vermischt und nochmals auf die gleiche CN-
Säule aufgegeben. Es wurde mit dem gleichen Gradienten in
der halben Zeit eluiert. Die gesamte Aktivität (11,75×
10⁶ Einheiten; Ausbeute 280%) wurde in einem einzigen Peak
eluiert.
Die die Interferon-Aktivität von der zweiten CN-Säule
enthaltenden Fraktionen (4 ml) wurden auf eine 4,6×250 mm-
Säule auf der Basis einer Diphenylgruppen-enthaltenden
SiO₂-Matrix, die vorher mit einem zweistündigen linearen
Gradienten von Puffer A zu Puffer B (gleiche Puffer wie
für die CN-Säule) vorbehandelt und mit Puffer A äquilibriert
war, bei einer Durchflußrate von 1,5 ml/Min.
gepumpt.
Es wurde der folgende Gradient bei einer Durchflußrate
von 0,5 ml/Min. verwendet: 0-25% B, 22 Min.; 25-50%,
98 Min. Der zweite Peak, der eluiert wurde, als das Gradient-Instrument
33% Puffer B anzeigte, stimmte mit dem
Interferon-Aktivitäts-Peak überein. Es wurden insgesamt
2,6×10⁶ Einheiten (22%)und 40 µg Protein mit diesem
Peak eluiert.
Die Diphenylgruppen-tragende SiO₂-Säule wurde folgendermaßen
hergestellt:
SiO₂ (10-2 mm, 10-5 mm Porengröße) wurde in 6N HCl
(10 : 1, V/G) während 24 Stunden unter gelegentlichem Schütteln
eingeweicht. Es wurde dann mit Wasser neutral gewaschen
und anschließend durch Waschen mit Aceton und
Methanol das Wasser entfernt. Nach Trocknen unter vermindertem
Druck über Nacht wurde die Kieselsäure (10 g) in 100 ml
trockenem Toluol, das 10 ml Dichlordiphenylsilan enthielt,
6 Stunden unter Rückfluß erhitzt. Die so modifizierte
Kieselsäure wurde zunächst mit 100 ml Toluol gewaschen und
anschließend in einem Soxhlet-Extraktor nacheinander mit
250 ml Toluol, Aceton und Methanol jeweils während 8 Stunden
behandelt. Schließlich erfolgte Behandlung mit Trimethylchlorsilan
in der vorstehend angegebenen Weise.
Je 3 g Trägermaterial wurden dann in 10,7 ml Chloroform
und 2,3 ml n-Butanol suspendiert und in 4,6×250-mm-
Säulen aus rostfreiem Stahl unter einem Druck von 340 atm.
gefüllt. Die Säulen wurden anschließend mit 75 ml Ethanol
gewaschen.
Aminosäureanalysen der Mittelfraktion des erhaltenen
Interferon-Peaks nach Hydrolyse in 5,7N HCl lieferten die
folgenden Ergebnisse:
Hexosaminanalyse nach 6-, 14- und 24stündiger
Hydrolyse des Interferons mit 5,7N HCl, enthaltend 0,02%
Thioglykolsäure, bei 110°C, unter Verwendung der Mittelfraktion
des Interferon-Peaks von der Diphenylsäule
lieferte 3 Glucosaminreste pro Molekül. Es wurde weder
Galactosamin noch Mannosamin gefunden.
Die Endgruppenbestimmung wurde mit einer 90 pMol-
Probe aus der Mittelfraktion des Interferon-Peaks von
der Diphenylsäule durchgeführt und ergab Met als N-terminale
Aminosäure.
150 pMol-Proben sowohl von Fibroblasten- wie von Leukozyten-Interferon
wurden dem tryptischen Abbau unterworfen
und anschließend chromatographiert. Es wurden in den beiden
Proben keine identischen Peptidfragmente gefunden.
Durch Sequenzierung einer 1,25-nMol-Probe von Fibroblasten-Interferon
wurde Met als N-terminale Aminosäure festgestellt.
Sequenzierung einer
weiteren 5,9-nMol-Probe von Fibroblasten-Interferon lieferte
die folgende N-terminale Aminosäuresequenz:
H₂N-Met¹-Ser-Tyr-Asn-Leu⁵-Leu-Gly-Phe-Leu-Gln¹⁰-Arg-
Ser-Ser-Asn-Phe¹⁵-Gln-. . .-Gln-Lys¹⁹-. . .
Rohes Interferon wurde aus menschlichen Fibroblasten
(Zell-Linie GM 2504A, erhältlich beim Human Genetic Mutant Repository, Camden, N. J., USA) gewonnen. Das rohe Material wurde 1M
bezüglich Natriumchlorid durch Zugabe gesättigter Natriumchloridlösung
gemacht. Dieses Material wurde durch eine
Säule von Blau Sepharose-4B (Volumen 20-25 ml, Durchmesser
2,5 cm, Durchflußmenge 2,5 ml/Min.) gegeben. Während des
Beladens wurde das Rohmaterial mit Eis gekühlt. Nach der
Beladung wurde die Säule mit 250 ml der folgenden Lösung
(2,5 ml/Min.) gewaschen:
30% Ethylenglykol, 1M NaCl, 50 mM Na₂HPO₄ (pH 7,2).
30% Ethylenglykol, 1M NaCl, 50 mM Na₂HPO₄ (pH 7,2).
Schließlich wurde das Interferon bei einer Durchflußrate
von 2,5 ml/Min. mit 250 ml der folgenden Lösung
eluiert:
50% Ethylenglykol, 1M NaCl, 50 mM Na₂HPO₄ (pH 7,2).
50% Ethylenglykol, 1M NaCl, 50 mM Na₂HPO₄ (pH 7,2).
Typische Ergebnisse des Assays waren:
5% Aktivität im Durchfluß,
10% Aktivität in der 30%igen Ethylenglykol-Lösung,
85% Aktivität in der 50%igen Ethylenglykol-Lösung.
5% Aktivität im Durchfluß,
10% Aktivität in der 30%igen Ethylenglykol-Lösung,
85% Aktivität in der 50%igen Ethylenglykol-Lösung.
Die Fraktionen des Interferon-Peaks aus der ersten
Blau Sepharose-Säule wurden zusammengefaßt und mit der
folgenden Lösung auf einen Ethylenglykolgehalt von 10%
(V/V) gebracht:
2M NaCl, 50 mM Na₂HPO₄ (pH 7,2).
2M NaCl, 50 mM Na₂HPO₄ (pH 7,2).
Dieses Material wurde auf eine Blau Sepharose-Säule
gegeben (Volumen 20-25 ml, 2,5 cm Durchmesser, Durchflußrate
2,5 ml/Min.). Es wurde mit 250 ml einer Lösung, enthaltend
2M NaCl, 50 mM Na₂HPO₄ (pH 7,2) und 30% (V/V)
Ethylenglykol gewaschen und eluiert mit einer Lösung, enthaltend
2M NaCl, 50 mM Na₂HPO₄ (pH 7,2) und 50% (V/V)
Ethylenglykol.
Typische Ergebnisse des Interferon-Assays waren:
10% Aktivität im Durchfluß,
30% Aktivität in der 30%igen Ethylenglykol-Lösung,
60% Aktivität in der 50%igen Ethylenglykol-Lösung.
10% Aktivität im Durchfluß,
30% Aktivität in der 30%igen Ethylenglykol-Lösung,
60% Aktivität in der 50%igen Ethylenglykol-Lösung.
Zunächst wurde die Probe aus dem 50%igen (V/V) Ethylenglykol-Eluat
von Blau Sepharose untersucht. Es folgten
Proben, die zweimal über die Blau Sepharose-Säule gegeben
wurden, in welchen Fällen die 30%igen oder die 50%igen
Ethylenglykol-Eluate verwendet werden konnten.
Es wurde eine 25×0,46-cm-Säule auf der Basis einer
durch Octylgruppen modifizierten SiO₂-Matrix (Lichrosorb
RP-8) verwendet. Die Säule wurde zunächst mit Wasser gewaschen
und dann mit dem Eluat der Blau Sepharose-Säule
beladen. Vor die Pumpe wurde eine Mischkammer (5 ml) geschaltet.
Es wurde bei einer Durchflußrate von 22 ml/Std.
mit dem folgenden stufenweisen Gradienten von n-Propanol,
bei einem konstanten, durch 1M Ameisensäure/0,8M Pyridin
gewährleisteten pH von 4,2 gearbeitet:
0% 10 Min.; 30% 40 Min.; 32% 40 Min.
0% 10 Min.; 30% 40 Min.; 32% 40 Min.
Schließlich wurde die Säule mit 60%igem n-Propanol
gewaschen und vor der nächsten Verwendung mit 1M Ameisensäure
und 0,8M Pyridin äquilibriert.
Das Interferon wurde mit dem 32%igen n-Propanol-Eluat
(zwischen 80 und 90 Minuten) eluiert. Dieses Material war
homogen aufgrund der NaDodSO₄-Acrylamid-Gelelektrophorese
(Färbung mit Coomassie Blau oder vorheriger Markierung der
Probe mitFluram).
Aminosäureanalysen (24stündige Hydrolyse, 0,2% TGS,
5,7N HCl) wurde an neun verschiedenen Proben aus vier
unterschiedlichen Präparaten durchgeführt. Die mittlere
Aminosäurezusammensetzung, bezogen auf einen Leucinwert
von 22,0, geht aus der folgenden Tabelle hervor:
Basierend auf den zu verschiedener Zeit durchgeführten
Analysen verschiedener Proben, die durch unterschiedliche,
in diesem und den vorangehenden Beispielen beschriebenen
Verfahren erhalten wurden (24stündige Hydrolyse in 6N HCl
mit 0,2% Thioglykolsäure, TGS), weist homogenes Human-
Fibroblasten-Interferon die folgende Aminosäurezusammensetzung
auf (±15%):
Homogenes Human-Fibroblasten-Interferon (1,5 mg) mit
einer spezifischen Aktivität von 4×10⁸ Einheiten/mg wurde
in 25 ml 5%igem normalem Human-Serumalbumin gelöst. Die
Lösung wurde durch ein bakteriologisches Filter filtriert
und auf 100 aseptische Ampullen verteilt. Jede Ampulle enthielt
6×10⁶ Einheiten reines Interferon, das sich für
die parenterale Applikation eignet. Die Ampullen werden bis
zum Gebrauch vorzugsweise in der Kälte (bei -20°C) aufbewahrt.
Claims (3)
1. Human-Fibroblasten-Interferon, frei von Natriumdodecylsulfat,
gekennzeichnet durch
- (a) homogene Form;
- (b) eine spezifische Aktivität von etwa 4×10⁸ Einheiten/mg;
- (c) ein Molekulargewicht von etwa 20 500 gemäß Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese;
- (d) die folgende relative Aminosäurezusammensetzung (±15%) basierend auf 24stündiger Hydrolyse in 6,0N HCl, enthaltend 0,2% Thioglycolsäure (bezogen auf einen Wert für Leucin von 22,0):
- (e) die Aminosäure-Teilsequenz
H₂N-Met¹-Ser-Tyr-Asn-Leu⁵-Leu-Gly-Phe-Leu-Gln¹⁰-Arg-Ser- Ser-Asn-Phe¹⁵-Gln-. . .-Gln-Lys¹⁹-. . . und - (f) höchstens 3 Glucosaminreste, 0 Galaktosamin- und 0 Mannosaminreste pro Molekül.
2. Verfahren zur Herstellung von Human-Fibroblasten-
Interferon gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß
eine wäßrige Lösung von Human-Fibroblasten-Interferon in
unreinem Zustand zunächst der Affinitäts-Chromatographie an
Concanavalin A-Sepharose oder Blau Dextran Sepharose und
die erhaltenen Interferon-Fraktionen dann der ein- oder mehrmaligen
HPLC an Säulen auf der Basis einer durch Cyclohexyl-
oder Octylgruppen modifizierten SiO₂-Matrix unterworfen werden,
wobei im Fall von vorhergehender Concanavalin A-Sepharose-Chromatographie
die Ausgangszusammensetzung des bei der
HPLC verwendeten Elutionsmittelgemischs Pyridin/Ameisensäure/
Isopropanol/n-Butanol/Wasser 8 : 8 : 20 : 0 : 64 (Vol.-%) ist und mit
einem Isopropanol/n-Butanol-Gradienten gearbeitet wird, so
daß die Endzusammensetzung des Elutionsmittelgemischs
8 : 8 : 25 : 20 : 39 (Vol.-%) ist, während im Fall von vorhergehender
Blau Dextran Sepharose-Chromatographie die Ausgangszusammensetzung
des bei der HPLC verwendeten Elutionsmittelgemischs
Pyridin/Ameisensäure/Isopropanol/n-Butanol/
Wasser 8 : 8 : 20 : 3,3 : 60,7 (Vol.-%) ist und mit einem Isopropanol/
n-Butanol-Gradienten gearbeitet wird, so daß die Endzusammensetzung
des Elutionsmittelgemischs ebenfalls 8 : 8 : 25 : 20 : 39
(Vol.-%) ist.
3. Pharmazeutische Präparate auf der Basis eines Human-
Fibroblasten-Interferons gemäß Anspruch 1.
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